CN103698527A - 基于磁性分离和量子点标记的铅中毒快速检测方法与试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种基于磁性分离和量子点(QDs)标记的液体生物样品中铅的快速检测方法，所述方法包括：1)制备抗铅单克隆抗体；2)将所述抗铅单克隆抗体与纳米磁珠通过共价键偶联，制备抗铅免疫纳米磁珠；3)向所述液体生物样品中加入双功能螯合剂、牛血清白蛋白(BSA)和三乙胺(TEA)，进行温育，之后加入所述抗铅免疫纳米磁珠充分混合，之后进行磁分离，向磁分离得到的沉淀物中加入生物素化的BSA抗体和链霉亲和素化的量子点(QDs)，使用荧光酶标仪进行荧光检测。本发明还提供一种用于液体生物样品中铅的快速检测的试剂盒。
Description
技术领域
本发明属于生物与新医药技术领域。具体地。本发明提供了一种基于磁性分离和量子点标记技术快速检测血液中铅含量的方法以及用于快速检测血液中铅含量的试剂盒。
背景技术
铅(Pb)污染因其具有持久性、生物富集性和毒性而备受关注，一直是国际科学界的热点研究课题之一。近年来，随着我国工业化和城市化进程的加快，铅污染呈上升趋势。通过工业“三废”的排放进入环境的重金属铅，甚至直接影响到了食物链和农产品质量，有很多地方粮食、蔬菜、水果等食物中铅含量严重超标或接近临界值，对人类的健康构成了极大威胁。2012年，刊登在美国《移民与难民研究》杂志上的一份关于“纽约健康和营养检测调查报告”显示，来自中国大陆的移民血液中铅、镉、汞等重金属含量高于来自其他亚洲地区的移民。铅比其他亚洲新移民高出44%。与此同时，在我国一些日用品(如，化妆品)中铅含量严重超标，进一步增加了铅中毒患者的数量。
目前，医院检测患者血铅含量的常规方法为光谱法。主要包括：分光光度法(UV)、原子吸收光谱法(AAS)、原子荧光光谱法(AFS)和电感耦合等离子体-质谱法(ICP-MS)。尽管这些方法成熟，结果可信度高，样品需要进行复杂的前处理，仪器昂贵，不适合进行快速检测和大量样品的筛选。
包括铅在内的重金属快速检测方法目前主要有酶分析法、生物化学传感器法、试纸法和免疫分析法。酶分析法灵敏度高，但选择性较差，对单一重金属离子的检测存在一定的困难。生物化学传感器法发展迅速，灵敏度、自动化程度高，可应用于环境在线监测，但传感器制作工艺较难，成本相对较高。试纸法虽然简单方便，但只能对金属离子进行定性或半定量分析。上述方法主要集中在环境水样的快速检测，而用于生物样品中重金属的快速检测鲜有报道。
免疫分析法是检测重金属离子的一种新方法，检测速度快、灵敏度高、选择性强，迄今为止，已经成功用于水中金属离子的检测。使用特异性的双功能螯合剂，可以螯合重金属离子并与载体蛋白偶联，形成完整的免疫原，通过杂交瘤细胞技术制备特异性单克隆抗体。将抗重金属的单克隆抗体连接到新型的Fe3O4磁性纳米颗粒表面，可以使Fe3O4磁性纳米颗粒具有靶向识别和磁性分离的双重功能，从而实现重金属的富集，提高检测灵敏度。
量子点(QDs)，又称为半导体纳米微晶粒，是一种直径在1～100nm能够接收激发光产生荧光的纳米颗粒。与传统的有机荧光染料相比，QDs具有量子产率高，光化学稳定性高，不易光解等优良的光学特性。将量子点与抗体结合用于荧光免疫分析的报道越来越多，利用亲和素修饰量子点后，量子点可以很容易的与生物素化的抗体结合，为抗体和量子点提供了一种分子连接的桥梁，应用这种方法检测毒素，可以达到用有机染料进行标记的同等的检测限。
发明内容
