CN114113605B - 用于脑瘤术中快速免疫组化的多聚酶-抗体组合 - Google Patents

Abstract

本发明的发明名称为用于脑瘤术中快速免疫组化的多聚酶‑抗体组合。本申请涉及用于脑瘤术中快速免疫组化的多聚酶‑抗体偶联物及其组合，包含所述多聚酶‑抗体偶联物或其组合的试剂盒，以及它们在癌症例如脑瘤诊断中的应用。

Description

用于脑瘤术中快速免疫组化的多聚酶-抗体组合

技术领域

本发明主要涉及用于肿瘤的快速鉴别和肿瘤分型，具体地涉及手术中脑瘤的快速鉴别和肿瘤分型以及确定肿瘤组织手术切除边际阴性的多聚酶-抗体偶联物及其组合、包含该多聚酶-抗体偶联物和/或其组合的试剂盒及其应用、以及使用其的鉴别方法。

发明背景

手术中快速精确鉴别肿瘤对于最佳脑肿瘤切除的重要性

全球每年发生的原发性脑瘤的人数约为250,000人。根据脑肿瘤的组织细胞形态和生长速率，将其从低(I)到高(IV)恶性分级。手术切除脑肿瘤是治疗的第一选择，并且通常是低度脑肿瘤的唯一治疗方法。切除脑肿瘤可降低颅内压以缓解症状，并减少需要通过后续放射治疗或化学疗法治疗的肿瘤块体积。一般需要尽最大的努力在手术过程中清除侵袭性脑肿瘤，否则残留的侵袭性癌细胞会继续生长导致肿瘤复发，从而降低患者的整体生存率。但是，当肿瘤浸润周边脆弱的功能性正常脑组织后，完全清除脑瘤变得几乎不可能^[1]。目前，术前影像学定位和术中精确鉴别肿瘤对于促进最佳肿瘤切除是必需的选择^[2]。大多数非侵入性的脑影相扫描仅能将将大脑肿瘤块精确地定位在毫米级水平。手术过程中仍然需要在组织细胞水平上通过组织形态进行鉴别性癌症诊断，以使外科医生做出切除与否的重要决定。对于恶性脑癌尤其如此。具有百年历史的术中冰冻切片上的苏木精和伊红组织和细胞染色当今仍然是必要的，并且是目前术中脑肿瘤鉴别诊断和边际确定的主要方法。

术中冰冻切片苏木精和伊红染色的固有质量缺陷

在冰冻切片上用苏木精和伊红染色载玻片来鉴定肿瘤的方法仅能依靠病理学家通过在显微镜下进行组织细胞学形态目测检查。因此，冰冻切片组织的苏木精和伊红染色质量一直是决定术中冰冻切片癌症诊断准确性的主要限制因素。本质上，冷冻切片苏木精和伊红染色技术存在两个难以克服的固有问题。第一个问题是冻结产生的缺陷。脑组织的柔软性质和组织冷冻过程中的高水分含量将冰晶引入组织，导致在整个组织内形成冷冻伪影，从而扭曲了细胞形态。例如，冷冻组织经常在少突胶质细胞瘤的核轮廓中产生不规则性，使其看起来与星形细胞瘤相似，因而难以进行区分。冷冻切片苏木精和伊红染色的第二个固有问题是，由于其非特异性化学染色性质，无法分辨基于分子水平差异的组织学结构。这些固有的缺陷给基于冰冻切片的组织形态做诊断的临床病理学家带来了巨大的挑战和负担，他们在很短的时间内仅能够依赖显微组织学形态识别和区分癌症组织。例如，在冷冻切片苏木精和伊红染色方面，区分脑膜瘤、周围神经鞘瘤和梭形细胞增殖是非常困难的。区分反应性神经胶质增生和低度神经胶质瘤是外科神经病理学中最困难的鉴别诊断挑战之一^[3]。脑外科手术中需要明确地区分转移性癌、脑膜瘤、髓母细胞瘤、胶质瘤、具有IDH1R132H突变的神经胶质瘤、星形细胞瘤、继发性胶质母细胞瘤等，单一的依靠苏木精和伊红的冰冻切片化学染色无法胜任这些脑瘤组织类型的快速鉴别。

尝试改善脑肿瘤术中诊断的努力

1)相干拉曼散射显微镜技术可将自发拉曼信号放大10,000倍，可进行实时组织学成像，而无需进行组织处理、切片和染色^[4]。这种脑组织成像技术展示了与冰冻切片苏木精和伊红染色结果的某些一致性^[4]。但是该技术特异性有限，未能普遍应用。

2)快速蒸发电离质谱是一项新兴技术，可通过分析电外科解剖过程中释放的气溶胶，对体内人体组织进行近实时表征。仪器仍然非常昂贵。仪器性能是否可以超过冰冻切片苏木精和伊红染色还有待观察^[5]。

3)用于脑肿瘤实时组织病理学成像的共聚焦显微术是另一种体内成像技术，它依赖于肿瘤特异性荧光造影剂。其在术中解释中的作用仍有待评估^[6]。

4)使用聚辣根过氧化物酶(polyHRP)标记的抗细胞角蛋白的二抗进行快速免疫组化可以在20分钟内完成术前哨淋巴结免疫组织化学(IHC)染色^[7]。Dako(加利福尼亚州，卡平特里亚)推出了快速免疫组化染色试剂盒EnVision，其可在37℃下在约20分钟内对冰冻切片进行染色。其使用标记二抗的二步法染色比直接法增加了一步染色程序，需要更多时间。但根据Mohs诊所应用的反馈信息，实际过程需要45分钟左右。

5)对于低细胞浸润性胶质瘤，术中冰冻切片苏木精和伊红染色由于染色非特异性和低色差导致鉴别分析很困难。已经开发出了快速灵敏的基因分型法，用于检测体细胞单核苷酸异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)，实时PCR检测IDH1突变，以及质谱法检测2-羟基戊二酸，突变体IDH的代谢物。该方法在60分钟内显示结果。

虽然如上所述的技术进展从不同的角度促进了脑肿瘤术中评估，但仍以冰冻切片苏木精和伊红染色手术作为基准来比较，以显示在某些苏木精和伊红染色困难病例中的有限改善。

现有技术中对于多聚酶抗体偶联物的研究和应用

为了得到多聚酶与抗体直接偶联，从而得到更大的显色信号放大，前期多个发明描述了许多具体制备和偶联多聚酶与抗体的方法。例如专利CN1300942A描述了多种制备方法，其应用聚焦之一是在溶液之中的免疫测定，其聚焦之二则是在常规石蜡包埋的组织切片上进行免疫组化染色，但仅仅染色孵育时间就超过60分钟，染色速度太慢，因而无法应用于术中检测。欧洲专利EP0175560A2描述了抗体与多种酶偶联成多聚酶-抗体的制备方法，用于抗体与抗原结合的定量测定。但是该专利所描述的免疫结合反应的测定均在溶液中无阻碍地进行。在生物组织的免疫组化染色与在溶液中的免疫反应截然不同，抗体以及抗体偶联物面临组织的复杂和不规则的空间阻碍，很多抗体可以在溶液中与抗原结合轻易进行反应，却无法与组织内的抗原结合进行反应，因此不能将在溶液中的免疫反应简单和直接地推广到对生物组织进行免疫组化的染色，其中技术上的跨越并非显而易见。CN 1945333A公开了一种乳腺癌淋巴结转移快速免疫组化检测试剂及应用该试剂的检测方法，通过将直接标有可将转移癌细胞与淋巴结固有细胞区别分开的多种抗体混合成试剂，经一步反应，特异性使淋巴结中的转移癌细胞着色。该技术的特点在于通过多聚酶与多种乳腺癌转移阳性抗体混合偶联来增加对应位于组织内的抗原密度，从而实现增加多聚酶信号放大增益，但是该方法仍然需要15-20分钟来实现术中诊断乳腺癌淋巴结转移。

因此，对于来自脑瘤组织的样本检测而言，仍然需要更加准确且可靠的方法来进行更快速地鉴别。(1)为了显著提高脑肿瘤术中诊断的准确性，必须在特定分子水平上的组织学特征上，特异性地增强染色信号；(2)所有这些检测过程都必须在少于10-15分钟时间内完成，以满足术中检测的时间限制；(3)必须具有多个具有分子特异染色的试剂形成抗体组合，根据这些抗体组合染色的结果才能更准确地鉴别多种肿瘤分型。

鉴于上述，本发明通过优化多聚酶与抗体直接偶联分子量的分布和随机多样性实现对单个抗原的高灵敏和高速度的染色，并以多种与脑瘤相关的多聚酶与抗体的直接偶联物形成脑瘤术中必要的诊断组合，满足了上述需要，并且实现了过去难以做到的脑瘤手术中免疫组化鉴别诊断。

