CN112661850A - 一种多抗组合物及其制备方法和在病理检测的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种多抗组合物，属于抗体免疫检测领域。所述多抗组合物包括第一多抗和第二多抗，所述第一多抗为羊抗兔多抗，所述第二多抗为羊抗鼠多抗。进一步公开了所述多抗组合物的制备方法及能够结合所述多抗组合物的第三多抗的Fab'片段，所述Fab'片段与多聚物PAMAM偶联，所述多聚物PAMAM上结合有酶标蛋白。本发明还公开了所述多抗组合物和所述Fab'片段在制备二步法病理检测试剂盒及检测中的应用。利用本发明，可直接对组织切片进行免疫组化检测，简单方便；同时二步法病理检测的多重放大优势，检测灵敏度更高、特异性更强。

Description

一种多抗组合物及其制备方法和在病理检测的应用

技术领域

本发明属于抗体免疫检测领域，具体地，涉及一种多抗组合物及其制备方法和在病理检测中的应用。

背景技术

免疫组化，是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及相对定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

在免疫组化检测技术中，抗体与酶的复合物(二抗)对免疫分析的特异性与灵敏度具有极其重要的作用。目前免疫组化常用Polymer酶标二抗法，这里的酶主要指辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase，简称HRP)。酶标记抗体或抗原的传统方法是过碘酸钠氧化法和戊二醛氧化法，此两种方法得到的酶标产物只带有较少的酶分子，在病理免疫组化检测中难以应用；故临床上一般使用高分子多聚物作为载体来实现连接多个酶分子，以达到放大信号的目的，二抗产品主要有2种原理，一步法二抗与二步法二抗，整体来说，二步法二抗比一步法二抗的灵敏度更高，染色强度更强。

然而，目前市场上多数病理增强型二抗在聚合物结构设计、制备工艺上没有大的改进，具体体现在：单位体积内酶、抗体数量没有显著增加；聚合物空间位阻没有明显降低，导致灵敏度较差，且成本较高。

发明内容

为了解决上述技术问题中的至少一个，本发明旨在提供一种灵敏度高和稳定性强的二步法免疫组化用试剂，为了达到这个目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明第一方面提供一种多抗组合物，包括第一多抗和第二多抗，所述第一多抗为羊抗兔多抗，所述第二多抗为羊抗鼠多抗。

在本发明的一些实施方案中，所述多抗组合物由0.08μg/mL的羊抗兔血清和0.35μg/mL的羊抗鼠血清按1:1的比例进行混合得到的。

本发明的第二方面提供本发明第一方面所述多抗组合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)获取兔多抗和鼠多抗，分别与福氏免疫佐剂1:1混匀，注射混合物到山羊背部肌肉中进行免疫；

(2)每隔4周重复免疫一次，第八次免疫完之后取山羊血，离心后取上清获得的羊抗兔血清或羊抗鼠血清；

(3)将血清通过0.45μm滤膜后加入等体积PBS，混匀；。

(4)将羊抗兔血清或羊抗鼠血清通过亲和纯化填料柱，再用等体积的pH 8.0平衡缓冲液进行平衡；

(5)往纯化柱中加入pH 2.5的洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱3-5个柱体积后获得洗脱产物；

(6)往洗脱产物中加入10％体积的pH 12的Tris-Hcl中和缓冲液调整抗体pH值，获得纯化后的羊抗兔多抗血清或羊抗鼠多抗血清。

(8)将羊抗兔血清用保存缓冲液梯度稀释至0.08μg/mL，将羊抗鼠血清用保存缓冲液梯度稀释至0.35μg/mL；

(9)将稀释完成的羊抗鼠和羊抗兔血清按1:1的比例进行混合，混合完成即为多抗组合物。

在本发明的一些实施方案中，进一步地，所述纯化填料柱偶联有兔多抗抗体或鼠多抗抗体。

在本发明的一些实施方案中，更进一步地，所述多抗组合物包括排除人源交叉的步骤：

将羊抗兔和羊抗鼠多抗分别通过偶联人多抗抗体的亲和纯化填料柱，收集流穿，流穿即为经过人多抗吸附后的高效价羊抗兔多抗或羊抗鼠多抗。

在本发明的一些实施方案中，所述兔多抗和鼠多抗的制备方法如下：

(1)从未经免疫的3月龄新西兰大白兔中取血30mL，离心取上清获得兔血清，从未经免疫的小鼠中取血5mL，离心获得小鼠血清；

(2)将兔血清或小鼠血清通过0.45μm滤膜后加入等体积PBS，混匀；

(3)将兔血清和小鼠血清分别通过Protein A和Protein G偶联的纯化填料柱，再用等体积的pH 8.0平衡缓冲液进行平衡；

(4)往纯化柱中加入pH 2.5的洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱3-5个柱体积后获得洗脱产物；

