TW202208855A - Ｂ７—ｈ３表現之免疫組織化學評估 - Google Patents
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Abstract
本發明係有關於一種使用免疫組織化學方法提供一抗體或其抗原結合片段之功效及/或安全性之一生物標記物的方法。使用石蠟包埋樣品結合一鼠類8H9抗體之先前免疫組織化學方法尚未提供令人滿意之結果。本發明揭露一種可以使用冷凍樣品以及石蠟包埋樣品兩者之方法。進一步，本發明係有關於一種適用於執行本發明之方法的部件套組。此外，本發明係有關於一種治療癌症之方法，其包含測量或證實一抗體或其抗原結合片段之功效、適合性及/或安全性的一生物標記物，其中所述抗體或其抗原結合片段係用於治療所述癌症。
Description
發明領域
本發明係有關於一種使用免疫組織化學方法提供或測量一抗體或其抗原結合片段之功效及/或安全性之一生物標記物的方法。本發明進一步係有關於一種免疫組織化學方法，其用於檢測並選擇性地定量B7-H3之過度表現，以選擇基於放射免疫療法、免疫療法或細胞療法可能受益於B7-H3抗體或其抗原結合片段的患者。更具體地，本發明係有關於一種用於提供或測量一生物標記物的方法，其基於B7-H3表現評估一抗體或其抗原結合片段在治療一個體中的癌症或治療癌症的一特定適應症，諸如卵巢癌，之功效及/或安全性。本發明進一步揭露一種用於測量或定性一B7-H3抗體或其抗原結合片段之臨床益處的方法。此外，本發明揭露一種藉由使用一鼠類8H9抗體檢測在一包含癌細胞之組織樣品中的B7-H3表現的方法。 此外，本發明係有關於一種適用於執行本發明之方法的部件套組。此外，本發明係有關於一種治療癌症的方法，其包含提供或測量一用於測量及/或證實一抗體或其抗原結合片段之適合性、功效及/或安全性的一生物標記物，其中所述抗體係用於所述治療中。一特定效用係來自於對高度表現B7H3腫瘤使用放射免疫療法之經證明的臨床益處，以及確定益處並選擇具有異質性表現(在患者之間及在腫瘤組織之間，以及在腫瘤組織中的定位)之患者的需求。
發明背景
抗B7-H3小鼠單株抗體8H9已成功地被用於患有B7-H3陽性腫瘤之患者的放射免疫療法。靶向B7-H3蛋白質的鼠類8H9抗體與人類實體腫瘤廣泛地反應，包括胚胎細胞腫瘤以及癌瘤。在異種移植模型中，其對肉瘤及腦瘤兩者顯示出有利的腫瘤攝取。當綴合至眼鏡蛇毒因子時，其誘發有效的補體介導腫瘤溶解。在臨床前模型中，其以單鏈Fv (scFv)形式將一有效力的免疫毒素靶向肉瘤及神經膠質瘤。作為一嵌合抗原受體，其重新定向自然殺手細胞以殺死B7-H3陽性腫瘤細胞。在早期人類臨床試驗中，已顯示放射性標記鼠類8H9抗體可以延長患有中樞神經系統(CNS)轉移之具有實體腫瘤之高風險患者的存活時間。對於軟腦膜轉移癌、瀰漫性內因性橋腦神經膠質瘤以及腹膜轉移癌之放射免疫療法而言，其係一有前景的靶標(Ahmed et al. Humanized Affinity-matured Monoclonal Antibody 8H9 Has Potent Antitumor Activity and Binds to FG Loop of Tumor Antigen B7-H3, The Journal of Biological Chemistry Vol. 290, NO. 50, pp. 30018-30029, December 11, 2015)。
人類B7-H3，亦稱為CD276，係以2Ig-B7-H3及4Ig-B7-H3兩種同功異型物存在。其在神經母細胞瘤中高度表現，但不一定會在其他類型的癌症中高度表現。已顯示鼠類mAb 8H9會結合至在B7-H3之2Ig-及4Ig-B7-H3兩者同功異型物上的一個獨特表位，亦即包括“IRDF”序列基元之FG環(Ahmed et al. Humanized Affinity-matured Monoclonal Antibody 8H9 Has Potent Antitumor Activity and Binds to FG Loop of Tumor Antigen B7-H3, The Journal of Biological Chemistry Vol. 290, NO. 50, pp. 30018-30029, December 11, 2015)。鑒於使用鼠類8H9抗體對B7-H3陽性腫瘤之放射免疫療法的臨床實用性，需要一種測試來檢測哪些患者將受益於一B7-H3導向治療。迄今為止，使用一鼠類8H9抗體檢測B7-H3表現之已知免疫組織化學技術尚未在諸如石蠟包埋樣品之樣品上提供令人滿意的結果。
Loos等人(Expression of the costimulatory molecule B7-H3 is associated with prolonged survival in human pancreatic cancer, BMC Cancer 9, 2009) 使用一不同的抗B7-H3抗體進行免疫組織化學分析，檢驗在患有胰臟癌之人類患者中的B7-H3表現(MAB 1027, R&D Systems, Minneapolis, MN)。抗原修復係在檸檬酸鹽緩衝液中藉由微波前處理而達成。使用二甲苯將3 µm厚的石蠟包埋胰臟組織切片去石蠟，並透過分級酒精再水合成蒸餾水。在Tris緩衝鹽水中洗滌之後，藉由將該等玻片培養在含有3%過氧化氫之甲醇中而淬滅內源性過氧化酶活性。使用TBS/3%BSA處理玻片，以阻斷二級抗體的非特異性活性。與該一級抗體，亦即一小鼠抗人類B7-H3抗體，在4°C下培養整夜之後，使用Tris緩衝鹽水與0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯洗滌玻片，使用抗小鼠經辣根過氧化酶標記的二級抗體處理1小時，並使用蘇木精複染。在經檢驗的68個胰臟癌組織中，有60個顯示陽性B7-H3蛋白質表現在胰腺癌細胞中。該研究證明腫瘤細胞相關B7-H3表現與術後存活時間延長顯著相關。該研究表明使用B7-H3之治療，例如藉由基因轉移，可能代表一種改善胰臟癌患者之結果的有前景的方法。
Qin等人(B7-H3 is a new cancer-specific endothelial marker in clear cell renal cell carcinoma, OncoTargets and Therapy 2013:6 1667-1673, 2013)使用一不同的抗B7-H3抗體(來自於美國明尼蘇達州明尼亞波利斯市R&D Systems的山羊抗人類B7-H3單株抗體)，藉由免疫組織化學法檢驗在透明細胞腎細胞癌瘤(RCC)之石蠟包埋檢體中的B7-H3表現。比較B7-H3與該泛內皮細胞特異性標記物CD34的表現模式。亦分析來自於所有患者的成對正常腎實質檢體以及4個黃體檢體。福馬林固定石蠟包埋組織被切成5 µm的切片、被去石蠟，並在分級系列之乙醇中再水合。抗原修復係使用一數位修復儀在1 mmol/L、pH 8的乙二胺四乙酸(EDTA)中將組織切片加熱至121°C、冷卻至90°C，並培養5分鐘，且使用過氧化酶阻斷試劑處理而完成。將切片與一對抗B7-H3及CD34之生物素標記多株抗體一起培養，接著與一辣根過氧化酶綴合抗生物素抗體一起培養，並藉由二胺基聯苯胺染色進行顯像。使用蘇木精將切片稍微複染。該研究在19%的透明細胞RCC病例中檢測到癌細胞中的B7-H3表現，並且在98%的病例中確認腫瘤脈管系統中的B7-H3表現。該研究指出B7-H3之瀰漫性血管表現與多種不良臨床及病理特徵相關，諸如較高的TNM分期及核等級。該研究說明在透明細胞RCC群體中的癌細胞特異性B7-H3表現的總機率係＜20%，意味著藉由對抗在癌細胞中表現之B7-H3之試劑所誘發的細胞毒性或抗腫瘤免疫在臨床實務中可能係不充分的。
Zang等人(Tumor associated endothelial expression of B7-H3 predicts survival in ovarian carcinomas, Mod Pathol. 2010)顯示卵巢交界性腫瘤以及癌瘤會異常地表現B7-H3以及B7x，且B7-H3陽性腫瘤脈管系統與高級別漿液性組織學亞型相關，增加複發率並降低存活率。在腫瘤脈管系統中的B7-H4表現可能反映出腫瘤侵襲性，並且對卵巢癌瘤有診斷及免疫治療的意義。
Zhang等人(B7-H3 is related to tumor progression in ovarian cancer, Oncology reports 38, 2017)顯示B7-H3透過Jak2/Stat3路徑影響卵巢癌的進展，指出B7-H3具有成為一有用的預後標記物的潛力。
發明概要
來自於活體組織切片的石蠟包埋樣品已與在Qin等人中所述之山羊抗人類B7-H3抗體以及與在Loos等人中所述之小鼠抗人類B7-H3抗體一起被使用於免疫組織化學(IHC)方法中。進一步地，冷凍樣品已被使用於免疫組織化學方法中。然而，石蠟包埋樣品與一鼠類8H9抗體，諸如一包含根據SEQ ID No. 1之重鏈及根據SEQ ID No. 2之輕鏈的抗體，在此情況下尚未被成功使用。因為冷凍組織樣品具有有限的儲存穩定性，且因為石蠟包埋組織樣品通常可以更佳地保存組織，因此需要一種對石蠟包埋組織樣品起作用之方法。本發明揭露一種可以使用冷凍樣品及石蠟包埋樣品兩者之方法，且其可通用於IHC之領域中。
一IHC技術可被用於每個個別患者。可從一個別患者收集多個樣品，並分析B7-H3之表現。
B7-H3在神經母細胞瘤中高度表現。B7-H3不一定會在其他類型的癌症中高度表現。舉例而言，Zang等人已顯示卵巢交界性腫瘤以及癌瘤會異常地表現B7-H3。 因此，需要一種試驗以區別可受益於靶向B7-H3之治療的群體或個體。
由於該B7-H3表現在正常組織上係低的，因此本發明之試驗可幫助確定用於可受益於靶向B7-H3之治療的群體或個體的最高可能劑量。
需要一種免疫組織化學方法，其允許對諸如B7-H3抗體之特異性抗體之功效及/或安全性及/或臨床益處的一生物標記物進行測量、檢測及/或評估。進一步需要一種基於放射免疫療法、免疫療法或細胞療法來檢測哪個患者可能受益於B7-H3抗體或其抗原結合片段之方法。特別地，需要這樣一種方法，其可被使用於至少一個石蠟包埋組織樣品或一先前被包埋在石蠟中的樣品。
於特定的實施態樣中，該抗B7-H3抗體或其抗原結合片段係一在國際公開號WO 02/32375、WO 2003/033670、WO 03/075846、WO 2008/116219、WO 2016/033225及WO 2018/209346中所揭露之抗體或其抗原結合片段，藉由引用將其全部內容併入本文。
根據一個態樣，本發明涉及一種用於檢測一抗原在至少一個包含癌細胞或潛在地包含癌細胞之組織樣品中的表現及/或過度表現的方法，其中所述樣品係選自於一解凍樣品、一冷凍樣品、一新鮮樣品、一石蠟包埋樣品、一福馬林包埋樣品，及/或一先前已被包埋在福馬林及/或石蠟中的樣品。
一「解凍樣品」係一已被冷凍但不再冷凍之樣品。 一「石蠟包埋樣品」係一被包埋在石蠟中的樣品。一「福馬林包埋樣品」係一被包埋在福馬林中的樣品。一樣品可屬於多於一個類別，例如一石蠟包埋樣品亦可以係一解凍樣品，以及一被包埋在福馬林中的樣品亦可以被包埋在石蠟中。
根據另一個態樣，本發明涉及一種用於檢測一表位在一包含癌細胞或潛在地包含癌細胞之組織樣品中的表現及/或過度表現的方法，其中所述樣品較佳地係一先前已被包埋在福馬林及/或石蠟中的樣品，且其中所述方法包含以下步驟：
i. 使用一酶阻斷物質進行酶阻斷，
ii. 使用一蛋白質阻斷物質進行蛋白質阻斷，
iii. 與一一級抗體結合，
iv. 與一二級抗體培養，以及
v. 使用一染色劑進行染色。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述表位係B7-H3抗原的一表位。間接證據顯示8H9結合至在B7H3中的“IRDF”序列。4Ig-B7H3(較常見的同功異型物)具有2個IRDF基元(因為4Ig B7H3係兩個2Ig-B7H3序列的一重複)。該“IRDF”序列係位於該FG環上，該FG環被認為是對蛋白質之B7家族之功能至關重要的一區域。
根據另一個態樣，本發明涉及一種用於提供及/或測量一抗體或其抗原結合片段在治療一個體中的癌症之功效及/或安全性之一生物標記物的方法，其中該方法係在一包含癌細胞之組織樣品上進行。
根據另一個態樣，本發明涉及一種用於檢測一抗體或其抗原結合片段在治療一個體中的癌症之臨床益處的方法，其中該方法係在一包含癌細胞之組織樣品上進行。
根據此態樣，該個體係一特定的個體或者一特定的癌症患者，因為該方法係將用於每個個別患者。
根據另一個態樣，本發明涉及一種用於提供及/或測量一抗體或其抗原結合片段在治療癌症的一適應症之功效及/或安全性之一生物標記物的方法，其中該方法係在包含癌細胞之組織樣品上進行。
根據另一個態樣，本發明涉及一種包含一抗體或其抗原結合片段之嵌合抗原受體(CAR)，其中所述嵌合抗原受體係根據本發明之方法被使用。
根據另一個態樣，本發明涉及一種表現該CAR之CAR-T細胞。
根據另一個態樣，本發明涉及一種該等CAR-T細胞之群體。
根據另一個態樣，本發明涉及一種包含CAR-T細胞之群體的組成物。
根據另一個態樣，本發明涉及一種治療一個體中的癌症的方法，其中該方法包含提供一抗體或其抗原結合片段之功效及/或安全性的一生物標記物，且其中所述抗體或其抗原結合片段係用於所述治療中。
根據另一個態樣，本發明涉及一種用於治療一個體中的癌症的方法，其中該方法包含使用一抗體或其抗原結合片段，且其中該適應症，諸如卵巢癌，使用所述抗體或其抗原結合片段治療所述癌症係藉由本發明之方法所確定或確認。
根據另一個態樣，本發明涉及一種用於治療一個體中的癌症的方法，其中該方法包含評估一抗體或其抗原結合片段的臨床益處，包含使用本發明之方法，且其中該臨床益處係對一患者的臨床益處，且其中所述抗體或其抗原結合片段係用於所述治療中。
根據另一個態樣，本發明涉及一種用於治療一個體中的癌症的方法，其中該方法包含提供一抗體或其抗原結合片段在一包含癌細胞之組織樣品中之功效及/或安全性的一生物標記物，包含使用本發明之方法，且其中所述抗體或其抗原結合片段係用於所述治療中。
根據另一個態樣，本發明涉及一種診斷一個體中的癌症的方法，其中該方法包含提供一抗體或其抗原結合片段之功效及/或安全性的一生物標記物，且其中所述抗體或其抗原結合片段係用於所述診斷中。
根據另一個態樣，本發明涉及一種用於診斷一個體中的癌症的方法，其中該方法包含使用一抗體或其抗原結合片段，且其中使用所述抗體或其抗原結合片段診斷所述癌症係藉由本發明之方法所確定或確認。
根據另一個態樣，本發明涉及一種用於診斷一個體中的癌症的方法，其中該方法包含評估一抗體或其抗原結合片段的臨床益處，包含使用本發明之方法，且其中該臨床益處係對一患者的臨床益處，且其中所述抗體或其抗原結合片段係用於所述診斷中。
根據另一個態樣，本發明涉及一種用於診斷一個體中的癌症的方法，其中該方法包含提供一抗體或其抗原結合片段在一包含癌細胞之組織樣品中之功效及/或安全性的一生物標記物，包含使用根據本發明之方法，且其中所述抗體或其抗原結合片段係用於所述診斷中。
根據另一個態樣，本發明涉及一種用於在癌症治療中使用之抗體或其抗原結合片段，其中該使用包含提供該抗體或其抗原結合片段之功效及/或安全性的一生物標記物。
根據另一個態樣，本發明涉及一種在癌症治療中使用之抗體或其抗原結合片段，其中使用所述抗體或其抗原結合片段治療所述癌症係藉由本發明之方法所確定或確認。
根據另一個態樣，本發明涉及一種在癌症治療中使用之抗體或其抗原結合片段，其中該使用包含評估該抗體或其抗原結合片段的臨床益處，包含使用本發明之方法，且其中該臨床益處係對一患者的臨床益處。
根據另一個態樣，本發明涉及一種在癌症治療中使用之抗體或其抗原結合片段，其中該使用包含提供該抗體或其抗原結合片段在一包含癌細胞之組織樣品中之功效及/或安全性的一生物標記物，包含使用本發明之方法。
根據另一個態樣，本發明涉及一種在癌症診斷方法中使用之抗體或其抗原結合片段，其中該使用包含提供該抗體或其抗原結合片段之功效及/或安全性的一生物標記物。
根據另一個態樣，本發明涉及一種在癌症診斷方法中使用之抗體或其抗原結合片段，且其中使用所述抗體或其抗原結合片段診斷所述癌症係藉由根據本發明之方法所確定或確認。
根據另一個態樣，本發明涉及一種在癌症診斷方法中使用之抗體或其抗原結合片段，其中該使用包含評估該抗體或其抗原結合片段的臨床益處，包含使用根據本發明之方法，且其中該臨床益處係對一患者的臨床益處。
根據另一個態樣，本發明涉及一種在癌症診斷方法中使用之抗體或其抗原結合片段，其中該使用包含提供一抗體或其抗原結合片段在一包含癌細胞之組織樣品中之功效及/或安全性的一生物標記物，包含使用本發明之方法。
根據另一個態樣，本發明涉及一種適用於執行本發明之方法的部件套組。
根據另一個態樣，本發明涉及一種部件套組，其中所述套組係將用於確定或定性一抗體或其抗原結合片段之功效及/或安全性的一生物標記物，其中所述抗體或其抗原結合片段係將用於治療一癌症。
根據另一個態樣，本發明涉及一種部件套組，其中所述套組係將用於確定或定性一患者從使用一抗原或其抗原結合片段之治療所具有或將具有的臨床益處，且其中所述患者係一癌症患者。
根據另一個態樣，本發明涉及一種部件套組，其中所述套組係將用於確定或定性一抗體或其抗原結合片段在治療癌症的一適應症之功效及/或安全性的一生物標記物。
根據另一個態樣，本發明涉及一種部件套組，其中所述套組係用於檢測在一包含癌細胞之組織樣品中的B7-H3表現，且其中所述樣品係選自於一已被包埋在石蠟中的樣品以及一已被冷凍的樣品。
根據另一個態樣，本發明涉及一種用於治療一個體中的癌症的方法，其中該方法包含使用本發明之套組。
根據另一個態樣，本發明涉及一種治療卵巢癌之方法，其包含向有需要之患者投與一治療有效量之根據本發明之抗體或其抗原結合片段。
根據另一個態樣，本發明涉及一種治療胃癌之方法，其包含向有需要之患者投與一治療有效量之根據本發明之抗體或其抗原結合片段。
根據另一個態樣，本發明涉及一種抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含選自於根據SEQ ID No. 3之重鏈可變區CDR1、根據SEQ IN No. 4或19之重鏈可變區CDR2、根據SEQ ID No. 5之重鏈可變區CD3、根據SEQ ID No. 6之輕鏈可變區CDR1、根據SEQ ID No. 7之輕鏈可變區CDR2及根據SEQ ID No. 8之輕鏈可變區CDR3之序列的至少一者。
根據另一個態樣，本發明涉及一種抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列。
根據另一個態樣，本發明涉及一種抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含一重鏈序列，其係與SEQ ID No. 1所示之序列具有至少約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約 97%、約98%或約99%的序列一致性，及/或一輕鏈序列，其係與SEQ ID No. 2所示之序列具有至少約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約 97%、約98%或約99%的序列一致性。
根據另一個態樣，本發明涉及一種用於治療卵巢癌之根據本發明之抗體或其抗原結合片段。
根據另一個態樣，本發明涉及一種用於治療胃癌之根據本發明之抗體或其抗原結合片段。
詳細揭示
根據一個實施態樣，本發明涉及一種用於檢測一抗原在至少一個包含癌細胞或潛在地包含癌細胞之組織樣品中的表現及/或過度表現的方法，其中所述樣品係選自於一解凍樣品、一冷凍樣品、一新鮮樣品、一石蠟包埋樣品、一福馬林包埋樣品，及/或一先前已被包埋在福馬林及/或石蠟中的樣品。
一「解凍樣品」係一已被冷凍但不再冷凍之樣品。 一「石蠟包埋樣品」係一被包埋在石蠟中的樣品。一「福馬林包埋樣品」係一被包埋在福馬林中的樣品。一樣品可屬於多於一個類別，例如一石蠟包埋樣品亦可以係一解凍樣品，以及一被包埋在福馬林中的樣品亦可以被包埋在石蠟中。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種用於檢測一表位在一包含癌細胞或潛在地包含癌細胞之組織樣品中的表現及/或過度表現的方法，其中所述樣品較佳地係一先前已被包埋在福馬林及/或石蠟中的樣品，且其中所述方法包含以下步驟：
i. 使用一酶阻斷物質進行酶阻斷，
ii. 使用一蛋白質阻斷物質進行蛋白質阻斷，
iii. 與一一級抗體結合，
iv. 與一二級抗體培養，以及
