CN111551709B

CN111551709B - 一种酶标二抗复合物及其制备方法

Info

Publication number: CN111551709B
Application number: CN202010402877.9A
Authority: CN
Inventors: 刘畅; 梁永波; 牛银银; 刘玲玲; 齐华
Original assignee: Henan Celnovtebio Biotechnology Inc
Current assignee: Henan Celnovtebio Biotechnology Inc
Priority date: 2020-05-13
Filing date: 2020-05-13
Publication date: 2021-04-02
Anticipated expiration: 2040-05-13
Also published as: CN111551709A

Abstract

本发明涉及一种酶标二抗复合物及其制备方法，属于免疫分析技术领域。本发明的酶标二抗复合物，包括聚合物骨架和标记酶，所述标记酶通过偶联剂连接在聚合物骨架上，所述标记酶上通过偶联剂连接有二抗抗体；所述聚合物骨架具有支链端部和与支链端部相连的中部分支结构，标记酶通过偶联剂连接在聚合物骨架的支链端部和中部分支结构上；所述聚合物骨架为超支化聚合物骨架。本发明的聚合物骨架的支链端部和中部分支结构均可连接偶联剂，有助于提高酶标二抗复合物的灵敏度，且酶和抗体的堆积方式，有利于提升聚合物中酶和抗体的聚合度，从而使得该酶标二抗复合物在免疫分析中的灵敏度大幅提升。

Description

一种酶标二抗复合物及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种酶标二抗复合物及其制备方法，属于免疫分析技术领域。

背景技术

免疫分析(Immunoassay)，即通过“抗体-抗原特异性结合”的原理，对样品内蛋白生物标记进行检测的方法。免疫分析因其高度的灵敏度和特异性，可广泛应用于各种生物样品的定性和定量分析。免疫分析的方法包括：酶联免疫(ELISA)，蛋白免疫印迹(Western-Blot)，免疫组织化学(Immunohistochemistry)，侧层流分析法(Lateral Flow Assay)，蛋白质芯片(Protein Array)，细胞免疫(Immunocytochemistry)等等。其中，“酶标二抗复合物”在免疫分析领域被广泛应用于生物标记的检测，其应用领域包括免疫组织化学、酶联免疫、细胞免疫和免疫印迹等，“酶标二抗复合物”的原理是通过复合物中的抗体特异性识别样本中的抗原靶标，再通过酶催化小分子底物聚沉并显色，显色结果可通过显微镜或光谱仪进行阅读。

目前，市场上基于“酶标二抗复合物”的免疫分析检测系统主要有简单“酶标二抗”、“卵白素-生物素-复合物”和“链式高分子-酶-抗体多聚物”这三种方式，具体为：

简单“酶标二抗”，即直接将单个二抗抗体和HRP酶进行化学偶联，简单“酶标二抗”的免疫检测原理如图1所示。由于抗体表面面积和官能团数量的限制，该方法仅能在一个抗体上标记最多三个HRP酶。由于该复合物的聚合度低下，灵敏度不足，故无法应用于很多低抗原表达量的样品。

“卵白素-生物素-复合物(Avidin-Biotin-Complex)”，以下简称ABC复合物，“卵白素-生物素-复合物”的免疫检测原理如图2所示，该方法基于“生物素-卵白素之间的高度亲和力”原理，通过“生物素标记二抗抗体”和“卵白素-生物素-酶复合物”的结合，形成多聚物，使得检测的灵敏度大幅提升。该方法的主要缺陷在于，核心的ABC复合物会和细胞组织中普遍存在的生物素结合，从而产生严重的非特异性染色，很大程度上干扰了结果的判读。因此，该方法目前在临床免疫分析中已被逐步淘汰。

“链式高分子-酶-抗体多聚物”的免疫检测原理如图3所示，该方法通过亲水性的链式高分子(例如葡聚糖，合成多肽等)来承载大量的酶和二抗抗体，从而使得检测灵敏度大幅提升，同时该方法也避免了在“ABC复合物”方法中所遇到的非特异性染色问题。例如，DAKO公司的产品DAKO EnVision^TM+二抗检测系统，就是在链式葡聚糖骨架上承载了大量过氧化物酶和二抗抗体，从而实现了高度灵敏和特异的免疫组织化学检测。目前，该方法是临床免疫组织化学检测中的主流选择。然而，该方法也并非完美无缺，其主要技术缺陷在于：(1)该方法采用葡聚糖链式聚合物骨架，其结构松散、流体动力学体积巨大，从而造成了极大的空间位阻，使得该聚合物对于细胞核膜的穿透力低下。因此，该聚合物对各种不同类型的抗原检测的表现参差不齐，特别是在一些细胞核内低表达抗原的检测中灵敏度不足；(2)该方法是直接将酶和完整抗体标记在链式骨架上，由于骨架上的表面积有限，酶和抗体的可标记数量受到了限制，因此灵敏度也无法进一步提升。

发明内容

本发明的目的在于提供一种酶标二抗复合物，该酶标二抗复合物具有良好的灵敏度。

本发明的第二个目的在于提供一种酶标二抗复合物的制备方法，该方法容易操作，可控性好。

本发明的技术方案如下：

一种酶标二抗复合物，所述酶标二抗复合物包括聚合物骨架和标记酶，所述标记酶通过偶联剂连接在聚合物骨架上，所述标记酶上通过偶联剂连接有二抗抗体；

所述聚合物骨架为超支化氨基化的聚二羟甲基丙酸酯，分子量为4000～50000g/mol，标记酶通过偶联剂连接在聚合物骨架的支链端部和中部分支结构上。

该聚合物骨架在支链端部和中部分支结构上都具备氨基活性基团并可进行偶联。超支化氨基化聚二甲羟基丙酸酯的分子量为4000g/mol～50000g/mol。聚合物骨架的分子量宜保持在所述范围内，分子量过小，则无法承载足量的酶和抗体，所制聚合物的灵敏度不足；而分子量过大，则造成聚合物的流体动力学体积过大，无法有效地穿透细胞膜，在某些细胞膜内染色的应用中灵敏度不足。

