CN113391059B - 一种micropolymer-HRP-纳米抗体复合物及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种micropolymer‑HRP‑纳米抗体复合物及其制备方法。本发明提供的micropolymer‑HRP‑纳米抗体复合物中的micropolymer、HRP及纳米抗体均经过不同化学修饰获得，其中所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明提供的复合物极大减小了免疫组化二抗的体积，提高了其分子运动能力和穿透能力，提高了其染色强度和染色灵敏度，同时提高了免疫组化二抗批次间的稳定性。
Description
技术领域
本发明属于免疫分析技术领域，具体涉及一种micropolymer-HRP-纳米抗体复合物及其制备方法。
背景技术
免疫组织化学(Immunohistochemistry)是利用抗原与抗体的特异性结合原理和特殊的标记技术，通过化学反应使标记了荧光素、酶、金属离子、同位素的二抗在显示剂的作用下显色，以此来对组织细胞内的特异性抗原进行定位、定性及相对定量检测的技术。免疫组化(IHC)染色对肿瘤的判定和用药指导有极其重要的意义，在医院病理科进行的肿瘤免疫组化分析对肿瘤分子分型至关重要，精准的肿瘤分型检测有利于指导患者精准用药，提高治疗效果，减少毒副作用。对国内52家三甲医院病理科免疫组化染色仪市场的调查中发现，Ventana(95/195),Leica(46/195)和Dako(37/195)这三家国外公司占有了约94％的国内市场份额，国内市场基本上被这3加国外公司垄断。
免疫组化二抗技术的发展主要经历了以下几个阶段：
第一、直接法。直接法是将酶标记的一抗直接与组织或细胞中相应的抗原结合，再用显色剂显色观察抗原抗体反应部位，此方法简便、易于操作，但由于信号放大效率弱，敏感度低，目前已很少应用。
第二、间接法。检测原理如图1所示，间接法首先通过一抗与组织或细胞中相应的抗原结合，再通过酶标二抗与一抗结合，再用显色剂显色观察抗原抗体反应部位。由于通过一个或多个二抗与一抗的不同抗原表位结合，使每个靶点上有更多的酶分子结合从而放大了信号，比直接法具有更高的敏感度，由于标记的二抗可通用，更为经济。但是由于一个二抗上最多可以标记3个酶分子，此方法的信号放大效率虽然较直接法有所提高，但是仍然很弱，不能满足病理诊断的要求，故此方法在临床诊断上已被淘汰。
第三、酶标链霉卵白素-生物素染色法。检测原理如图2所示，该方法基于“生物素-链霉卵白素之间的高度亲和力”原理，通过“生物素标记二抗”和“链霉卵白素-生物素-酶复合物”的结合，形成多聚物，使得检测的灵敏度大幅提升。该方法的主要缺陷在于，核心的ABC复合物会和细胞组织中普遍存在的生物素结合，从而产生严重的非特异性染色，很大程度上干扰了结果的判读。因此，该方法目前在临床免疫分析中已被逐步淘汰。
第四、酶标多聚物染色法。检测原理如图3所示，该法是将酶标记在以惰性葡聚糖为骨架的主链上，形成葡聚糖酶复合物，每一条葡聚糖主链上大约可连接4-70个酶分子及1-10个抗体分子，改系统可同时连接抗兔、抗鼠的二抗，能够与兔或鼠来源的一抗结合。由于使用非生物素检测系统，从而避免了内源性生物素引起的非特异性染色，且其灵敏度可与酶标链霉卵白素-生物素染色法相媲美，故此方法是目前临床应用的主流方法。DAKO公司的产品DAKO EnVisionTM+二抗检测系统，就是在链式葡聚糖骨架上连接了大量过氧化物酶和二抗抗体，从而实现了高度灵敏和特异的免疫组织化学检测。目前，该方法是临床免疫组织化学检测中的主流选择。然而，该方法也并非完美无缺，其主要技术缺陷在于：该方法采用分子量≥50万葡聚糖聚合物骨架，连接了4-70个酶分子及1-10个抗体分子，其结构松散、流体动力学体积巨大，从而造成了极大的空间位阻，使得该聚合物对于细胞核膜的穿透力低下。因此，该聚合物对各种不同类型的抗原检测的表现参差不齐，特别是在一些细胞核内低表达抗原的检测中灵敏度不足。
申请号为201610013923.X的中国发明专利，主要改进的地方在于采用紧凑的PAMAM Dendrimer做骨架，克服目前使用链状高分子(比如以葡聚糖或多肽)为载体的多聚体酶标方法的主要缺陷，极大地缩小了多聚体酶的体积，提高抗体上酶标的密度，使单位体积内连接到二抗上的酶的数目大幅度增加。但是，此技术存在两个不足之处：一是制备过程中多次使用剧毒的二甲亚砜做偶联试剂，既危害人体健康，又危害环境；二是制备时采用的二抗为多抗，多抗需要通过免疫动物获得，生产周期长，过程复杂，批次之间生产可控性较差，且多抗跟其它抗体交叉反应较强，容易导致非特异性的背景染色。