v. 使用一染色劑進行染色。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述表位係B7-H3抗原的一表位。
間接證據顯示8H9結合至在B7H3中的“IRDF”序列。4Ig-B7H3(較常見的同功異型物)具有2個IRDF基元(因為4Ig B7H3係兩個2Ig-B7H3序列的一重複)。該“IRDF”序列係位於該FG環上，該FG環被認為是對蛋白質之B7家族之功能至關重要的一區域。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述一級抗體具有約30 μg/ml之濃度，且其中所述與一一級抗體結合係在約4°C下執行，及/或其中所述結合係執行約4-24小時。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述方法進一步包含以下步驟：
i. 使用Tris-EDTA進行抗原修復，其中所述Tris-EDTA具有約9的pH值及/或約100°C的溫度。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述抗原修復係執行約1-30分鐘、5-25分鐘、10-20分鐘或較佳地約15-20分鐘。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述抗原修復係執行約15分鐘。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述抗原修復係執行約20分鐘。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述方法進一步包含在室溫下冷卻所述組織樣品的一步驟，其中所述冷卻係在所述抗原修復之後進行。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述冷卻係進行約1-30分鐘、約10-25分鐘、約15-20分鐘或較佳地約20分鐘。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述組織樣品係來自於一個體，且其中所述方法係用於評估所述個體是否可受益於一療法，其中所述療法係選自於放射免疫療法、免疫療法或細胞療法。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述抗原係一B7-H3抗原。
B7-H3亦稱為CD276。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述B7-H3抗原包含SEQ ID No. 17及/或18之序列。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述B7-H3抗原包含選自於根據SEQ ID No. 15之肽及根據SEQ ID No. 16之肽的至少一種肽。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述方法使用抗體以檢測在所述組織樣品之細胞中的蛋白質。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述一級抗體係一抗B7H3抗體。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中一抗B7-H3抗體或其抗原結合片段係用於檢測B7-H3表現。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述抗B7-H3抗體或其抗原結合片段包含選自於根據SEQ ID No. 3之重鏈可變區CDR1、根據SEQ IN No. 4或19之重鏈可變區CDR2、根據SEQ ID No. 5之重鏈可變區CD3、根據SEQ ID No. 6之輕鏈可變區CDR1、根據SEQ ID No. 7之輕鏈可變區CDR2及根據SEQ ID No. 8之輕鏈可變區CDR3之序列的至少一者。
該CDRs係指一抗體的互補決定區胺基酸序列。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述抗B7-H3抗體或其抗原結合片段包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述抗B7-H3抗體或其抗原結合片段包含一重鏈序列，其係與SEQ ID No. 1所示之序列具有至少約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約 97%、約98%或約99%的序列一致性，及/或一輕鏈序列，其係與SEQ ID No. 2所示之序列具有至少約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約 97%、約98%或約99%的序列一致性。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述其抗原結合片段係一單鏈可變片段(scFv)。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述scFv包含SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 13或SEQ ID No. 14所示之胺基酸序列的一部分。
該8H9 scFv基因序列之有義股係由SEQ ID No. 10所表示，互補股係由SEQ ID No. 11所表示，以及cDNA係由SEQ ID No. 12所表示。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述scFv包含該等胺基酸取代K13E、R18Q、R45Q、K103E及K107E之至少一者。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述抗B7-H3抗體或其抗原結合片段係一鼠類8H9抗體或一其抗原結合片段。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述抗體或其抗原結合片段係經人源化。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述抗體或其抗原結合片段係一嵌合抗體或一其抗原結合片段。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述抗體或其抗原結合片段係經放射性標記。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述放射性標記係選自於一α或β發射放射性治療標記、一PET標記以及一SPECT標記。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述α或β發射標記係選自於131
I、177
Lu、228
Th、225
Ac、227
Ra。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述PET標記係選自於124
I、18
F、64
Cu、68
Ga、11
C、225
Ac及89
Zr。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述SPECT標記係選自於131
I、177
Lu、99
mTc、64
Cu及99
mTc。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述抗體或其抗原結合片段係綴合至一螯合劑化合物。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述螯合劑化合物係結合至一放射性同位素。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述放射性同位素係選自於124
I、131
I及177
Lu或99
mTc、64
Cu (螯合至NOTA)及89
Zr (螯合至DFO)。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述螯合劑化合物係選自於DOTA、DTPA、NOTA及DFO。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述DOTA係DOTA的一變異體。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述DTPA係DTPA的一變異體。DOTA亦稱為1,4,7,10-四氮雜環十二烷-1,4,7,10-四乙酸，且具有分子式(CH2CH2NCH2CO2H)4。
DTPA具有IUPAC名稱為2-[雙[2-[雙(羧甲基)胺基]乙基]胺基]乙酸。DTPA具有分子式C14H23N3O10。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述方法可被用於至少一個先前已被包埋在石蠟中的樣品，以及一個先前已被冷凍的樣品。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述方法進一步包含一或多個沖洗步驟，較佳地其中至少一個沖洗步驟係使用水。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述水係d2H2O。
d2H2O亦稱為再蒸餾水。根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述步驟中的一或多個或所有係藉由使用至少一種洗滌緩衝液進行洗滌而分離。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述步驟中的一或多個或所有係藉由使用至少一種洗滌緩衝液進行至少一次洗滌而分離。
一洗滌可被定義為將一足夠量之可溶性試劑，較佳地係一緩衝液，添加至一組織樣品並且再次移除該可溶性試劑，較佳地係緩衝液。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述步驟中的一或多個或所有係藉由使用至少一種洗滌緩衝液進行至少兩次洗滌而分離。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述步驟中的一或多個或所有係藉由使用至少一種洗滌緩衝液進行至少三次洗滌而分離。根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中每次洗滌係執行約1-5分鐘、約2-4分鐘或較佳地約3分鐘。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中每次洗滌係執行約0.1分鐘-2分鐘、0.5分鐘-1.5分鐘或較佳地約1分鐘。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述洗滌緩衝液係磷酸鹽緩衝鹽水。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述洗滌緩衝液係0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述酶阻斷物質係一過氧化酶阻斷物。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述過氧化酶阻斷物係配於d2H2O的3% H2
O2
。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述蛋白質阻斷物質係酪蛋白溶液。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述酶阻斷係執行1-60分鐘、2-55分鐘、3-50分鐘、4-45分鐘、5-40分鐘、6-35分鐘、7-30分鐘、8-25分鐘、9-20分鐘、10-15分鐘或約10分鐘。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述蛋白質阻斷係執行1-60分鐘、5-55分鐘、10-50分鐘、15-45分鐘、20-40分鐘、25-35分鐘，或約30分鐘。根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述方法進一步包含與一擴增該一級抗體之訊號的試劑培養的一步驟。
一擴增該一級抗體之訊號的試劑可以係EnvisionTM
Flex + Mouse (連接子)。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述擴增該一級抗體之訊號的試劑係一抗體聚合物。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述與一擴增該一級抗體之訊號的試劑培養係執行約1-30分鐘、約5-25分鐘、約10-20分鐘或較佳地約15分鐘。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述擴增該一級抗體之訊號的試劑增強該訊號至少2倍、至少3倍、至少4倍或較佳地係至少5倍。 根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述與一一級抗體結合係執行1-48小時、4-44小時、8-40小時、12-36小時、16-32小時、20-28小時或約24小時。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述與一一級抗體結合係執行1-240分鐘、30-110分鐘、60-180分鐘、90-150分鐘或約120分鐘。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述與一一級抗體結合係執行約120分鐘或約24小時。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述與一一級抗體結合係執行一段時間以允許至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或至少99%之該等抗原與該一級抗體結合。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述一級抗體係任何前述抗體或者一IgG1抗體。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述IgG1抗體係一小鼠IgG1抗體。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述一級抗體具有1-60 μg/ml、5-55 μg/ml、10-50 μg/ml、15-45 μg/ml、20-40 µg/ml、25-35 µg/ml或約30 µg/ml之濃度。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述一級抗體具有1-40 μg/ml、3-35 μg/ml、10-30 μg/ml、15-25 μg/ml或較佳地約20 µg/ml之濃度。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述二級抗體係綴合至一經標記聚合物。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述經標記聚合物係一經辣根過氧化酶標記的聚合物。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述二級抗體係一抗小鼠抗體。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述與一二級抗體培養係執行1-120分鐘、10-110分鐘、20-100分鐘、30-90分鐘、40-80分鐘、50-70分鐘或約60分鐘。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述與一二級抗體培養係執行1-240分鐘、10-230分鐘，20-220分鐘、30-210分鐘、40-200分鐘、50-190分鐘、60-180分鐘、70-170分鐘、80-160分鐘、90-150分鐘、100-140分鐘、110-130分鐘或較佳地約120分鐘。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述染色劑係一聯苯胺。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述聯苯胺係3,3’-二胺基聯苯胺。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述使用一染色劑進行培養係執行1-6分鐘、1.5-5.5分鐘、2-5分鐘、2.5-4.5分鐘、3-4分鐘或約3分鐘。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述使用一染色劑進行培養係執行約1-10分鐘、約1-9分鐘、約2-7分鐘或較佳地約3-5分鐘。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其包含一步驟，其中所述組織樣品係被一複染劑複染。
一複染劑係一用於提供對比之物質，使得該等經抗體染色之細胞相較於未使用所述複染劑之細胞更引人注目。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述複染劑係蘇木精以及選擇性地伊紅。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述樣品係在複染之後脫水。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述組織樣品係在脫水之後被蓋上蓋玻片。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中一或多個或所有所述步驟係藉由根據本發明之至少一次洗滌而分離。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述步驟係按照以下順序進行：
i. 使用一酶阻斷物質進行酶的阻斷，
ii. 使用一蛋白質阻斷物質進行蛋白質的阻斷，
iii. 與一一級抗體結合，
iv. 與一二級抗體培養，以及
v. 使用一染色劑進行染色。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述組織樣品之製備包含一或多個或所有以下步驟：
1.1 整體整修(Gross trimming)，
1.2 透過分級系列之酒精進行加工，
1.3 組織定位，以及
1.4 包埋在石蠟中。
其中所述步驟係接續著根據本發明之任何步驟。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中該方法包含一或多個或所有以下步驟：
2.1 以切片機切片一石蠟包埋樣品，
2.2 固定於玻片，
2.3 準備染色以及抗體染色，以及
2.4 複染。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述石蠟包埋樣品係經切片機切片成1至7 μm厚、2至6 μm厚或約3至5 μm厚之厚度。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述組織樣品係固定於玻片。
根據一個實施方案，本發明涉及該方法，其中準備染色以及染色包含一或多個或所有以下步驟：
3.1 去石蠟作用，
3.2 水合作用，
3.3 抗原修復，以及
其中所述步驟係接續著阻斷、結合、培養及染色。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述樣品先前已被包埋在石蠟中。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述樣品已被或係被包埋在石蠟中及/或經福馬林固定。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述樣品係經去石蠟。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述抗原修復係藉由一緩衝液而執行。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述緩衝液係Tris-EDTA緩衝液。