本发明的酶标二抗复合物，以支链端部和中部分支结构均可连接偶联剂的超支化聚合物骨架作为承载酶和抗体的骨架，与传统“链式葡聚糖”高分子骨架和只有支链末端具有活性基团的星形树枝状大分子骨架PAMAM相比，本发明的聚合物骨架具有更高的灵敏度，具体分析如下：(1)与传统“链式葡聚糖”高分子骨架相比，本发明的聚合物骨架可以使得酶和抗体的结合更加紧凑，降低其流体动力学体积，从而提升聚合物对细胞膜的穿透力，提升细胞膜内染色的灵敏度；(2)与星形树枝状大分子骨架PAMAM相比，星形树枝状大分子骨架PAMAM仅在每一个支链的末端具备氨基活性基团，得到的是内部没有连接酶和抗体的三维球状结构，可形象地看作为空心结构，本发明的聚合物骨架除了在每个支链的末端具备氨基活性基团以外，在其每个支链的中部——即三维结构的内部也密布着氨基活性基团，也就是说三维结构的内部也可以连接酶和抗体，可形象地看作是内部实心的三维球状结构，其酶的排列密度比星形树枝状大分子骨架结构更加紧密，更有利于提升灵敏度。

本发明的酶标二抗复合物，标记酶通过偶联剂连接在聚合物骨架上，标记酶上通过偶联剂连接有二抗抗体，这种酶和抗体的堆积方式，有利于提升聚合物中酶和抗体的聚合度，从而使得该酶标二抗复合物在免疫分析中的灵敏度大幅提升。传统方法是直接将酶和抗体标记在高分子骨架上，酶和抗体为了有限的骨架表面空间而发生竞争，使得聚合物的聚合度受到限制。本发明先将标记酶通过偶联剂连接在聚合物骨架上，使得标记酶占满骨架的表面空间，然后再将二抗抗体通过偶联剂连接在标记酶上，这种方式能够更加充分地利用骨架表面空间，将酶和抗体的聚合度大幅提升，从而提高酶标二抗复合物的灵敏度。

优选地，所述标记酶为辣根过氧化物酶和/或碱性磷酸酶。辣根过氧化物酶是免疫诊断中最常用的标记酶，在免疫诊断应用中占比达80％以上，优势为酶活性高，稳定性高，成本经济，故得到了大规模应用；碱性磷酸酶在免疫诊断应用中份额排第二，其优势为超高的反应活性，但是生产成本比过氧化物酶更高，且在标记反应中稳定性不如辣根过氧化物酶，故仅占20％左右的份额。酶的选择是根据免疫诊断的具体应用来决定的，不同的酶所能适用的显色底物及其显色机理也有区别。

为了缓解酶标二抗复合物制备时存在的安全隐患和环境污染问题，优选地，所述偶联剂为方酸二酯。方酸二酯可与超支化聚合物骨架、标记酶和二抗抗体上的氨基进行反应，从而能够将超支化聚合物骨架与标记酶进行偶联，也能够将标记酶和二抗抗体进行偶联，且具有以下优势：(1)方酸二酯为无毒的固体，不污染环境，不需要特殊条件，在开放试验台上即可进行反应，因此有助于简化操作，降低生产成本，更容易实现产品的工业化生产；(2)产率高，可控性好，不易因过度反应而发生聚合物过度交联的情况，因此，得到的产品的质量更加稳定。

优选地，所述方酸二酯为方酸二甲酯、方酸二乙酯、方酸二正丁酯中的一种或两种以上的组合。

优选地，所述二抗抗体为二抗抗体Fab'片段；所述二抗抗体Fab'片段是由以下方法制得的：二抗抗体Fab'2片段经二硫苏糖醇还原剂切断，形成分子量为50-55kDa的二抗抗体Fab'片段。相比完整的二抗抗体IgG(分子量150kDa左右)，二抗抗体Fab'片段的分子量仅在50-55kDa左右，更加小巧灵活，位阻小，可以更加容易地插入聚合物的表面的各种活性位点中，也有利于显著提高抗体的标记数量和密度，使得酶标二抗复合物在免疫分析中的灵敏度大幅提升。

该酶标二抗复合物涵盖的二抗抗体Fab'片段的种属较多，优选地，所述二抗抗体Fab'片段为兔抗鼠IgG-Fab'片段、鼠抗兔IgG-Fab'片段、羊抗鼠IgG-Fab'片段、羊抗兔IgG-Fab'片段、马抗鼠IgG-Fab'片段、马抗兔IgG-Fab'片段、鼠抗羊IgG-Fab'片段、兔抗羊IgG-Fab'片段、马抗羊IgG-Fab'片段、驴抗鼠IgG-Fab'片段、驴抗兔IgG-Fab'片段、鼠抗驴IgG-Fab'片段、兔抗驴IgG-Fab'片段、马抗驴IgG-Fab'片段或驴抗马IgG-Fab'片段。

一种酶标二抗复合物的制备方法，包括以下步骤：

(1)利用偶联剂对聚合物骨架进行活化，得到活化的聚合物骨架；

(2)步骤(1)得到的活化的聚合物骨架与标记酶进行偶联反应，得到负载酶的复合物；

(3)利用偶联剂对步骤(2)得到的负载酶的复合物进行活化，得到活化的负载酶的复合物；

(4)步骤(3)得到的活化的负载酶的复合物与二抗抗体进行偶联反应，得到酶标二抗复合物。

本发明的酶标二抗复合物的制备方法，只需要利用偶联剂对聚合物骨架进行活化，然后连接上标记酶，再利用偶联剂对标记酶进行活化，然后偶联上二抗抗体即得。该方法容易操作，可控性好，可按照预先设计的酶和抗体的堆积方式，将标记酶偶联在聚合物骨架上，然后将二抗抗体偶联在标记酶上。

优选地，步骤(1)中，所述活化反应的温度为10～35℃，所述活化反应的时间为2h。

为了促使更多的标记酶偶联在活化的聚合物骨架上，偶联反应时选择标记酶过量，优选地，步骤(2)中，所述活化的聚合物骨架与标记酶的摩尔比为1:10-1:100。

优选地，步骤(2)中，所述偶联反应的温度为10～35℃，所述偶联反应的时间为3h。

优选地，步骤(3)中，所述活化反应的温度为10～35℃，所述活化反应的时间为2h。

二抗抗体用量的选择需综合考虑成本因素和目标应用所需达到的聚合物性能。当二抗抗体相对于负载酶的复合物的质量比越高时，最终聚合物所能承载的二抗抗体数量就越多，相应的聚合物灵敏度也会提升。然而，这时抗体标记反应的转化率也会降低，由于原料的浪费，而使得成本升高。相反的，降低二抗抗体相对于负载酶的复合物的比例，会使得最终聚合物的灵敏度有所降低，但同时也能提高抗体标记反应的转化率，从而降低生产成本。从兼顾成本和检测灵敏度方面综合考虑，优选地，步骤(4)中，所述二抗抗体与负载酶的复合物的质量比为2:1-1:10。