(5)再往洗脱产物中加入10％体积的pH 12的Tris-Hcl中和缓冲液，即获得兔多抗或鼠多抗。

本发明的第三方面能够一种能够结合本发明第一方面所述多抗组合物的第三多抗的Fab'片段，所述第三多抗为驴抗羊多抗，所述Fab'片段与多聚物偶联，所述多聚物上结合有显色剂。

在本发明的一些实施方案中，所述多聚物为PAMAM多聚物。在本发明的一些实施方案中，所述显色剂选自荧光素、酶、金属离子、量子点和同位素中的一种。在本发明的一些具体实施方案中，所述酶选自辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶和β-糖苷酶中的一种。在本发明的一些优选实施方案中，所述显色剂为辣根过氧化物酶。

在本发明的一些具体实施方案中，所述Fab'片段的制备方法如下：

(1)将驴抗羊IgG粉末溶解于PBS缓冲液中，调整抗体浓度为10mg/mL。

(2)按1:50的比例在驴抗羊IgG中加入1mg/mL的胃蛋白酶溶液，混匀，在37℃中水浴酶切2h。

(3)将酶切产物用PBS缓冲液在30kDa超滤管进行超滤，超滤3次以上去除胃蛋白酶。

(4)将超滤产物通过SephadexG200分子筛柱进行纯化，根据在线监测OD280的峰图收集不同时间的流穿溶液，先流穿出来的即为F(ab)2溶液。

(5)在F(ab)2溶液中加入终浓度为0.5M的半胱氨酸盐酸盐，混匀后37℃还原反应10min。

(6)将还原完全的Fab'用PBS缓冲液在10kDa超滤管进行超滤，超滤3次以上去除半胱氨酸盐酸盐，即得到所述Fab'片段。

在本发明的一些具体实施方案中，所述Fab'片段与多聚物PAMAM偶联并与HRP蛋白偶联的步骤如下：

(1)将多聚物PAMAM溶解在PBS缓冲液中，终浓度为5mg/mL。

(2)将终浓度为1mM的Sulfo-MBS交联剂加入到溶解好的多聚物PAMAM中，震荡混匀，室温孵育30min进行交联，形成PAMAM-MBS交联产物。

(3)将交联反应完成的混合物用PBS缓冲液透析过夜，换液3次，去除Sulfo-MBS小分子。

(4)将HRP粉末溶解到PBS缓冲液中，形成终浓度为5mg/mL的HRP溶液。

(5)往驴抗羊Fab'和HRP溶液分别加入终浓度为5mM的TCEP溶液，室温反应30min。将反应产物用PBS缓冲液在30kDa超滤管进行超滤，超滤3次以上去除TECP。

(6)在PAMAM-MBS交联产物中加入TECP处理完成之后的驴抗羊Fab'和HRP溶液，三种分子的摩尔比为2:1:1。混合物室温孵育30min进行交联。

(7)交联完成之后把交联产物通过SephadexG25分子筛柱，根据在线监测OD280的峰图收集不同时间的流穿溶液，先流穿出来的为PAMAM-MBS-HRP-Fab'偶联溶液。

本发明的第四方面提供本发明第一方面所述的多抗组合物和本发明第三方面所述的Fab'片段在制备二步法病理检测试剂盒中的应用。

本发明的第五方面提供一种二步法病理检测试剂盒，包括本发明第一方面所述的多抗组合物和本发明第三方面所述的Fab'片段。

在本发明的一些实施方案中，所述试剂盒进一步包括DAB显色液和/或苏木素工作液。

在本发明的一些具体实施方案中，所述DAB显色液的制备方法如下：

(1)配制浓度为0.1M的Tris-Hcl缓冲液40mL，缓冲液中再依次加入1mL浓度为2M的咪唑溶液，1mL 0.4％的氯化铵溶液，1mL 30％的葡萄糖溶液，