本发明应用杂交瘤细胞技术制备铅单克隆抗体(PbMAb)；活化的纳米磁珠和QDs分别与PbMAb和二抗相连，制备免疫纳米探针；利用免疫磁珠的可富集特性和QDs荧光信号的变化，以期建立多重信号协同放大、具有超高灵敏度的快速检测人血液中Pb的新方法，具有重要的科学意义和极广阔的应用前景。
技术问题：本发明的目的在于针对目前尚无的生物样品中重金属Pb的快速检测方法，建立一种利用免疫磁珠高效分离与QDs荧光信号的变化，快速检测血液中Pb含量的分析方法。
技术方案：本发明提供的基于磁性分离和量子点标记的铅中毒快速检测方法与试剂盒包括如下步骤：
1)Pb免疫抗原合成：Pb、双功能螯合剂[(R)-2-硫氰基-3-(4-氨基苯基)丙基]-(S-S)环己烷-1,2二乙三胺五乙酸(p-SCN-Bn-CHX-A＂-DTPA)、血蓝蛋白(KLH)按照一定比例，在三乙胺(TEA)存在下，25℃振荡反应22h；使用PBS缓冲液洗涤反应产物，并通过超滤管滤掉未反应的小分子物质；使用上述缓冲液稀释抗原，备用。
2)Pb检测抗原合成：将Pb、p-SCN-Bn-CHX-A＂-DTPA与牛血清白蛋白(BSA)在TEA的作用下合成检测抗原。
3)抗Pb单克隆抗体(PbMAb)的制备与纯化：小鼠免疫后制备抗Pb杂交瘤细胞，然后大量制备腹水型PbMAb，最后使用饱和(NH4)2SO4沉淀法纯化抗体，使用Sephacry S-300进一步纯化抗体。
4)抗Pb免疫磁珠(PbMAb-Fe3O4)制备：将PbMAb与Fe3O4纳米磁珠偶联，制备抗铅免疫磁珠(PbMAb-Fe3O4)。
5)检测方法的效果评价：分别通过标准曲线的线性范围，检出限，精密度，加标回收率实验以及与实际样品ICP/MS的检测结果对比，评价方法的准确性与可靠性。
有益效果：在我国铅污染严重，建立简便、快速的铅中毒快速检测方法不但对中毒病人的诊断、救治具有重要的理论意义和应用价值，还将对提高我国公共卫生管理水平和公共卫生安全事件处置能力具有重要理论意义和现实意义。
本发明根据荧光免疫的双抗体夹心原理，利用免疫磁珠分离速度快、效率高、操作简便等优点，结合QDs光化学稳定性高，不易光解等优良的光学特性，分别以免疫磁珠和QDs为载体连接PbMAb和二抗，使得快速、准确地检测生物样品中Pb的含量得以实现。
本发明仅用100μl血，十几微升的试剂，在少于1h的时间内即可实现对生物样品中铅含量的测定。由于使用的仪器为荧光酶标仪，可以同时检测96个样品，成本低，省时高效。
更具体地，本发明提供以下各项：
1.用于液体生物样品中铅的快速检测的试剂盒，所述试剂盒包含：
抗铅免疫纳米磁珠，所述抗铅免疫纳米磁珠通过将抗铅单克隆抗体与纳米磁珠经由共价键偶联制备；
双功能螯合剂；
牛血清白蛋白(BSA)；
三乙胺(TEA)；
生物素化的BSA抗体；和
链霉亲和素化的QDs。
2.根据1所述的试剂盒，其中所述纳米磁珠是Fe3O4纳米磁珠。
3.根据1所述的试剂盒，其中所述纳米磁珠的粒径为280nm。
4.根据1所述的试剂盒，其中所述双功能螯合剂是p-SCN-Bn-CHX-A＂-DTPA。
5.根据1所述的试剂盒，其中所述液体生物样品选自尿液或血液。
6.根据1所述的试剂盒，其中所述液体生物样品是血液。
7.根据1所述的试剂盒，其中所述抗铅单克隆抗体利用铅免疫抗原制备，所述铅免疫抗原通过在三乙胺(TEA)的存在下将铅、双功能螯合剂(优选为p-SCN-Bn-CHX-A＂-DTPA)和血蓝蛋白(KLH)混合来制备。
8.根据1所述的试剂盒，其中用于所述QDs的激发波长=405nm，发射波长=585nm。
9.基于磁性分离和量子点(QDs)标记的液体样品中铅的快速检测方法，所述方法包括：