优选地，步骤(4)中，所述偶联反应的温度为10～35℃，所述偶联反应的时间为1h。

以方酸二酯作为偶联剂、超支化氨基化聚二甲羟基丙酸酯作为骨架、二抗抗体Fab'片段作为二抗抗体为例，对制备方法的进行说明，方酸二酯偶联剂对表面含氨基的超支化骨架进行活化，活化产物经过脱盐可去除多余未反应的方酸二酯小分子，获得表面含方酸单酯的聚二甲羟基丙酸酯；该表面含方酸单酯的聚二甲羟基丙酸酯可以和表面含氨基的酶进行偶联反应，可获得负载酶的复合物，将负载酶的复合物经过方酸二酯偶联剂进一步活化和脱盐后，和二抗抗体Fab'片段进行孵育偶联，纯化后可得酶标二抗复合物。

二抗抗体Fab'片段是通过以下方法制得的：将商业化的二抗抗体Fab'2片段原料，经过二硫苏糖醇还原剂切断，可获取相应的二抗抗体Fab'片段。

附图说明

图1为简单“酶标二抗”的免疫检测原理；

图2为“卵白素-生物素-复合物”的免疫检测原理；

图3为“链式高分子-酶-抗体多聚物”的免疫检测原理；

图4为实施例1中Boltorn^TM H40的结构式；

图5为实施例1的酶标二抗复合物的免疫检测原理示意图；

图6为本发明实施例中超支化高分子骨架通过方酸二酯偶联化学和酶进行化学偶联的反应机理示意图；

图7为试验例2中三组样品在相同实验条件下的ELISA检测信号强度；

图8为试验例3中酶标二抗复合物在“人肾上腺皮脂腺瘤组织”样本中检测“突触素蛋白”的免疫组化染色结的显微图片；

图9为试验例3中对照样在“人肾上腺皮脂腺瘤组织”样本中检测“突触素蛋白”的免疫组化染色结果的显微图片；

图10为试验例3中酶标二抗复合物在“人阑尾组织”样本中检测“CD20蛋白”的显微图片；

图11为试验例3中对照样在“人阑尾组织”样本中检测“CD20蛋白”的显微图片；

图12为试验例3中酶标二抗复合物在“人乳腺组织”样本中检测“Her2蛋白”的显微图片；

图13为试验例3中对照样在“人乳腺组织”样本中检测“Her2蛋白”的显微图片；

图14为试验例3中酶标二抗复合物在“人胃组织”样本中检测“Ki67蛋白”的显微图片；

图15为试验例3中对照样在“人胃组织”样本中检测“Ki67蛋白”的显微图片；

图16为试验例3中酶标二抗复合物在“人扁桃体组织”样本中检测“BCL6蛋白”的显微图片；

图17为试验例3中对照样在“人扁桃体组织”样本中检测“BCL6蛋白”的显微图片；

图18为试验例3中酶标二抗复合物在“人结肠组织”样本中检测“CDX2蛋白”的显微图片；

图19为试验例3中对照样在“人结肠组织”样本中检测“CDX2蛋白”的显微图片；

图20为试验例4中实施例5制得的酶标二抗复合物和对照品在相同实验条件下的ELISA检测信号强度；

图21为试验例5中转移堆叠体的示意图；

图22为试验例5中实施例6制得的酶标二抗复合物和对照品在25ng-1.25ng CK20蛋白上样量区间内的信号强度对比图；

图23为试验例5中实施例6制得的酶标二抗复合物和对照品对染色胶片进行扫描和灰度分析所得结果对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。

本发明的实施例中，所使用的超支化氨基化聚二甲羟基丙酸酯的牌号为Boltorn^TMH40，分子量为19200g/mol，来自于：Polymer Factory公司，SKU：PFH-010412。

本发明的实施例中，所使用的辣根过氧化物酶来自于：Pierce^TM HorseradishPeroxidase，ThermoFisher Scientific公司，SKU:31490。

本发明的实施例中，所使用的羊抗鼠二抗抗体IgG-F(ab')2片段来自于：Abcam公司，SKU:ab98634。所使用的羊抗鼠二抗抗体IgG-Fab'片段是由羊抗鼠二抗抗体IgG-F(ab')2片段经二硫苏糖醇还原剂切断后形成。

本发明的实施例中，所使用的羊抗兔二抗抗体IgG-F(ab')2片段来自于：Abcam公司，SKU:ab98504。所使用的羊抗兔二抗抗体IgG-Fab'片段是由羊抗兔二抗抗体IgG-F(ab')2片段经二硫苏糖醇还原剂切断后形成。

本发明的实施例中，室温的范围为10～35℃。过夜是指12h。

一、本发明的酶标二抗复合物的具体实施例如下：

实施例1

本实施例的酶标二抗复合物，包括超支化氨基化聚二甲羟基丙酸酯Boltorn^TM H40和辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶通过方酸二乙酯连接在超支化氨基化聚二甲羟基丙酸酯Boltorn^TM H40上，辣根过氧化物酶上通过方酸二乙酯连接有羊抗鼠二抗抗体IgG-Fab'片段。

超支化氨基化聚二甲羟基丙酸酯Boltorn^TM在其支链端部和中部分支结构具有可与偶联剂偶联的氨基；氨基化的Boltorn^TM系列产品的结构示意图如图4所示。

本实施例的酶标二抗复合物的免疫检测原理示意图如图5所示，酶和抗体片段分层堆积在超支化氨基化聚二甲羟基丙酸酯骨架的表面。

实施例2

本实施例的酶标二抗复合物，包括超支化氨基化聚二甲羟基丙酸酯Boltorn^TM H40和辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶通过方酸二乙酯连接在超支化氨基化聚二甲羟基丙酸酯Boltorn^TM H40上，辣根过氧化物酶上通过方酸二乙酯连接有羊抗兔二抗抗体IgG-Fab'片段。