(2)将250mg 3,3'-二氨基联苯胺粉末加入至(1)中的Tris-Hcl缓冲液中，加去离子水定容至50mL，获得20×DAB显色浓缩液，在使用前用0.1M的Tris-Hcl稀释至1×使用；

在本发明的一些实施方案中，所述苏木素工作液的制备方法如下：

(1)在800mL去离子水中加入50g氯化钾、0.2g碘酸钠、1g柠檬酸形成苏木素缓冲液，

(2)再往苏木素缓冲液中加入1g苏木精粉末，完全溶解后加入去离子水定容至1L，即为苏木素工作液。

本发明第六方面提供一种二步法病理检测检测方法，包括以下步骤：

(1)将待检测组织切片进行脱蜡、水化、抗原修复、封闭，并浸泡在PBST中。

(7)一抗孵育：在切片上滴加兔单抗或鼠单抗，液体将切片大小完全覆盖切片，室温孵育30min后，收集切片，在PBST中涮洗；

(8)一抗后孵育：在切片上滴加权利要求1所述的抗体组合物，将切片大小完全覆盖切片组织，室温孵育15-20min后收集切片，在PBST中涮洗；

(9)二抗孵育：加入权利要求4或5所述的Fab'片段，液体将切片大小完全覆盖切片组织，室温孵育15-20min后收集切片，在PBST中涮洗；

(10)DAB显色：在切片上滴加DAB显色液，液体将切片大小完全覆盖切片组织，显色1-5min，自来水冲洗终止显色，收集切片，在自来水中涮洗。

(11)苏木素复染：将切片放入苏木素工作液中，染色4min，用自来水涮洗除去多余的染料，后在PBST溶液中返蓝约1min；

(12)梯度酒精脱水、透明、封片；

(13)显微镜下观察染色结果。

本发明第七方面提供一种复合物，所述复合物由生物样本、一抗、权利要求1所述的多抗组合物和权利要求4或5所述Fab'片段结合而成，其中，所述一抗为兔单抗和/或鼠单抗，

所述生物样本的抗原与所述兔单抗和/或鼠单抗结合；

所述兔单抗和/或鼠单抗与所述多抗组合物中的羊抗兔多抗和/或羊抗鼠多抗结合；

所述羊抗兔多抗和/或羊抗鼠多抗与所述Fab'片段结合。。

在本发明中，所述多种羊抗兔多抗中的多种抗体可以和兔单抗结合，同样所述羊抗鼠多抗中的多种抗体可以与鼠单抗结合。进一步地，多种所述驴抗羊多抗中的Fab'片段可以与羊抗兔多抗结合，同样，多种所述驴抗羊多抗的Fab'片段可以与羊抗鼠多抗结合。由此，可以实现多重放大的效应。

本发明的有益效果

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

本发明所用试剂都是即用型，可以直接滴加于切片上，无需进行其他试剂的额外配制，简单方便。

利用本发明进行抗原检测，所述多种羊抗兔多抗中的多种抗体可以和兔单抗结合，同样所述羊抗鼠多抗中的多种抗体可以与鼠单抗结合。进一步地，多种所述驴抗羊多抗中的Fab'片段可以与羊抗兔多抗结合，同样，多种所述驴抗羊多抗的Fab'片段可以与羊抗鼠多抗结合。由此，可以实现多重放大的效应。

本发明还分别优化了二抗的其他相关组分，集合了二步法二抗的多重放大优势、多聚物二抗本身的放大优势、优化配方的DAB显色液和苏木素的优势，能够综合将本试剂盒的信号放大效应做到最大。

本发明的试剂盒和检测方法灵敏度高，特异性强。

附图说明

图1示出了新工艺和原工艺纯化羊抗兔多抗的效价检测图。

图2示出了新工艺和原工艺纯化羊抗鼠多抗的效价检测图。

图3示出了羊抗兔多抗经过人多抗吸附后效价结果。

图4示出了羊抗鼠多抗经过人多抗吸附后效价结果。

图5示出了利用本发明的一抗后试剂和多聚物二抗进行病理检测的示意图。

图6示出了靶点为CK5/6的免疫组化抗体在宫颈癌切片上的染色情况(20倍镜下观察)，A：实验组1；B：实验组2；C：实验组3；D：第一对照组；E：第二对照组。

图7示出了靶点为CK5/6的免疫组化抗体在肺鳞癌切片上的染色情况(20倍镜下观察)，A：实验组；B：第一对照组；C：第二对照组；D：第三对照组。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。