发明内容

本发明采用多聚酶直接偶联抗体，进而由多个特定抗体的多聚酶-抗体偶联物构成快速鉴别肿瘤的配套抗体组合，在脑瘤手术中实施冰冻组织切片上的快速精确免疫组化染色。

在一方面，本发明提供了多聚酶与抗体形成的多聚酶-抗体偶联物。在本发明的多聚酶-抗体偶联物中，每个多聚酶-抗体偶联物可以包含：(i)一个或多个多聚酶，(ii)识别目标分析物的抗体。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，多聚酶-抗体偶联物包括多个多聚酶。在一些实施方式中，多聚酶-抗体偶联物包括多个酶分子，各个多聚酶-抗体偶联物包括不同数目的酶分子。在一些实施方式中，多聚酶-抗体偶联物包括多个多聚酶，其中多个多聚酶之中的各多聚酶的酶分子数目可以相同或不同。在一些实施方式中，多聚酶-抗体偶联物包括多个多聚酶，其中多个多聚酶的组合结构可以有差异。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物可以包含多个多聚酶和抗体，其中各个多聚酶包含数目不一的酶分子，所述偶联物的分子量大小形成多散型分布，该多散型分布以每个多聚酶抗体偶联物的分子量为约400kDa至约2,000kDa为特征。该多散型分布是指在如上所定义的分子量范围内的各个区间的多聚酶-抗体偶联物的数目不为零。例如，在400-600kDa间其数目占整个分子量范围数目的约2％-8％，例如4％、5％、6％、7％或8％，优选地4％-6％；在600-800kDa之间占约5％-10％，例如6％、7％、8％、9％或10％，优选地7％-9％；在800-1000kDa之间占6％-13％，例如7％、8％、9％、10％、11％或12％，优选地9％-11％；在1000-1200kDa之间占7％-14％，例如8％、9％、10％、11％、12％、13％或14％，优选地9％-12％；在1200-1400kDa之间占9-16％，例如9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％，优选地11％-13％；在1400-1600kDa之间占10-18％，例如10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％，优选地12％-14％；在1600-2000kDa之间占12-18％，例如12％、13％、14％、15％、16％、17％或18％，优选地13％-15％。更具体地，本发明的多聚酶-抗体偶联物的分子量可以为300kDa至约10,000kDa，优选地，400kDa至约10,000kDa、400kDa至约5,000kDa、500kDa至约5,000kDa或750kDa至约5,000kDa，在该范围内各个区间内均有不同分子量，且偶联物的分子量形成如上所述的多散型分布。在一个实施方式中，多聚酶-抗体偶联物的三维结构在各个分子量区间内呈现随机分布，例如，在400kDa至约8,00kDa区间内包含随机不同三维结构的多聚酶-抗体偶联物；在800kDa至约1,200kDa区间内包含另外类型的随机不同三维结构的多聚酶-抗体偶联物；在1,200kDa至约1,600kDa区间内包含其它类型的随机不同三维结构的多聚酶-抗体偶联物；在1,600kDa至约2,000kDa区间内包含其它类型的随机不同三维结构的多聚酶-抗体偶联物，其中在上述四个区间内的多聚酶-抗体偶联物所包含的三维结构可以各不相同的。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物可以含有多个多聚酶，各个多聚酶-抗体偶联物中多聚酶总数含有各不相同数目的酶分子，如可以含有8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、50、60、70、80、90、100、120、140、150、160、180、200、220、240和/或250个酶分子，或上述数目中的一个或多个的酶分子。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物的分子量的分布在各个分子量区间是不均一的且其三维结构的构成是随机的。例如，本发明的多聚酶-抗体偶联物的三维结构的构成是随机的且在各个各个分子量区间各不相同。在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物包括多个酶分子或多聚酶，其中所述多个酶分子或多聚酶可以包括相同或不同的酶类型。例如本发明的多聚酶-抗体偶联物中的所有酶分子或多聚酶都可以是辣根过氧化物酶。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，用于本发明的多聚酶-抗体偶联物的多聚酶的酶分子可以包括辣根过氧化物酶(HRP)、β-D-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、荧光素酶、乳酸脱氢酶、或半乳糖氧化酶等。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的示例性多聚酶-抗体偶联物包括多聚过氧化物酶-Pan-CK抗体偶联物、多聚过氧化物酶-GFAP抗体偶联物、多聚过氧化物酶-EMA抗体偶联物、和多聚过氧化物酶-突触蛋白抗体偶联物。

在一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物可以由多聚酶与抗体通过共价连接形成。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物可以包含初级抗体(或一抗)。在一些实施方式中，所述初级抗体可以包括全长抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、或抗体融合蛋白、或其抗原结合片段。在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，所述初级抗体可以包括靶向本发明的目标抗原和其相关的疾病如癌症的抗体或其抗原结合片段。在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，所述初级抗体可以选自靶向本发明的目标抗原和其相关的疾病如癌症的抗体或其抗原结合片段。在进一步的实施方式中，所述癌症包括或选自脑肿瘤，如脑胶质瘤、神经胶质瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、神经鞘膜瘤、颅内神经上皮肿瘤、脊索瘤；神经内分泌细胞肿瘤，包括嗅觉细胞肿瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、垂体腺瘤；转移性肿瘤；少突胶质细胞瘤、IDH1突变瘤、星形细胞肿瘤、雪旺氏细胞瘤、脉络丛神经瘤、脉络丛神经瘤、乳头状肿瘤、纺锤形肿瘤、非典型的类畸形/类瘤。在根据上述任何实施方式的更进一步实施方式中，所述初级抗体或抗原结合片段可以包括抗Pan-CK、抗GFAP、抗EMA、抗突触蛋白(Synatophysin)、抗CD34抗体或其抗原结合片段中的一种或多种，例如其中的任意两种、三种、四种、或五种。在根据上述任何实施方式的更进一步实施方式中，所述初级抗体或抗原结合片段可以包括抗Pan-CK、抗GFAP、抗EMA、抗突触蛋白(Synatophysin)、抗CD34抗体或其抗原结合片段中的一种或多种，例如其中的任意两种、三种、四种、或五种。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，用于本发明的多聚酶-抗体偶联物的多聚酶分子可以经由交联试剂共价地连接。在一些实施方式中，多聚酶的酶分子可以直接共价地连接。在一些实施方式中，多聚酶的酶分子以线性方式共价地连接。在一些实施方式中，多聚酶的酶分子以分支方式共价地连接。在一些实施方式中，多聚酶的酶分子以混合的线性和分支方式共价地连接。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，用于本发明的多聚酶-抗体偶联物的多聚酶可以具有大约300kDa至大约5兆道尔顿(MDa)的分子量。在一些实施方式中，多聚酶具有至少大约500kDa的分子量。在一些实施方式中，多聚酶具有小于或大约5MDa的分子量。在一些实施方式中，多聚酶具有至少大约750kDa的分子量。在一些实施方式中，多聚酶具有至少大约1、2、3或4MDa的分子量。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，多聚酶在被偶联至抗体之前首先形成。

在另一方面，本发明提供了多聚酶-抗体偶联物的组合，其包括多种如上所述的多聚酶-抗体偶联物，例如两种、三种、四种、或五种不同的多聚酶-抗体偶联物。优选地，本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合包括抗Pan-CK、抗GFAP、抗EMA、抗突触蛋白(Synatophysin)、抗CD34抗体或其抗原结合片段的多聚酶-抗体偶联物，或由其组成。

在本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中，各多聚酶-抗体偶联物可以包含：(i)一个或多个多聚酶，(ii)识别目标分析物的抗体。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，在本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中的各多聚酶-抗体偶联物可以包括多个酶分子或多个多聚酶，其中所述多个酶分子或多个多聚酶可以包括相同或不同的酶类型，例如本发明的多聚酶-抗体偶联物中的所有酶分子或多聚酶均可以是辣根过氧化物酶。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，在本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中，多聚酶的酶分子可以包括辣根过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、荧光素酶、乳酸脱氢酶、半乳糖氧化酶等。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中的各个多聚酶-抗体偶联物包含初级抗体和多聚酶，其中所述初级抗体可以包括全长抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或抗体融合蛋白、或抗原结合片段。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中的各个多聚酶-抗体偶联物包含初级抗体和多聚酶，其中所述各个多聚酶-抗体偶联物中的初级抗体包含针对不同抗原的抗体。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中的各多聚酶-抗体偶联物包含初级抗体和多聚酶，所述初级抗体可以包括或选自靶向不同的目标抗原和其相关的疾病如癌症的抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方式中，所述癌症包括或选自：脑肿瘤，如脑胶质瘤、神经胶质瘤、少突胶质细胞瘤、IDH1突变瘤、星形细胞肿瘤、雪旺氏细胞瘤、脉络丛神经瘤、脉络丛神经瘤、乳头状肿瘤、纺锤形肿瘤、非典型的类畸形/类瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、神经鞘膜瘤、颅内神经上皮肿瘤、脊索瘤；神经内分泌细胞肿瘤，包括嗅觉细胞肿瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、垂体腺瘤；转移性肿瘤等。

在根据上述任何实施方式的更进一步的实施方式中，所述初级抗体或其抗原结合片段可以包括或选自如下的二种或更多种，如三种、四种、五种抗体或抗原结合片段：抗Pan-CK、抗GFAP、抗EMA、抗突触蛋白(Synatophysin)、抗CD34抗体或其抗原结合片段。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，在本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中，各个多聚酶-抗体偶联物包含初级抗体和多聚酶，其中所述初级抗体可以是针对不同抗原的抗体。优选地，例如，本发明的示例性多聚酶-抗体偶联物的组合可以包括选自以下的抗体或抗原结合片段：抗Pan-CK、抗GFAP、抗EMA、抗突触蛋白(Synatophysin)、抗CD34抗体或其抗原结合片段。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的示例性多聚酶-抗体偶联物的组合包括多聚过氧化物酶-Pan-CK抗体偶联物、多聚过氧化物酶-GFAP抗体偶联物、多聚过氧化物酶-EMA抗体偶联物、和多聚过氧化物酶-突触蛋白抗体偶联物。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，在本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中，各多聚酶-抗体偶联物包含初级抗体和多聚酶，其中各多聚酶-抗体偶联物含有针对不同抗原的初级抗体或其抗原结合片段。优选地，所述初级抗体选自抗Pan-CK、抗GFAP、抗EMA、抗突触蛋白(Synatophysin)、抗CD34抗体或其抗原结合片段中的一种或多种，例如其中的任意两种、三种、四种、或五种。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，用于本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合的多聚酶分子可以经由交联试剂共价地连接。在一些实施方式中，多聚酶的酶分子可以直接共价地连接。在一些实施方式中，多聚酶的酶分子以线性方式共价地连接。在一些实施方式中，多聚酶的酶分子以分支方式共价地连接。在一些实施方式中，多聚酶的酶分子以混合的线性和分支方式共价地连接。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中的包含多个多聚酶的多聚酶群体包括以每个多聚酶的酶分子数目为特征的多聚酶的大小分布。在一些实施方式中，包含多个多聚酶的多聚酶的群体包括以多聚酶的结构为特征的多聚酶的多散型分布。

在根据上述任何实施方式的进一步的实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中的包含多个多聚酶的多聚酶的群体分子量的大小分布是不均一且随机的。在一些实施方式中，所述包含多个多聚酶的多聚酶偶联物的分子量呈现随机多散性分布，在300kDa至约5000kDa范围内的各个区间内均有不同分子量，例如在400kDa至约2,000kDa范围内的各个区间的多聚酶-抗体偶联物的数目不为零。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，用于本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合的多聚酶可以具有大约300kDa至大约5兆道尔顿(MDa)的分子量。在一些实施方式中，多聚酶具有至少大约500kDa的分子量。在一些实施方式中，多聚酶具有小于或大约5MDa的分子量。在一些实施方式中，多聚酶具有至少大约750kDa的分子量。在一些实施方式中，多聚酶具有至少大约1、2、3或4MDa的分子量。