实施例3

本实施例的酶标二抗复合物，包括超支化氨基化聚二甲羟基丙酸酯Boltorn^TM H40和辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶通过方酸二乙酯连接在超支化氨基化聚二甲羟基丙酸酯Boltorn^TM H40上，辣根过氧化物酶上通过方酸二乙酯连接有羊抗鼠IgG-F(ab')2片段(Abcam公司，SKU:ab98634)。

实施例4

本实施例的酶标二抗复合物，包括超支化氨基化聚二甲羟基丙酸酯Boltorn^TM H40和辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶通过方酸二乙酯连接在超支化氨基化聚二甲羟基丙酸酯Boltorn^TM H40上，辣根过氧化物酶上通过方酸二乙酯连接有羊抗鼠IgG完整抗体(Abcam公司，SKU:ab6708)。

二、本发明的酶标二抗复合物的制备方法具体实施例如下：

本发明实施例中，超支化高分子骨架通过方酸二酯偶联化学和酶进行化学偶联的反应机理示意图如图6所示，图6中，R₁为烷基基团，如甲基，乙基，正丁基；由图6可知，方酸二酯与超支化高分子骨架上的氨基进行偶联，超支化高分子骨架上含有方酸单酯的官能团，其方酸单酯能够与酶上的氨基偶联，形成偶联产物，即为负载酶的复合物。酶和抗体偶联步骤的化学反应机理与此相似。

实施例5

本实施例的酶标二抗复合物的制备方法，制备的是实施例1的酶标二抗复合物，步骤如下：

(1)将1mg超支化氨基化聚二甲羟基丙酸酯Boltorn^TM H40于室温下溶解于2mL的PBS缓冲液(PH＝7.4)中。

(2)将3mg方酸二乙酯溶解于300μL的DMSO中，一边搅拌，一边将方酸二乙酯溶液全部滴加入步骤(1)得到的溶液中，在室温下搅拌反应2小时。

(3)将步骤(2)得到的反应物通过Sephadex G-25(GE Life Science，SKU:17003302)纯化柱，除去剩余的方酸二乙酯，并且将缓冲液置换为硼酸钠碱性缓冲液(0.5M，PH＝9)，获得表面含方酸单乙酯基团的超支化氨基化聚二甲羟基丙酸酯溶液，约4mL。

(4)将115mg辣根过氧化物酶以20mg/mL浓度溶于PBS缓冲液(PH＝7.4)，然后一边搅拌一边滴加入上述步骤(3)得到的表面含方酸单乙酯基团的超支化氨基化聚二甲羟基丙酸酯溶液中，室温搅拌反应3小时。在本步反应中，酶和高分子骨架的物质的量之比为50:1。

(5)将步骤(4)得到的溶液通过Superdex 200Prep Grade纯化柱(GE LifeScience，SKU:17104301-17104306)，除去未完全反应的辣根过氧化物酶，并将缓冲液置换为PBS缓冲液(PH＝7.4)，收集最先流出纯化柱的大分子组分，获得纯净的“Boltorn^TM H40-辣根过氧化物酶聚合物”溶液，即为负载酶的复合物溶液，约13mL。

(6)将2.7mg方酸二乙酯溶解于270μL的DMSO中。一边搅拌一边把方酸二乙酯溶液全部滴加入步骤(5)得到的负载酶的复合物溶液中，在25℃下反应2h，完成对辣根过氧化物酶表面的活化。之后，再次让溶液通过Sephadex G-25纯化柱，除去多余的方酸二乙酯，并将缓冲液置换为硼酸钠碱性缓冲液(0.5M，PH＝9)，获得表面经过方酸单乙酯活化的负载酶的复合物溶液，约17mL。

(7)将77mg羊抗鼠二抗抗体IgG-F(ab')2片段(Abcam公司，SKU:ab98634)在AmiconΜLtra-15 30K离心过滤器(EMD Millipore公司，SKU：UFC903024)中浓缩至10mg/mL，15mL。将70mg二硫苏糖醇溶解于2mL的PBS缓冲液中(PH＝7.4)，一边搅拌，一边将二硫苏糖醇溶液全部滴加入抗体溶液中。在37℃水浴中孵育30分钟后，将抗体溶液通过Sephadex G-25纯化柱，除去多余的二硫苏糖醇还原剂，获得纯净的羊抗鼠二抗抗体IgG-Fab'片段溶液，约20mL。

(8)将上述步骤(7)中获得的羊抗鼠二抗抗体IgG-Fab'片段溶液边搅边滴加入步骤(6)中获得的方酸单乙酯活化的负载酶的复合物溶液中，室温搅拌反应1小时。二抗抗体Fab'片段与负载酶的复合物的质量比为2:3。

(9)将步骤(8)得到的反应混合物通过Superdex 200Prep Grade尺寸排阻色谱，收集最先流出纯化柱的大分子聚合物组分，获得纯净的反应产物酶标二抗复合物，并将缓冲液置换为PBS缓冲液(PH＝7.4)，产物体积约45mL。

实施例6

本实施例的酶标二抗复合物的制备方法，制备的是实施例2的酶标二抗复合物，步骤如下：

(5)将步骤(4)得到的溶液通过Superdex 200Prep Grade纯化柱，除去未完全反应的辣根过氧化物酶，并将缓冲液置换为PBS缓冲液(PH＝7.4)，收集最先流出纯化柱的大分子组分，获得纯净的“Boltorn^TM H40-辣根过氧化物酶聚合物”溶液，即为负载酶的复合物溶液，约13mL。

(7)将77mg羊抗兔二抗抗体IgG-F(ab')2片段(Abcam公司，SKU:ab98504)在AmiconΜLtra-15 30K离心过滤器(EMD Millipore公司，SKU：UFC903024)中浓缩至10mg/mL，15mL。将70mg二硫苏糖醇溶解于2mL的PBS缓冲液中(PH＝7.4)，一边搅拌，一边将二硫苏糖醇溶液全部滴加入抗体溶液中。在37℃水浴中孵育30分钟后，将抗体溶液通过Sephadex G-25纯化柱，除去多余的二硫苏糖醇还原剂，获得纯净的羊抗兔二抗抗体IgG-Fab'片段溶液，约20mL。