1)制备抗铅单克隆抗体；
2)将所述抗铅单克隆抗体与纳米磁珠通过共价键偶联，制备抗铅免疫纳米磁珠；
3)向所述液体生物样品中加入双功能螯合剂(优选为p-SCN-Bn-CHX-A＂-DTPA)、牛血清白蛋白(BSA)和三乙胺(TEA)，进行温育，之后加入所述抗铅免疫纳米磁珠充分混合，之后进行磁分离，向磁分离得到的沉淀物中加入生物素化的BSA抗体和链霉亲和素化的量子点(QDs)，使用荧光酶标仪进行荧光检测。
10.根据9所述的方法，其中所述纳米磁珠是Fe3O4纳米磁珠，其粒径优选为280nm。
附图说明
图1是本发明铅免疫抗原紫外光谱图，图2是本发明铅检测抗原紫外光谱图。从图中可以看出吸收峰发生偏移，说明抗原合成成功。
图3是本发明小鼠血清抗铅效价，图4是本发明小鼠血清抗铅特异性。从图中可以看出，小鼠血清抗铅效价为32000，抗铅的特异性为32000左右，表明小鼠免疫成功。
图5是本发明抗铅杂交瘤细胞培养液上清液效价图。从图中看出我们筛选出了一株抗铅特异性和效价均较高的细胞株。
图6是本发明抗铅杂交瘤细胞腹水效价图。图7是本发明抗铅杂交瘤细胞腹水特异度图。从图中可以看出，小鼠杂交瘤细胞腹水抗铅效价和特异度均能达到25600，说明腹水中存在特异性的抗铅抗体。
图8是纯化后抗铅单克隆抗体效价图。从图中可以看出，经纯化后的抗铅单克隆抗体效价较高。
图9是纯化后抗铅单克隆抗体凝胶电泳图。从图中可以看出纯化后抗铅单克隆抗体分子量为25KDa和50KDa，没有异常条带，纯度较高。
图10是纳米磁珠与单克隆抗体反应的示意图。
具体实施方式
通过以下实施例进一步说明本发明，但本发明的权利要求不仅限于实施例。
实施例1
1)Pb免疫抗原合成：将Pb(国家有色金属及电子材料分析测试中心，GSB04-1742-2004)、双功能螯合剂[(R)-2-硫氰基-3-(4-氨基苯基)丙基]-(S-S)环己烷-1,2二乙三胺五乙酸(p-SCN-Bn-CHX-A＂-DTPA)(Macroyclics，美国)和血蓝蛋白(KLH)(Sigma，美国，H7017)以及三乙胺(TEA)(国产分析纯)按照Pb:p-SCN-Bn-CHX-A＂-DTPA:KLH:TEA=9:12:200:13(W/W/W/W)的比例，25℃振荡反应22h；使用PBS缓冲液洗涤反应产物，并通过超滤管(30KD)滤掉未反应的小分子物质；使用PBS缓冲液稀释所获得的Pb免疫抗原。
2)Pb检测抗原合成：将Pb、p-SCN-Bn-CHX-A＂-DTPA、牛血清白蛋白(BSA)(Sigma，美国，A1933)和TEA按照Pb:p-SCN-Bn-CHX-A＂-DTPA:BSA:TEA=9:12:200:13(W/W/W/W)的比例合成检测抗原。Pb免疫抗原和Pb检测抗原的光谱鉴定结果如图1、2所示。
实施例2
抗Pb单克隆抗体(PbMAb)的制备与纯化：
将1.0mg/ml的Pb免疫抗原与等体积弗氏完全佐剂(FCA)，通过注射器双推法充分混匀，使其形成白色油包水乳状物，即抗原乳化剂。使用多点免疫法，免疫6周龄雌性Balb/C小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司，211)，每隔2周免疫1次，共免疫5次。在进行第2、3、4次免疫时，将Pb免疫抗原与等体积弗氏不完全佐剂(FIA)混合，以同样剂量加强免疫，在第5次免疫时，仅用Pb免疫抗原而不加佐剂。小鼠免疫后小鼠血清的效价与特异性如图3-4所示。取抗血清效价最高的免疫小鼠制备脾细胞，按照参考文献(Howard.G.C和Kaser.M.R的抗体制备与使用实验指南[M].