申请号为202011221677.X的中国发明专利，提供了一种小多聚体酶-抗体片段，以树枝状聚合物作为骨架，使连接到骨架上的酶更为紧凑，减小了空间占位，然后将其与半抗体偶联，使抗体的质量和体积减半，最后用异双功能偶联试剂，将小多聚酶复合体与抗体片段的特定位点连接；最终制成的抗体片段虽然具有提高组织渗透能力，有效降低染色背景的优点，但是这种小多聚体酶-抗体片段容易影响染色灵敏度，破坏免疫组化二抗批次间的稳定性。
发明内容
针对现有技术普遍存在的缺陷，本发明提供了一种micropolymer-HRP-纳米抗体复合物及其制备方法。本发明提供的复合物极大减小了免疫组化二抗的体积，提高了其分子运动能力和穿透能力，提高了其染色强度和染色灵敏度；同时提高了免疫组化二抗批次间的稳定性。
为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种micropolymer-HRP-纳米抗体复合物，所述纳米抗体是通过噬菌体展示技术获得，可以同时靶向小鼠和家兔IgG，亲和力高，特异性强，且与Human IgG没有交叉反应(图13)；其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
QVQLVESGGGLVQTGGSLNLSCVASGTYRIDPMACWHRPPPKERELFAVITTDGQTTYSDYSKGGLFISSTNINNTAELLMMNLLTDDDSVYYCNLRNLRIGFNYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO.1)；
优选地，所述micropolymer可以为聚酰胺-胺型树枝状高分子化合物(包括聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM1.0代、聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM2.0代、聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM3.0代、聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM4.0代、聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM5.0代、聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM6.0代)、分子量为2000～40000的氨基葡聚糖、分子量为2000～40000的超支化氨基化聚二羟甲基丙酸酯或分子量为2000～40000的多聚赖氨酸中的一种。
优选地，所述micropolymer为PAMAM4.0代、分子量20000的氨基葡聚糖或分子量9600的超支化氨基化聚二羟甲基丙酸酯中的一种。
本发明还提供了一种所述micropolymer-HRP-纳米抗体复合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、将辣根过氧化物酶通过化学修饰，让其带有功能基团A，获得带有功能基团A的HRP；
S2、将micropolymer通过化学修饰，让其带有功能基团B，获得带有功能基团B的micropolymer；
S3、将步骤S1制得的带功能基团A的HRP与步骤S2制得的带功能基团B的micropolymer反应，得到micropolymer-HRP复合物；
S4、纳米抗体通过化学修饰，让其带有功能基团C，获得带有功能基团C的纳米抗体；
S5、将步骤S3制得的micropolymer-HRP复合物通过化学修饰，让其带有功能基团D，获得带有功能基团D的micropolymer-HRP复合物；
S6、带步骤S4制得的带有功能基团C的纳米抗体与步骤S5制得的带功能基团D的micropolymer-HRP复合物反应，即得。
优选地，步骤S1所述的功能基团A为巯基、醛基、马来酰亚胺基团或N-羟基琥珀酰亚胺中的一种；优选为巯基(-SH)或醛基(-CHO)；
优选地，步骤S2所述的功能基团B为巯基、氨基或马来酰亚胺基团中的一种；优选为氨基(-NH2)和马来酰亚胺基团(-MAL)；
优选地，步骤S4所述的功能基团C为巯基或马来酰亚胺基团中的一种；优选为巯基(-SH)；
优选地，步骤S5的功能基团D为巯基或马来酰亚胺基团中的一种；优选为马来酰亚胺基团(-MAL)；
优选地，步骤S3、步骤S6所述的反应条件为于25℃下反应24h。