(8)将上述步骤(7)中获得的羊抗兔二抗抗体IgG-Fab'片段溶液边搅边滴加入步骤(6)中获得的方酸单乙酯活化的负载酶的复合物溶液中，室温搅拌反应1小时。二抗抗体Fab'片段与负载酶的复合物的质量比为2:3。

实施例7

本实施例的酶标二抗复合物的制备方法，制备的是实施例3的酶标二抗复合物，与实施例5的不同之处仅在于，将羊抗鼠二抗抗体IgG-Fab'片段替换为羊抗鼠IgG-F(ab')2片段。

实施例8

本实施例的酶标二抗复合物的制备方法，制备的是实施例4的酶标二抗复合物，与实施例5的不同之处仅在于，将羊抗鼠二抗抗体IgG-Fab'片段替换为羊抗鼠IgG完整抗体。

三、相关试验例

试验例1

为了体现不同长度的二抗抗体对灵敏度的影响，本试验例分别利用羊抗鼠IgG-Fab’片段、羊抗鼠IgG-F(ab')2片段、羊抗鼠IgG完整抗体对实施例5步骤(6)所得的表面经过方酸单乙酯活化的负载酶的复合物溶液(3mL，其中过氧化物酶的浓度8mg/mL)进行标记，检测三种抗体的标记效率，并对标记效率进行了对比，以验证羊抗鼠IgG-Fab’片段相对于另外两种抗体(羊抗鼠IgG-F(ab')2片段、羊抗鼠IgG完整抗体)的优势，具体包括抗体的预处理步骤和标记步骤，得到的标记效率结果如表1所示。

(1)抗体的预处理

(a)羊抗鼠IgG-Fab’片段溶液

将14mg羊抗鼠二抗抗体IgG-F(ab')2片段(Abcam公司，SKU:ab98634)在Amicon ΜLtra-15 30K离心过滤器中浓缩至10mg/mL，1.4mL。将6.5mg二硫苏糖醇溶解于0.233mL的PBS缓冲液中(PH＝7.4)，一边搅拌，一边将二硫苏糖醇溶液全部滴加入抗体溶液中。在37℃水浴中孵育30分钟后，将抗体溶液通过Sephadex G-25纯化柱，除去多余的二硫苏糖醇还原剂，获得纯净的羊抗鼠二抗抗体IgG-Fab'片段溶液，约2mL，7mg/mL，即为羊抗鼠IgG-Fab’片段溶液。

(b)羊抗鼠IgG-F(ab')2片段溶液

将14mg羊抗鼠二抗抗体IgG-F(ab')2片段(Abcam公司，SKU:ab98634)在Amicon ΜLtra-15 30K离心过滤器中浓缩至2mL，约7mg/mL，即为羊抗鼠IgG-F(ab')2片段溶液。

(c)羊抗鼠IgG完整抗体溶液

将14mg羊抗鼠二抗抗体IgG(Abcam公司，SKU:ab6708)在AmiconΜLtra-15 30K离心过滤器中浓缩至2mL，约7mg/mL，即为羊抗鼠IgG完整抗体溶液。

(2)标记效率的比较

A组反应：取表面经过方酸单乙酯活化的负载酶的复合物溶液1mL，将步骤(a)中所得的羊抗鼠IgG-Fab’片段溶液边搅边滴加进其中，室温搅拌反应1小时。将反应混合物通过Superdex 200Prep Grade尺寸排阻色谱，收集最先流出纯化柱的大分子聚合物组分，获得纯净的反应产物酶标二抗复合物(Boltorn^TM H40-辣根过氧化物酶-羊抗鼠IgG-Fab'片段聚合物)，并将缓冲液置换为PBS缓冲液(PH＝7.4)，产物体积约5mL。收集后流出的未被反应的羊抗鼠IgG-Fab’片段，通过UV-Vis光谱仪计算其中抗体含量。

B组反应：取表面经过方酸单乙酯活化的负载酶的复合物溶液1mL，将步骤(b)中所得的羊抗鼠IgG-F(ab')2片段溶液边搅边滴加进其中，室温搅拌反应1小时。将反应混合物通过Superdex 200Prep Grade尺寸排阻色谱，收集最先流出纯化柱的大分子聚合物组分，获得纯净的反应产物酶标二抗复合物(Boltorn^TM H40-辣根过氧化物酶-羊抗鼠IgG-F(ab')2片段聚合物)，并将缓冲液置换为PBS缓冲液(PH＝7.4)，产物体积约5mL。收集后流出的未被反应的羊抗鼠IgG-F(ab')2片段，通过UV-Vis光谱仪计算其中抗体含量。

C组反应：取表面经过方酸单乙酯活化的负载酶的复合物溶液1mL，将步骤(c)中所得的羊抗鼠IgG完整抗体溶液边搅边滴加进其中，室温搅拌反应1小时。将反应混合物通过Superdex 200Prep Grade尺寸排阻色谱，收集最先流出纯化柱的大分子聚合物组分，获得纯净的反应产物酶标二抗复合物(Boltorn^TM H40-辣根过氧化物酶-羊抗鼠IgG聚合物)，并将缓冲液置换为PBS缓冲液(PH＝7.4)，产物体积约5mL。收集后流出的未被反应的羊抗鼠IgG完整抗体，通过UV-Vis光谱仪计算其中抗体含量。

表1 三种抗体的标记效率

注：成功标记的量＝反应物起始量-未反应的剩余量

由表1可知，当抗体反应物相对过量时，羊抗鼠IgG-Fab'片段能够达到的标记效率最高，即该羊抗鼠IgG-Fab'片段对表面经过方酸单乙酯活化的负载酶的复合物的可标记空间利用率最高，最有利于获得高灵敏度的产品。

试验例2

本试验例对试验例1中的三组酶标二抗复合物(A组：Boltorn^TM H40-辣根过氧化物酶-羊抗鼠IgG-Fab'片段聚合物；B组：Boltorn^TM H40-辣根过氧化物酶-羊抗鼠IgG-F(ab')2片段聚合物；C组：Boltorn^TM H40-辣根过氧化物酶-羊抗鼠IgG聚合物)在酶联免疫实验中的性能进行表征，详细实验步骤如下：