实施例

以下例子在此用于示范本发明的优选实施方案。本领域内的技术人员会明白，下述例子中披露的技术代表发明人发现的可以用于实施本发明的技术，因此可以视为实施本发明的优选方案。但是本领域内的技术人员根据本说明书应该明白，这里所公开的特定实施例可以做很多修改，仍然能得到相同的或者类似的结果，而非背离本发明的精神或范围。

除非另有定义，所有在此使用的技术和科学的术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。

那些本领域内的技术人员将意识到或者通过常规试验就能了解许多这里所描述的发明的特定实施方案的许多等同技术。这些等同将被包含在权利要求书中。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

实施例1一抗后试剂的制备

1.兔多抗的制备

(1)从多只未经免疫的3月龄新西兰大白兔中各取血30mL，离心取上清获得兔血清。

(2)将兔血清通过0.45μm滤膜后加入等体积PBS，混匀。

(3)将兔血清混合物过通过Protein A偶联的纯化填料柱，再用等体积的pH8.0平衡缓冲液进行平衡。

(4)再往纯化柱中加入pH 2.5的洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱3-5个柱体积后获得洗脱产物。

(5)再往洗脱产物中加入10％体积的pH 12的Tris-Hcl中和缓冲液，即获得兔多抗溶液，测定抗体浓度。

2.鼠多抗的制备

(1)从多只未经免疫的小鼠中各取血5mL，离心获得小鼠血清。

(2)将小鼠血清通过0.45μm滤膜后加入等体积PBS，混匀。

(3)将兔血清混合物通过Protein G偶联的纯化填料柱，再用等体积的pH8.0平衡缓冲液进行平衡。

(4)再往纯化柱中加入pH 2.5的洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱3-5个柱体积后获得洗脱产物。

(5)再往洗脱产物中加入10％体积的pH 12的Tris-Hcl中和缓冲液，即获得小鼠多抗溶液，测定抗体浓度。

3.一抗后试剂的制备

(1)将兔多抗和小鼠多抗分别调节浓度为至4mg/mL，取1mL分别与福氏免疫佐剂1:1混匀，注射2mL混合物到山羊背部肌肉中进行免疫。

(2)每隔4周重复免疫一次，第八次免疫完之后取山羊血200mL，离心后取上清获得约90-110mL的羊抗兔和羊抗鼠血清。

(3)将血清通过0.45μm滤膜后加入等体积PBS，混匀。

(4)将羊抗兔血清混合物通过亲和纯化填料柱，再用等体积的pH 8.0平衡缓冲液进行平衡。

(5)再往纯化柱中加入pH 2.5的洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱3-5个柱体积后获得洗脱产物。

(6)再往洗脱产物中加入10％体积的pH 12的Tris-Hcl中和缓冲液调整抗体pH值。

(7)用同样的方式可以获得通过纯化后的羊抗鼠多抗。

(8)将羊抗兔血清用保存缓冲液梯度稀释至0.08μg/mL，将羊抗鼠血清用保存缓冲液梯度稀释至0.35μg/mL。

(3)将稀释完成的羊抗鼠和羊抗兔血清按1:1的比例进行混合，混合完成的血清即为一抗后试剂。

实施例2一抗后试剂亲和纯化

为了进一步提高一抗后试剂的性能，本实施例采用新工艺对兔多抗和小鼠多抗进行亲和纯化。其步骤如下：

(1)将兔多抗和小鼠多抗分别调节浓度为至4mg/mL，取1mL分别与福氏免疫佐剂1:1混匀，注射2mL混合物到山羊背部肌肉中进行免疫。

(2)每隔4周重复免疫一次，第八次免疫完之后取山羊血200mL，离心后取上清获得约90-110mL的羊抗兔和羊抗鼠血清。

(3)将血清通过0.45μm滤膜后加入等体积PBS，混匀。

(4)将羊抗兔血清混合物通过偶联有兔多抗抗体的亲和纯化填料柱，再用等体积的pH 8.0平衡缓冲液进行平衡。

(5)再往纯化柱中加入pH 2.5的洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱3-5个柱体积后获得洗脱产物。