在一些实施方式中，多聚酶在被偶联至抗体之前首先形成。

在本发明的另一方面，本发明提供了包含上述本发明的多聚酶-抗体偶联物或多聚酶-抗体偶联物的组合的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的多聚酶-抗体偶联物或如上所述的多聚酶-抗体偶联物的组合，其中所述如上所述的多聚酶-抗体偶联物或如上所述的多聚酶-抗体偶联物的组合中的各多聚酶-抗体偶联物可以包括多种初级抗体，优选地，所述多种初级抗体可以是针对不同抗原的抗体。

在根据上述任何实施方式的进一步的实施方式中，所述多种初级抗体可以包括以下的两种或更多种，如三种、四种、或五种抗体或抗原结合片段：抗Pan-CK、抗GFAP、抗EMA、抗突触蛋白(Synatophysin)、抗CD34抗体或其抗原结合片段。

在根据上述任何实施方式的进一步的实施方式中，所述多种初级抗体可以选自以下的两种或更多种，如三种、四种、或五种抗体或抗原结合片段：抗Pan-CK、抗GFAP、抗CD34、抗EMA、抗突触蛋白(Synatophysin)抗体或其抗原结合片段。

本发明的试剂盒包含如上所述的多聚酶-抗体偶联物或其组合和使用说明书，其中所述多个多聚酶-抗体偶联物中的每个可以包含：(i)一个或多个多聚酶，(ii)识别目标分析物的抗体。例如，试剂盒可以包含两种或更多种，如三种、四种、或五种抗体或其抗原结合片段的多聚酶-抗体偶联物：抗Pan-CK、抗GFAP、抗EMA、抗CD34、抗突触蛋白(Synatophysin)抗体或其抗原结合片段

在进一步的一些实施方式中，本发明的试剂盒还包括多聚酶的底物。上述多聚酶的底物包括DAB。

在本发明还一方面，本发明提供了用于检测组织样品中的目标分析物的方法，其包括：

使包含目标分析物的组织样品与包括含有多个酶分子和识别目标分析物的抗体的多聚酶-抗体偶联物接触，以形成包含目标分析物和多聚酶-抗体偶联物的复合体；基本上移除不形成复合体的多聚酶-抗体偶联物；和使组织与多个酶分子的底物接触，从而检测目标分析物。在一些实施方式中，组织是冷冻组织。在一些实施方式中所述组织样品是连续的石蜡或连续的冰冻组织切片。

在根据本发明的上述任何实施方式的一些实施方式中，方法进一步包括封闭步骤，然后进行如下步骤：使包含目标分析物的组织与包含多个酶分子和识别目标分析物的抗体的多聚酶-抗体偶联物接触，以形成包含目标分析物和多聚酶-抗体偶联物的复合体；其中封闭步骤包括使组织与封闭剂接触。在一些实施方式中，组织是冷冻组织。在一些实施方式中，封闭剂包括脱脂乳、BSA、酪蛋白或动物血清。

在本发明还一方面，本发明提供了上述的多聚酶-抗体偶联物或多聚酶-抗体偶联物的组合在制备用于区分脑肿瘤和转移癌的试剂或试剂组合或试剂盒中的应用。

在本发明还一方面，本发明提供了上述的多聚酶-抗体偶联物或多聚酶-抗体偶联物的组合在制备用于术中鉴别肿瘤如脑肿瘤和/或转移癌的类型的试剂或试剂组合或试剂盒中的应用。

在本发明还一方面，本发明提供了上述的多聚酶-抗体偶联物或多聚酶-抗体偶联物的组合在制备用于确定肿瘤如脑肿瘤和/或转移癌的等级的试剂或试剂组合或试剂盒中的应用。

在本发明还一方面，本发明提供了上述的多聚酶-抗体偶联物或多聚酶-抗体偶联物的组合在制备用于确定肿瘤如脑肿瘤和/或转移癌组织手术切除边际阴性的试剂或试剂组合或试剂盒中的应用。

在本发明还一方面，本发明提供了上述的多聚酶-抗体偶联物或多聚酶-抗体偶联物的组合在制备用于区分样品中的转移性癌、脑膜瘤、髓母细胞瘤、胶质瘤、具有IDH1R132H突变的神经胶质瘤、星形细胞瘤、继发性胶质母细胞瘤的试剂或试剂组合或试剂盒中的应用。

在根据上述方面的实施方式中，所述样品为手术样品，所述脑肿瘤包括例如脑胶质瘤、神经胶质瘤、少突胶质细胞瘤、IDH1突变瘤、星形细胞肿瘤、雪旺氏细胞瘤、脉络丛神经瘤、脉络丛神经瘤、乳头状肿瘤、纺锤形肿瘤、非典型的类畸形/类瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、神经鞘膜瘤、颅内神经上皮肿瘤、脊索瘤；神经内分泌细胞肿瘤，包括嗅觉细胞肿瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、垂体腺瘤等。

附图说明

本发明的特征在所附权利要求书中具体地提出。通过参考说明性实施方式的下述具体实施方式和附图将会使本领域技术人员更好地理解本发明的特征和优势，所述附图如下：

图1显示了使用本发明多聚过氧化物酶-抗Pan-CK抗体偶联物对冰冻的前列腺癌切片进行10分钟快速染色的结果(20X)。前列腺癌上皮细胞呈阳性(如箭头指示)。

图2示出了使用本发明的多聚过氧化物酶-抗GFAP抗体偶联物对脑胶质瘤冰冻切片进行10分钟快速染色的结果(20X)。脑胶质瘤细区域呈阳性染色(如箭头指示)。

图3示出了使用本发明的多聚过氧化物酶-抗EMA抗体偶联物对冰冻的肾组织切片进行10分钟快速染色的结果(20X)。肾组织上皮细胞呈阳性染色(如箭头指示)。

图4示出了使用本发明的多聚过氧化物酶-抗突触蛋白抗体偶联物对肝神经内分泌肿瘤组织冰冻切片进行10分钟快速染色的结果(20X)。神经内分泌肿瘤组织突触蛋白呈性染色(如箭头指示)。

图5A至5E示出了使用本发明的示例性多聚过氧化物酶-抗体偶联物的组合对低级别胶质瘤冰冻连续切片进行快速染色的结果(10X)。5A.多聚过氧化物酶-抗Pan-CK抗体偶联物染色结果，低级别胶质瘤呈阴性；5B多聚过氧化物酶-抗GFAP抗体偶联物，低级别胶质瘤呈阳性；5C.多聚过氧化物酶-抗突触蛋白抗体偶联物染色染色结果，低级别胶质瘤呈弱阳性；5D.多聚过氧化物酶-抗EMA抗体偶联物染色染色结果，低级别胶质瘤呈阴性；5E.H&E染色对照。

图6A至6E示出了使用本发明的示例性多聚过氧化物酶-抗体偶联物的组合对高级别胶质瘤冰冻连续切片进行快速染色的结果(10X)。6A.多聚过氧化物酶-抗Pan-CK抗体偶联物染色染色结果，高级别胶质瘤呈阴性；6B多聚过氧化物酶-抗GFAP抗体偶联物染色结果，高级别胶质瘤呈阳性；6C.多聚过氧化物酶-抗EMA抗体偶联物染色染色结果，高级别胶质瘤呈阴性；6D.多聚过氧化物酶-抗突触蛋白抗体偶联物染色染色结果，高级别胶质瘤呈阴性；6E.H&E染色对照。

图7A至7E示出了使用本发明的示例性多聚过氧化物酶-抗体偶联物的组合对转移癌冰冻连续切片进行快速染色的结果。7A.多聚过氧化物酶-抗Pan-CK抗体偶联物染色，转移癌细胞呈阳性；7B.多聚过氧化物酶-抗EMA抗体偶联物染色，转移癌呈弱阳性；7C.多聚过氧化物酶-抗GFAP抗体偶联物染色结果，转移癌呈阴性；10D.多聚过氧化物酶-抗突触蛋白抗体偶联物染色,转移癌呈阴性；7E.H&E染色对照。

具体实施方式

为了解决基于冰冻切片苏木精和伊红染色的术中脑肿瘤症诊断中固有的非特异性和低色差问题，本发明采用一种快速、灵敏且特异的多聚酶-抗体偶联物或其组合，以缩短在新鲜/冰冻组织上进行免疫组化染色的时间。经过特殊设计和优化的聚合物HRP-特异性抗体偶联物能够直接与特定抗原结合，不需要二步法中的标记二抗，在室温下不到10分钟的时间内即可在新鲜组织或冰冻切片上显示出颜色不同的各种肿瘤细胞。这种新颖的10分钟快速免疫组化染色适用于术中癌症鉴别和区分。

运用多聚酶标记的二抗加上一套针对脑肿瘤的抗体的组合对石蜡包埋组织切片进行免疫组化染色以达到鉴别诊断是目前标准的病理诊断过程。由于应用该技术的染色过程耗时数个小时才能完成，因而不能直接用于手术过程中对冰冻组织的肿瘤鉴别诊断。发明人运用本发明的多聚酶-抗体偶联物的技术建立了一套包含多种针对不同抗原的特异抗体的多聚酶-抗体偶联物的组合，该组合可以在10分钟内对组织切片例如冰冻切片进行快速免疫组化染色，从而实现手术中肿瘤的快速鉴别和诊断，即时、精确地指导手术。

本发明采用多聚酶-抗体共价连接形成偶联物。在一个方面，本发明提供了多聚酶-抗体偶联物，其中每个多聚酶-抗体偶联物包含：(i)一个或多个多聚酶，(ii)识别目标分析物的抗体。在一些实施方式中，每个多聚酶都具有多个酶分子。

在一些实施方式中，用于本发明的多聚酶-抗体偶联物的多聚酶可以包括多个酶分子，例如包括至少约6个酶分子，如至少8个、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个、至少22个、至少24个、至少26个、至少28个、至少30个、至少32个、至少34个、至少36个、至少38个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少120个、至少140个、至少150个、至少160个、至少180个、至少200个、至少220个、至少240个、约250个酶分子，或上述数目中的一个或多个的酶分子。在一些实施方式中，多聚酶包括少于大约250、200、180、160、150、140、120、100、80、75、60、50、40、25、20、15、或10个酶分子，或上述数目中的一个或多个的酶分子。在一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物包括每个多聚酶-抗体偶联物约6至约80个之间、约10至约80个之间、约20至约80个之间、约30至约80个之间、约6至约100个之间、约10至约100个之间、约20至约100个之间、约30至约100个之间、约40至约100个之间、约6至约200个之间、约10至约200个之间、约20至约200个之间、约30至约200个之间、约50至约200个之间、约100至约200个之间的酶分子、约6至约250个之间、约10至约250个之间、约20至约250个之间、约30至约250个之间、约50至约250个之间、约100至约250个之间的酶分子、或上述数目中的一个或多个的酶分子。