优选地，每个步骤S3制得的micropolymer-HRP复合物中含有2-20个HRP。
需要注意的是，如果选择的micropolymer本身具有可利用的功能基团B，则无需进行步骤S2所述的对micropolymer的化学修饰过程。
与现有技术相比，本发明提供的micropolymer-HRP-纳米抗体复合物及其制备方法具有如下优点：
(1)本发明提供的micropolymer-HRP复合物，是以低分子量的micropolymer做骨架，采用分子量为常规二抗的10％～20％的纳米抗体做二抗制备的原料，极大的减小了免疫组化二抗的体积，提高了其分子运动能力和穿透能力，提高了其染色强度和染色灵敏度；
(2)本发明选择的纳米抗体，是目前已知最小的可结合抗原的抗体分子，其分子量约为15KD，与传统抗体相比，纳米抗体本身具有相对分子质量小、亲和力高、稳定性高、溶解性好、免疫原性低、穿透力强、能够在大肠杆菌中大量表达等优势，用于本发明中，能够同时靶向兔和鼠单抗，将其应用到免疫组化二抗的制备上，减少整个二抗的体积；同时，纳米抗体与其它种属的交叉反应极低，用它制备的二抗染色背景极低；
(3)本发明所述的纳米抗体，可以通过原核表达批量生产，批次间生产稳定性高，用它作为原料制备出来的免疫组化二抗批次间稳定性也比传统的用多克隆抗体作为原料制备出来的免疫组化二抗高。
附图说明
图1为间接法免疫组化二抗检测原理示意图；
图2为酶标链霉卵白素-生物素染色法检测原理示意图；
图3为酶标多聚物染色法检测原理示意图；
图4为实施例1中二抗复合物在扁桃体组织P63靶点检测结果；
图5为实施例2中二抗复合物在扁桃体组织P63靶点检测结果；
图6为实施例3中二抗复合物在扁桃体组织P63靶点检测结果；
图7为实施例4中二抗复合物在扁桃体组织P63靶点检测结果；
图8为实施例5中二抗复合物在扁桃体组织P63靶点检测结果；
图9为实施例6中二抗复合物在扁桃体组织P63靶点检测结果；
图10为DAKO即用型二抗在扁桃体组织P63靶点检测结果；
图11为实施例2中二抗复合物在结肠组织CK20靶点检测结果；
图12为DAKO即用型二抗在结肠组织CK20靶点检测结果；
图13为纳米抗体对鼠IgG1和IgG2a、兔IgG1、Human IgG亲和力检测结果；
图14～图16为三批不同批次的羊抗兔多抗合成的免疫组化二抗同时检测同一个组织的切片的检测结果图；
图17～图19是三批不同批次的纳米抗体合成的免疫组化二抗同时检测同一个组织的切片的检测结果图；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。本实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域常规技术方法和仪器说明书内容进行操作；所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1一种micropolymer-HRP-纳米抗体复合物
所述micropolymer-HRP-纳米抗体复合物中的纳米抗体是通过噬菌体展示技术获得，可以同时靶向小鼠和家兔IgG；其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
QVQLVESGGGLVQTGGSLNLSCVASGTYRIDPMACWHRPPPKERELFAVITTDGQTTYSDYSKGGLFISSTNINNTAELLMMNLLTDDDSVYYCNLRNLRIGFNYWGQGTQVTVSS(SEQ ID NO.1)；
所述micropolymer为分子量40000的氨基葡聚糖。
所述micropolymer-HRP-纳米抗体复合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、称取辣根过氧化物酶100mg，加入50mM PBS(10mM EDTA，pH 8.0)10mL，混匀使HRP充分溶解，然后称取2mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐加入上述反应液中，25℃反应1小时，然后将反应后的溶液过PD-10脱盐柱后，即得巯基修饰的HRP；
S2、称取10mg分子量为40000的氨基葡聚糖，加入1mL 10mM PBS，pH7.4溶解，称取2mg NHS-PEG4-MAL(活性酯聚乙二醇马来酰亚胺)加入氨基葡聚糖溶液中，25℃反应4小时，将反应后的氨基葡聚糖溶液过PD-10脱盐柱后，即得MAL修饰的氨基葡聚糖；