(6)再往洗脱产物中加入10％体积的pH 12的Tris-Hcl中和缓冲液调整抗体pH值。

(7)用同样的方式可以获得通过亲和纯化后的羊抗鼠多抗。

将通过亲和纯化后的多抗和只经过特异性纯化的多抗通过ELISA方法进行效价比较，结果显示通过亲和纯化(新工艺)多抗的效价是只经过特异性纯化(原工艺)的多抗效价的1.5倍以上。ELISA具体步骤如下：

(1)抗原包被：用稀释液稀释兔IgG/鼠IgG至浓度为1ug/ml，50ul/well加入酶标板，保证液面平铺，4℃过夜。

(2)第二天，将酶标板至于洗板机上清洗，洗液为1×PBST，300μl/well，洗三次。洗完后，加入封闭液100ul/well封闭1h。

(3)一抗孵育：封闭结束后，用1×PBST洗板三次。将预先用封闭液梯度稀释好的羊抗兔/羊抗鼠多抗按100ul/well加入酶标板相应的孔中，30℃孵育1h。

(4)二抗孵育：一抗孵育结束后，用1×PBST洗板三次。将预先用封闭液稀释好HRP标记的驴抗羊二抗按50ul/well加入酶标板相应孔中，30℃孵育40min。

(5)显色：二抗孵育结束后，用1×PBST洗板三次。显色试剂为TMB显色液，按50ul/well加入酶标板，30℃避光显色15min。

(6)终止：显色结束后，按50ul/well加入1M H₂SO₄终止显色，室温放置5min。

(7)读值：5min后，于酶标仪测酶标板450nm的OD值。

新工艺和原工艺纯化羊抗兔多抗的效价检测图如图1所示，可知新工艺纯化羊抗兔多抗的效价(EC50值3.27)明显强于原工艺的羊抗兔多抗的效价(EC50值5.14)，新工艺效价是原工艺效价的1.6倍。

新工艺和原工艺纯化羊抗鼠多抗的效价检测图如图2所示，可知新工艺纯化羊抗鼠多抗的效价(EC50值7.04)明显强于原工艺的羊抗鼠多抗的效价(EC50值10.5)，新工艺效价是原工艺效价的1.5倍。

实施例3一抗后试剂排除人源交叉优化

将羊抗兔和羊抗鼠多抗通过偶联有人多抗抗体(上海晶都生物，10mg/管)的亲和纯化填料柱，收集流穿，流穿即为经过人多抗吸附后的高效价羊抗兔多抗和羊抗鼠多抗，测定抗体浓度。

将经过人多抗吸附的羊抗兔多抗进行交叉检测，结果如图3所示，吸附前和人多抗IgG还是有部分交叉(EC50值409)，经过吸附后多抗与人多抗已经基本无交叉(EC50值0.000158)。表明经过吸附的羊抗兔多抗和人已经无物种交叉，且效价无明显下降。

将经过人多抗吸附的羊抗鼠多抗进行交叉检测，结果如图4所示，吸附前和人多抗IgG还是有部分交叉(EC50值205)，经过吸附后多抗与人多抗已经基本无交叉(EC50值0.00534)。表明经过吸附的羊抗鼠多抗和人已经无物种交叉，且效价无明显下降。