1.包被抗原

(1)用PBS缓冲液稀释“重组人CK20蛋白”抗原(Abcam公司，ab73640)至1μg/mL。

(2)在微量滴定板上，每个凹孔中滴加100μL抗原溶液。

(3)在37℃孵育2小时。

(4)甩干抗原溶液，每个凹孔用PBS-T(含0.05％吐温20，下同)缓冲液洗涤3次，甩干洗涤液。

2.一抗孵育

(1)用PBS-T缓冲液分别稀释“小鼠抗CK20单克隆抗体”(Abcam公司，货号：ab854)至1000ng/mL浓度。

(2)按表2中所示，在微量滴定板上从第1行1000ng/mL开始，对一抗溶液进行3倍逐级稀释至0.457μg/mL。

(3)室温孵育30分钟。

(4)甩干一抗溶液，每个凹孔用PBS-T(含0.05％吐温20，下同)缓冲液洗涤3次，甩干洗涤液。

3.二抗孵育

(1)用PBS-T缓冲液分别稀释试验例1所制备的酶标二抗复合物至表2中所示相应浓度，并按表2中区域划分在相应的凹孔中加入100μL二抗溶液。

(2)室温孵育30分钟。

(3)甩干二抗溶液，每个凹孔用PBS-T(含0.05％吐温20，下同)缓冲液洗涤3次，甩干洗涤液。

4.底物显色

(1)在每个凹孔内加入100μL即用型TMB显色底物100μL。

(2)室温孵育5分钟。

(3)在每个凹孔内加入50μL2M硫酸溶液，中止显色反应。

5.用酶标比色仪器记录结果，得到的结果如表2中所示；三组样品在相同实验条件下的ELISA检测信号强度如图7所示，图7中，CK20蛋白抗原包被浓度1μg/mL，一抗孵育浓度从1000ng/mL开始进行逐级稀释至0.457μg/mL，二抗孵育浓度为10ng/mL。

表2 三组抗体对应的酶标二抗复合物通过酶标比色仪器得到的结果

表2和图7结果显示，在相同操作及实验条件下，A组反应制备的“Boltorn^TM H40-辣根过氧化物酶-羊抗鼠IgG-Fab'抗体片段聚合物”在酶联免疫实验中的检测信号明显强于B组中制备的“Boltorn^TM H40-辣根过氧化物酶-羊抗鼠IgG-F(ab')2片段聚合物”，以及C组中制备的“Boltorn^TM H40-辣根过氧化物酶-羊抗鼠IgG聚合物”；而B组和C组聚合物之间的信号相差不大。本实验说明，Fab'片段标记法所产生的A组聚合物在三组中灵敏度最高。

试验例3

一、手工免疫组化时的标准操作流程，适用于实施例5和实施例6制得的酶标二抗复合物，具体步骤如下：

1.脱蜡、水化

(1)选取相应的石蜡包埋组织切片。

(2)将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。

(3)将切片置于无水乙醇中浸泡5分钟。

(4)将切片置于95％乙醇中浸泡5分钟。

(5)将切片置于70％乙醇中浸泡5分钟。

(6)将切片置于去离子水中浸泡5分钟。

2.热抗原修复

向高压锅中加入EDTA抗原修复液(PH9)，将上述切片浸泡其中，盖上高压锅盖，加热至沸腾，维持2.5分钟。停止加热，自然冷却10分钟，水浴冷却20分钟。打开锅盖，将切片转移至去离子水中浸泡5分钟。更换去离子水，再将切片浸泡5分钟。

3.内源性过氧化物酶封闭

(1)用PBS缓冲液冲洗切片，甩干PBS缓冲液。

(2)向组织上滴加0.1mL的内源性过氧化物酶封闭剂，室温孵育5分钟。

(3)用PBS缓冲液冲洗切片。

(4)将切片置于PBS缓冲液中浸泡5分钟，更换PBS后再浸泡5分钟。

4.一抗孵育

(1)甩干PBS缓冲液。

(2)向组织上滴加0.1mL相应的一抗抗体，确保一抗溶液覆盖整个组织。

(3)室温孵育1小时。

(4)用PBS缓冲液冲洗切片。

(5)将切片置于PBS缓冲液中浸泡5分钟，更换PBS后再浸泡5分钟。

5.二抗孵育

(1)甩干PBS缓冲液。

(2)向组织上滴加0.1mL相应的二抗聚合物试剂，确保二抗溶液覆盖整个组织。

(3)室温孵育30分钟。

(4)用PBS缓冲液冲洗切片。

6.DAB显色

(1)配置DAB显色液：将1滴DAB底物溶液滴加入1mLDAB缓冲液中，混匀待用。

(2)甩干PBS缓冲液。

(3)向组织上滴加0.1mL的DAB显色液。

(4)室温孵育5分钟。

(5)用去离子水冲洗切片。

(6)将切片置于去离子水中浸泡5分钟，更换去离子水再浸泡5分钟。

7.苏木素衬染

(1)甩干去离子水。

(2)向组织上滴加0.1mL苏木素染液。

(3)室温孵育5分钟。

(4)用去离子水冲洗切片。

(5)将切片置于去离子水中浸泡5分钟，更换去离子水再浸泡5分钟。

8.脱水、透明、封片

(1)将切片置于70％乙醇中浸泡5分钟。

(2)将切片置于95％乙醇中浸泡5分钟。

(3)将切片置于无水乙醇中浸泡5分钟。

(4)将切片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟。

(5)将切片从溶剂中取出，平铺，在组织上滴加0.05mL中性树酯，盖上盖玻片。放置于化学通风橱中过夜风干。

9.在显微镜下观察组织形态，判定染色结果。

二、实施例5制得的酶标二抗复合物的性能

为了评价实施例5所制备的酶标二抗复合物在免疫组织化学实验中的特异性和灵敏度。我们采用了实施例5制得的酶标二抗复合物以1:500的稀释比配制所得的工作液，并以美国DAKO公司的多聚体酶标羊抗鼠二抗产品EnVision+System-HRP Labeled PolymerAnti-Mouse(货号：K4000)作为对照样。本实验中，采用经福尔马林固定及石蜡包埋的组织样本，包括人肾上腺皮质素瘤组织，人阑尾组织，人乳腺组织。本实验所采用的操作步骤依照本试验例(一)所述的手工免疫组化标准操作流程。除酶标二抗复合物以外其他试剂均采用河南赛诺特生物技术有限公司的目录产品。通过对比实施例5所制备的酶标二抗复合物和对照样产品在多个项目中的染色强度，说明本发明实施例5所制备的酶标二抗复合物在特异性相当的前提下，灵明度更高，具体分析如下：