S3、将步骤S1制得的巯基修饰的HRP与步骤S2制得的MAL修饰的氨基葡聚糖混合在一起，25℃反应24小时，将反应得到的“氨基葡聚糖-HRP”复合物用GE公司生产的SephacrylS-200填料纯化，平衡缓冲液用10mM PBS，pH7.4，收集第一个主峰，即得“氨基葡聚糖-HRP”复合物；
S4、称取百英生物公司开发的同时靶向兔和鼠单抗的纳米抗体冻干粉10mg，加入50mM PBS(含10mM EDTA，pH 8.0)1.5mL，混匀使其充分溶解，然后称取1mg 2-亚氨基硫烷盐酸盐加入上述反应液中，25℃反应1小时，将反应后的溶液过PD-10脱盐柱后，即得巯基修饰的纳米抗体；
S5、称取2mg NHS-PEG4-MAL加入步骤S3最终制得的“氨基葡聚糖-HRP”复合物中，25℃反应4小时，然后将反应后的“氨基葡聚糖-HRP”复合物过PD-10脱盐柱后，即得MAL修饰的氨基葡聚糖-HRP；
S6、带步骤S4制得的巯基修饰的纳米抗体与步骤S5制得的MAL修饰的氨基葡聚糖-HRP混合在一起，25℃反应24小时，反应液过GE公司生产的Sephacryl S-200填料纯化，平衡缓冲液用10mM PBS，pH7.4，收集第一个主峰，即得。
实施例2一种micropolymer-HRP-纳米抗体复合物
所述micropolymer-HRP-纳米抗体复合物中的纳米抗体与实施例1相同，所述micropolymer为聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM4.0代。
所述micropolymer-HRP-纳米抗体复合物的制备方法与实施例1类似；
与实施例1的区别在于，实施例2中用聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM4.0代取代分子量为40000的氨基葡聚糖。
实施例3一种micropolymer-HRP-纳米抗体复合物
所述micropolymer-HRP-纳米抗体复合物中的纳米抗体与实施例1相同，所述micropolymer为分子量为19100的超支化氨基化聚二羟甲基丙酸酯。
所述micropolymer-HRP-纳米抗体复合物的制备方法与实施例1类似；
与实施例1的区别在于，实施例3中用分子量为19100的超支化氨基化聚二羟甲基丙酸酯取代分子量为40000的氨基葡聚糖。
实施例4一种micropolymer-HRP-纳米抗体复合物
所述micropolymer-HRP-纳米抗体复合物中的纳米抗体与实施例1相同，所述micropolymer为分子量为40000的多聚赖氨酸。
所述micropolymer-HRP-纳米抗体复合物的制备方法与实施例1类似；
与实施例1的区别在于，实施例4中分子量为40000的多聚赖氨酸取代分子量为40000的氨基葡聚糖。
实施例5一种micropolymer-HRP-纳米抗体复合物
所述micropolymer-HRP-纳米抗体复合物中的纳米抗体与实施例1相同，所述micropolymer为分子量为40000的氨基葡聚糖。
所述micropolymer-HRP-纳米抗体复合物的制备方法，包括如下步骤：
S1、称取辣根过氧化物酶100mg，加入pH 5.0的醋酸缓冲液10mL，混匀使HRP充分溶解，称取10mg高碘酸钠溶于1mL水中，然后将其加入上述反应液中，25℃反应0.5小时，将PD-10脱盐柱用0.1M、pH9.5的碳酸缓冲液平衡，然后将反应后的溶液PD-10脱盐柱，即得醛基修饰的HRP；
S2、称取10mg分子量为40000的氨基葡聚糖，加入醛基修饰的HRP溶液中，垂直混合，室温反应4小时，获得反应液，称取15mg硼氢化钠溶于1.5mL0.1M pH9.5的碳酸缓冲液，然后将其全部加入反应液中，加入后25℃反应2小时，加入1M的乙醇胺溶液1mL，25℃反应1小时，结束反应，将反应后的样品用GE公司生产的Sephacryl S-200填料纯化，平衡缓冲液用10mM PBS，pH7.4，收集第一个主峰，即得“氨基葡聚糖-HRP”复合物；
S3、称取百英生物公司开发的同时靶向兔和鼠单抗的纳米抗体冻干粉10mg，加入50mM PBS(含10mM EDTA,pH 8.0)1.5mL，混匀使其充分溶解，称取1mg2-亚氨基硫烷盐酸盐加入上述反应液中，25℃反应1小时，将反应后的溶液过PD-10脱盐柱后，即得巯基修饰的纳米抗体；
S4、称取2mg NHS-PEG4-MAL加入步骤S3所得的“氨基葡聚糖-HRP”复合物中，25℃反应4小时，将反应后的“氨基葡聚糖-HRP”复合物过PD-10脱盐柱后，即得MAL修饰的氨基葡聚糖-HRP；
S5、带步骤S3制得的巯基修饰的纳米抗体与步骤S4制得的带功能基团D的micropolymer-HRP复合物混合在一起，25℃反应24小时，反应液过GE公司生产的SephacrylS-200填料纯化，平衡缓冲液用10mM PBS，pH7.4，收集第一个主峰，即得。