实施例4多聚物二抗的制备

1.驴抗羊Fab'片段的制备

(1)将驴抗羊IgG粉末溶解于PBS缓冲液中，调整抗体浓度为10mg/mL。

(2)按1:50的比例在驴抗羊IgG中加入1mg/mL的胃蛋白酶溶液，混匀，在37℃中水浴酶切2h。

(3)将酶切产物用PBS缓冲液在30kDa超滤管进行超滤，超滤3次以上去除胃蛋白酶。

(4)将超滤产物通过SephadexG200分子筛柱进行纯化，根据在线监测OD280的峰图收集不同时间的流穿溶液，先流穿出来的即为F(ab)2溶液。

(5)在F(ab)2溶液中加入终浓度为0.5M的半胱氨酸盐酸盐，混匀后37℃还原反应10min。

(6)将还原完全的Fab'用PBS缓冲液在10kDa超滤管进行超滤，超滤3次以上去除半胱氨酸盐酸盐。

2.多聚物PAMAM与驴抗羊Fab'和HRP蛋白的偶联

(1)将多聚物PAMAM溶解在PBS缓冲液中，终浓度为5mg/mL。

(2)将终浓度为1mM的Sulfo-MBS交联剂加入到溶解好的多聚物PAMAM中，震荡混匀，室温孵育30min进行交联，形成PAMAM-MBS交联产物。

(3)将交联反应完成的混合物用PBS缓冲液透析过夜，换液3次，去除Sulfo-MBS小分子。

(4)将HRP粉末溶解到PBS缓冲液中，形成终浓度为5mg/mL的HRP溶液。

(5)往驴抗羊Fab'和HRP溶液分别加入终浓度为5mM的TCEP溶液，室温反应30min。将反应产物用PBS缓冲液在30kDa超滤管进行超滤，超滤3次以上去除TECP。

(6)在PAMAM-MBS交联产物中加入TECP处理完成之后的驴抗羊Fab'和HRP溶液，三种分子的摩尔比为2:1:1。混合物室温孵育30min进行交联。

(7)交联完成之后把交联产物通过SephadexG25分子筛柱，根据在线监测OD280的峰图收集不同时间的流穿溶液，先流穿出来的为PAMAM-MBS-HRP-Fab'偶联溶液，即为多聚物二抗。

本实施的多聚物二抗，和实施例1、2、3制备并纯化和优化后的一抗后试剂，一起可用于制备二步法二抗病理检测试剂盒。

如图5所示，其中，首先利用兔单抗和/或鼠单抗与组织样本上的靶标抗原结合。然后利用一抗后试剂(包含羊抗兔多抗和羊抗鼠多抗)，羊抗兔多抗中的多种抗体可以和兔单抗结合，同样羊抗鼠多抗中的多种抗体可以与鼠单抗结合。再加入多聚物二抗，多种驴抗羊多抗中的Fab'片段可以与羊抗兔多抗和/或羊抗鼠多抗结合，由此可以对靶标抗原进行多重放大，检测的灵敏度更高，适合低丰度靶标抗原的病理检测。

实施例5本发明制备的一抗后试剂和多聚物二抗在免疫组化实验中的应用

为了验证本发明制备的一抗后试剂和多聚物二抗及其搭配使用的性能，选取宫颈癌切片进行以下免疫组化实验：

(1)将宫颈癌切片进行脱蜡、水化。

(2)使用Tris-EDTA，pH9.0抗原修复缓冲液，在高温常压下对组织抗原进行煮沸15min修复。待15min后关火，并将组织切片一直放在抗原修复缓冲液中冷却至室温。

(3)将冷却至室温的切片使用自来水涮洗。

(4)使用3％过氧化氢封闭组织切片上的内源性过氧化物酶，室温孵育10min。

(5)拿出染色架，倒掉塑料染色缸中的过氧化氢，加入自来水后放入染色架涮洗切片，涮洗3次，每次涮10下。

(6)画圈：使用无尘纸将切片上组织周围的水擦干，免疫组化笔在组织周围画圈，画好圈的片子浸泡在PBST中。

(7)一抗孵育：将切片排列在湿盒中，在切片上滴加适当稀释的靶点为CK5/6的免疫组化抗体(Cytokeratin 5/6Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody BX50144，Biolynx，3ml/管)3滴/张，液体将切片大小完全覆盖切片。室温孵育30min后，收集切片，在PBST中涮洗。

(8)一抗后孵育：将切片排列在湿盒中，在切片上滴加一抗后试剂，3滴/张，液体将切片大小完全覆盖切片组织，室温孵育15-20min后收集切片，在PBST中涮洗。

(9)二抗孵育：将切片排列在湿盒中，加入制备的多聚物二抗，3滴/张，液体将切片大小完全覆盖切片组织。室温孵育15-20min后收集切片，在PBST中涮洗。

(10)DAB显色：按照1：20的比例稀释DAB浓缩液为DAB显色工作液。将切片排列在湿盒中，在切片上滴加DAB显色工作液液100μL/张，液体将切片大小完全覆盖切片组织，显色1-5min，自来水冲洗终止显色。收集切片，在自来水中涮洗。