北京：科学出版社，2010)将脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞(南京凯基生物科技发展有限公司，KG075)融合，筛选阳性杂交瘤细胞进行克隆，阳性率达到100%后将细胞扩大培养，结果如图5所示。将阳性细胞注射到小鼠腹腔，抽取腹水，评价腹水效价，结果如图6、7所示。腹水分别使用饱和(NH4)2SO4沉淀法和Sephacry S-300柱层析法纯化腹水中的PbMAb。将纯化的抗体进行效价检测和凝胶电泳实验，结果分别如图8和9所示。
实施例3
抗Pb免疫磁珠(PbMAb-Fe3O4)制备：因为纳米磁珠(
M-280Tosylactivated，lifetechnologies，美国，14203)背景值低，抗体与微珠表面共价连接，是使蛋白质复合物免疫沉淀的极佳选择。微珠磁性聚集温和而快速并且孵育耗时极短。因此纳米磁珠选用M-280Tosylactivated，其粒径为280nm。抗Pb免疫磁珠合成步骤如下：
(1)取165μL纳米磁珠，磁分离1min，去除上清；
(2)加入100μg抗铅单克隆抗体和0.1M pH7.4的磷酸缓冲液反应使体积变为150μL，涡旋震荡；
(3)加100μL3M(NH4)2SO40.1M pH7.4的磷酸缓冲液涡旋震荡。
(4)37℃摇动孵化12-18h；
(5)磁分离2min，去除上清；
(6)移除磁铁，加入1mL0.5%BSA0.01M pH7.4的磷酸缓冲液，37℃摇动孵化1h；
(7)磁分离2min，去除上清；
(8)移除磁铁，加入1mL0.1%BSA0.01M pH7.4的磷酸缓冲液，涡旋振荡5-10s；
(9)磁分离2min，去除上清；
(10)重复步骤7-8；
(11)用240μL0.1%BSA0.01M pH7.4的磷酸缓冲液重悬免疫磁珠。
纳米磁珠与抗铅单克隆抗体反应原理如图10所示。
实施例4
基于磁性分离和量子点标记的铅中毒的快速检测方法：
(1)向0.1mL血样中加入，13μl10μg/ml p-SCN-Bn-CHX-A＂-DTPA、1μl2.17mg/ml BSA和1μl4.6×10-4%TEA，37℃摇床反应15min。
(2)加入2μL抗Pb免疫磁珠反应15min后磁分离2min。
(3)加入4μL生物素化的BSA抗体(abcam，英国，ab7636)和1μL1mM的链霉亲和素化得量子点(Qdot?585Streptavidin Conjugate，lifetechnologies，美国，Q10113MP)，37℃摇床反应15min后磁分离2min。
(4)用荧光酶标仪进行结果检测(Ex=405nm，Em=585nm)。
标准曲线测定：取健康人空白血清100μL于200μL离心管中，加入不同浓度的铅配制成浓度为1、10、100、500、1000ng/ml的标准血样。按本发明的快速检测方法处理，以浓度(C)对吸光度(OD)进行线性回归，计算标准曲线方程C=70.783OD-825.713，R=0.948。该检测方法线性范围为1-1000ng/ml，最低检出限为1ng/ml。
加标回收率测定：将0.1mL病人血清(北京朝阳医院职业病与中毒医学中心)分别加入50ng Pb然后将其按照本发明的快速检测方法处理后检测，通过测得量与加入量的比值，计算加标回收率。加标回收率为94.97%—108.56%。
精密度测定：配制铅低、中、高3种浓度的血清样品，按照本发明的快速检测方法处理，进样测定。1天内平行操作5次，计算日内精密度。结果如表1所示。
表1：血清中铅含量测定精密度(n=5)