实施例6一种micropolymer-HRP-纳米抗体复合物
所述micropolymer-HRP-纳米抗体复合物中的纳米抗体与实施例1相同，所述micropolymer为聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM4.0代。
所述micropolymer-HRP-纳米抗体复合物的制备方法与实施例5类似；
与实施例5的区别在于，实施例6用聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM4.0代取代分子量为40000的氨基葡聚糖。
试验例
本发明生产的小分子多聚HRP酶标纳米抗体用于免疫组化病理标本染色有比市场上现有的链状多聚体酶标联二抗具有更高的灵敏度以及更好的稳定性。以下应用实例均采用相同的操作步骤进行，除了对照二抗采用DAKO即用型二抗(SM802)之外，其它试剂全部使用自产试剂，使用实例详细操作步骤如下：
(1)实验方式：采用广州安必平的半自动免疫组化仪进行操作，排除手工操作的干扰；
(2)脱蜡及抗原修复：将组织切片放入安必平的全自动抗原修复仪上(型号：LBP-5196-II)进行，实验参数为：烤片：65℃，30分钟；脱蜡I:10分钟；脱蜡II：10分钟；酒精I：3分钟；酒精II：3分钟；抗原修复：97℃，20分钟；
(3)封闭及后续所有步骤全部由广州安必平免疫组化染色仪(型号：LBP-5548)自动进行，仪器实验参数为：双氧水封闭：仪器默认；一抗：加入150μL，30±3℃孵育30分钟；二抗：加入150μL，30±3℃孵育20分钟；DAB：加入150μL，30±3℃孵育5分钟；苏木素:仪器默认；
(4)脱水：取出上述切片，分别在如下液体中浸泡3分钟：75％的酒精，95％的酒精，100％的酒精；
(5)封片：取出上述切片，在抽风柜中吹干，在每张切片上滴加一滴中性树胶封片剂，盖上盖玻片，放置在通风橱内吹干10分钟；
(6)阅片：在显微镜下观察染色效果。
应用实例1：本次实验采用扁挑体组织，检测靶点为P63，在同样的操作步骤下，分别采用实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6和DAKO即用型二抗(SM802)进行实验，实验结果显示实施例2(图5)和实施例6(图9)染色强度明显强于DAKO即用型二抗(图10)，其它实施例1(图4)、实施例3(图6)、实施例4(图7)、实施例5(图8)略强于DAKO即用型二抗(图10)。
应用实例2：本次实验采用结肠组织，检测靶点为CK20，在同样的操作步骤下，采用应用实例1中评测最好的实施例2制备的二抗和DAKO即用型二抗(SM802)进行实验，实验结果显示实施例2(图11)的染色强度明显强于DAKO即用型二抗(图12)。
应用实例3：本次实验采用同一个蜡块连续切片的结肠组织，检测靶点为CK20，在同样的操作步骤下，采用实施例2的方法，以3个不同批次的羊抗兔多抗为原料制备3个批次的二抗，然后将这3个批次的二抗进行实验，实验结果显示以不同批次的羊抗兔多抗为原料制备的二抗，批次间染色强度差异较大，如图14～图16。
应用实例4：本次实验采用同一个蜡块连续切片的结肠组织，检测靶点为CK20，在同样的操作步骤下，采用实施例2的方法，以3个不同批次的自研纳米抗体为原料制备3个批次的二抗，然后将这3个批次的二抗进行实验，实验结果显示用不同批次的纳米抗体为原料制备的二抗，发现批次间染色强度差异较小，且染色强度比羊抗兔合成的二抗染色强度强；如图17～图19。
应用实例5：纳米抗体对Mouse IgG1、Mouse IgG2a、Rabbit IgG1和Human-IgG结合能力检测。分别用Mouse IgG1、Mouse IgG2a、Rabbit IgG1和Human-IgG包被酶标板，首孔2.5μg/mL，四倍梯度稀释，末孔空白，4℃过夜。第二天用PBST洗3-5次，拍干后每孔加350μL酶标板包被封闭液，37℃封闭1h，用PBST洗3-5次，拍干后每孔加100μL HRP标记的纳米抗体(1mg/mL，1:2000稀释使用)，37℃孵育1h，用PBST洗3-5次，拍干后每孔加100μL TMB，37℃避光反应5-10min，最后每孔加50μL 2M硫酸终止显色，读取450nm处的吸光值。结果如图13所示，HRP标记的原核表达的抗小鼠和家兔IgG纳米抗体与Mouse IgG1、Mouse IgG2a、RabbitIgG1都有结合，与Human IgG都没有结合。