(1)图8为实施例5制得的酶标二抗复合物在“人肾上腺皮脂腺瘤组织”样本中检测“突触素蛋白”的免疫组化染色结果的显微图片，图9为对照样在“人肾上腺皮脂腺瘤组织”样本中检测“突触素蛋白”的免疫组化染色结果的显微图片，图8和图9分别为实施例5制得的酶标二抗复合物和对照样在同样操作程序和实验条件下在“人肾上腺皮脂腺瘤组织”样本中检测“突触素蛋白”的免疫组化染色结果，结果表明在相同实验条件下，实施例5制得的酶标二抗复合物的染色强度明显强于对照样。

(2)图10为实施例5制得的酶标二抗复合物在“人阑尾组织”样本中检测“CD20蛋白”的显微图片，图11为对照样在“人阑尾组织”样本中检测“CD20蛋白”的显微图片，图10和图11分别为实施例5制得的酶标二抗复合物和对照样在同样操作程序和实验条件下在“人阑尾组织”样本中检测“CD20蛋白”的免疫组化染色结果。结果表明，在相同实验条件下，实施例5制得的酶标二抗复合物的染色强度明显强于对照样。

(3)图12为实施例5制得的酶标二抗复合物在“人乳腺组织”样本中检测“Her2蛋白”的显微图片，图13为对照样在“人乳腺组织”样本中检测“Her2蛋白”的显微图片，图12和图13分别为实施例5制得的酶标二抗复合物和对照样在同样操作程序和实验条件下在“人乳腺组织”样本中检测“Her2蛋白”的免疫组化染色结果。结果表明，在相同实验条件下，实施例5制得的酶标二抗复合物的染色强度明显强于对照样。

三、实施例6制得的酶标二抗复合物的性能

为了评价实施例6所制备的酶标二抗复合物在免疫组织化学实验中的特异性和灵敏度。我们采用了实施例6制得的酶标二抗复合物以1:500的稀释比配制所得的工作液，并以美国DAKO公司的多聚体酶标羊抗兔二抗产品EnVision+System-HRP Labeled PolymerAnti-Rabbit(货号：K4002)作为对照样。本实验中，采用经福尔马林固定及石蜡包埋的组织样本，包括人胃组织，人扁桃体组织，人结肠组织。本实验所采用的操作步骤依照本试验例(一)所述的手工免疫组化标准操作流程。除酶标二抗复合物以外其他试剂均采用河南赛诺特生物技术有限公司的目录产品。通过对比实施例6所制备的酶标二抗复合物和对照样产品在多个项目中的染色强度，说明本发明实施例6所制备的酶标二抗复合物在特异性相当的前提下，灵明度更高，具体分析如下：

(1)图14为实施例6制得的酶标二抗复合物在“人胃组织”样本中检测“Ki67蛋白”的显微图片，图15为对照样在“人胃组织”样本中检测“Ki67蛋白”的显微图片，图14和图15分别为实施例6制得的酶标二抗复合物和对照样在同样操作程序和实验条件下在“人胃组织”样本中检测“Ki67蛋白”的免疫组化染色结果。结果表明，在相同实验条件下，实施例6制得的酶标二抗复合物的染色强度明显强于对照样。

(2)图16为实施例6制得的酶标二抗复合物在“人扁桃体组织”样本中检测“BCL6蛋白”的显微图片，图17为对照样在“人扁桃体组织”样本中检测“BCL6蛋白”的显微图片，图16和图17分别为实施例6制得的酶标二抗复合物和对照样在同样操作程序和实验条件下在“人扁桃体组织”样本中检测“BCL6蛋白”的免疫组化染色结果。结果表明，在相同实验条件下，实施例6制得的酶标二抗复合物的染色强度明显强于对照样。

(3)图18为实施例6制得的酶标二抗复合物在“人结肠组织”样本中检测“CDX2蛋白”的显微图片，图19为对照样在“人结肠组织”样本中检测“CDX2蛋白”的显微图片，图18和图19分别为实施例6制得的酶标二抗复合物和对照样在同样操作程序和实验条件下在“人结肠组织”样本中检测“CDX2蛋白”的免疫组化染色结果。结果表明，在相同实验条件下，实施例6制得的酶标二抗复合物的染色强度明显强于对照样。

试验例4

本试验例对实施例5制得的酶标二抗复合物在酶联免疫实验中的性能表现进行检测。采用了实施例5制得的酶标二抗复合物，并以英国Abcam公司的产品“羊抗鼠二抗(H+L)-HRP聚合物”(货号：ab205719)作为对照品。在相同的实验条件下，本发明实施例5制得的酶标二抗复合物的显色信号强度明显强于对照品，说明其灵敏度更高，详细实验步骤如下：

1.包被抗原

(1)用PBS缓冲液稀释“脂肪壁酸”抗原(Sigma Aldrich公司，货号：L2515)至1μg/mL。

(2)在微量滴定板上，每个凹孔中滴加100μL抗原溶液。

(3)在常温下孵育过夜。

2.一抗孵育

(1)用PBS-T缓冲液分别稀释“小鼠抗脂肪壁酸单克隆抗体”(Invitrogen公司，货号：MA1-7402)至表1中所示浓度。

(2)按表1中所示的浓度和区域划分，在每个凹孔中滴加一抗溶液100μL。

(3)室温孵育45分钟。

3.二抗孵育

(1)用PBS-T缓冲液分别稀释实施例5制得的酶标二抗复合物及对照品聚合物至表3中所示相应浓度。如表3中所示，从300ng/mL的开始，对相应二抗聚合物进行3倍逐级稀释至0.412ng/mL；最后一行不加，作为阴性对照组。

(2)室温孵育45分钟。

4.底物显色

(1)在每个凹孔内加入100μL即用型TMB显色底物(Thermo Fisher公司，货号：34022)100μL。

(2)室温孵育10分钟。

(3)在每个凹孔内加入50μL的2M硫酸溶液，中止显色反应。

5.用酶标比色仪器记录结果，得到的结果如表3中所示；实施例5制得的酶标二抗复合物和对照品在相同实验条件下的ELISA检测信号强度如图20所示，图20中，脂肪壁酸抗原包被浓度1μg/mL，一抗孵育浓度500ng/mL，二抗孵育浓度为从300μg/mL开始进行3倍逐级稀释至0.412μg/mL。