(11)苏木素复染：将切片放入苏木素工作液中，染色4min，用自来水涮洗除去多余的染料，后在PBST溶液中返蓝约1min。

(12)梯度酒精脱水、透明、封片。

(13)显微镜下观察染色结果。

免疫组化实验分为以下三组：

实验组1：将本发明制备的一抗后试剂与Advanced Biosystems品牌的二抗DonkeyAnti-Goat IgG(1523-07)进行搭配使用；

实验组2：将本发明制备的多聚物二抗与Advanced Biosystems品牌的Goat anti-Mouse+Rabbit IgG(H+L)specific(Broad)(1991-07)的一抗后试剂进行搭配使用；

实验组3：将本发明制备的一抗后试剂与多聚物二抗进行搭配使用；

第一对照组：Advanced Biosystems品牌的驴抗羊(1523-07)原配一抗后-二抗体系；

第二对照组：Advanced Biosystems品牌的羊抗鼠/兔(1991-07)原配一抗后-二抗体系。

结果如图6所示，可以看出在连续切片的宫颈癌组织切片中都出现了阳性胞浆染色，但是实验组1(图6A)、实验组2(图6B)和实验组3(图6C)的染色强度比第二对照组(图6E)更强，大大强于第一对照组(图6D)。并且，实验组3的染色强度比实验组1和实验组2更强。

实施例6 DAB显色液和苏木素工作液的优化

为了达到更好的染色效果，本实施例进一步对DAB显色液和苏木素工作液进行优化。

1.DAB显色液优化

(1)配制浓度为0.1M的Tris-Hcl缓冲液40mL，缓冲液中再依次加入1mL浓度为2M的咪唑溶液，1mL 0.4％的氯化铵溶液，1mL 30％的葡萄糖溶液。

(2)将250mg 3,3'-二氨基联苯胺粉末加入至3.1中的Tris-Hcl缓冲液中，加去离子水定容至50mL，即可获得20×DAB显色浓缩液，在使用前需要用0.1M的Tris-Hcl稀释至1×使用。

2.苏木素工作液

(1)在800mL去离子水中加入50g氯化钾、0.2g碘酸钠、1g柠檬酸形成苏木素缓冲液。

(2)再往苏木素缓冲液中加入1g苏木精粉末，完全溶解后加入去离子水定容至1L，即为苏木素工作液。

利用优化后的DAB显色液和苏木素工作液对肺鳞癌切片进行免疫组化实验，其中，一抗使用靶点为CK5/6的免疫组化抗体(Cytokeratin 5/6 Recombinant RabbitMonoclonal Antibody BX50144，Biolynx，3ml/管)，实验分为以下四组：

实验组：将本发明制备的一抗后-二抗体系与本实施例的DAB显色液和苏木素工作液进行搭配使用；

第一对照组：将本发明制备的一抗后-二抗体系与Advanced Biosystems品牌的DAB显色液(DAB Chromogen Kit,DAB)和苏木素工作液进行搭配使用；

第二对照组：将Advanced Biosystems品牌的一抗后-二抗体系(1991-07)与原配的DAB显色液(DAB Chromogen Kit,DAB)和苏木素工作液进行搭配使用。

第三对照组：将Advanced Biosystems品牌的一抗后-二抗体系(1991-07)与本实施例的DAB显色液和苏木素工作液进行搭配使用。

结果如图7所示，可以看出在连续切片的肺鳞癌组织切片中都出现了阳性胞浆染色，实验组(图7A)的染色强度比第一对照组(图7B)更强，大大强于第二对照组(图7C)和第三对照组(图7D)。第一对照组的染色强度比第二对照组和第三对照组更强。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种多抗组合物，其特征在于，包括第一多抗和第二多抗，所述第一多抗为羊抗兔多抗，所述第二多抗为羊抗鼠多抗。

2.权利要求1所述多抗组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)获取兔多抗和鼠多抗，分别与福氏免疫佐剂1:1混匀，注射混合物到山羊背部肌肉中进行免疫；

(2)每隔4周重复免疫一次，第八次免疫完之后取山羊血，离心后取上清获得的羊抗兔血清或羊抗鼠血清；

(3)将血清通过0.45μm滤膜后加入等体积PBS，混匀；。

(4)将羊抗兔血清或羊抗鼠血清通过纯化填料柱，再用等体积的pH8.0平衡缓冲液进行平衡；

(5)往纯化柱中加入pH 2.5的洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱3-5个柱体积后获得洗脱产物；