需要说明的是，尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。
序列表
<110> 泰州市百英生物科技有限公司
<120> 一种micropolymer-HRP-纳米抗体复合物及其制备方法
<130> 2021.6.7
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 116
<212> PRT
<213> 纳米抗体(Nanobody)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Thr Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Asn Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Thr Tyr Arg Ile Asp Pro
20 25 30
Met Ala Cys Trp His Arg Pro Pro Pro Lys Glu Arg Glu Leu Phe Ala
35 40 45
Val Ile Thr Thr Asp Gly Gln Thr Thr Tyr Ser Asp Tyr Ser Lys Gly
50 55 60
Gly Leu Phe Ile Ser Ser Thr Asn Ile Asn Asn Thr Ala Glu Leu Leu
65 70 75 80
Met Met Asn Leu Leu Thr Asp Asp Asp Ser Val Tyr Tyr Cys Asn Leu
85 90 95
Arg Asn Leu Arg Ile Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
Claims (8)
1.一种micropolymer-HRP-纳米抗体复合物，其特征在于，所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述micropolymer为分子量为40000的氨基葡聚糖、聚酰胺-胺型树枝状高分子PAMAM4.0代、分子量为40000的多聚赖氨酸、分子量为19100的超支化氨基化聚二羟甲基丙酸酯中的一种。
2.权利要求1所述micropolymer-HRP-纳米抗体复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将辣根过氧化物酶通过化学修饰，让其带有功能基团A，获得带有功能基团A的HRP；
S2、将micropolymer通过化学修饰，让其带有功能基团 B，获得带有功能基团 B的micropolymer；
S3、将步骤S1制得的带功能基团A的HRP与步骤S2制得的带功能基团B的micropolymer反应，得到micropolymer-HRP复合物；
S4、纳米抗体通过化学修饰，让其带有功能基团C，获得带有功能基团C的纳米抗体；
S5、将步骤S3制得的micropolymer-HRP复合物通过化学修饰，让其带有功能基团D，获得带有功能基团D的micropolymer-HRP复合物；
S6、带步骤S4制得的带有功能基团 C的纳米抗体与步骤S5制得的带功能基团 D的micropolymer-HRP复合物反应，即得。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1所述的功能基团A为巯基、醛基、马来酰亚胺基团或N-羟基琥珀酰亚胺中的一种。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S2所述的功能基团B为巯基、氨基或马来酰亚胺基团中的一种。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S4所述的功能基团C为巯基或马来酰亚胺基团中的一种。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S5的功能基团D为巯基或马来酰亚胺基团中的一种。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3、步骤S6的反应条件为于25℃下反应24h。
8.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S3制得的micropolymer-HRP复合物中含有2-20个HRP。
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