在一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物包括多个多聚酶，其中各个多聚酶包括大约相同数目的酶分子。在一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物包括多个多聚酶，其中各个多聚酶包括不同数目的酶分子。在一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物包括多个多聚酶，其中多个多聚酶展示了每个多聚酶的酶分子数目的分布。在一些实施方式中，多聚酶-抗体偶联物包括多个多聚酶，其中多个多聚酶在形状上的具有随机差异。

在一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物可以包含多个多聚酶和抗体，其中各多聚酶-抗体偶联物包含数目不一的酶分子和抗体，所述偶联物的分子量大小形成多散型分布。该多散型分布是指在如上所定义的分子量范围内的各个分区区间的多聚酶-抗体偶联物的数目不为零，并且该多散型分布以每个多聚酶-抗体偶联物的分子量为约400kDa至约2,000kDa为特征。例如，在400-600kDa间其数目占整个分子量范围数目的约2-8％，例如4％、5％、6％、7％或8％，优选地4％-6％；在600-800kDa之间占约5-10％，例如6％、7％、8％、9％或10％，优选地7％-9％；在800-1000kDa之间占6-13％，例如7％、8％、9％、10％、11％或12％，优选地9％-11％；在1000-1200kDa之间占7-14％，例如8％、9％、10％、11％、12％、13％或14％，优选地9％-12％；在1200-1400kDa之间占9-16％，例如9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％，优选地11％-13％；在1400-1600kDa之间占10-16％，例如10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％，优选地12％-14％；在1600-2000kDa之间占12-18％，例如12％、13％、14％、15％、16％、17％或18％，优选地13％-15％。更具体地，本发明的多聚酶-抗体偶联物的分子量可以为300kDa至约10,000kDa，优选地，400kDa至约10,000kDa、400kDa至约5,000kDa、500kDa至约5,000kDa或750kDa至约5,000kDa，在该范围内各个区间内均有不同分子量，且偶联物的分子量大小形成如上所述的多散型分布。

免疫组化与液体中抗原-抗体结合很大不同之处在于生物组织的抗原所处环境的复杂性：组织多样和随机的三维结构形成空间网络阻挡多种和过大的多聚酶-抗体偶联物。为使多聚酶-抗体偶联物快速有效地接近和结合抗原，本发明采取的方案是：1)限制过大的多聚酶-抗体偶联物；2)选取多样分子量的多聚酶-抗体偶联物；3)多样或随机的多聚酶-抗体偶联物的三维结构。经过反复试验本发明采用偶联物的分子量为约400kDa至约2,000kDa范围内，其分子量呈现随机多散性分布的多聚酶-抗体偶联物，即在400kDa至约2,000kDa范围内各个区间内均有不同分子量和不同三维结构的多聚酶-抗体偶联物，以此实现多种多聚酶－抗体偶联物与冰冻组织中对应抗原的快速接近，进而结合。例如，在400-600kDa区间内其数目占整个分子量范围数目的约2-8％，例如4％、5％、6％、7％或8％，优选地4％-6％；在600-800kDa区间内占约5-10％，例如6％、7％、8％、9％或10％，优选地7％-9％；在800-1000kDa区间内占6-13％，例如7％、8％、9％、10％、11％或12％，优选地9％-11％；在1000-1200kDa区间内占7-14％，例如8％、9％、10％、11％、12％、13％或14％，优选地9％-12％；在1200-1400kDa区间内占9-16％，例如9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％，优选地11％-13％；在1400-1600kDa区间内占10-16％，例如10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％，优选地12％-14％；在1600-2000kDa区间内占12-18％，例如12％、13％、14％、15％、16％、17％或18％，优选地13％-15％。并且例如，在400kDa至约8,00kDa区间内包含随机不同三维结构的多聚酶-抗体偶联物；在800kDa至约1,200kDa区间内包含另外类型的随机不同三维结构的多聚酶-抗体偶联物；在1,200kDa至约1,600kDa区间内包含其它类型的随机不同三维结构的多聚酶-抗体偶联物；在1,600kDa至约2,000kDa区间内包含其它类型的随机不同三维结构的多聚酶-抗体偶联物，其中在上述四个区间内的多聚酶-抗体偶联物所包含的三维结构可以各不相同的。该组合分布的实现是由如下几个变量的组合来实现的；1)每一个多聚酶-抗体偶联物由至少一个多聚酶组成；2)每个多聚酶所含的酶的数量为一到数百个；3)该多聚酶三维结构是多样和随机的；4)该多聚酶结合到抗体的位点是多个；5)各个不同的多聚酶结合到抗体的不同位点的方式是随机的。这些多个变量在在抗体/多聚物的偶联反应中形成的最终产物在多聚酶-抗体偶联物分子量的分布上是多散型的，而在其三维结构是多样和随机的。具有该分子量分布特征的多聚酶-抗体偶联物可以快速与异质新鲜或冰冻切片组织中的抗原结合，只需5-10分钟或更短的孵育时间形成抗原与多聚酶-抗体缀和物的复合物，进一步通过清洗除去未形成复合物的多聚酶－抗体缀和物，使组织结合的多聚酶与该酶的底物接触，从而快速检测目标分析物。

在一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物可以含有多个多聚酶，所述多个多聚酶中的每一个多聚酶含有的酶分子数目各不相同，如可以含有8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、50、60、70、80、90、100、120、140、150、160、180、200、220、240和/或250个酶分子，或上述数目中的一个或多个的酶分子。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物的分子量的分布在各分子量区间是不均一且其三维结构是多样和随机的。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物可以具有在大约400kDa至大约500kDa、600kDa、700kDa、800kDa、900kDa、1000kDa、2000kDa、3000kDa、4000kDa、5000kDa、6000kDa、7000kDa、8000kDa、9000kDa或l0000kDa之间的分子量，和/或具有在大约500kDa至大约600kDa、700kDa、800kDa、900kDa、1000kDa、2000kDa、3000kDa、4000kDa、5000kDa、6000kDa、7000kDa、8000kDa、9000kDa或l0000kDa之间的分子量，和/或具有在大约600kDa至大约700kDa、800kDa、900kDa、1000kDa、2000kDa、3000kDa、4000kDa、5000kDa、6000kDa、7000kDa、8000kDa、9000kDa或l0000kDa之间的分子量，和/或具有在大约700kDa至大约800kDa、900kDa、1000kDa、2000kDa、3000kDa、4000kDa、5000kDa、6000kDa、7000kDa、8000kDa、9000kDa或l0000kDa之间的分子量，和/或具有在大约800kDa至大约900kDa、1000kDa、2000kDa、3000kDa、4000kDa、5000kDa、6000kDa、7000kDa、8000kDa、9000kDa或l0000kDa之间的分子量，和/或具有在大约900kDa至大约1000kDa、2000kDa、3000kDa、4000kDa、5000kDa、6000kDa、7000kDa、8000kDa、9000kDa或l0000kDa之间的分子量，和/或具有在大约1000kDa至大约2000kDa、3000kDa、4000kDa、5000kDa、6000kDa、7000kDa、8000kDa、9000kDa或l0000kDa之间的分子量。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，包含多个多聚酶的多聚酶群体包括以每个多聚酶的酶分子数目为特征的多聚酶的大小分布。在一些实施方式中，包含多个多聚酶的多聚酶的群体包括以多聚酶的结构为特征的多聚酶的形状随机分布。在进一步的实施方式中，包含多个多聚酶的多聚酶群体的分子量的分布是不均一且随机的。在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，包含多个多聚酶的多聚酶偶联物的分子量呈现随机多散性分布，在300kDa至约5000kDa范围内各个区间内均有不同分子量。例如，在400-600kDa间其数目占整个分子量范围数目的约2-8％，例如4％、5％、6％、7％或8％，优选地4％-6％；在600-800kDa之间占约5-10％，例如6％、7％、8％、9％或10％，优选地7％-9％；在800-1000kDa之间占6-13％，例如7％、8％、9％、10％、11％或12％，优选地9％-11％；在1000-1200kDa之间占7-14％，例如8％、9％、10％、11％、12％、13％或14％，优选地9％-12％；在1200-1400kDa之间占9-16％，例如9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％，优选地11％-13％；在1400-1600kDa之间占10-16％，例如10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％，优选地12％-14％；在1600-2000kDa之间占12-18％，例如12％、13％、14％、15％、16％、17％或18％，优选地13％-15％。更具体地，本发明的多聚酶-抗体偶联物的分子量可以为300kDa至约10,000kDa，优选地，400kDa至约10,000kDa、400kDa至约5,000kDa、500kDa至约5,000kDa或750kDa至约5,000kDa，在该范围内各个区间内均有不同分子量，且偶联物的分子量形成如上所述的多散型分布。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物包括多个酶分子或多聚酶，其中所述多个酶分子或多聚酶可以包括相同或不同的酶类型，例如本发明的多聚酶-抗体偶联物中的所有酶分子或多聚酶可以包括辣根过氧化物酶。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物包括多聚酶和抗体，所述多聚酶的酶分子可以包括辣根过氧化物酶(HRP)、β-D-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、荧光素酶、乳酸脱氢酶、半乳糖氧化酶等。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物可以由多聚酶与抗体通过共价连接形成。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物可以包含初级抗体。在一些实施方式中，所述初级抗体可以包括全长抗体、单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体或抗体融合蛋白、或抗原结合片段。

抗体结合片段的实例包括但不用限于Fab、F(ab')2、Fab’片段、Fd片段、单链抗体分子(例如scFv)、Fv片段、双抗体、线性抗体、和由抗体片段形成的多特异性抗体。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，抗体包括IgG、IgM、IgE，IgA或IgD。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，所述初级抗体可以包括或选自靶向本发明的目标抗原和其相关的疾病如癌症的抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方式中，所述癌症包括：脑肿瘤如脑胶质瘤、神经胶质瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤、室管膜瘤、神经鞘膜瘤、颅内神经上皮肿瘤、脊索瘤；上皮样肉瘤；神经内分泌细胞肿瘤，包括嗅觉细胞肿瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、垂体腺瘤；转移性肿瘤等在根据上述任何实施方式的更进一步实施方式中，所述初级抗体或抗原结合片段可以包括或选自以下：抗Pan-CK、抗GFAP、抗EMA、抗突触蛋白(Synatophysin)、抗S-100、抗NSE、抗波形蛋白(Vimentin)、抗LCA、抗AFP、抗CD34、抗Ki-67、抗P63、抗NFP、抗IDH1、抗BRAF、抗嗜铬粒蛋白(Chromogranin)、抗LCA抗体或其抗原结合片段。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物包括多聚酶分子和抗体，其中所述多聚酶分子可以经由交联试剂共价地连接。例如，多聚酶的酶分子可以直接共价地连接，或以线性方式共价地连接，或以分支方式共价地连接，或以混合的线性和分支方式共价地连接。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，多聚酶在被偶联至抗体之前首先形成。