EDTA亦稱為乙二胺四乙酸。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述Tris-EDTA緩衝液具有7-10、7.5-9.5、8-9或約9之pH值。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述Tris-EDTA緩衝液係60-140°C、65-135°C、70-130°C、75-125°C、80-120°C、85-115°C、90-110°C、95-105°C或約100°C。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述抗原修復係執行1-60分鐘、2-55分鐘、3-50分鐘、4-45分鐘、5-40分鐘、6-35分鐘、7-30分鐘、8-25分鐘、9-20分鐘、10-15分鐘或約15分鐘。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述步驟係在0-8°C、0.5-7.5°C、1-7°C、1.5-6.5°C、2-6°C、2.5-5.5°C、3-5°C、3.5-4.5°C或約4°C下進行。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述步驟係進行1-48小時、4-44小時、8-40小時、12-36小時、16-32小時、20-28小時或約24小時。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中該等步驟係接續著上述一或多個或所有步驟。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述步驟係按照以下順序進行：
4.1 去石蠟作用
4.2 水合作用
4.3 抗原修復
接續著阻斷、結合、培養及染色。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中該等步驟係按照以下順序進行：阻斷、結合、培養、染色。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述組織樣品之製備包含一或多個或所有以下步驟：
A.1 將所述組織樣品包埋在最佳切割溫度介質中，
A.2 製備一塊所述樣品，
A.3 將所述樣品放置在一密封的塑膠袋或其他合適的容器中，以及
A.4 將所述樣品維持在-20°C以下，
其中所述組織樣品係一冷凍樣品或一解凍樣品。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述組織樣品係一解凍樣品。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述最佳切割溫度介質包含以下一或多個或全部：聚乙烯醇、聚乙二醇，或非反應性成分。根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述樣品係維持在-30°C、-35°C、-40°C、-45°C、-50°C、-55°C、-60°C、-65°C、-70°C、-75°C、-80°C、-85°C、-90°C、-95°C以下或-100°C以下。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述樣品係被切片成1-10 μm厚、1.5-9.5 μm厚、2-9 μm厚、2.5-8.5 μm厚、3-8 μm厚、3.5-7.5 μm厚、4-7 μm厚、4.5-6.5 μm厚、5-6 μm厚之厚度，或約5 µm厚度。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中係使用冷凍切片機將所述樣品切片。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述樣品係被轉移至一帶電的玻片上。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述樣品係被風乾。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述樣品係在室溫下被風乾，其中所述室溫係10°C至40°C。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述室溫係選自於10-40°C、15-35°C、17-33°C、18-30°C、19-27°C或約20- 25°C。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述樣品係被風乾1-48小時、4-44小時、8-40小時、12-36小時、16-32小時、20-28小時或約24小時。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中該方法包含一或多個或所有以下步驟：
B.1 將一組織樣品暴露於室溫，其中所述室溫係10-40°C
B.2 固定該樣品，
其中所述步驟係接續著前述步驟。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述室溫係選自於10-40°C、15-35°C、17-33°C、18-30°C、19-27°C或約20-25°C。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述暴露於室溫係執行1-60分鐘、5-55分鐘、10-50分鐘、15-45分鐘、20-40分鐘、25-35分鐘或約30分鐘。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述樣品係在多聚甲醛中固定。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述樣品係在丙酮中固定。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述丙酮係-10-20°C、-5-15°C、0-10°C、0.5-7°C、1-6°C或2-5°C。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述固定係執行1-20分鐘、5-15分鐘或約10分鐘。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述步驟係接續著前述一或多個或所有步驟。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌細胞係來自於表現或可能表現B7-H3之任何癌症類型的癌細胞。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌細胞係選自於癌瘤、肉瘤，淋巴瘤及白血病癌細胞。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌細胞係選自於神經母細胞瘤、髓母細胞瘤、神經膠質母細胞瘤、小細胞肺癌、非小細胞癌瘤、一小兒肉瘤、一成人肉瘤、乳癌、肝癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌瘤、肺腺癌或胃腸癌細胞。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌細胞係卵巢癌細胞。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述卵巢癌細胞係腺癌細胞。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述腺癌細胞係漿液性腺癌細胞。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述腺癌細胞係漿液性乳頭狀腺癌細胞。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌細胞係胃癌細胞。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述胃癌細胞係胃癌瘤細胞。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述胃癌瘤細胞係胃腺癌細胞。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述胃癌瘤細胞係胃囊腺癌細胞。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌細胞係神經母細胞瘤癌細胞。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌細胞係來自於一轉移瘤、一高風險癌症及/或一復發性癌症。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述方法包含在所述組織樣品上進行之以下步驟：
i. 去石蠟作用
ii. 使用Tris-EDTA緩衝液進行抗原修復，其中所述緩衝液具有9之pH值以及100°C之溫度，且其中所述抗原修復係執行約15分鐘
iii. 冷卻約30分鐘
iv. 在d2H2O中沖洗約1分鐘
v. 使用過氧化酶阻斷物阻斷酶，其中所述過氧化酶阻斷物係配於d2H2O的3% H2
O2
，且其中所述暴露係執行約10分鐘
vi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水沖洗約1分鐘
vii. 使用酪蛋白溶液進行蛋白質的阻斷約30分鐘
viii. 與一一級抗體結合，其中所述一級抗體包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列，或者係一MsIgG1抗體，且其中所述抗體具有30 µg/ml之濃度，且其中所述暴露係將執行約24小時，且其中所述暴露係將在約4°C下執行
ix. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯沖洗約2分鐘
x. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯沖洗約2分鐘
xi. 與一綴合至一辣根過氧化酶的二級抗體培養，其中所述二級抗體係一抗小鼠抗體，且其中所述暴露係執行約60分鐘
xii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯沖洗約2分鐘
xiii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯沖洗約2分鐘
xiv. 使用3,3’-二胺基聯苯胺染色約3分鐘
xv. 使用水沖洗約1分鐘
xvi. 蘇木精複染。
EDTA亦稱為乙二胺四乙酸。PBS亦稱為磷酸鹽緩衝鹽水。CAS蛋白質阻斷物亦稱為酪蛋白溶液。DAB亦稱為3,3’-二胺基聯苯胺。d2H2O亦稱為再蒸餾水。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述方法包含在所述組織樣品上進行之以下步驟：
i. 從-80°C取出該冷凍樣品並保持在室溫下，其中所述室溫係選自於上述任何溫度作為室溫110，且其中所述樣品係保持在室溫下約30分鐘
ii. 在4%多聚甲醛或丙酮中固定約10分鐘
iii. 在d2H2O中沖洗約1分鐘
iv. 使用過氧化酶阻斷物進行酶的阻斷，其中所述過氧化酶阻斷物係配於d2H2O的3% H2
O2
，且其中所述暴露係執行約10分鐘
v. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水沖洗約1分鐘
vi. 使用酪蛋白溶液進行蛋白質的阻斷約30分鐘
vii. 與一級抗體結合，其中所述一級抗體包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列，或者係一MsIgG1抗體，且其中所述抗體具有30 µg/ml之濃度，且其中所述暴露係將執行約120分鐘
viii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯沖洗約2分鐘
ix. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯沖洗約2分鐘
x. 與一綴合至一辣根過氧化酶的二級抗體培養，其中所述二級抗體係一抗小鼠抗體，且其中所述暴露係執行約60分鐘
xi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯沖洗約2分鐘
xii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯沖洗約2分鐘
xiii. 使用3,3’-二胺基聯苯胺染色約3分鐘
xiv. 使用水沖洗約1分鐘
xv. 蘇木精複染。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述方法包含在所述組織樣品上進行之以下步驟：
i. 去石蠟作用
ii. 使用Tris-EDTA緩衝液進行抗原修復，其中所述緩衝液具有9之pH值，且其中所述抗原修復係執行約20分鐘
iii. 冷卻約20分鐘
iv. 在d2H2O中第一次沖洗約1分鐘
v. 在d2H2O中第二次沖洗約1分鐘
vi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第一次洗滌約2分鐘
vii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第二次洗滌約2分鐘
viii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第三次洗滌約2分鐘
ix. 使用過氧化酶阻斷物阻斷酶，其中所述過氧化酶阻斷物係配於d2H2O的3% H2
O2
，且其中所述暴露係執行約10分鐘
x. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第一次洗滌約2分鐘
xi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第二次洗滌約2分鐘
xii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第三次洗滌約2分鐘
xiii. 使用酪蛋白溶液進行蛋白質的阻斷約30分鐘
xiv. 與一一級抗體結合，其中所述一級抗體包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列，或者係一MsIgG1抗體，且其中所述抗體具有20 µg/ml之濃度，且其中所述暴露係將執行約24小時，且其中所述暴露係將在約4°C下執行
xv. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第一次洗滌約2分鐘
xvi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第二次洗滌約2分鐘
xvii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第三次洗滌約2分鐘
xviii. 與一擴增該一級抗體之訊號的試劑培養，其中所述培養係執行約15分鐘
xix. 與一綴合至一辣根過氧化酶的二級抗體培養，其中所述二級抗體係一抗小鼠抗體，且其中所述暴露係執行約60分鐘
xx. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第一次洗滌約2分鐘
xxi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第二次洗滌約2分鐘
xxii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第三次洗滌約2分鐘
xxiii. 使用3,3’-二胺基聯苯胺染色約3-5分鐘
xxiv. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水沖洗約2分鐘
xxv. 蘇木精複染。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述組織樣品係一卵巢組織樣品。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述方法包含在所述組織樣品上進行之以下步驟：
i. 去石蠟作用
ii. 使用Tris-EDTA緩衝液進行抗原修復，其中所述緩衝液具有9之pH值，且其中所述抗原修復係執行約20分鐘
iii. 冷卻約20分鐘
iv. 在d2H2O中第一次沖洗約1分鐘
v. 在d2H2O中第二次沖洗約1分鐘
vi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第一次洗滌約2分鐘
vii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第二次洗滌約2分鐘
viii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第三次洗滌約2分鐘
ix. 使用過氧化酶阻斷物阻斷酶，其中所述過氧化酶阻斷物係配於d2H2O的3% H2
O2
，且其中所述暴露係執行約10分鐘
x. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第一次洗滌約2分鐘
xi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第二次洗滌約2分鐘
xii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第三次洗滌約2分鐘
xiii. 使用酪蛋白溶液進行蛋白質的阻斷約30分鐘
xiv. 與一一級抗體結合，其中所述一級抗體包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列，或者係一MsIgG1抗體，且其中所述抗體具有30 µg/ml之濃度，且其中所述暴露係將執行約24小時，且其中所述暴露係將在約4°C下執行
xv. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第一次洗滌約2分鐘
xvi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第二次洗滌約2分鐘
xvii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第三次洗滌約2分鐘
xviii. 與一綴合至一辣根過氧化酶的二級抗體培養，其中所述二級抗體係一抗小鼠抗體，且其中所述暴露係執行約120分鐘
xix. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第一次洗滌約2分鐘
xx. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第二次洗滌約2分鐘
xxi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水第三次洗滌約2分鐘
xxii. 使用3,3’-二胺基聯苯胺染色約3-5分鐘
xxiii. 使用水沖洗約1分鐘
xxiv. 蘇木精複染。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述組織樣品係一胃組織樣品。根據一個實施態樣，本發明涉及一種用於提供及/或測量一抗體或其抗原結合片段在治療一個體中的癌症之功效及/或安全性之一生物標記物的方法，其中該方法係在一包含癌細胞之組織樣品上進行。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種用於檢測一抗體或其抗原結合片段在治療一個體中的癌症之臨床益處的方法，其中該方法係在一包含癌細胞之組織樣品上進行。