表3 实施例5制得的酶标二抗复合物和对照品通过酶标比色仪器得到的结果

表3和图20结果显示，在相同操作及实验条件下，本发明实施例5制得的酶标二抗复合物在酶联免疫实验中的检测信号明显强于对照品，说明其灵敏度更高。

试验例5

本试验例对实施例6制得的酶标二抗复合物在蛋白免疫印迹(Western-Blotting)实验中的性能表现进行检测。采用了实施例6制得的酶标二抗复合物，并以英国Abcam公司的产品“羊抗兔二抗(H+L)-HRP聚合物”(货号：ab205718)作为对照品。在相同的实验条件下，实施例6制得的酶标二抗复合物的显色信号强度明显强于对照品，说明其灵敏度更高。详细实验步骤如下：

1.样品制备

(1)向“重组人CK20蛋白”样品(Abcam公司，ab73640)中加入等体积的样品缓冲液，配方如下：4％SDS、20％甘油、0.004％溴酚蓝，余量为0.125M Tris-HCl(PH＝6.8)。

(2)将上述混合物在95度下煮5分钟，进行蛋白变性。

2.上样和电泳

(1)分别将以下量的CRM197蛋白样品和分子量标准依次上样到SDS-PAGE凝胶孔中：

实验组(用于测试实施例6制得的酶标二抗复合物)：-20ng，10ng，5ng，2.5ng，1.25ng，分子量标准。

对照组(用于测试对照品的Abcam聚合物)：-20ng，10ng，5ng，2.5ng，1.25ng，分子量标准。

SDS-PAGE凝胶采用GenScript公司SurePAGE^TM蛋白预制梯度胶，Bis-Tris，4-12％，15孔(货号：M00654)。

(2)在150V下电泳1小时

3.蛋白转移

(1)制备转移堆叠体如图21所示。

(2)在100V下电泳20分钟，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上。

4.抗体染色

(1)用封闭液在室温下封闭膜1小时。封闭液配方如下：5％奶粉、0.05％Tween20，溶解于PBS缓冲液中，PH＝7.4。

(2)将“兔抗CK20抗体(Abcam公司，SKU：ab64090)”在PBS-T缓冲液中稀释到2μg/mL。把膜放入抗体溶液中常温孵育2小时。

(3)用PBS-T缓冲液洗涤膜3次，每次5分钟。

(4)将本发明所实施例6制得的酶标二抗复合物和“羊抗兔二抗(H+L)-HRP聚合物”分别于封闭液中稀释到1μg/mL。把膜按照对应二抗区域裁剪成两段，分别放入两种二抗溶液中，常温孵育1小时。

(5)用PBS-T缓冲液洗涤膜3次，每次5分钟。

5.显色

使用BioRad公司的Clarity Wstern ECL Substrate(货号：170-5060)进行显色反应，具体步骤遵照该产品说明书。

6.使用BioRad ChemiDoc XRS仪器进行影像采集，并将曝光好的胶片用扫描仪扫描，用图像处理系统进行灰度值分析。

实验结果如图22和图23所示，图22的结果表明，在相同实验条件下，在25ng-1.25ng CK20蛋白上样量区间内，采用实施例6制得的酶标二抗复合物进行检测的信号比Abcam聚合物信号更强。图23为对染色胶片进行扫描和灰度分析所得结果，结果表明，在25ng至1.25ng上样量区间内，用实施例6制得的酶标二抗复合物进行检测所得信号和用Abcam聚合物检测所得信号相比，强度在7.42倍至12.0倍之间。

Claims

1.一种酶标二抗复合物，其特征在于，所述酶标二抗复合物包括聚合物骨架和标记酶，所述标记酶为辣根过氧化物酶和/或碱性磷酸酶，所述标记酶通过偶联剂连接在聚合物骨架上，所述标记酶上通过偶联剂连接有二抗抗体；所述二抗抗体为二抗抗体Fab'片段，二抗抗体Fab'片段的分子量在50-55kDa；

所述聚合物骨架为超支化氨基化的聚二羟甲基丙酸酯，分子量为4000~50000g/mol，标记酶通过偶联剂连接在聚合物骨架的支链端部和中部分支结构上。

2.根据权利要求1所述的酶标二抗复合物，其特征在于，所述偶联剂为方酸二酯。

3.根据权利要求2所述的酶标二抗复合物，其特征在于，所述方酸二酯为方酸二甲酯、方酸二乙酯、方酸二正丁酯中的一种或两种以上的组合。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的酶标二抗复合物，其特征在于，所述二抗抗体Fab'片段是由以下方法制得的：二抗抗体Fab'2片段经二硫苏糖醇还原剂切断，形成分子量50-55kDa的二抗抗体Fab'片段。

5.根据权利要求4所述的酶标二抗复合物，其特征在于，所述二抗抗体Fab'片段为兔抗鼠IgG-Fab'片段、鼠抗兔IgG-Fab'片段、羊抗鼠IgG-Fab'片段、羊抗兔IgG-Fab'片段、马抗鼠IgG-Fab'片段、马抗兔IgG-Fab'片段、鼠抗羊IgG-Fab'片段、兔抗羊IgG-Fab'片段、马抗羊IgG-Fab'片段、驴抗鼠IgG-Fab'片段、驴抗兔IgG-Fab'片段、鼠抗驴IgG-Fab'片段、兔抗驴IgG-Fab'片段、马抗驴IgG-Fab'片段或驴抗马IgG-Fab'片段。

6.一种如权利要求1-5中任一项所述的酶标二抗复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）利用偶联剂对聚合物骨架进行活化，得到活化的聚合物骨架；

（2）步骤（1）得到的活化的聚合物骨架与标记酶进行偶联反应，得到负载酶的复合物；

（3）利用偶联剂对步骤（2）得到的负载酶的复合物进行活化，得到活化的负载酶的复合物；

（4）步骤（3）得到的活化的负载酶的复合物与二抗抗体进行偶联反应，得到酶标二抗复合物。

7.根据权利要求6所述的酶标二抗复合物的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，所述活化的聚合物骨架与标记酶的摩尔比为1:10 - 1:100。

8.根据权利要求6或7所述的酶标二抗复合物的制备方法，其特征在于，步骤（4）中，所述二抗抗体与负载酶的复合物的质量比为2:1 - 1:10。