在本发明的另一方面，本发明提供了多聚酶-抗体偶联物的组合，其包括多个如上所述本发明的多聚酶-抗体偶联物。在本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中，所述多个多聚酶-抗体偶联物中的每个可以包含：(i)一个或多个多聚酶，(ii)识别目标分析物的抗体。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，在本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中的每个多聚酶-抗体偶联物可以包括多个酶分子，例如包括至少约6个酶分子，如至少8、至少10个、至少12个、至少14个、至少16个、至少18个、至少20个、至少22个、至少24个、至少26个、至少28个、至少30个、至少32个、至少34个、至少36个、至少38个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少120个、至少140个、至少150个、至少160个、至少180个、至少200个、至少220个、至少240个、约250个酶分子，或上述数目中的一个或多个的酶分子。在一些实施方式中，多聚酶包括少于大约250、200、180、160、150、140、120、100、80、75、60、50、40、25、20、15、或10个酶分子，或上述数目中的一个或多个的酶分子。在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，多聚酶-抗体偶联物包括每个多聚酶-抗体偶联物约6至约80个之间、约10至约80个之间、约20至约80个之间、约30至约80个之间、约6至约100个之间、约10至约100个之间、约20至约100个之间、约30至约100个之间、约40至约100个之间、约6至约200个之间、约10至约200个之间、约20至约200个之间、约30至约200个之间、约50至约200个之间、约100至约200个之间的酶分子，约6至约250个之间、约10至约250个之间、约20至约250个之间、约30至约250个之间、约50至约250个之间、约100至约250个之间的酶分子、或上述数目中的一个或多个的酶分子。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中的每个多聚酶-抗体偶联物包含多个多聚酶和抗体，其中各个多聚酶包含数目不一的酶分子，所述偶联物的分子量大小形成多散型分布，该多散型分布以每个多聚酶抗体偶联物的分子量为约400kDa至约2,000kDa为特征。在根据上述任何实施方式的一个实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中的多聚酶-抗体偶联物的分子量在300kDa至约10,000kDa范围内，且呈现随机多散性分布，即，在400kDa至约2,000kDa范围内各个区间内均有不同分子量和不同三维结构的多聚酶-抗体偶联物。该多散型分布是指在如上所定义的分子量范围(400kDa至约2,000kDa)内的各个分区区间的多聚酶-抗体偶联物的数目不为零，例如，在400-600kDa之间其数目占整个分子量范围数目的约2-8％，例如4％、5％、6％、7％或8％，优选地4％-6％；在600-800kDa之间占约5-10％，例如6％、7％、8％、9％或10％，优选地7％-9％；在800-1000kDa之间占6-13％，例如7％、8％、9％、10％、11％或12％，优选地9％-11％；在1000-1200kDa之间占7-14％，例如8％、9％、10％、11％、12％、13％或14％，优选地9％-12％；在1200-1400kDa之间占9-16％，例如9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％，优选地11％-13％；在1400-1600kDa之间占10-16％，例如10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％，优选地12％-14％；在1600-2000kDa之间占12-18％，例如12％、13％、14％、15％、16％、17％或18％，优选地13％-15％。更具体地，本发明的上述组合中的多聚酶-抗体偶联物的分子量可以为300kDa至约10,000kDa，优选地，400kDa至约10,000kDa、400kDa至约5,000kDa、500kDa至约5,000kDa或750kDa至约5,000kDa，在该范围内各个区间内均有不同分子量，且偶联物的分子量形成如上所述的多散型分布。

在一个实施方式中，多聚酶-抗体偶联物的三维结构在各个分子量区间内呈现随机分布，例如，在400kDa至约8,00kDa区间内包含随机不同三维结构的多聚酶-抗体偶联物；在800kDa至约1,200kDa区间内包含另外类型的随机不同三维结构的多聚酶-抗体偶联物；在1,200kDa至约1,600kDa区间内包含其它类型的随机不同三维结构的多聚酶-抗体偶联物；在1,600kDa至约2,000kDa区间内包含其它类型的随机不同三维结构的多聚酶-抗体偶联物，其中在上述四个区间内的多聚酶-抗体偶联物所包含的三维结构可以各不相同的。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中的每个多聚酶-抗体偶联物可以含有的多聚酶的分子量不均一，各多聚酶可以含有数目不一的酶分子，如可以含有8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、50、60、70、80、90、100、120、140、150、160、180、200、220、240和/或250个酶分子，或上述数目中的一个或多个的酶分子。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中的每个多聚酶-抗体偶联物的分子量的分布可以是不均一且随机的。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中的每个多聚酶-抗体偶联物可以具有在约400kDa至约500kDa、600kDa、700kDa、800kDa、900kDa、1000kDa、2000kDa、3000kDa、4000kDa、5000kDa、6000kDa、7000kDa、8000kDa、9000kDa或l0000kDa之间的分子量，和/或具有在大约500kDa至大约600kDa、700kDa、800kDa、900kDa、1000kDa、2000kDa、3000kDa、4000kDa、5000kDa、6000kDa、7000kDa、8000kDa、9000kDa或l0000kDa之间的分子量，和/或具有在大约600kDa至大约700kDa、800kDa、900kDa、1000kDa、2000kDa、3000kDa、4000kDa、5000kDa、6000kDa、7000kDa、8000kDa、9000kDa或l0000kDa之间的分子量，和/或具有在大约700kDa至大约800kDa、900kDa、1000kDa、2000kDa、3000kDa、4000kDa、5000kDa、6000kDa、7000kDa、8000kDa、9000kDa或l0000kDa之间的分子量，和/或具有在大约800kDa至大约900kDa、1000kDa、2000kDa、3000kDa、4000kDa、5000kDa、6000kDa、7000kDa、8000kDa、9000kDa或l0000kDa之间的分子量，和/或具有在大约900kDa至大约1000kDa、2000kDa、3000kDa、4000kDa、5000kDa、6000kDa、7000kDa、8000kDa、9000kDa或l0000kDa之间的分子量，和/或具有在大约1000kDa至大约2000kDa、3000kDa、4000kDa、5000kDa、6000kDa、7000kDa、8000kDa、9000kDa或l0000kDa之间的分子量。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，在本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中的每个多聚酶-抗体偶联物可以包括多个酶分子或多个多聚酶，其中所述多个酶分子或多个多聚酶可以包括相同的酶类型，例如本发明的多聚酶-抗体偶联物中的所有酶分子或多聚酶都是辣根过氧化物酶。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，在本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中的每个多聚酶-抗体偶联物可以包括多个酶分子或多个多聚酶，其中所述多个酶分子或多个多聚酶可以包括不同的酶类型，例如本发明的多聚酶-抗体偶联物中的一些酶分子或多聚酶是辣根过氧化物酶，而另一些是碱性磷酸酶；或者其中所述多个酶分子或多个多聚酶可以包括相同的酶类型，例如本发明的多聚酶-抗体偶联物中的酶分子或多聚酶均是辣根过氧化物酶。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，在本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中，多聚酶可以包括或选自辣根过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、荧光素酶、乳酸脱氢酶、半乳糖氧化酶等。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中的各个多聚酶-抗体偶联物包含初级抗体和多聚酶，其中各多聚酶-抗体偶联物包含的所述初级抗体可以是针对不同抗原的抗体。例如，本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合包括或选自如下的二种或更多种，如三种、四种、或五种抗体或其抗原结合片段：抗Pan-CK、抗GFAP、抗EMA、抗突触蛋白(Synatophysin)、抗CD34抗体或其抗原结合片段。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中的各多聚酶-抗体偶联物包含初级抗体和多聚酶，所述初级抗体可以包括或选自靶向本发明的目标抗原和其相关的疾病如癌症的抗体或抗原结合片段。在进一步的实施方式中，所述癌症包括脑肿瘤如脑胶质瘤、神经胶质瘤、少突胶质细胞瘤、IDH1突变瘤、星形细胞肿瘤、雪旺氏细胞瘤、脉络丛神经瘤、脉络丛神经瘤、乳头状肿瘤、纺锤形肿瘤、非典型的类畸形/类瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、神经鞘膜瘤、颅内神经上皮肿瘤、脊索瘤；神经内分泌细胞肿瘤，包括嗅觉细胞肿瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、垂体腺瘤；转移性肿瘤等。在还进一步的实施方式中，所述癌症选自脑肿瘤如脑胶质瘤、神经胶质瘤、少突胶质细胞瘤、IDH1突变瘤、星形细胞肿瘤、雪旺氏细胞瘤、脉络丛神经瘤、脉络丛神经瘤、乳头状肿瘤、纺锤形肿瘤、非典型的类畸形/类瘤、脑膜瘤、室管膜瘤、神经鞘膜瘤、颅内神经上皮肿瘤、脊索瘤；神经内分泌细胞肿瘤，包括嗅觉细胞肿瘤、髓母细胞瘤、神经母细胞瘤、垂体腺瘤；转移性肿瘤等。在根据上述任何实施方式的更进一步的实施方式中，所述初级抗体或抗原结合片段可以包括或选自如下的二种或更多种，如三种、四种、或五种抗体或抗原结合片段：抗Pan-CK、抗GFAP、抗EMA、抗突触蛋白(Synatophysin)、抗CD34抗体或其抗原结合片段。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，在本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中，各个多聚酶-抗体偶联物包含初级抗体和多聚酶，其中所述初级抗体可以是针对不同抗原的抗体。例如，本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合可以包含或选自以下的二种或更多种抗体或抗原结合片段：抗Pan-CK、抗GFAP、抗EMA、抗突触蛋白(Synatophysin)、抗S-100、抗NSE、抗波形蛋白、抗LCA、抗AFP、抗CD34、抗Ki-67、抗P63、抗NFP、抗IDH1、抗BRAF、抗噬铬粒蛋白(Chromogranin)、抗LCA抗体或其抗原结合片段；优选地，包括或选自抗Pan-CK、抗GFAP、抗EMA、抗突触蛋白(Synatophysin)、和抗CD34抗体。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，在本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中，各个多聚酶-抗体偶联物包含初级抗体和多聚酶，其中各个多聚酶-抗体偶联物含有的初级抗体或其抗原结合片段是不同的。优选地，所述初级抗体包括或选自抗Pan-CK、抗GFAP、抗EMA、抗突触蛋白(Synatophysin)、抗CD34抗体或其抗原结合片段中的一种或多种，例如上述抗体中的三种、四种、或五种。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，用于本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合的多聚酶分子可以经由交联试剂共价地连接。在一些实施方式中，多聚酶的酶分子可以直接共价地连接。在一些实施方式中，多聚酶的酶分子以线性方式共价地连接。在一些实施方式中，多聚酶的酶分子以分支方式共价地连接。在一些实施方式中，多聚酶的酶分子以混合的线性和分支方式共价地连接。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中的包含多个多聚酶的多聚酶群体包括以每个多聚酶的酶分子数目为特征的多聚酶的大小分布。在一些实施方式中，包含多个多聚酶的多聚酶的群体包括以多聚酶的结构为特征的多聚酶的形状分布。所述多聚酶-抗体偶联物的分子量大小形成多散型分布，该多散型分布是指在如上所定义的分子量范围内的各个分区区间的多聚酶-抗体偶联物的数目不为零。例如，在400-600kDa之间其数目占整个分子量范围数目的约2-8％，例如4％、5％、6％、7％或8％，优选地4％-6％；在600-800kDa之间占约5-10％，例如6％、7％、8％、9％或10％，优选地7％-9％；在800-1000kDa之间占6-13％，例如7％、8％、9％、10％、11％或12％，优选地9％-11％；在1000-1200kDa之间占7-14％，例如8％、9％、10％、11％、12％、13％或14％，优选地9％-12％；在1200-1400kDa之间占9-16％，例如9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％，优选地11％-13％；在1400-1600kDa之间占10-16％，例如10％、11％、12％、13％、14％、15％或16％，优选地12％-14％；在1600-2000kDa之间占12-18％，例如12％、13％、14％、15％、16％、17％或18％，优选地13％-15％。更具体地，本发明上述组合中的多聚酶-抗体偶联物的分子量可以为300kDa至约10,000kDa，优选地，400kDa至约10,000kDa、400kDa至约5,000kDa、500kDa至约5,000kDa或750kDa至约5,000kDa，在该范围内各个区间内均有不同分子量，且偶联物的分子量形成如上所述的多散型分布。