根據此實施態樣，該個體係一特定的個體或者一特定的癌症患者，因為該方法係將用於每個個別患者。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種用於提供及/或測量一抗體或其抗原結合片段在治療癌症的一適應症之功效及/或安全性之一生物標記物的方法，其中該方法係在包含癌細胞之組織樣品上進行。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種包含一抗體或其抗原結合片段之嵌合抗原受體(CAR)，其中所述嵌合抗原受體係根據本發明之方法被使用。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種表現該嵌合抗原受體之CAR-T細胞。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種CAR-T細胞之群體。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種包含CAR-T細胞之群體的組成物。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種治療一個體中的癌症的方法，其中該方法包含使用一抗體或其抗原結合片段之功效及/或安全性的一生物標記物，且其中所述抗體或其抗原結合片段係用於所述治療中。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種用於治療一個體中的癌症的方法，其中該方法包含使用一抗體或其抗原結合片段，且其中該適應症，諸如卵巢癌，使用所述抗體或其抗原結合片段治療所述癌症係藉由本發明之方法所確定或確認。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種用於治療一個體中的癌症的方法，其中該方法包含評估一抗體或其抗原結合片段的臨床益處，包含使用本發明之方法，且其中該臨床益處係對一患者的臨床益處，且其中所述抗體或其抗原結合片段係用於所述治療中。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種用於治療一個體中的癌症的方法，其中該方法包含評估一抗體或其抗原結合片段在一包含癌細胞之組織樣品中之功效及/或安全性的一生物標記物，包含使用本發明之方法，且其中所述抗體或其抗原結合片段係用於所述治療中。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述組織樣品係一來自於所述個體的組織樣品。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述方法評估B7-H3之過度表現。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌細胞係選自於如上所述之任何癌細胞。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述抗體或其抗原結合片段係如上所述之任何抗體或抗原結合片段。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌症係表現或可能表現B7-H3之任何癌症類型。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌症係選自於一癌瘤、一肉瘤、一淋巴瘤及一白血病。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌症係選自於神經母細胞瘤、髓母細胞瘤、神經膠質母細胞瘤、小細胞肺癌、非小細胞癌瘤、一小兒肉瘤、一成人肉瘤、乳癌、肝癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌瘤、肺腺癌或一胃腸癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌症係卵巢癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述卵巢癌係一腺癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述腺癌係一漿液性腺癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述腺癌係一漿液性乳頭狀腺癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌症係一胃癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述胃癌係一癌瘤。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌瘤係一腺癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌瘤係一囊腺癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌症係神經母細胞瘤。根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌症係一轉移瘤、一高風險癌症及/或一復發性癌症。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述治療係結合化學療法及/或手術。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種適用於執行本發明之方法的部件套組。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種部件套組，其中所述套組係將用於確定或定性一抗體或其抗原結合片段之功效及/或安全性的一生物標記物，其中所述抗體或其抗原結合片段係將用於治療一癌症。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種部件套組，其中所述套組係將用於確定或定性一患者從使用一抗原或其抗原結合片段之治療所具有或將具有的臨床益處，且其中所述患者係一癌症患者。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種部件套組，其中所述套組係將用於確定或定性一抗體或其抗原結合片段在治療癌症的一適應症之功效及/或安全性的一生物標記物。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種部件套組，其中所述套組係用於檢測在一包含癌細胞之組織樣品中的B7-H3表現，且其中所述樣品係選自於一已被包埋在石蠟中的樣品以及一已被冷凍的樣品。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其包含一用於檢測B7-H3表現之抗B7-H3抗體或其抗原結合片段。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述套組包含一一級抗體。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，或者所述一級抗體係如上所述之任何抗體或其抗原結合片段。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述套組使用抗體以檢測在所述組織樣品之細胞中的蛋白質。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述套組包含一二級抗體。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述二級抗體係一抗小鼠抗體。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述二級抗體係綴合至一酶。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述酶係一過氧化酶。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述過氧化酶係辣根過氧化酶。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述套組包含一酶阻斷物。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述酶阻斷物係一過氧化酶阻斷物。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述過氧化酶阻斷物係配於d2H2O的3% H2
O2
。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述套組包含一蛋白質阻斷物。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述蛋白質阻斷物係酪蛋白溶液。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述套組包含一用於顯色染色之物質。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述用於顯色染色之物質係一聯苯胺。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述聯苯胺係3,3’-二胺基聯苯胺。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述用於顯色染色之物質係一複染劑。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述複染劑係蘇木精以及選擇性地伊紅。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述套組進一步包含一擴增該一級抗體之訊號的試劑。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述擴增該一級抗體之訊號的試劑係一抗體聚合物。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述套組包含一用於洗滌之物質。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述用於洗滌之物質係一洗滌緩衝液。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述洗滌緩衝液係磷酸鹽緩衝鹽水。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述洗滌緩衝液係0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中該套組進一步包含水。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述水係d2H2O。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述癌細胞係選自於如上所述之任何癌細胞。
根據一個實施態樣，本發明涉及該套組，其中所述癌症係選自於如上所述之任何癌症。
根據一個實施方案，本發明涉及一種用於治療一個體中的癌症的方法，其中該方法包含使用根據本發明之套組。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌症係選自於如上所述之任何癌症。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌症係一胃癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述胃癌係一癌瘤。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌瘤係一腺癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌瘤係一囊腺癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述胃癌係選自於由腺癌、淋巴瘤、胃腸基質腫瘤(GIST)、類癌腫瘤，及其他癌症所組成之群組。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌症係一卵巢癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述卵巢癌係一腺癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述腺癌係一漿液性腺癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述腺癌係一漿液性乳頭狀腺癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述卵巢癌係選自於由上皮癌瘤、漿液性癌瘤、原發性腹膜癌瘤、透明細胞癌瘤、透明細胞腺癌、子宮內膜樣、惡性混合穆勒氏腫瘤(癌肉瘤)、黏液性腫瘤、黏液性腺癌、腹膜假黏液瘤、未分化之上皮癌、惡性布倫納氏腫瘤、移行細胞癌瘤、性索基質腫瘤、顆粒層細胞腫瘤、成年型顆粒層細胞腫瘤、幼年型顆粒層細胞腫瘤，塞特利氏-雷迪格氏細胞腫瘤(Sertoli-Leydig cell tumor)、硬化性基質腫瘤、生殖細胞腫瘤、惡性胚胎瘤、絨毛膜癌瘤、未成熟(固體)畸胎瘤、成熟畸胎瘤(皮樣囊腫)、卵黃囊腫瘤/內胚竇腫瘤、胚胎性癌瘤、多胚瘤、鱗狀細胞癌瘤、混合性腫瘤、繼發性卵巢癌，以及交界性腫瘤所組成之群組。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中所述癌症係一神經母細胞瘤。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中細胞之分佈係選自於由瀰漫性及多處局部性所組成之群組，較佳地係藉由實施例2之方法所確定。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中該發生率係1，較佳地係2，更佳地係3，較佳地係4，較佳地係藉由實施例2之方法所確定。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中該發生率係2-4，較佳地係3-4，較佳地係藉由實施例2之方法所確定。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中該染色強度係1，較佳地係2，更佳地係3，較佳地係4，較佳地係藉由實施例2之方法所確定。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中該染色強度係2-4，較佳地係3-4，較佳地係藉由實施例2之方法所確定。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中該染色係顆粒狀，較佳地係藉由實施例2之方法所確定。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中該染色係位在膜上或細胞質，較佳地係藉由實施例2之方法所確定。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中該染色係位在膜上，較佳地係藉由實施例2之方法所確定。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中該亞細胞位置係選自於由顆粒(G)、膜(M)、細胞質(C)、細胞外(E)、脈管系統(V)、核內(In)、頂部(A)及基部(B)所組成之群組，較佳地係藉由實施例3之方法所確定。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中陽性腫瘤細胞的量以百分比計係選自於由29%、30-49%、50-74%及75-100%所組成之群組，較佳地係藉由實施例3之方法所確定。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中陽性腫瘤細胞的量以百分比計係高於10%、高於20%，較佳地係高於30%，較佳地係藉由實施例3之方法所確定。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中陽性腫瘤細胞之發生率係選自於由正常、最小、輕度、中度及重度所組成之群組，較佳地係藉由實施例3之方法所確定。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中陽性染色在細胞水平上的強度係選自於由不明確、輕度(微弱)、中度、強烈及極度所組成之群組，較佳地係藉由實施例3之方法所確定。
根據一個實施態樣，本發明涉及該方法，其中染色之發生率代表陽性腫瘤細胞的一輕度至重度分佈，較佳地係藉由實施例3之方法所確定。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含選自於根據SEQ ID No. 3之重鏈可變區CDR1、根據SEQ IN No. 4或19之重鏈可變區CDR2、根據SEQ ID No. 5之重鏈可變區CD3、根據SEQ ID No. 6之輕鏈可變區CDR1、根據SEQ ID No. 7之輕鏈可變區CDR2及根據SEQ ID No. 8之輕鏈可變區CDR3之序列的至少一者。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含一重鏈序列，其係與SEQ ID No. 1所示之序列具有至少約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約 97%、約98%或約99%的序列一致性，及/或一輕鏈序列，其係與SEQ ID No. 2所示之序列具有至少約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約 97%、約98%或約99%的序列一致性。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種根據本發明之抗體或抗原結合片段，其中所述其抗原結合片段係一單鏈可變片段(scFv)。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種根據本發明之抗體或抗原結合片段，其中所述scFv包含SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 13或SEQ ID No. 14所示之胺基酸序列的一部分。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種根據本發明之抗體或抗原結合片段，其中所述scFv包含該等胺基酸取代K13E、R18Q、R45Q、K103E及K107E之至少一者。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種根據本發明之抗體或抗原結合片段，其中所述抗B7-H3抗體或其抗原結合片段係一鼠類8H9抗體或其抗原結合片段。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種根據本發明之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段係經人源化。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種根據本發明之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段係一嵌合抗體或一其抗原結合片段。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種根據本發明之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段係經放射性標記。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種根據本發明之抗體或抗原結合片段，其中所述放射性標記係選自於一PET標記以及一SPECT標記。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種根據本發明之抗體或抗原結合片段，其中所述PET標記係選自於124
I、225
Ac及89
Zr。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種根據本發明之抗體或抗原結合片段，其中所述SPECT標記係選自於131