取病人血样(北京朝阳医院职业病与中毒医学中心)按照本发明的快速检测方法进行检测与ICP/MS法对照评价准确度，两种方法的测定结果间差异无统计学意义，显示建立的方法准确性可靠，结果如表2所示。
检测方法特异性鉴定：重金属单克隆抗体特异性以抗体交叉反应性表明：按照反应条件测定得到的抗体和其他金属离子Pb2+、Hg2+、Mn2+、Bi2+、Ni2+，是否反应或反应大小情况。将Pb连续浓度梯度稀释后，与螯合剂DTPA反应30min，然后按照本发明的快速检测方法进行检测，建立所有金属抑制标准曲线，并计算半抑数制率(IC50)，交叉反应率(CR)按公式计算得出：交叉反应率(CR)=IC50(Pb)/IC50(其它金属离子)×100%，用半数抑制(IC50)来衡量抗体灵敏度，半数抑制越低，说明抗体的灵敏度越高；也即IC50的数值越小，说明抗体的特异性能越强。表3显示本发明的抗铅单克隆抗体与其他金属离子交叉反应的结果，从表3中可以看出本发明的抗铅单克隆抗体与其他金属离子的交叉反应率较低。
表3：抗铅单克隆抗体与其他离子的交叉反应
Claims (10)
1.用于液体生物样品中铅的快速检测的试剂盒，所述试剂盒包含：
抗铅免疫纳米磁珠，所述抗铅免疫纳米磁珠通过将抗铅单克隆抗体与纳米磁珠经由共价键偶联制备；
双功能螯合剂；
牛血清白蛋白(BSA)；
三乙胺(TEA)；
生物素化的BSA抗体；和
链霉亲和素化的QDs。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述纳米磁珠是Fe3O4纳米磁珠。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述纳米磁珠的粒径为280nm。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述双功能螯合剂是p-SCN-Bn-CHX-A＂-DTPA。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述液体生物样品选自尿液或血液。
6.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述液体生物样品是血液。
7.根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述抗铅单克隆抗体利用铅免疫抗原制备，所述铅免疫抗原通过在三乙胺(TEA)的存在下将铅、双功能螯合剂(优选为p-SCN-Bn-CHX-A＂-DTPA)和血蓝蛋白(KLH)混合来制备。
8.根据权利要求1所述的试剂盒，其中用于所述QDs的激发波长=405nm，发射波长=585nm。
9.基于磁性分离和量子点(QDs)标记的液体样品中铅的快速检测方法，所述方法包括：
1)制备抗铅单克隆抗体；
2)将所述抗铅单克隆抗体与纳米磁珠通过共价键偶联，制备抗铅免疫纳米磁珠；
3)向所述液体生物样品中加入双功能螯合剂(优选为p-SCN-Bn-CHX-A＂-DTPA)、牛血清白蛋白(BSA)和三乙胺(TEA)，进行温育，之后加入所述抗铅免疫纳米磁珠充分混合，之后进行磁分离，向磁分离得到的沉淀物中加入生物素化的BSA抗体和链霉亲和素化的量子点(QDs)，使用荧光酶标仪进行荧光检测。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述纳米磁珠是Fe3O4纳米磁珠，其粒径优选为280nm。
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