在一个实施方式中，多聚酶-抗体偶联物的三维结构在各个分子量区间内呈现随机分布，例如，在400kDa至约8,00kDa区间内包含随机不同三维结构的多聚酶-抗体偶联物；在800kDa至约1,200kDa区间内包含另外类型的随机不同三维结构的多聚酶-抗体偶联物；在1,200kDa至约1,600kDa区间内包含其它类型的随机不同三维结构的多聚酶-抗体偶联物；在1,600kDa至约2,000kDa区间内包含其它类型的随机不同三维结构的多聚酶-抗体偶联物，其中在上述四个区间内的多聚酶-抗体偶联物所包含的三维结构可以各不相同的。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合中包含多个多聚酶的多聚酶的群体分子量的大小分布是不均一且随机的。在一些实施方式中，所述包含多个多聚酶的多聚酶的群体分子量呈现随机多散性分布，在400kDa至约5000kDa范围内各个区间内均有不同分子量。在一些具体的实施方式中，本发明提供了由多聚过氧化物酶分别与4种或5种与脑瘤鉴别相关的抗体形成的4种或5种多聚过氧化物酶-抗体偶联物的组合。这些多聚酶-抗体偶联物的组合可以应用到脑瘤相关的领域，特别是得益于其在新鲜和冰冻组织快速染色的特征，可以用于术中脑肿瘤的鉴别诊断和切除边际的确定。在进一步的实施方式中，本发明的用于术中脑肿瘤的多聚酶-抗体偶联物的组合包括多种(例如，四种或五种)多聚过氧化物酶-抗体偶联物：多聚过氧化物酶-Pan-CK抗体偶联物、多聚过氧化物酶-GFAP抗体偶联物、多聚过氧化物酶-EMA抗体偶联物、多聚过氧化物酶-突触蛋白抗体偶联物、和/或多聚过氧化物酶-CD34抗体偶联物。在更进一步的实施方式中，用于术中脑肿瘤的示例性多聚酶-抗体偶联物的组合由至少4种或5种多聚过氧化物酶-抗体组成：多聚过氧化物酶-Pan-CK抗体偶联物、多聚过氧化物酶-GFAP抗体偶联物、多聚过氧化物酶-EMA抗体偶联物、多聚过氧化物酶-突触蛋白抗体偶联物、多聚过氧化物酶-CD34抗体偶联物、和/或多聚过氧化物酶-Ki-67抗体偶联物。本发明的用于术中脑肿瘤的上述多聚酶-抗体偶联物的组合专为确定肿瘤等级和术中鉴别诊断转移癌、神经胶质瘤、脑膜瘤、髓母细胞瘤等脑肿瘤而设计。

多聚过氧化物酶-Pan-CK抗体偶联物：将鳞状上皮，腺上皮以及来自良性或恶性来源(例如小细胞癌，脊索瘤，滑膜和上皮样肉瘤)的过渡细胞染色。近年来，它已被用于颅内神经上皮肿瘤和转移性癌的鉴别诊断。在转移性癌细胞中，它以高扩散性和相对较差的特异性以正扩散模式染色细胞质。

多聚过氧化物酶-GFAP抗体偶联物：染色对正常，反应性和赘生性星形胶质细胞，室管膜细胞和少突胶质细胞呈阳性；神经节细胞，神经元，上皮来源的转移性癌，成纤维细胞及其来源染色阴性。使用该抗体来诊断脑胶质瘤，表现为扩散性细胞质染色阳性。在转移性癌症，髓质和其他胚胎起源的肿瘤中，它显示出局灶性染色阴性。

多聚过氧化物酶-EMA抗体偶联物：EMA存在于各种腺上皮中，例如乳房，内分泌腺和顶分泌腺以及胰腺，而在肠胃上皮，宫颈内膜上皮和前列腺中很少或没有EMA表达。EMA在脑膜瘤，室管膜瘤(膜反应占90％)，神经鞘膜瘤和脊索瘤中呈阳性。

多聚过氧化物酶-突触蛋白抗体偶联物：主要用于识别神经内分泌细胞肿瘤，包括嗅觉细胞肿瘤，髓母细胞瘤，神经母细胞瘤，垂体腺瘤和小细胞癌。它在神经胶质瘤上呈阴性染色，而在正常神经元和髓母细胞瘤中呈强阳性染色。与GFAP，Pan-CK结合使用，它们可用于以原始神经元成分对脑膜瘤，髓母细胞瘤，转移性癌，神经胶质瘤进行鉴别诊断，特别适用于鉴定髓母细胞瘤和转移性癌。

在根据上述任何实施方式的进一步的实施方式中，应用如上的示例性多聚过氧化物酶-抗体抗体偶联物的组合可应用于脑肿瘤术中病理诊断。比如选择多聚过氧化物酶-Pan-CK抗体偶联物和多聚过氧化物酶-GFAP抗体偶联物应用于神经外科手术快速诊断鉴别神经胶质瘤，神经胶质瘤或转移性肿瘤^[8]。表1总结了实施例中使用的本发明的示例性多聚过氧化物酶-抗体偶联物的组合在肿瘤术中的具体应用。

表1本发明的示例性多聚过氧化物酶-抗体偶联物的组合在不同肿瘤手术中的鉴别应用

+：阳性；-：阴性

在本发明的另一方面，本发明提供了包含上述本发明的多聚酶-抗体偶联物或多聚酶-抗体偶联物的组合的试剂盒，所述试剂盒包括多个如上所述的多聚酶-抗体偶联物或如上所述的多聚酶-抗体偶联物的组合，其中所述多个如上所述的多聚酶-抗体偶联物或如上所述的多聚酶-抗体偶联物的组合中的各多聚酶-抗体偶联物可以包括多种初级抗体，优选地，所述多种初级抗体可以针对不同的抗原，如不同的肿瘤抗原。

在根据上述任何实施方式的进一步的实施方式中，所述多种初级抗体可以包括或选自以下的一种或多种，如二种、三种、四种、或五种抗体或抗原结合片段：抗Pan-CK、抗GFAP、抗EMA、抗突触蛋白(Synatophysin)、抗CD34抗体或抗原结合片段。

在根据上述任何实施方式的进一步的实施方式中，本发明的试剂盒包括a)多聚酶-抗体偶联物，和b)使用说明书。在另外一些实施方式中，试剂盒包括a)多聚酶-抗体偶联物，和b)多聚酶的底物。在进一步的实施方式中，本发明试剂盒包括a)多聚酶-抗体偶联物，b)多聚酶的底物，和c)使用说明书。在进一步的实施方式中，多聚酶是聚合的-HRP，多聚酶的底物包括DAB。

在根据上述任何实施方式的进一步的实施方式中，试剂盒包括a)多聚酶-抗体偶联物的组合，和b)使用说明书。在一些实施方式中，试剂盒包括a)多聚酶-抗体偶联物的组合，和b)多聚酶的底物。在一些实施方式中，试剂盒包括a)多聚酶-抗体偶联物的组合，b)多聚酶的底物，和c)使用说明书。在一些实施方式中，多聚酶是聚合的-HRP，多聚酶的底物包括DAB。

在本发明还一方面，本发明提供了用于检测组织中的目标分析物的方法，其包括：

使包含目标分析物的组织与包括含有多个酶分子和识别目标分析物的抗体的多聚酶-抗体偶联物接触，以形成包含目标分析物和多聚酶-抗体偶联物的复合体；基本上移除不形成复合体的多聚酶-抗体偶联物；和使组织与多聚酶-抗体偶联物中的多个酶分子的底物接触，从而检测目标分析物。在一些实施方式中，组织是冷冻组织。

在一些实施方式中，本发明提供了用于检测组织中的目标分析物的方法，包括：(a)使包含目标分析物的组织样本与本发明的多聚酶-抗体偶联物在约15℃和约45℃之间的孵育温度下接触约1分钟至大约1小时的时间以形成包含目标分析物和至少一种多聚酶-抗体偶联物的复合体，其中抗体能够特异性地结合至目标分析物；(b)移除不形成复合体的聚合的-酶-抗体缀合物；(c)使组织样本与酶的底物接触，从而检测目标分析物。