I、177
Lu、99
mTc、64
Cu及89
Zr。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種根據本發明之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段係綴合至一螯合劑化合物。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種根據本發明之抗體或抗原結合片段，其中所述螯合劑化合物係結合至一放射性同位素。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種根據本發明之抗體或抗原結合片段，其中所述放射性同位素係選自於124
I、131
I及177
Lu或99
mTc、64
Cu (螯合至NOTA)及89
Zr (螯合至DFO)。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種根據本發明之抗體或抗原結合片段，其中所述螯合劑化合物係選自於DOTA、DTPA、NOTA及DFO。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種根據本發明之抗體或抗原結合片段，其中所述DOTA係DOTA的一變異體。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種根據本發明之抗體或抗原結合片段，其中所述DTPA係DTPA的一變異體。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種用於治療卵巢癌之根據本發明之抗體或其抗原結合片段，其中所述卵巢癌係一腺癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種用於治療卵巢癌之根據本發明之抗體或其抗原結合片段，其中所述腺癌係一漿液性腺癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種用於治療卵巢癌之根據本發明之抗體或其抗原結合片段，其中所述腺癌係一漿液性乳頭狀腺癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種用於治療卵巢癌之根據本發明之抗體或其抗原結合片段，其中所述卵巢癌係選自於由上皮癌瘤、漿液性癌瘤、原發性腹膜癌瘤、透明細胞癌瘤、透明細胞腺癌、子宮內膜樣、惡性混合穆勒氏腫瘤(癌肉瘤)、黏液性腫瘤、黏液性腺癌、腹膜假黏液瘤、未分化之上皮癌、惡性布倫納氏腫瘤、移行細胞癌瘤、性索基質腫瘤、顆粒層細胞腫瘤、成年型顆粒層細胞腫瘤、幼年型顆粒層細胞腫瘤，塞特利氏-雷迪格氏細胞腫瘤、硬化性基質腫瘤、生殖細胞腫瘤、惡性胚胎瘤、絨毛膜癌瘤、未成熟(固體)畸胎瘤、成熟畸胎瘤(皮樣囊腫)、卵黃囊腫瘤/內胚竇腫瘤、胚胎性癌瘤、多胚瘤、鱗狀細胞癌瘤、混合性腫瘤、繼發性卵巢癌，以及交界性腫瘤所組成之群組。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種用於治療胃癌之根據本發明之抗體或其抗原結合片段，其中所述胃癌係一癌瘤。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種用於治療胃癌之根據本發明之抗體或其抗原結合片段，其中所述癌瘤係一腺癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種用於治療胃癌之根據本發明之抗體或其抗原結合片段，其中所述癌瘤係一囊腺癌。
根據一個實施態樣，本發明涉及一種用於治療胃癌之根據本發明之抗體或其抗原結合片段，其中所述胃癌係選自於由腺癌、淋巴瘤、胃腸基質腫瘤(GIST)、類癌腫瘤，及其他癌症所組成之群組。
一種根據本發明之抗體或其抗原結合片段之用途，其用於製備治療根據本發明之適應症的藥物。
以下實施例旨在闡明本發明，且不能被認為係限制性的。
實施例1：B7-H3表現之免疫組織化學評估
免疫組織化學染色通常係一具有挑戰性的測定法，且一最佳條件之選擇需要運用各種參數。以下條件未提供最佳條件給福馬林固定石蠟包埋(FFPE)樣品之免疫組織化學染色，其中該等樣品使用包含根據SEQ ID No. 1之重鏈及根據SEQ ID No. 2之輕鏈的鼠類8H9抗體：
- 抗原修復檸檬酸緩衝液pH 6，
- 抗原修復Tris-EDTA緩衝液pH 8，
- 濃度為1-20 μg/ml之該一級抗體，及/或
- 在室溫下培養少於3小時。
在Tris-EDTA pH 9處理內的高壓及低壓對組織造成嚴重損害。
實施例2：非小細胞癌瘤、卵巢癌、髓母細胞瘤、神經母細胞瘤、神經膠質母細胞瘤、肉瘤及黑色素瘤中的B7-H3表現的免疫組織化學評估。
本研究已確定一靶向人類免疫調節B7-H3蛋白質之包含根據SEQ ID No. 1之重鏈及根據SEQ ID No. 2之輕鏈的鼠類8H9抗體是否會結合至任何人類腫瘤組織。本研究已評估一鼠類8H9抗體與神經母細胞瘤、髓母細胞瘤、卵巢癌、非小細胞肺癌(NSCLS)、肉瘤、黑色素瘤及神經膠質母細胞瘤的潛在結合。 特定的陽性組織染色結果顯示可在人類中活體內被該抗體靶向之癌症類型。
該實驗設計係呈現於表1中
表1：
| 表1. 實驗設計之總結 | |||
| 組織 | FFPE | 冷凍 | 抗體 |
| 非小細胞癌瘤 | √ | √ | Mu8H9 |
| 卵巢癌 | √ | √ | |
| 神經母細胞瘤 | √ | NA | |
| 髓母細胞瘤 | √ | NA | |
| 神經膠質母細胞瘤 | √ | √ | |
| 肉瘤 | √ | √ | |
| 黑色素瘤 | √ | √ | |
| 非小細胞癌瘤 | √ | √ | 同型對照小鼠IgG1 |
| 卵巢癌 | √ | √ | |
| 神經母細胞瘤 | √ | √ | |
| 髓母細胞瘤 | √ | √ | |
| 神經膠質母細胞瘤 | √ | √ | |
| 肉瘤 | √ | √ | |
| 黑色素瘤 | √ | √ |
該同型對照小鼠IgG1結合至該免疫原：TNP (三硝基酚) + KLH (鑰孔蟲戚血藍蛋白)。
所有組織係由比較生物科學公司組織學實驗室從認可的供應商所獲得。
組織製備
所有組織係經整體整修，透過分級系列之酒精進行加工，定位並包埋在石蠟中，經切片機切片成3至5 µm之厚度，固定於玻片，使用包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列的mu8H9抗體以及對照抗體進行免疫組織化學染色，並且藉由標準方法蓋上蓋玻片。將未經固定之冷凍組織包埋在最佳切割溫度介質(OCT)中並且製備成塊。將該等OCT組織塊放置在密封的塑膠袋或其他合適的容器中，並維持在-70°C以下以待切片。使用一冷凍切片機將未經固定之OCT包埋組織樣品切成~5 μm之厚度，將其轉移至帶電的玻片上，並允許其在室溫下風乾整夜。將玻片放置在一裝有乾燥劑之塑膠袋內的玻片盒中，並儲存在-70°C以下以待使用。
免疫組織化學染色方法
為了評估該B7-H3在此等組織中的表現，使用包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列的mu8H9抗體將切片染色。在福馬林固定石蠟包埋切片以及冷凍切片上進行染色。
IHC方法FFPE切片
一級抗體，亦即包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列的mu8H9抗體或者同型對照小鼠IgG1，係經由一綴合至一抗小鼠抗體之經辣根過氧化酶標記的聚合物所辨識，藉由一比色測定法允許檢測，針對標靶分子表現細胞。將在玻片上的組織去石蠟、水合，並且藉由具有pH 9之數值以及100°C之溫度的經加熱Tris-EDTA緩衝液進行抗原修復15分鐘。在4℃下將組織染色整夜。該染色係由以下步驟所組成，該等步驟係藉由使用洗滌緩衝液沖洗而分離：過氧化酶阻斷物10分鐘；CAS阻斷物(酪蛋白溶液)30分鐘；一級抗體整夜；綴合至一抗小鼠抗體之經辣根過氧化酶標記的聚合物60分鐘；3,3’-二胺基聯苯胺3分鐘。然後使用蘇木精複染該等玻片，脫水，並藉由標準方法蓋上蓋玻片。
該方法係依照以下步驟進行：
•去石蠟作用
•抗原修復(Tris-EDTA，pH 9，100°C) 15分鐘
•冷卻30分鐘
1. 在d2H2O中沖洗1分鐘
2. 過氧化酶阻斷物(配於d2H2O的3% H2
O2
) 10分鐘
3. 0.01M磷酸鹽緩衝鹽水1分鐘
4. 酪蛋白溶液30分鐘
5. 一級抗體(mu8H9或MsIgG1，30 µg/ml)約24小時，4°C
6. 0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯2分鐘
7. 0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯2分鐘
8. 綴合至一辣根過氧化酶之二級抗體60分鐘
9. 0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯2分鐘
10. 0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯2分鐘
11. 3,3’-二胺基聯苯胺3分鐘
12. 水1分鐘
13. 蘇木精複染
IHC方法冷凍切片
一級抗體(包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列的mu8H9抗體，或者同型對照小鼠IgG1)係經由一綴合至一抗小鼠抗體之經辣根過氧化酶標記的聚合物所辨識，藉由一比色測定法允許檢測，針對標靶分子表現細胞。將在玻片上的組織保持在室溫下30分鐘，接著在2 -5°C冷丙酮中固定10分鐘。在室溫下將組織染色。該染色係由以下步驟所組成，該等步驟係藉由使用洗滌緩衝液沖洗而分離：過氧化酶阻斷物10分鐘；CAS阻斷物(酪蛋白溶液)30分鐘；一級抗體120分鐘；綴合至一抗小鼠抗體之經辣根過氧化酶標記的聚合物60分鐘；3,3’-二胺基聯苯胺3分鐘。然後使用蘇木精複染該等玻片，脫水，並藉由標準方法蓋上蓋玻片。
•從-80取出該等冷凍切片，並保持在室溫下30分鐘
•在4%多聚甲醛中固定10分鐘
1. 在d2H2O中沖洗1分鐘
2. 過氧化酶阻斷物(配於d2H2O的3% H2
O2
)10分鐘
3. 0.01M磷酸鹽緩衝鹽水1分鐘
4. 酪蛋白溶液30分鐘
5. 一級抗體(mu8H9或MsIgG1，30 µg/ml) 120分鐘
6. 0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯2分鐘
7. 0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯2分鐘
8. 綴合至一辣根過氧化酶之二級抗體60分鐘
9. 0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯2分鐘
10. 0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯2分鐘
11. 3,3’-二胺基聯苯胺3分鐘
12. 水1分鐘
13. 蘇木精複染
組織評估
針對常規的組織病理學評估，係由美國獸醫病理學家學院所認證的一獸醫病理學家藉由光學顯微鏡對所有組織進行定性檢查，目的係確認組織身份、正常形態以及顯著自溶作用之缺乏。
組織病理學評分系統
0 = 正常 - 在該等研究條件下並且考慮到所關注之動物的年齡、性別以及品系，組織被認為係正常的。在其他情況下可能存在變化，此等變化被認為係偏離正常。
1 = 最小 - 變化的量幾乎不超過正常範圍內。
2 = 輕度 - 該病變通常容易被識別，但嚴重程度有限。該病變可能不會產生任何功能性損傷。
3 = 中度 - 該病變係明顯的，但嚴重程度增加的可能性很大。有限的組織或器官功能障礙係有可能的。
4 = 重度 - 該程度被認為係盡可能完整，或者在強度或程度上大到可預期顯著的組織或器官功能障礙。
針對免疫組織化學評估及評分，該研究病理學家評估所有經染色之組織，包括經染色之任何組織或細胞種類的身份以及染色的強度兩者。判斷所有玻片的組織元素及染色的適當性。亦包括適當的陽性及陰性對照。
免疫組織化學評分系統
染色的強度係基於以下多點量表(multi-point scale)進行評分：± (不明確)，1+ (微弱)，2+ (中度)，3+ (強烈)，4+ (極度)，或者Neg (陰性)。未對所產生之數據使用統計分析。
藉由與相應之對照玻片比較而被判斷為特異性的任何染色以及染色的本質，針對其強度、頻率(經染色之細胞的數量及發生率)，以及染色親和力進行評分。
基於標靶抗原的已知表現而被判斷為特異性或非特異性的任何染色。
評估該特定測定法的靈敏度、特異性及再現性，基於該測試物品與陽性對照材料之特異性反應；與陰性對照材料之特定活性的缺乏；以及與陰性對照物品之反應性的缺乏。
判斷所有玻片的組織元素及染色的適當性。重做被認為不適當的玻片。
照相顯微術
代表性顯微照片係呈現於圖2至圖35中。
數據
該病理學家使用光學顯微鏡檢查所有提交之組織切片，並且將該等結果直接地記錄在表格中。該病理學家使用所產生之數據評估該等與表位表現相關之組織病理學結果。
結果
顯微鏡結果以及評分
該評分係呈現於表2中。代表性顯微照片係呈現於圖2至圖35中。在所有組織中在腫瘤細胞的一子集中檢測到Mu8H9染色係瀰漫性且多處局部性。該染色係顆粒狀，通常係強烈至極度(3-4級)，並且係位於該膜上且偶爾係在細胞質，雖然亦有一些脈管系統及細胞內染色。大部分的腫瘤組織的染色係使用市售之抗BH-73抗體進行免疫組織化學染色。染色條件以及染色模式係與mu8H9相似，特別係針對冷凍切片的IHC染色。
人類腫瘤組織
| 表2：使用包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列的mu8H9之組織病理學評分的總結 | ||||
| 組織 (FFPE) | 分佈 | 發生率 | 染色強度 | 評語 |
| 非小細胞肺癌瘤 | 瀰漫性 | 4 | 4 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 卵巢漿液性癌瘤 | 多處局部性 | 2 | 2 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 神經母細胞瘤 | 瀰漫性 | 4 | 3 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 髓母細胞瘤 | 瀰漫性 | 4 | 4 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 神經膠質母細胞瘤 | 多處局部性 | 4 | 4 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 肉瘤 | 多處局部性 | 2 | 2 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 黑色素瘤 | 瀰漫性 | 4 | 4 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 肝癌 | 瀰漫性 | 3 | 3 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 肝正常 | NA | 0 | 0 | NA |
| 組織 (冷凍) | 分佈 | 發生率 | 染色強度 | 評語 |
| 非小細胞肺癌瘤 | 瀰漫性 | 2 | 3 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 肺腺癌 | 多處局部性 | 2 | 2 | 顆粒狀，細胞表面，腺體上皮細胞的一些細胞內 |
| 卵巢癌 | 瀰漫性 | 4 | 3 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 神經膠質母細胞瘤 | 瀰漫性 | 3 | 3 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 肉瘤 | 瀰漫性 | 4 | 4 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 黑色素瘤 | 多處局部性 | 3 | 3 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 表3：使用市售之抗B7-H3之組織病理學評分的總結 | ||||
| 組織 (FFPE) | 分佈 | 發生率 | 染色強度 | 評語 |
| 非小細胞肺癌瘤 | 瀰漫性 | 4 | 4 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 卵巢漿液性癌瘤 | 多處局部性 | 3 | 3 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內及血管 |
| 神經母細胞瘤 | 瀰漫性 | 4 | 3 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 髓母細胞瘤 | 瀰漫性 | 3 | 4 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 神經膠質母細胞瘤 | 多處局部性 | 4 | 4 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 肉瘤 | 多處局部性 | 4 | 4 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 黑色素瘤 | 多處局部性 | 3 | 4 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 肝癌 | 瀰漫性 | 3 | 3 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 肝正常 | NA | 0 | 0 | NA |
| 組織 (冷凍) | 分佈 | 發生率 | 染色強度 | 評語 |
| 非小細胞肺癌瘤 | 瀰漫性 | 4 | 4 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 肺腺癌 | 多處局部性 | 3 | 3 | 顆粒狀，細胞表面，腺體上皮細胞的一些細胞內 |
| 卵巢癌 | 瀰漫性 | 4 | 4 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內及血管 |
| 神經膠質母細胞瘤 | 瀰漫性 | 4 | 4 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 肉瘤 | 瀰漫性 | 4 | 4 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
| 黑色素瘤 | 多處局部性 | 3 | 3 | 顆粒狀，細胞表面，一些細胞內 |
使用mu8H9之陽性染色出現在所有FFPE以及冷凍組織中。表現之發生率在NSCLC、神經母細胞瘤、髓母細胞瘤、神經膠質母細胞瘤、黑色素瘤，以及肝癌中似乎更為廣泛，且在卵巢癌以及肉瘤中係中度。
結論
包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列的鼠類8H9抗體在以下條件下辨識在不同腫瘤類型之FFPE樣品中的標靶分子B7-H3：
- 抗原修復Tris-EDTA pH 9在100°C下 (無任何壓力，避免組織損傷)。
- 在30 µg/ml下在4°C下培養整夜。
包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列的Mu8H9對在所有腫瘤組織中的腫瘤細胞的染色係瀰漫性，且在一些情況下係多處局部性。該染色模式通常係極度、顆粒狀並且位於膜上，雖然也有細胞質、細胞內及血管染色。陽性染色在所有腫瘤類型中係明顯的，然而在非小細胞癌瘤、神經母細胞瘤、髓母細胞瘤、神經膠質母細胞瘤、黑色素瘤及肝癌的FFPE切片中似乎更為廣泛。染色在卵巢癌及肉瘤中係微弱至中度。在所有冷凍腫瘤中有強烈陽性染色，除了肺腺癌係中度染色之外。
實施例3 使用包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列的鼠類8H9抗體之卵巢癌組織中B7-H3 (CD276)表現的組織病理學評估。