(6)往洗脱产物中加入10％体积的pH 12的Tris-Hcl中和缓冲液调整抗体pH值，获得纯化后的羊抗兔多抗血清或羊抗鼠多抗血清。

(8)将羊抗兔血清用保存缓冲液梯度稀释至0.08μg/mL，将羊抗鼠血清用保存缓冲液梯度稀释至0.35μg/mL；

(9)将稀释完成的羊抗鼠和羊抗兔血清按1:1的比例进行混合，混合完成即为多抗组合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述兔多抗和鼠多抗的制备方法如下：

(1)从未经免疫的3月龄新西兰大白兔中取血30mL，离心取上清获得兔血清，从未经免疫的小鼠中取血5mL，离心获得小鼠血清；

(2)将兔血清或小鼠血清通过0.45μm滤膜后加入等体积PBS，混匀；

(3)将兔血清和小鼠血清分别通过Protein A和Protein G偶联的纯化填料柱，再用等体积的pH 8.0平衡缓冲液进行平衡；

(4)往纯化柱中加入pH 2.5的洗脱缓冲液进行洗脱，洗脱3-5个柱体积后获得洗脱产物；

(5)再往洗脱产物中加入10％体积的pH 12的Tris-Hcl中和缓冲液，即获得兔多抗或鼠多抗。

4.一种能够结合权利要求1所述多抗组合物的第三多抗的Fab'片段，其特征在于，所述第三多抗为驴抗羊多抗，所述Fab'片段与多聚物偶联，所述多聚物上还结合有显色剂。

5.根据权利要求4所述的Fab'片段，其特征在于，所述显色剂选自荧光素、酶、金属离子、量子点和同位素中的一种。

6.权利要求1所述的多抗组合物和权利要求4-5任一所述的Fab'片段在制备二步法病理检测试剂盒中的应用。

7.一种二步法病理检测试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的多抗组合物和权利要求4或5所述的Fab'片段。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒进一步包括DAB显色液和/或苏木素工作液，优选地，

所述DAB显色液的制备方法如下：

(1)配制浓度为0.1M的Tris-Hcl缓冲液40mL，缓冲液中再依次加入1mL浓度为2M的咪唑溶液，1mL 0.4％的氯化铵溶液，1mL 30％的葡萄糖溶液，

(2)将250mg 3,3'-二氨基联苯胺粉末加入至(1)中的Tris-Hcl缓冲液中，加去离子水定容至50mL，获得20×DAB显色浓缩液，在使用前用0.1M的Tris-Hcl稀释至1×使用；

所述苏木素工作液的制备方法如下：

(1)在800mL去离子水中加入50g氯化钾、0.2g碘酸钠、1g柠檬酸形成苏木素缓冲液，

(2)再往苏木素缓冲液中加入1g苏木精粉末，完全溶解后加入去离子水定容至1L，即为苏木素工作液。

9.一种二步法病理检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将待检测组织切片进行脱蜡、水化、抗原修复、封闭，并浸泡在PBST中。

(7)一抗孵育：在切片上滴加兔单抗或鼠单抗，液体将切片大小完全覆盖切片，室温孵育30min后，收集切片，在PBST中涮洗；

(8)一抗后孵育：在切片上滴加权利要求1所述的抗体组合物，将切片大小完全覆盖切片组织，室温孵育15-20min后收集切片，在PBST中涮洗；

(9)二抗孵育：加入权利要求4或5所述的Fab'片段，液体将切片大小完全覆盖切片组织，室温孵育15-20min后收集切片，在PBST中涮洗；

(10)DAB显色：在切片上滴加DAB显色液，液体将切片大小完全覆盖切片组织，显色1-5min，自来水冲洗终止显色，收集切片，在自来水中涮洗。

(11)苏木素复染：将切片放入苏木素工作液中，染色4min，用自来水涮洗除去多余的染料，后在PBST溶液中返蓝约1min；

(12)梯度酒精脱水、透明、封片；

(13)显微镜下观察染色结果。

10.一种复合物，其特征在于，由生物样本、一抗、权利要求1所述的多抗组合物和权利要求4或5所述Fab'片段结合而成，其中，所述一抗为兔单抗和/或鼠单抗，

所述生物样本的抗原与所述兔单抗和/或鼠单抗结合；

所述兔单抗和/或鼠单抗与所述多抗组合物中的羊抗兔多抗和/或羊抗鼠多抗结合；

所述羊抗兔多抗和/或羊抗鼠多抗与所述Fab'片段结合。

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