在一些实施方式中，包含目标分析物的组织样本(例如，组织切片)与本发明的多聚酶-抗体偶联物在约15℃和约45℃之间的孵育温度下接触大约3分钟至大约1小时以形成包含目标分析物和至少一种多聚酶-抗体偶联物的复合体，并且多聚酶-抗体偶联物包含能够特异性地结合至目标分析物的初级抗体。在上述实施方式中，组织样品是连续的冷冻组织切片或连续的石蜡切片。

在根据上述任何实施方式的进一步的实施方式中，包含一系列目标分析物(例如，分析物A和分析物B)的组织样本(例如组织切片)与本发明的多聚酶-抗体偶联物的组合(例如，特异性地结合分析物A的多聚酶-抗体偶联物和特异性地结合分析物B的多聚酶-抗体偶联物)在大约15℃和大约45℃的孵育温度下接触大约3分钟至大约1小时以形成包含目标分析物和至少一种多聚酶-抗体偶联物的一系列复合体，并且多聚酶-抗体偶联物包含能够特异性地结合至它们各自的目标分析物的初级抗体。在一些实施方式中，组织样品是连续的冷冻组织切片或连续的石蜡切片。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，孵育温度在约15℃和约18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃之间，在约20℃和约21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃之间，在约25℃和约30℃之间，优选地在约25℃和约37℃之间。

在根据上述任何实施方式的一些实施方式中，孵育时间为在约1分钟至约3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟之间，在5分钟至大约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟之间，在10分钟至大约15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟之间，在约15分钟至约20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟之间，在约20分钟至约25、30、35、40、45、50、55或60分钟之间，在约25分钟至约30、35、40、45、50、55或60分钟之间，在约30分钟至约35、40、45、50、55或60分钟之间。

在更具体的实施方式中，孵育时间为约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟。

在孵育之后，通常利用洗涤缓冲液对组织样本进行洗涤，所述洗涤缓冲液包括例如PBS、TBS、MOPS、MES、HEPES或碳酸氢盐缓冲液，任选地包含洗涤剂，例如吐温20(例如，0.01-0.2％的吐温20)。例如，示例性洗涤缓冲液是含有0.05％吐温20的10mM PBS。

洗涤步骤可以进行2到6次，优选地3、4或5次，每个洗涤步骤持续1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟或更多的时间。

在一些实施方式中，洗涤温度在约15℃和约18、19、20、21、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50℃之间，在大约20℃和大约21、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃之间，在约25℃和约30℃之间，或在约25℃和大约37℃之间。

在一些实施方式中，洗涤温度为约15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃。

在一些实施方式中，洗涤时间在约1分钟至约3、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟之间。

在一些实施方式中，洗涤时间为大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟。

在根据本发明的上述任何实施方式的一些实施方式中，方法进一步包括封闭步骤，包括如下步骤：使包含目标分析物的组织与包含多个酶分子和识别目标分析物的抗体的多聚酶-抗体偶联物接触，以形成包含目标分析物和多聚酶-抗体偶联物的复合体；其中封闭步骤包括使组织与封闭剂接触。

在一些实施方式中，方法进一步包括封闭步骤，包括在将抗体缀合物与组织一起孵育之前的封闭步骤，其中所述封闭步骤包括使所述组织与封闭剂接触。

在一些实施方式中，封闭剂包括脱脂乳、BSA、酪蛋白或动物血清。

在一些实施方式中，封闭剂包括缓冲液，例如TBS或PBS，优选地，含有BSA的TBS或PBS。

在一些实施方式中，封闭剂包括缓冲液体系，选自PBS、TBS、MOPS、MES、HEPES和碳酸氢盐，任选地含有血清白蛋白，例如1-5％的牛血清白蛋白(BSA)、马血清白蛋白、山羊血清白蛋白、兔血清白蛋白或明胶，和吐温20，例如0.001-0.05％的吐温20。

在一些实施方式中，封闭剂包括大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％的脱脂乳。

在一些实施方式中，封闭剂包括大约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％的BSA。

在一些实施方式中，封闭温度在约15℃和约18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃之间，在大约20℃和大约21、22、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45℃之间，在大约25℃和大约30℃之间，优选地在大约25℃和大约37℃之间。

在一些实施方式中，封闭温度为大约15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃或45℃。

在一些实施方式中，封闭时间在大约3分钟至大约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟之间，在5分钟至大约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟之间，在10分钟至大约15、20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟之间，在大约15分钟至大约20、25、30、35、40、45、50、55或60分钟之间，在大约20分钟至大约25、30、35、40、45、50、55或60分钟之间，在大约25分钟至大约30、35、40、45、50、55或60分钟之间，或在大约30分钟至大约35、40、45、50、55或60分钟之间。

在一些实施方式中，方法进一步包括检测步骤。在洗涤步骤之后，将包含酶的底物——例如用于HRP的DAB或用于AP的坚牢红——的检测剂添加至组织样本。

在一些实施方式中，检测试剂包括缓冲液，比如PBS或TBS缓冲液，任选地具有BSA和/或聚乙二醇。

在根据本发明的上述任何实施方式的一些实施方式中，酶促反应使用分光光度计检测。在一些实施方式中，酶促反应使用化学光度计检测。在一些实施方式中，酶促反应使用荧光检测器检测。在一些实施方式中，酶促反应使用比色(colormetric)信号检测器检测。在一些实施方式中，酶促反应使用光学显微镜或荧光显微镜检测。

在根据本发明的上述任何实施方式的一些实施方式中，组织是冷冻组织。在一些实施方式中，组织是石蜡包埋组织。在一些实施方式中，所述组织样本为临床涂片或培养的细胞或组织。优选地，组织(样本)是连续的冷冻组织切片或石蜡切片。

在一些实施方式中，组织是大于大约5μm厚度的组织切片。在一些实施方式中，组织是约5μm厚度的组织切片。在一些实施方式中，组织是小于约5μm厚度的组织切片。在一些实施方式中，组织是约1.5μm厚度至约5.5μm厚度的组织切片。在一些实施方式中，组织是约4.5μm厚度至约7.5μm厚度的组织切片。

在一些实施方式中，方法进一步包括固定步骤。在一些实施方式中，组织在包含醛的固定剂中固定。优选地，包含醛的固定剂例如福尔马林(甲醛)和戊二醛，更优选地，固定剂为1-10％福尔马林。在另一实施方式中，组织在丙酮固定剂中固定。在另一实施方式中，组织在甲醇固定剂中固定。在另一实施方式中，组织在50-90％的酒精固定剂中固定。本发明创造的优点：

原发性脑瘤的治疗方法通常涉及手术切除肿瘤。但是，由于肿瘤浸润毗邻脆弱的脑组织，大脑肿瘤的彻手术底清除是非常困难的，部分原因是因为依靠冰冻切片组织的苏木精和曙红染色评估术中脑瘤诊断的准确性不够。本发明采用多聚酶与抗体共价连接形成偶联物，并且合成了由多聚酶分别与4-5种脑瘤相关的抗体，形成4-5种多聚酶-抗体偶联物，用于脑瘤鉴别，应用到脑瘤相关的领域，特别是得益于其在新鲜和冰冻组织快速染色的特征，可以用于术中脑瘤的鉴别诊断和切除边际的确定，提高脑肿瘤诊断的准确性。应用该技术将会显著改善外科手术管理，尤其是对于某些浸润性和侵袭性脑癌。

实施例

下文中，本发明将参考具体的实施例来更详细描述。以下实施例和说明仅用于说明性目的，并不构成对本发明实质内容的限制。

下列实施例中使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均为商业可得的常规试剂。

实施例1.在载玻片上的冷冻组织的预处理

将放置在玻片上的冰冻组织切片在固定液中固定30秒，该固定液为10％福尔马林或低温丙酮。然后用磷酸洗涤缓冲液(PBS)洗涤载玻片20秒钟左右；如果组织切片富含内源性过氧化物酶，则应用4％左右的过氧化氢封闭溶液(4％的过氧化氢溶于水)处理1至2分钟，之后分别用水和洗涤缓冲液洗涤载玻片20秒钟左右。

实施例2.多聚过氧化物酶-Pan-CK抗体偶联物染色

将多聚过氧化物酶/Pan-CK偶联物稀释到适当浓度(1-30微克/毫升)并添加到经过如上预处理的冰冻前列腺癌组织切片上，反应3至5分钟。用磷酸洗涤缓冲液(PBS)洗涤切片3次共20秒。添加底物通用DAB染色溶液(Vector Lab，SK-4100)，反应3分钟。用水洗涤载玻片10秒至1分钟3次。添加150μl通用苏木精溶液(Sigma-Aldrich)染色20秒至1分钟。用水清洗15秒钟(或更久)3次。加150μl通用密封胶(Vector Lab)盖玻片。整个染色在10分钟之内完成。其组织染色的显微照片如图1所示：本发明的偶联物多聚过氧化物酶-Pan-CK在冰冻的前列腺癌切片上在10分钟内快速染色，前列腺癌细胞浆被特异染色。

实施例3.多聚过氧化物酶-GFAP抗体偶联物染色

将多聚过氧化物酶/GFAP抗体偶联物稀释到适当浓度(1-30微克/毫升)并添加到经过如上预处理的脑瘤冰冻切片上，反应3至5分钟。用磷酸洗涤缓冲液(PBS)洗涤切片3次共20秒。添加底物通用DAB染色溶液(Vector Lab，SK-4100)，反应3分钟。用水洗涤载玻片10秒至1分钟3次。添加150μl通用苏木精溶液(Sigma-Aldrich)染色20秒至1分钟。用水清洗15秒钟(或更久)3次。加150μl通用密封胶(Vector Lab)盖玻片。整个染色在10分钟之内完成。其组织染色的显微照片图2所示：本发明的多聚过氧化物酶-GFAP偶联物在脑瘤冰冻切片上在10分钟内快速染色，脑星形胶质细胞其细胞浆被特异染色。

实施例4.多聚过氧化物酶-EMA抗体偶联物染色

将多聚过氧化物酶/EMA偶联物稀释到适当浓度(1-30微克/毫升)并添加到经过如上预处理的冰冻肾组织切片上，反应3至5分钟。用磷酸洗涤缓冲液(PBS)洗涤切片3次共20秒。添加底物通用DAB染色溶液(Vector Lab，SK-4100)，反应3分钟。用水洗涤载玻片10秒至1分钟3次。添加150μl通用苏木精溶液(Sigma-Aldrich)染色20秒至1分钟。用水清洗15秒钟(或更久)3次。加150μl通用密封胶(Vector Lab)盖玻片。整个染色在10分钟之内完成。其组织染色的显微照片如图3所示：本发明的多聚过氧化物酶-EMA偶联物在冰冻的肾组织切片的10分钟快速染色，肾实质癌细胞浆被特异染色。