本研究之目的係使用免疫組織化學技術確定包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列的鼠類8H9抗體是否會結合至福馬林固定石蠟包埋卵巢癌組織。在大多數的卵巢癌組織中的腫瘤細胞中檢測到瀰漫性及多處局部性的特異性染色。通常，80%的腫瘤樣品顯示對該抗體的陽性染色，代表B7-H3在40-100%的腫瘤細胞中的表現。該染色係顆粒狀，通常係輕度至極度(1-4級)，並具有細胞質/膜模式。在大多數的腫瘤細胞(50-100%)中發現該陽性膜染色具有+2至+4之總強度。染色之發生率代表陽性腫瘤細胞在整個切片中的一輕度至重度(+2至+4)分佈。小鼠同型對照(Ms IgG)在任何濃度下皆無染色。該對照組織(正常卵巢)未顯示與該8H9抗體的任何反應。
實驗設計
實施例2之研究方案係被用於IHC染色，然而，如在免疫組織化學染色方法的一節中所述，採取額外的步驟以最佳化在卵巢癌組織中的訊號強度。 最初係針對包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列的鼠類8H9抗體的3種濃度(10、20及30 µg/ml)最佳化該染色方案，並且選擇20 µg/ml之濃度作為最佳濃度用於其餘的研究。馮威里氏因子(vWF)係被使用作為該測試系統之品質控制的一標記物。該染色方案之修飾性以及再現性係使用在表4中所呈現之實驗設計經過8次驗證而驗證。
表4：實驗設計
組織病理學方法
提交之組織
| 組織類型 | 抗體濃度 | ||||
| 8H9 抗體 | Ms IgG | 8H9抗體 | Ms IgG1 | vWF | |
| 20 µg/ml | 20 µg/ml | 20 µg/ml | 20 µg/ml | 1:100 | |
| 無小鼠連接子 | 有小鼠連接子 | ||||
| 正常卵巢 | √ | √ | √ | √ | - |
| TMA卵巢癌 | √ | √ | √ | √ | - |
| 卵巢癌(漿液性腺癌) | √ | √ | √ | √ | - |
| 卵巢癌(漿液性腺癌) | √ | √ | √ | √ | - |
| 卵巢癌(腺癌) | √ | √ | √ | √ | - |
| 卵巢癌(腺癌) | √ | √ | √ | √ | √ |
| 卵巢癌(漿液性腺癌) | √ | √ | √ | √ | √ |
所有組織係由比較生物科學公司組織學實驗室從認可的供應商所獲得。
組織製備
來自於個別捐贈者之該卵巢正常及癌症FFPF組織係經切片機切片成5 µm厚度，並固定在帶電的玻片上。市售之25個卵巢癌病例在5個組織微陣列(TMA)玻片上(50個核芯，25個核芯用於測試包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列的鼠類8H9抗體，以及25個核芯用於測試Ms IgG)係被用於驗證在大量的組織樣品中的染色結果。
免疫組織化學染色方法
使用鼠類8H9抗體將切片染色以評估B7-H3在此等組織中的表現。簡而言之，將玻片上的FFPE組織切片去石蠟、水合，並且進行經加熱Tris-EDTA緩衝液(pH 9，100°C)抗原修復。在PBS洗滌之後，使用過氧化物阻斷物溶液處理切片10分鐘，使用PBS洗滌，並且在室溫(RT)下與蛋白質阻斷緩衝液培養30分鐘。然後，該等組織與包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列的鼠類8H9抗體培養整夜。使用在實施例2中所用之染色方案的一經修飾版本進行第二天的染色，其中在添加HRP綴合聚合物的60分鐘之前，使用一訊號增強劑(EnvisionTM
FLEX + Mouse (連接子))處理該等切片15分鐘。在PBS洗滌三回合之後，將該等切片暴露於一色素原試劑(EnVisionTM
FLEX DAB + Chromogen)1-2分鐘，並且在顯微鏡下評估該訊號之強度。然後將該等玻片用蘇木精複染、脫水，並且藉由標準方法蓋上蓋玻片。
用於卵巢FFPE組織之IHC方法：
組織評估
| 第一天： | |
| 在60°C的烘箱中加熱玻片以熔化石蠟至少2小時 | |
| 去石蠟作用以及脫水作用(二甲苯，100%，95%，70%乙醇，去離子水，PBS) | |
| 使用1X Tris-EDTA緩衝液pH 9進行抗原修復(將該等玻片亞沸騰，無需加壓) | 20分鐘 |
| 在室溫下冷卻該等玻片 | 20分鐘 |
| 在去離子水中沖洗玻片 | 2x1分鐘 |
| 使用PBS洗滌玻片 | 2X3分鐘 |
| 過氧化酶阻斷物 (可立即使用) | 10分鐘 |
| 使用PBS洗滌玻片 | 2X3分鐘 |
| 在室溫下與阻斷漿液(CAS)培養 | 30分鐘 |
| 與一級抗體(們)培養 - 8H9 (20 µg/mL) -MsIgG1 (20 µg/mL) | 4°C整夜 |
| 第二天： | |
| 使用PBS洗滌 | 2X3分鐘 |
| 使用EnVisionTM FLEX + Mouse (連接子)培養指定的玻片 | 15分鐘 |
| 在室溫下使用二級抗體(EnvisionTM Polymer-HRP mouse)培養玻片 | 60分鐘 |
| 在PBS中沖洗 | 2X3分鐘 |
| 與DAB基質-色素原培養 | 3-5分鐘 |
| 在PBS中沖洗 | |
| 應用複染、去水合作用，並蓋上蓋玻片。使該等玻片乾燥整晚 |
針對常規的組織病理學評估，係由美國獸醫病理學家學院所認證的一獸醫病理學家藉由光學顯微鏡對所有組織進行定性檢查，目的係確認組織身份、正常形態以及顯著自溶作用之缺乏。
免疫組織化學評分系統
針對免疫組織化學評估及評分，該研究主任及研究病理學家評估所有經染色之組織，包括經染色之任何組織或細胞種類的身份以及染色的強度兩者。判斷所有玻片的組織元素及染色的適當性。亦包括適當的陽性及陰性對照。還包括足夠的陽性和陰性對照。考量到以下標準而提供評分：
•染色的強度係基於以下多點量表進行評分：± (不明確)，1+ (微弱)，2+ (中度)，3+ (強烈)，4+ (極度)，或者Neg (陰性)。未對所產生之數據使用統計分析。
•藉由與相應之對照玻片比較而被判斷為特異性的任何染色以及染色的本質，針對其強度、頻率(經染色之細胞的數量及發生率)，以及染色親和力進行評分。染色之發生率代表陽性腫瘤細胞在整個切片中的分佈。如果陽性腫瘤細胞係位於切片的不同區域，則會提供一評分範圍(例如+2-3)以反映在該等區域中陽性細胞發生率之間的差異。
•基於標靶抗原的已知表現而被判斷為特異性或非特異性的任何染色。
•評估該特定測定法的靈敏度、特異性及再現性，基於該測試物品與陽性對照材料之特異性反應；與陰性對照材料之特定活性的缺乏；以及與陰性對照物品之反應性的缺乏。
•判斷所有玻片的組織元素及染色的適當性。重做被認為不適當的玻片。
表5：組織病理學評分術語
照相顯微術
代表性顯微照片係呈現於圖36至圖40中
數據
| 組織病理學評分術語 | ||||
| 亞細胞位置 | 陽性腫瘤細胞(%) | 陽性染色之分佈模式 | 陽性腫瘤細胞在該切片中的發生率 | 陽性染色在細胞水平上的強度 |
| 顆粒狀(G) 膜(M) 細胞質(C) 細胞外(E) 脈管系統(V) 核內(In) 頂部(A) 基部(B) | Neg: 不存在 1 = 高至29% 2 = 30-49 % 3 = 50-74% 4 = 75-100 % | 瀰漫性(D) 局部性(F) 多處局部性(MF) 陰性(N) | 0 = 正常 1 = 最小 2 = 輕度 3 = 中度 4 = 重度 | 0 = 不明確 1 = 輕度(微弱) 2 = 中度 3 = 強烈 4 = 極度 Neg = 不存在 |
使用光學顯微鏡評估所有組織切片，並且將該等結果直接地記錄在表格中。使用所產生之數據評估該等與表位表現相關之組織病理學結果。使用影像處理軟體對個別捐贈者組織樣品之選定代表性影像進行該染色強度的定量測量。該強度反映棕色DAB(3,3二胺基聯苯胺)反應之暗度，其係在切片的不同區域中測量並且以一平均值表示。此定量強度測量僅用於教學目的，且不應用於做出臨床決策。因為DAB染色不符合比爾-蘭伯特定律(Beer-Lambert law)，因此該染色強度(暗度對亮度)可能不代表B7-H3在該目標器官中的濃度。
結果
顯微鏡結果以及評分
表6及表7詳細描述包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列的鼠類8H9抗體的組織病理學評分結果。表5顯示該等組織病理學評分術語。代表性顯微照片係顯示於圖36-圖40中。
表6
| 6個個別卵巢癌病例之IHC評分 | |||||||
| 捐贈者 ID | 診斷* | 位置 | 陽性細胞(%) | 膜染色(%) | 分佈模式 | 發生率 | 強度 |
| 1 | 正常卵巢 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| 2 | 腺癌 | C=M | 100% | 70-80% | D | 4 | ¾ |
| 3 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| 4 | 腺癌 | C＞M | 80% | 30-40% | MF | 3 | 4 |
| 5 | 漿液性腺癌 | C＞M | 100% | 30-40% | D | ¾ | ¾ |
| 6 | 漿液性腺癌 | C＞M | 100% | 60-70% | D | 3 | ¾ |
*該等組織係從具有經證實臨床診斷之捐贈者所獲得。由於該等腫瘤的異質性，偶爾會從可能不代表該診斷之區域收集組織。
表7：25個TMA卵巢癌病例之IHC染色
| 捐贈者 ID | 診斷 | 位置 | 陽性細胞(%) | 膜染色(%) | 分佈模式 | 發生率 | 強度 |
| A | 漿液性腺癌(稀疏) | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| A2 | 漿液性乳頭狀腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| A3 | 漿液性乳頭狀腺癌 | M | 50% | 80-90% | MF | 2 | 2 |
| A4 | 漿液性腺癌 | M | 50-75% | 70-80% | MF | 2 | 2 |
| A5 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| A6 | 漿液性乳頭狀腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| A7 | 漿液性乳頭狀腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| A8 | 漿液性乳頭狀腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| A9 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| A10 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| B1 | 漿液性腺癌 | C＞M | 80% | 50-60% | D | 2/3 | 2 |
| B2 | 漿液性腺癌 | C＞M | 100% | 50-60% | D | 3 | 2 |
| B3 | 漿液性腺癌 | C＞M | 80% | 60-70% | D | 3 | 2 |
| B4 | 漿液性腺癌 | C＞M | 100% | 70-80% | D | 3 | 2 |
| B5 | 漿液性腺癌(稀疏) | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| B6 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| B7 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| B8 | 漿液性腺癌(稀疏) | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| B9 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| B10 | 漿液性腺癌(稀疏) | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| C1 | 漿液性腺癌 | C＞M | 100% | 50-60% | D | 3 | ¾ |
| C2 | 漿液性腺癌 | M＞C | 100% | 60-70% | D | 2 | 2 |
| C3 | 漿液性腺癌 | M＞C | 100% | 60-70% | D | 3 | 2 |
| C4 | 漿液性腺癌 | M＞C | 100% | 70-80% | D | 3 | 2 |
| C5 | 漿液性腺癌 | M＞C | 100% | 80-90% | D | 3 | 3 |
| C6 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| C7 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| C8 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| C9 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| C10 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| D1 | 漿液性腺癌 | M=C | 100% | 60-70% | D | 3 | 2 |
| D2 | 漿液性腺癌 | M=C | 100% | 50-60% | D | 2 | 2 |
| D3 | 漿液性腺癌 | M=C | 100% | 90-100% | D | 3 | 3 |
| D4 | 漿液性腺癌 | M＞C | 100% | 90-100% | D | 3 | 2 |
| D5 | 漿液性腺癌 | M＞C | 100% | 60-70% | D | 2 | 1 |
| D6 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| D7 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| D8 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| D9 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| D10 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| E1 | 漿液性腺癌 | M＞C | 100% | 60-70% | D | 2 | 2 |
| E2 | 黏液性腺癌 | C＞M | 100% | 60-70% | D | ¾ | 3 |
| E3 | 黏液性腺癌 | M＞C | 80% | 90-100% | MF | 2/3 | 2 |
| E4 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| E5 | 子宮內膜腺癌 | M＞C | 40% | 50-60% | MF | 2 | 1 |
| E6 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| E7 | 黏液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| E8 | 黏液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| E9 | 漿液性腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
| E10 | 子宮內膜腺癌 | N/A | Neg | 0 | N | 0 | 0 |
在大多數的卵巢癌組織中的腫瘤細胞中檢測到瀰漫性及多處局部性的特異性染色。該對照組織(正常卵巢)未顯示與該8H9抗體的任何反應。在個別捐贈者及TMAs兩者中，該染色係顆粒狀，通常係輕度至極度(1-4級)，並具有細胞質/膜模式。通常，80%的腫瘤樣品(30個腫瘤樣品中有24個係來自於5位個別捐贈者及25個TMA)對該抗體顯示陽性染色，代表B7-H3在40-100%的腫瘤細胞中的表現。在高倍視野(HPF)放大倍數(400X及1000X)下，在每個切片的三個隨機區域中評估膜染色的百分比。使用以下公式計算膜染色的百分比
提供此等三個讀數的一平均值作為在該等腫瘤細胞中膜染色的百分比，其顯示在大多數的腫瘤細胞中的陽性膜染色具有+2至+4的總強度。染色之發生率代表陽性腫瘤細胞在整個切片中的一輕度至重度(+2至+4)分佈。數位影像的定量分析顯示每個個別捐贈者之樣品的不同染色強度。小鼠同型對照在任何濃度下皆無染色。
結論及討論
此研究之目的係使用免疫組織化學技術評估包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列的鼠類8H9抗體對FFPE卵巢癌組織之染色，該鼠類8H9抗體係一治療劑當被放射性標記以作為一檢測B7-H3之工具。在大多數的卵巢癌組織中的腫瘤細胞中檢測到瀰漫性及多處局部性的特異性染色。該對照組織(正常卵巢)未顯示與8H9抗體的任何反應。該染色係顆粒狀，通常係輕度至極度(1-4級)，並具有細胞質/膜模式。通常，80%的腫瘤樣品顯示對該抗體的陽性染色，代表B7-H3在40-100%的腫瘤細胞中的表現。該染色係顆粒狀，通常係輕度至極度(1-4級)，並具有細胞質/膜模式。在大多數的腫瘤細胞(50-100%)中發現該陽性膜染色具有+2至+4之總強度。染色之發生率代表陽性腫瘤細胞在整個切片中的一輕度至重度(+2至+4)分佈。小鼠同型對照在任何濃度下皆無染色。該對照組織(正常卵巢)未顯示與該8H9抗體的任何反應。小鼠同型對照在任何濃度下皆無染色。此研究之結果表明，B7-H3在不同類型的卵巢癌中的表現存在一差異，其可以被一8H9抗體靶向以用於治療及/或診斷目的。
實施例4 使用包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列的鼠類8H9抗體之胃癌組織中B7-H3 (CD276)表現的組織病理學評估。
本研究之目的係評估來自於9位患者之胃癌瘤的組織病理學及免疫組織化學結果，其係使用包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列的單株鼠類8H9抗體染色。此免疫組織化學研究評估該鼠類8H9抗體與衍生自9位患者之人類胃癌組織的潛在結合。特定的陽性染色結果顯示可在人類中活體內被8H9抗體靶向之腫瘤細胞類型。
提交之組織
來自於衍生自患者的福馬林固定石蠟包埋(FFPE)塊的玻片被提交至該CBI組織學實驗室。該等組織係胃癌瘤，並進行組織病理學及免疫組織化學檢測，使用該單株鼠類8H9抗體以評估特異性8H9抗體結合及表現。
FFPE組織製備
使用蘇木精及伊紅(H&E)將人類胃癌組織切片染色。然後由一經董事會認證之獸醫病理學家透過光學顯微鏡評估組織。
免疫組織化學染色方法
使用鼠類8H9抗體將切片染色以評估該B7-H3在此等組織中的表現。該染色技術係在CBI所開發。詳細方法係如下所示。
用於人類胃癌組織(FFPE)之IHC方案
| 第一天 | |
| 去石蠟作用以及脫水作用(二甲苯，100%，95%，70%乙醇，去離子水，PBS) | |
| 使用1X Tris-EDTA緩衝液pH 9進行抗原修復(將該等玻片亞沸騰，無需加壓) | 20分鐘 |
| 在室溫下冷卻該等玻片 | 20分鐘 |
| 在去離子水中沖洗玻片 | 2X1分鐘 |
| 使用PBS*洗滌玻片 | 2X3分鐘 |
| 過氧化酶阻斷物 (可立即使用) | 10分鐘 |
| 使用PBS洗滌玻片 | 2X3分鐘 |
| 在室溫下與阻斷漿液(CAS)培養 | 30分鐘 |
| 與一級抗體(們)培養 - 8H9 抗體 (30 µg/mL) - MsIgG1 (30 µg/mL) | 4°C整夜 |
| 第二天 | |
| 使用PBS洗滌 | 2X3分鐘 |
| 在室溫下使用二級抗體(Envision Polymer-HRP mouse)培養玻片 | 120分鐘 |
| 在PBS中沖洗 | 2X3分鐘 |
| 與DAB基質-色素原培養 | 3-5分鐘 |
| 在去離子水中沖洗 | |
| 應用複染、去水合作用，並蓋上蓋玻片。使該等玻片乾燥整晚 |
*PBS (1X)係用作為本研究之洗滌緩衝液。然而PBS可以被其他洗滌緩衝液代替，例如Tris-EDTA或者具有Tween-20 (0.05%)之PBS。
FFPE組織評估
由美國獸醫病理學家學院所認證的一獸醫病理學家藉由光學顯微鏡對組織進行定性檢查。該病理學家準備一份報告，描述該等組織學特徵並且確認診斷或者確認組織身份。如果需要進行任何數值半定量評估，則使用在實施例2中所述之工業標準5點評分系統對病變進行評分(Mann, et al., 2012)。
免疫組織化學評估
針對免疫組織化學評估及評分，該研究病理學家評估所有經染色之組織，包括經染色之任何組織或細胞種類的身份以及染色之強度及分佈。判斷所有玻片的組織元素及染色的適當性。此外，該等先前研究之結果(例如實施例1及實施例2)被用作為一參考文獻以評估包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列的鼠類8H9抗體對於胃癌組織之特異性，相較於分別地對於神經母細胞瘤(陽性對照)、人類心臟及肝臟(陰性對照)組織以及市售B7-H3之特異性。比較該8H9抗體之特異性與MsIgG對照之特異性。僅針對IHC染色使用，該抗體之靈敏度被最佳化在30 µg/ml。
特別地，評估在該細胞膜上或在該細胞質內的陽性染色。在該腫瘤細胞細胞質中以及在該細胞膜上可觀察到對8H9抗體的陽性染色。
免疫組織化學評分系統
應用如在實施例2中可見之系統。使用以下進行染色之說明：
•陽性組織對照：8H9抗體在細胞質(C)、細胞外(E)、膜(M)、核(N)，核周(P)中的表現具有一顆粒狀模式。
•陰性組織對照：缺乏特異性染色。
•H&E對照：表徵細胞形態並辨識微結構異常，包括發炎、血管滲漏、纖維化、腫瘤侵襲等等。
應用盲性評估(masked assessment)來描述並診斷患者組織。
西方墨點分析
在每個患者FFPE組織樣品的兩個切片上進行西方墨點法。分析所獲得之數位影像，並將所檢測之蛋白質的定量數據報告為分子量、訊號/峰、強度等等。
結果
組織病理學結果
患者組織之組織病理學(H&E)染色評估之總結係呈現於表8中。
表8：組織病理學及免疫組織化學結果之總結
I = 強度，D = 分佈
免疫組織化學結果
| ID | 染色 | ||
| 8H9抗體，I； (膜染色%) | 8H9抗體總染色 (I’D) | 蘇木精及伊紅 | |
| 20 (µg/ml) | 30 (µg/ml) | ||
| 001 | N/A | 無染色 | 梭狀細胞腫瘤，可能係平滑肌瘤，良性 |
| 001-2 | 中度(50%的腫瘤細胞) | 強烈；強烈 (3；3) | 胃腺癌 |
| 002 | 微弱顆粒狀膜染色 (＜10%的腫瘤細胞) | 中度至強烈；中度至強烈 (2-3；2-3) | 胃腺癌 |
| 003 | 極少至無膜染色 | 中度至極度；中度至強烈 (2-3, 4；2-3) | 胃癌瘤 |
| 004 | 中度顆粒狀膜染色(20%腫瘤細胞) | 中度至強烈；中度至強烈 (2-3；2-3) | 胃腺癌 |
| 005 | 中度顆粒狀膜染色(30%腫瘤細胞) | 極度；極度 (4；4) | 胃腺癌 |
| 006 | 中度顆粒狀膜染色(30%腫瘤細胞) | 極度；極度 (4；4) | 胃腺癌 |
| 007 | 偶爾顆粒狀膜染色(＜10%的腫瘤細胞) | 極度；極度 (4；4) | 胃囊腺癌 |
| 008 | 強烈顆粒狀膜染色在大多數的腫瘤細胞上 | 極度；極度 (4；4) | 胃腺癌 |
| 009 | 微弱顆粒狀膜染色(30%的腫瘤細胞) | 中度至強烈；中度至強烈 (2-3；2-3) | 胃腺癌 |
患者之免疫組織化學染色評估之總結係呈現於表9中。代表性顯微照片係呈現於圖41-圖50中。
表9：針對每個經測試之組織使用包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列的鼠類8H9抗體之ICH染色結果
| ID | 診斷 | IHC染色 |
| 001 | 梭狀細胞腫瘤，可能係平滑肌瘤，良性 | 在該切片中的任何細胞群體上皆無陽性染色 |
| 001-2 | 胃腺癌 | 20 µg/ml：在約50%的腫瘤細胞中觀察到具有2-3級染色強度的膜染色。最小至中度細胞質染色係出現在腫瘤細胞中及在少數微血管中 |
| 30 µg/ml：在約80%的腫瘤細胞中發現具有3級染色強度的膜染色。最小至中度細胞質染色係出現在腫瘤細胞中及在少數微血管中 | ||
| 002 | 胃腺癌 | 在整個切片中大多數的贅生性上皮被中度染色。此係2-3級染色強度以及2-3級分佈。該染色模式係瀰漫性以及細胞質的。此外，在該等淋巴結節中有一些淋巴樣細胞亞群亦被陽性染色。該肌層有一些微弱非特異性染色。 在20 µg/ml下，少於10%的腫瘤細胞偶爾有微弱顆粒狀膜染色。 |
| 003 | 胃癌瘤 | 在整個切片中大約一半的贅生性上皮被輕度至中度染色。此係2-3級染色強度以及2-3級分佈。少數局部區域的染色係更為強烈，係4級染色強度且所有細胞在局部區域中皆被陽性染色。該染色模式係瀰漫性且細胞質的。 通常，越多梭狀樣細胞未被染色或輕度染色，則具有較多上皮樣形態之細胞會被更強烈地染色。 此外，在該等淋巴結節中有一些淋巴樣細胞亞群亦被陽性染色。基質、血管及神經束皆未被染色。 在20 µg/ml下，幾乎沒有或沒有陽性膜染色。 |
| 004 | 胃腺癌 | 在整個切片中幾乎所有贅生性上皮被輕度至中度染色。此係2-3級染色強度以及2-3級分佈。該染色模式係瀰漫性且細胞質的。基質、淋巴樣斑、血管及神經束皆未被染色。 在20 µg/ml下，在約20%的腫瘤細胞上有中度顆粒狀膜染色。淋巴樣細胞亦表現顆粒狀膜染色。 |
| 005 | 胃腺癌 | 在整個切片中幾乎所有贅生性上皮被強烈染色，所有黏膜上皮亦是如此。此係4級染色強度以及4級分佈。該染色模式係瀰漫性且細胞質的。此外，在該等淋巴結節、神經束及微血管內皮中有一些淋巴樣細胞亞群亦被陽性染色。基質並未被染色。 在20 μg/ml下，在分化程度較低的腫瘤細胞的區域中，在約30%的腫瘤細胞上有中度顆粒狀膜染色。 |
| 006 | 胃腺癌 | 在整個切片中幾乎所有贅生性上皮被強烈染色，所有黏膜上皮亦是如此。此係4級染色強度以及4級分佈。該染色模式係瀰漫性且細胞質的。此外，在改等淋巴結節、神經束以及微血管內皮中有一些淋巴樣細胞亞群亦被陽性染色。基質並未被染色。 在20 μg/ml下，在約30%的腫瘤細胞上有中度顆粒狀膜染色。 |
| 007 | 胃囊腺癌 | 在整個切片中幾乎所有贅生性上皮被強烈染色。此係4級染色強度以及4級分佈。該染色模式係瀰漫性且細胞質的。此外，在該等淋巴結節及微血管內皮中有一些淋巴樣細胞亞群亦被陽性染色。基質及神經束並未被染色。 在20 μg/ml下，少於10%的腫瘤細胞偶爾有顆粒狀膜染色。 |
| 008 | 胃腺癌 | 在整個切片中幾乎所有贅生性上皮被中度至強烈染色。此係4級染色強度以及3級分佈。在微血管內皮上亦有一些微弱陽性染色。 該染色模式係瀰漫性且細胞質的。此外，在該等淋巴結節中有一些淋巴樣細胞亞群亦被陽性染色。基質及神經束並未被染色。 在20 μg/ml下，大多數的腫瘤細胞顯現顆粒狀膜染色。 |
| 009 | 胃腺癌 | 約50%的腫瘤細胞被中度至陽性染色。該染色係一瀰漫性細胞質模式。此係2-3級染色強度以及2-3級分佈。發炎或淋巴樣細胞或基質通常未被陽性染色。正常黏膜上皮細胞並未被染色。 在20 μg/ml下，在約30%的腫瘤細胞上有微弱顆粒膜染色。在腫瘤區域中的中度微血管血管內皮染色亦係明顯的。 |
腫瘤細胞對8H9抗體染色呈明顯強烈陽性。該染色係特異性且僅限於該等腫瘤細胞。正常細胞，例如平滑肌、血管、神經、正常黏膜及血管皆未被染色。
簡單西方墨點分析結果
該8H9抗體之西方墨點分析顯示，因為蛋白質的交聯以及降解而出現多個非特異性條帶。因此無法使用此方法評估該標靶抗原的表現。
病患結果
結果指出，8H9與所提交之組織中的該等胃癌瘤腫瘤細胞的細胞質及膜有一特異性強烈結合。該平滑肌瘤(ID 001)並未被染色。
結論
在大多數的胃癌組織中的腫瘤細胞中檢測到特異性染色。 1/9係陰性，亦即該梭狀細胞腫瘤，可能係平滑肌瘤，良性。
從30 μg/ml至20 μg/ml之向下滴定係分辨膜染色所必需的。在強度方面有一高度異質性，然而大多數的胃腫瘤表現膜染色。
此研究之結果表明，B7-H3在不同類型的胃癌中的表現存在一差異，其可以被一8H9抗體靶向以用於治療及/或診斷目的。
(無)
圖1提供一種與本發明之一實施態樣有關之檢測方法的一流程圖。
圖2A及圖2B顯示非小細胞肺癌瘤之FFPE切片的免疫組織化學，其使用一包含根據SEQ ID No. 1之重鏈及根據SEQ ID No. 2之輕鏈的抗體。使用濃度為30 µg/mL之所述抗體在4°C下將該等玻片染色整夜。腫瘤細胞有重度顆粒狀細胞表面及細胞內染色。圖2A顯示20倍放大倍率的視野，且圖2B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係4/4。
圖3A及圖3B顯示非小細胞肺癌瘤之FFPE切片的免疫組織化學，其使用同型對照小鼠IgG1抗體(MsIgG1)。使用30 µg/mL MsIgG1在4°C下將該等玻片染色整夜。腫瘤細胞沒有染色。圖3A顯示20倍放大倍率的視野，且圖2B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係0/0。
圖4A及圖4B顯示神經母細胞瘤之FFPE切片的免疫組織化學，其使用一包含根據SEQ ID No. 1之重鏈及根據SEQ ID No. 2之輕鏈的抗體。使用濃度為30 µg/mL之所述抗體在4°C下將該等玻片染色整夜。腫瘤細胞有強烈至極度顆粒狀細胞表面及一些細胞內染色。圖4A顯示20倍放大倍率的視野，且圖4B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係4/3。
圖5A及圖5B顯示神經母細胞瘤之FFPE切片的免疫組織化學，其使用MsIgG1。使用30 µg/mL MsIgG1在4°C下將該等玻片染色整夜。其沒有染色。圖5A顯示20倍放大倍率的視野，且圖5B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係0/0。
圖6A及圖6B顯示髓母細胞瘤之FFPE切片的免疫組織化學，其使用一包含根據SEQ ID No. 1之重鏈及根據SEQ ID No. 2之輕鏈的抗體。使用濃度為30 µg/mL之所述抗體在4°C下將該等玻片染色整夜。腫瘤細胞有極度顆粒狀細胞表面及細胞內染色。圖6A顯示20倍放大倍率的視野，且圖6B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係4/4。
圖7A及圖7B顯示髓母細胞瘤之FFPE切片的免疫組織化學，其使用MsIgG1。使用30 µg/mL MsIgG1在4°C下將該等玻片染色整夜。其沒有染色。圖7A顯示20倍放大倍率的視野，且圖7B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係0/0。
圖8A及圖8B顯示神經膠質母細胞瘤之FFPE切片的免疫組織化學，其使用一包含根據SEQ ID No. 1之重鏈及根據SEQ ID No. 2之輕鏈的抗體。使用濃度為30 µg/mL之所述抗體在4°C下將該等玻片染色整夜。腫瘤細胞有極度顆粒狀細胞表面及細胞內染色。圖8A顯示20倍放大倍率的視野，且圖8B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係4/4。
圖9A及圖9B顯示神經膠質母細胞瘤之FFPE切片的免疫組織化學，其使用MsIgG1。使用30 µg/mL MsIgG1在4°C下將該等玻片染色整夜。其沒有染色。圖9A顯示20倍放大倍率的視野，且圖9B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係0/0。
圖10A及圖10B顯示卵巢癌之FFPE切片的免疫組織化學，其使用一包含根據SEQ ID No. 1之重鏈及根據SEQ ID No. 2之輕鏈的抗體。使用濃度為30 µg/mL之所述抗體在4°C下將該等玻片染色整夜。腫瘤細胞的一子集有中度多處局部顆粒狀細胞表面及細胞內及血管染色。圖10A顯示20倍放大倍率的視野，且圖10B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係2/2。
圖11A及圖11B顯示卵巢癌之FFPE切片的免疫組織化學，其使用MsIgG1。使用30 µg/mL MsIgG1在4°C下將該等玻片染色整夜。其沒有染色。圖11A顯示20倍放大倍率的視野，且圖11B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係0/0。
圖12A及圖12B顯示肉瘤之FFPE切片的免疫組織化學，其使用一包含根據SEQ ID No. 1之重鏈及根據SEQ ID No. 2之輕鏈的抗體。使用濃度為30 µg/mL之所述抗體在4°C下將該等玻片染色整夜。腫瘤細胞的一子集有中度多處局部顆粒狀細胞表面及細胞內染色。圖12A顯示20倍放大倍率的視野，且圖12B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係2/2。
圖13A及圖13B顯示肉瘤之FFPE切片的免疫組織化學，其使用MsIgG1。使用30 µg/mL MsIgG1在4°C下將該等玻片染色整夜。其沒有染色。圖13A顯示20倍放大倍率的視野，且圖13B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係0/0。
圖14A及圖14B顯示黑色素瘤之FFPE切片的免疫組織化學，其使用一包含根據SEQ ID No. 1之重鏈及根據SEQ ID No. 2之輕鏈的抗體。使用濃度為30 µg/mL之所述抗體在4°C下將該等玻片染色整夜。腫瘤細胞有重度顆粒狀細胞表面及細胞內染色。圖14A顯示20倍放大倍率的視野，且圖14B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係4/4。
圖15A及圖15B顯示黑色素瘤之FFPE切片的免疫組織化學，其使用MsIgG1。使用30 µg/mL MsIgG1在4°C下將該等玻片染色整夜。腫瘤細胞沒有染色。其顯示巨噬細胞的中度染色。圖15A顯示20倍放大倍率的視野，且圖15B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係0/0。
圖16A及圖16B顯示肝癌之FFPE切片的免疫組織化學，其使用一包含根據SEQ ID No. 1之重鏈及根據SEQ ID No. 2之輕鏈的抗體。使用濃度為30 µg/mL之所述抗體在4°C下將該等玻片染色整夜。腫瘤細胞有強烈顆粒狀細胞表面及細胞內染色。圖16A顯示20倍放大倍率的視野，且圖16B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係3/3。
圖17A及圖17B顯示正常肝臟之FFPE切片的免疫組織化學，其使用一包含根據SEQ ID No. 1之重鏈及根據SEQ ID No. 2之輕鏈的抗體。使用濃度為30 µg/mL之所述抗體在4°C下將該等玻片染色整夜。其沒有染色。圖17A顯示20倍放大倍率的視野，且圖17B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係0/0。
圖18A顯示非小細胞肺癌瘤之冷凍切片的免疫組織化學，其使用一包含根據SEQ ID No. 1之重鏈及根據SEQ ID No. 2之輕鏈的抗體。使用濃度為2 µg/mL之所述抗體將該等玻片染色。其有中度數量之強烈陽性經染色腫瘤細胞。圖18A顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係2/3。
圖18B顯示非小細胞肺癌瘤之冷凍切片的免疫組織化學，其使用MsIgG1。使用2 µg/mL MsIgG1將該等玻片染色。其沒有染色。圖18B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係0/0。
圖19A顯示肺腺癌之冷凍切片的免疫組織化學，其使用一包含根據SEQ ID No. 1之重鏈及根據SEQ ID No. 2之輕鏈的抗體。使用濃度為2 µg/mL之所述抗體將該等玻片染色。其有強烈陽性經染色腫瘤細胞子集。圖19A顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係3/3。
圖19B顯示肺腺癌之冷凍切片的免疫組織化學，其使用MsIgG1。使用2 µg/mL MsIgG1將該等玻片染色。其沒有染色。圖19B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係0/0。
圖20A顯示黑色素瘤之冷凍切片的免疫組織化學，其使用一包含根據SEQ ID No. 1之重鏈及根據SEQ ID No. 2之輕鏈的抗體。使用濃度為2 µg/mL之所述抗體將該等玻片染色。其有強烈多處局部經染色腫瘤細胞。圖20A顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係3/3。
圖20B顯示黑色素瘤之冷凍切片的免疫組織化學，其使用MsIgG1。使用2 µg/mL MsIgG1將該等玻片染色。其沒有染色。圖20B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係0/0。
圖21A顯示肉瘤之冷凍切片的免疫組織化學，其使用一包含根據SEQ ID No. 1之重鏈及根據SEQ ID No. 2之輕鏈的抗體。使用濃度為2 µg/mL之所述抗體將該等玻片染色。其有強烈至極度經染色腫瘤細胞。圖21A顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係4/4。
圖21B顯示肉瘤之冷凍切片的免疫組織化學，其使用MsIgG1。使用2 µg/mL MsIgG1將該等玻片染色。其沒有染色。圖21B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係0/0。
圖22A顯示卵巢癌之冷凍切片的免疫組織化學，其使用一包含根據SEQ ID No. 1之重鏈及根據SEQ ID No. 2之輕鏈的抗體。使用濃度為2 µg/mL之所述抗體將該等玻片染色。其有強烈至極度多處局部經染色腫瘤細胞。圖22A顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係4/3。
圖22B顯示卵巢癌之冷凍切片的免疫組織化學，其使用MsIgG1。使用2 µg/mL MsIgG1將該等玻片染色。其沒有染色。圖22B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係0/0。
圖23A顯示神經膠質母細胞瘤之冷凍切片的免疫組織化學，其使用一包含根據SEQ ID No. 1之重鏈及根據SEQ ID No. 2之輕鏈的抗體。使用濃度為2 µg/mL之所述抗體將該等玻片染色。其有強烈經染色腫瘤細胞子集。圖23A顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係3/3。
圖23B顯示神經膠質母細胞瘤之冷凍切片的免疫組織化學，其使用MsIgG1。使用2 µg/mL MsIgG1將該等玻片染色。其沒有染色。圖23B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係0/0。
圖24A及圖24B顯示非小細胞肺癌瘤之FFPE切片的免疫組織化學，其使用市售之抗B7-H3抗體。使用2 µg/mL B7-H3抗體在4°C下將該等玻片染色整夜。腫瘤細胞有重度顆粒狀細胞表面及細胞內染色。圖24A顯示20倍放大倍率的視野，且圖24B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係4/4。