实施例5.多聚过氧化物酶-突触蛋白抗体偶联物染色

将多聚过氧化物酶/突触蛋白抗体偶联物稀释到适当浓度(1-30微克/毫升)并添加到经过如上预处理的冰冻肝组织切片上，反应3至5分钟。用磷酸洗涤缓冲液(PBS)洗涤切片3次共20秒。添加底物通用DAB染色溶液(Vector Lab，SK-4100)，反应3分钟。用水洗涤载玻片10秒至1分钟3次。添加150μl通用苏木精溶液(Sigma-Aldrich)染色20秒至1分钟。用水清洗15秒钟(或更久)3次。加150μl通用密封胶(Vector Lab)盖玻片。整个染色在10分钟之内完成。其组织染色的显微照片如图4所示：本发明的多聚过氧化物酶-Synaptophysin偶联物在肝组织冰冻切片上在10分钟内快速染色，神经内分泌瘤细胞浆特异染色。

实施例6.本发明的示例性多聚过氧化物酶-抗体偶联物的组合对低级别胶质瘤的连续冰冻切片中的染色

分别将多聚过氧化物酶-Pan-CK偶联物、多聚过氧化物酶-GFAP抗体偶联物、多聚过氧化物酶-EMA偶联物、多聚过氧化物酶/突触蛋白抗体偶联物稀释到适当浓度(1-30微克/毫升)并添加到经过如上预处理的一系列被经典病理学诊断为低级别胶质瘤的冰冻切片上，分别反应3至5分钟。各切片用磷酸洗涤缓冲液(PBS)洗涤切片3次共20秒。各切片分别添加底物通用DAB染色溶液(Vector Lab，SK-4100)，反应3分钟。分别用水洗涤载玻片10秒至1分钟3次。各切片分别添加150μl通用苏木精溶液(Sigma-Aldrich)染色20秒至1分钟，然后用水清洗15秒钟(或更久)3次。各切片分别加150μl通用密封胶(Vector Lab)盖玻片。整个染色在10分钟之内完成。一系列低级别胶质瘤冰冻切片的组织染色的显微照片如图5A-5E所示：5A.多聚过氧化物酶-抗Pan-CK抗体偶联物染色结果，低级别胶质瘤呈阴性；5B多聚过氧化物酶-抗GFAP抗体偶联物，低级别胶质瘤呈阳性；5C.多聚过氧化物酶-抗突触蛋白抗体偶联物染色染色结果，低级别胶质瘤呈弱阳性；5D.多聚过氧化物酶-抗EMA抗体偶联物染色染色结果，低级别胶质瘤呈阴性；5E.H&E染色对照。

由上述结果可知，本示例性多聚过氧化物酶-抗体偶联物的组合的诊断结果与经典病理诊断结果一致。

实施例7.本发明的示例性多聚过氧化物酶-抗体偶联物的组合对高级别胶质瘤的连续冰冻切片中的染色

分别将多聚过氧化物酶-Pan-CK偶联物、多聚过氧化物酶-GFAP抗体偶联物、多聚过氧化物酶-EMA偶联物、多聚过氧化物酶-突触蛋白抗体偶联物稀释到适当浓度(1-30微克/毫升)并添加到经过如上预处理的一系列被经典病理学诊断为高级别胶质瘤的冰冻切片上，分别反应3至5分钟。各切片用磷酸洗涤缓冲液(PBS)洗涤切片3次共20秒。各切片分别添加底物通用DAB染色溶液(Vector Lab，SK-4100)，反应3分钟。分别用水洗涤载玻片10秒至1分钟3次。各切片分别添加150μl通用苏木精溶液(Sigma-Aldrich)染色20秒至1分钟，然后用水清洗15秒钟(或更久)3次。各切片分别加150μl通用密封胶(Vector Lab)盖玻片。整个染色在10分钟之内完成。一系列高级别胶质瘤冰冻切片的组织染色的显微照片如图6A-6E所示：6A.多聚过氧化物酶-抗Pan-CK抗体偶联物染色染色结果，高级别胶质瘤呈阴性；6B多聚过氧化物酶-抗GFAP抗体偶联物染色结果，高级别胶质瘤呈阳性；6C.多聚过氧化物酶-抗EMA抗体偶联物染色染色结果，高级别胶质瘤呈阴性；6D.多聚过氧化物酶-抗突触蛋白抗体偶联物染色染色结果，高级别胶质瘤呈阴性；6E.H&E染色对照。由上述结果可知，本示例性多聚过氧化物酶-抗体偶联物的组合的诊断结果与经典病理诊断结果一致。

实施例8.本发明的示例性多聚过氧化物酶-抗体偶联物的组合对转移癌的连续冰冻切片中的染色

分别将多聚过氧化物酶-Pan-CK偶联物、多聚过氧化物酶-GFAP抗体偶联物、多聚过氧化物酶-EMA偶联物、多聚过氧化物酶-突触蛋白抗体偶联物稀释到适当浓度(1-30微克/毫升)并添加到经过如上预处理的一系列被经典病理学诊断为转移癌的冰冻切片上，分别反应3至5分钟。各切片用磷酸洗涤缓冲液(PBS)洗涤切片3次共20秒。各切片分别添加底物通用DAB染色溶液(Vector Lab，SK-4100)，反应3分钟。分别用水洗涤载玻片10秒至1分钟3次。各切片分别添加150μl通用苏木精溶液(Sigma-Aldrich)染色20秒至1分钟，然后用水清洗15秒钟(或更久)3次。各切片分别加150μl通用密封胶(Vector Lab)盖玻片。整个染色在10分钟之内完成。一系列对转移癌的冰冻切片的组织染色的显微照片如图7A-7E所示：7A.多聚过氧化物酶-抗Pan-CK抗体偶联物染色，转移癌细胞呈阳性；7B.多聚过氧化物酶-抗EMA抗体偶联物染色，转移癌呈弱阳性；7C.多聚过氧化物酶-抗GFAP抗体偶联物染色结果，转移癌呈阴性；7D.多聚过氧化物酶-抗突触蛋白抗体偶联物染色,转移癌呈阴性；7E.H&E染色对照。由上述结果可知，本示例性多聚过氧化物酶-抗体偶联物的组合的诊断结果与经典病理诊断结果基本上一致。

如上抗体组合仅仅是示例性的，另外，其亦可偶联其它多聚酶，运用不同颜色的反应底物可以在同一张切片组织上染上不同颜色，进行肿瘤的相关鉴别和定位。

文献索引

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[8]Xuebin Zhang,Jiayu Liu,Xiaoling Yan,Rapid intraoperativeimmunocytochemistry of central nervous system tumors,Int J Clin ExpPathol.2020；13(1):44-48.

Claims (14)

1.多聚酶-抗体偶联物的组合，其特征在于每个多聚酶-抗体偶联物包含：

(i)一个或多个多聚酶；

(ii)至少一个识别目标分析物的抗体，

其中每个多聚酶都具有多个酶分子，其中每个多聚酶-抗体偶联物包含数目不一的酶和抗体，其分子量大小形成多散型分布，其中所述多聚酶-抗体偶联物在400kDa至2,000kDa范围内的各个区间具有不同分子量和不同三维结构，其中所述多聚酶-抗体偶联物在400-600kDa间其数目占整个分子量范围数目的2％-8％，在600-800kDa之间占5％-10％，在800-1000kDa之间占6％-13％，在1000-1200kDa之间占7％-14％，在1200-1400kDa之间占9-16％，在1400-1600kDa之间占10-18％，在1600-2000kDa之间占12-18％，并且其中所述多聚酶-抗体偶联物选自：多聚酶/Pan-CK抗体偶联物、多聚酶/GFAP抗体偶联物、多聚酶/EMA抗体偶联物、多聚酶/突触蛋白抗体偶联物、和多聚酶/Ki-67抗体偶联物。

2.根据权利要求1所述的多聚酶-抗体偶联物的组合，其中所述多聚酶选自辣根过氧化物酶(HRP)、β-D-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶、超氧化物歧化酶、荧光素酶、乳酸脱氢酶、半乳糖氧化酶。

3.根据权利要求1所述的多聚酶-抗体偶联物的组合，其包含多聚过氧化物酶-Pan-CK抗体偶联物、多聚过氧化物酶-GFAP抗体偶联物、多聚过氧化物酶-EMA抗体偶联物、和多聚过氧化物酶-突触蛋白抗体偶联物。

4.根据权利要求3所述的多聚酶-抗体偶联物的组合，所述组合由多聚过氧化物酶-Pan-CK抗体偶联物、多聚过氧化物酶-GFAP抗体偶联物、多聚过氧化物酶-EMA抗体偶联物、和多聚过氧化物酶-突触蛋白抗体偶联物组成。

5.试剂盒，其包含：权利要求1-4中任一项所述的多聚酶-抗体偶联物的组合，和使用说明书。

6.权利要求5所述的试剂盒，进一步包含多聚酶分子的底物。

7.权利要求1-4中任一项所述的多聚酶-抗体偶联物的组合在制备用于术中鉴别组织样品中脑瘤的类型或等级的试剂或试剂组合或试剂盒中的应用。

8.权利要求7所述的应用，其中所述组织样品为手术样品。

9.权利要求7所述的应用，其中所述组织样品包括石蜡或冰冻组织切片。

10.权利要求1-4中任一项所述的多聚酶-抗体偶联物的组合在制备用于区分脑瘤与转移癌的试剂或试剂组合或试剂盒中的应用。

11.权利要求10所述的应用，其中所述脑瘤选自神经胶质瘤、脑膜瘤或髓母细胞瘤。

12.权利要求1-4中任一项所述的多聚酶-抗体偶联物的组合在制备用于鉴别和/或区分神经胶质瘤、脑膜瘤、和髓母细胞瘤的试剂或试剂组合或试剂盒中的应用。

13.权利要求1-4中任一项所述的多聚酶-抗体偶联物的组合在制备用于确定肿瘤和/或转移癌组织手术切除边际阴性的试剂或试剂组合或试剂盒中的应用。

14.权利要求13所述的应用，其中所述肿瘤为脑肿瘤。

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