圖25A及圖25B顯示神經母細胞瘤之FFPE切片的免疫組織化學，其使用市售之抗B7-H3抗體。使用2 µg/mL B7-H3抗體在4°C下將該等玻片染色整夜。腫瘤細胞有重度顆粒狀細胞表面染色。圖25A顯示20倍放大倍率的視野，且圖25B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係4/3。
圖26A及圖26B顯示髓母細胞瘤之FFPE切片的免疫組織化學，其使用市售之抗B7-H3抗體。使用2 µg/mL B7-H3抗體在4°C下將該等玻片染色整夜。腫瘤細胞有強烈顆粒狀細胞表面及細胞內染色。圖26A顯示20倍放大倍率的視野，且圖26B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係3/4。
圖27A及圖27B顯示神經膠質母細胞瘤之FFPE切片的免疫組織化學，其使用市售之抗B7-H3抗體。使用2 µg/mL B7-H3抗體在4°C下將該等玻片染色整夜。腫瘤細胞有強烈顆粒狀細胞表面及細胞內染色。圖27A顯示20倍放大倍率的視野，且圖27B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係4/4。
圖28A及圖28B顯示卵巢癌之FFPE切片的免疫組織化學，其使用市售之抗B7-H3抗體。使用2 µg/mL B7-H3抗體在4°C下將該等玻片染色整夜。腫瘤細胞有中度顆粒狀細胞表面、細胞內及血管染色。圖28A顯示20倍放大倍率的視野，且圖28B顯示40倍放大倍率的視野。該組織病理學評分係3/3。
圖29A及圖29B顯示非小細胞肺癌瘤之FFPE切片的蘇木精及伊紅複染色。其顯示保存良好之腫瘤組織。圖29A顯示20倍放大倍率的視野，且圖29B顯示40倍放大倍率的視野。
圖30A及圖30B顯示神經母細胞瘤之FFPE切片的蘇木精及伊紅複染色。其顯示保存良好之腫瘤組織。圖30A顯示20倍放大倍率的視野，且圖30B顯示40倍放大倍率的視野。
圖31A及圖31B顯示髓母細胞瘤之FFPE切片的蘇木精及伊紅複染色。其顯示保存良好之腫瘤組織。圖31A顯示20倍放大倍率的視野，且圖31B顯示40倍放大倍率的視野。
圖32A及圖32B顯示卵巢癌之FFPE切片的蘇木精及伊紅複染色。其顯示保存良好之腫瘤組織。圖32A顯示20倍放大倍率的視野，且圖32B顯示40倍放大倍率的視野。
圖33A及圖33B顯示肉瘤之FFPE切片的蘇木精及伊紅複染色。其顯示保存良好之腫瘤組織。圖33A顯示20倍放大倍率的視野，且圖33B顯示40倍放大倍率的視野。
圖34A及圖34B顯示肉瘤之FFPE切片的蘇木精及伊紅複染色。其顯示保存良好之腫瘤組織。圖34A顯示20倍放大倍率的視野，且圖34B顯示40倍放大倍率的視野。
圖35A及圖35B顯示神經膠質母細胞瘤之FFPE切片的蘇木精及伊紅複染色。其顯示保存良好之腫瘤組織。圖35A顯示20倍放大倍率的視野，且圖35B顯示40倍放大倍率的視野。
圖36至圖40顯示25個TMA卵巢癌病例之IHC染色。捐贈者ID係如表7所示。
圖41顯示患者之胃組織的H&E及IHC染色(ID: 001，梭狀細胞腫瘤，可能係平滑肌瘤，良性)。H&E影像顯示在該肌層中有一大的腫塊(A，黑色星狀)。該腫瘤係由梭狀細胞所組成，其對8H9抗體(B及D)或MsIgG (C及E)沒有免疫反應。
圖42顯示患者之胃組織的IHC染色(ID: 001-2，胃腺癌)。在30 μg/ml下，8H9抗體在80%的腫瘤細胞的膜上表現，具有3級染色強度(A)。微血管經常充滿嗜中性球及淋巴細胞以及腫瘤細胞(B、C)。在20 μg/ml下，觀察到在約50%的腫瘤細胞中具有2-3級染色強度的膜染色(D)。在大部分腫瘤細胞的膜上檢測到8H9抗體之表現(E、F)。未發現與MsIgG對照同型的免疫反應性(數據未顯示)。
圖43A顯示患者之胃組織的H&E及IHC染色(ID 002；胃腺癌)。H&E影像顯示在該黏膜中有一突出增生性腫塊(A，虛線框)。該腫瘤係由戒環細胞(B，黃色箭頭)所組成。在贅生性上皮的膜及細胞質中檢測到與8H9抗體的免疫反應性(B及D)。在使用MsIgG處理的切片中未發現免疫染色(C及E)。圖43B顯示在20 μg/ml下，在少於10%的腫瘤細胞上偶爾有微弱顆粒狀膜染色(F及G，紅色箭頭)。在腫瘤區域中觀察到血管內皮染色(H)。
圖44A顯示患者之胃組織的H&E及IHC染色(ID: 003，胃癌)。H&E影像顯示無胃結構的腫瘤結節(A，虛線圓圈)。在大約一半的所有贅生性上皮中檢測到與8H9抗體的免疫反應性(B)，其具有一瀰漫性及細胞質模式(D，黃色箭頭)。在使用MsIgG處理的切片中未發現免疫染色(C及E)。圖44B顯示在20 μg/ml下，極少至沒有陽性膜染色(F及G)。血管內皮染色出現在腫瘤區域中(H)。
圖45A顯示患者之胃組織的H&E及IHC染色(ID: 004，胃腺癌)。H&E影像顯示在該黏膜及黏膜下層中有一息肉狀增生性腫塊，包括許多小的淋巴結節(A，開始代表淋巴結節)。在幾乎所有贅生性上皮中檢測到與8H9抗體的免疫反應性，其具有一瀰漫性及細胞質模式(B及D)。在使用MsIgG處理的切片中未發現免疫染色(C及E)。圖45B顯示在20 μg/ml下，在約20%的腫瘤細胞上有中度顆粒狀膜染色(F及G，紅色箭頭)。血管內皮染色出現在腫瘤區域中(H)。
圖46A顯示患者之胃組織的H&E及IHC染色(ID: 005，胃腺癌)。H&E影像顯示在伴有嚴重發炎、充血及出血的肌層及漿膜中有一大的瀰漫性腫塊(A)。在幾乎所有贅生性上皮中檢測到與8H9抗體的免疫反應性，其具有一瀰漫性及細胞質模式(B及D)。在使用MsIgG處理的切片中未發現免疫染色(C及E)。圖46B顯示在20 μg/ml下，在分化程度較低之腫瘤細胞的區域中在約30%的腫瘤細胞上有中度顆粒狀膜染色(F及G，紅色箭頭)。血管內皮染色出現在腫瘤區域中(H)。
圖47A顯示患者之胃組織的H&E及IHC染色(ID: 006，胃腺癌)。H&E影像顯示在該黏膜中有一大的瀰漫性浸潤性腫塊，其浸潤該黏膜下層、肌層及漿膜及漿膜(A)。在幾乎所有贅生性上皮中檢測到與8H9抗體的免疫反應性，其具有一瀰漫性及細胞質模式(B及D)。在使用MsIgG處理的切片中未發現免疫染色(C及E)。圖47B顯示在20 μg/ml下，在約30%的腫瘤細胞上有中度顆粒狀膜染色(F及G，紅色箭頭)。血管內皮染色出現在腫瘤區域中(H)。
圖48A顯示患者之胃組織的H&E及IHC染色(ID: 007，囊腺癌)。H&E影像顯示一大的瀰漫性浸潤性腫塊侵襲黏膜、黏膜下層、肌層及漿膜(A)。在幾乎所有贅生性上皮中檢測到與8H9抗體的免疫反應性，其具有一瀰漫性及細胞質模式(B及D)。在使用MsIgG處理的切片中未發現免疫染色(C及E)。圖48B顯示在20 μg/ml下，在少於10%的腫瘤細胞上偶爾有顆粒狀膜染色(F及G，紅色箭頭)。血管內皮染色出現在腫瘤區域中(H)。
圖49A顯示患者之胃組織的H&E及IHC染色(ID: 008，胃腺癌)。H&E影像顯示具有一突出增生性腫塊之胃黏膜的整個厚度以及黏膜下層的擴展(A)。在幾乎所有贅生性上皮中檢測到與8H9抗體的免疫反應性，其具有一瀰漫性及細胞質模式(B及D)。在使用MsIgG處理的切片中未發現免疫染色(C及E)。圖49B顯示在20 μg/ml下，大多數的腫瘤細胞顯示顆粒狀膜染色(F及G，紅色箭頭)。血管內皮染色出現在腫瘤區域中(H)。
圖50A顯示患者之胃組織的H&E及IHC染色(ID: 009，胃腺癌)。H&E影像顯示正常及贅生性胃組織(A)。在約50%的贅生性上皮中檢測到與8H9抗體的免疫反應性，其具有一瀰漫性及細胞質模式(B及D)。在使用MsIgG處理的切片中未發現免疫染色(C及E)。圖50B顯示在20 μg/ml下，在約30%的腫瘤細胞上有微弱顆粒狀膜染色(F及G，紅色箭頭)。血管內皮染色出現在腫瘤區域中(H)。
所有引用之參考文獻係藉由引用併入本文中。
提供隨附圖式以及實施例以解釋而不是限制本發明。本發明之態樣、實施態樣、請求項及任何項目可以被結合，對於本發明所屬領域中具有通常知識者而言係清楚的。
除非另有說明，否則所有百分比係以重量/重量表示。除非另有說明，否則所有測量係在標準條件(環境溫度及壓力)下進行。除非另有說明，否則測試條件係根據歐洲藥典8.0。
(無)
Claims (276)
- 一種用於檢測一抗原在至少一個包含癌細胞或潛在地包含癌細胞之組織樣品中的表現及/或過度表現的方法，其中所述樣品係選自於一解凍樣品、一冷凍樣品、一新鮮樣品、一石蠟包埋樣品、一福馬林包埋樣品，及/或一先前已被包埋在福馬林及/或石蠟中的樣品。
- 一種用於檢測一表位在一包含癌細胞或潛在地包含癌細胞之組織樣品中的表現及/或過度表現的方法，其中所述樣品較佳地係一先前已被包埋在福馬林及/或石蠟中的樣品，且其中所述方法包含以下步驟： i. 使用一酶阻斷物質進行酶阻斷， ii. 使用一蛋白質阻斷物質進行蛋白質阻斷， iii. 與一一級抗體結合， iv. 與一二級抗體進行培養，以及 v. 使用一染色劑進行染色。
- 如請求項2之方法，其中所述表位係B7-H3抗原的一表位。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述一級抗體具有約30 μg/ml之濃度，且其中所述與一一級抗體結合係在約4°C下執行，及/或其中所述結合係執行約4-24小時。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述方法進一步包含以下步驟： i. 使用Tris-EDTA進行抗原修復，其中所述Tris-EDTA具有約9的pH值及/或約100°C的溫度。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述抗原修復係執行約1-30分鐘、5-25分鐘、10-20分鐘或較佳地約15-20分鐘。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述抗原修復係執行約15分鐘。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述抗原修復係執行約20分鐘。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述方法進一步包含在室溫下冷卻所述組織樣品的一步驟，其中所述冷卻係在所述抗原修復之後進行。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述冷卻係進行約1-30分鐘、約10-25分鐘、約15-20分鐘或較佳地約20分鐘。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述組織樣品係來自於一個體，且其中所述方法係用於評估所述個體是否可受益於一療法，其中所述療法係選自於放射免疫療法、免疫療法或細胞療法。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述抗原係一B7-H3抗原。
- 如請求項12之方法，其中所述B7-H3抗原包含SEQ ID No. 17或SEQ ID No. 18之序列。
- 如請求項12至13中任一項之方法，其中所述B7-H3抗原包含至少一種肽，其選自於根據SEQ ID No. 15之肽及根據SEQ ID No. 16之肽。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述方法使用抗體以檢測在所述組織樣品之細胞中的蛋白質。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述一級抗體係一抗B7H3抗體。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中一抗B7-H3抗體或其抗原結合片段係用於檢測B7-H3表現。
- 如請求項17之方法，其中所述抗B7-H3抗體或其抗原結合片段包含選自於根據SEQ ID No. 3之一重鏈可變區CDR1、根據SEQ IN No. 4或19之一重鏈可變區CDR2、根據SEQ ID No. 5之一重鏈可變區CD3、根據SEQ ID No. 6之一輕鏈可變區CDR1、根據SEQ ID No. 7之一輕鏈可變區CDR2及根據SEQ ID No. 8之一輕鏈可變區CDR3之序列中的至少一者。
- 如請求項17之方法，其中所述抗B7-H3抗體或其抗原結合片段包含根據SEQ ID No. 1之一重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之一輕鏈序列。
- 如請求項17之方法，其中所述抗B7-H3抗體或其抗原結合片段包含一重鏈序列及/或一輕鏈序列，所述重鏈序列係與SEQ ID No. 1所示之序列具有至少約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約 97%、約98%或約99%的序列一致性，所述輕鏈序列係與SEQ ID No. 2所示之序列具有至少約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約 97%、約98%或約99%的序列一致性。
- 如請求項17至20中任一項之方法，其中所述其抗原結合片段係一單鏈可變片段(scFv)。
- 如請求項21之方法，其中所述scFv包含SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 13或SEQ ID No. 14所示之胺基酸序列的一部分。
- 如請求項21至22之方法，其中所述scFv包含胺基酸取代K13E、R18Q、R45Q、K103E及K107E中之至少一者。
- 如請求項17至23中任一項之方法，其中所述抗B7-H3抗體或其抗原結合片段係一鼠類8H9抗體或其一抗原結合片段。
- 如請求項17至24中任一項之方法，其中所述抗體或其抗原結合片段係經人源化。
- 如請求項17至25中任一項之方法，其中所述抗體或其抗原結合片段係一嵌合抗體或其一抗原結合片段。
- 如請求項17至26中任一項之方法，其中所述抗體或其抗原結合片段係經放射性標記。
- 如請求項27之方法，其中所述放射性標記係選自於一PET標記以及一SPECT標記。
- 如請求項28之方法，其中所述PET標記係選自於124 I、225 Ac及89 Zr。
- 如請求項28之方法，其中所述SPECT標記係選自於131 I、177 Lu、99 mTc、64 Cu及89 Zr。
- 如請求項17至30中任一項之方法，其中所述抗體或其抗原結合片段係綴合至一螯合劑化合物。
- 如請求項31之方法，其中所述螯合劑化合物係結合至一放射性同位素。
- 如請求項32之方法，其中所述放射性同位素係選自於124 I、131 I及177 Lu或99 mTc、64 Cu (螯合至NOTA)及89 Zr (螯合至DFO)。
- 如請求項31至33中任一項之方法，其中所述螯合劑化合物係選自於DOTA、DTPA、NOTA及DFO。
- 如請求項34之方法，其中所述DOTA係DOTA的一變異體。
- 如請求項34之方法，其中所述DTPA係DTPA的一變異體。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述方法可被用於至少一個先前已被包埋在石蠟中的樣品，以及一個先前已被冷凍的樣品。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述方法進一步包含一或多個沖洗步驟，較佳地其中至少一個沖洗步驟係使用水。
- 如請求項38之方法，其中所述水係d2H2O。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述步驟中的一或多個或所有係藉由使用至少一種洗滌緩衝液進行洗滌來分離。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中一或多個或所有所述步驟中的一或多個或所有係藉由使用至少一種洗滌緩衝液進行至少一次洗滌來分離。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述步驟中的一或多個或所有係藉由使用至少一種洗滌緩衝液進行至少兩次洗滌來分離。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述步驟中的一或多個或所有係藉由使用至少一種洗滌緩衝液進行至少三次洗滌來分離。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中每次洗滌係執行約1-5分鐘、約2-4分鐘或較佳地約3分鐘。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中每次洗滌係執行約0.1分鐘-2分鐘、0.5分鐘-1.5分鐘或較佳地約1分鐘。
- 如請求項40之方法，其中所述洗滌緩衝液係磷酸鹽緩衝鹽水。
- 如請求項40至46中任一項之方法，其中所述洗滌緩衝液係0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述酶阻斷物質係一過氧化酶阻斷物。
- 如請求項48之方法，其中所述過氧化酶阻斷物係配於d2H2O的3% H2 O2 。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述蛋白質阻斷物質係酪蛋白溶液。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述酶阻斷係執行1-60分鐘、2-55分鐘、3-50分鐘、4-45分鐘、5-40分鐘、6-35分鐘、7-30分鐘、8-25分鐘、9-20分鐘、10-15分鐘或約10分鐘。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述蛋白質阻斷係執行1-60分鐘、5-55分鐘、10-50分鐘、15-45分鐘、20-40分鐘、25-35分鐘，或約30分鐘。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述方法進一步包含與一擴增該一級抗體之訊號的試劑進行培養的一步驟。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述擴增該一級抗體之訊號的試劑係一抗體聚合物。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述與一擴增該一級抗體之訊號的試劑進行培養係執行約1-30分鐘、約5-25分鐘、約10-20分鐘或較佳地約15分鐘。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述擴增該一級抗體之訊號的試劑增強該訊號至少2倍、至少3倍、至少4倍或較佳地至少5倍。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述與一一級抗體結合係執行1-48小時、4-44小時、8-40小時、12-36小時、16-32小時、20-28小時或約24小時。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述與一一級抗體結合係執行1-240分鐘、30-110分鐘、60-180分鐘、90-150分鐘或約120分鐘。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述與一一級抗體結合係執行約120分鐘或約24小時。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述與一一級抗體結合係執行一段時間以允許至少10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或至少99%之該等抗原被該一級抗體結合。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述一級抗體係如請求項15至36之任何抗體或者一IgG1抗體。
- 如請求項61之方法，其中所述IgG1抗體係一小鼠IgG1抗體。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述一級抗體具有1-60 μg/ml、5-55 μg/ml、10-50 μg/ml、15-45 μg/ml、20-40 µg/ml、25-35 µg/ml或約30 µg/ml之濃度。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述一級抗體具有1-40 μg/ml、5-35 μg/ml、10-30 μg/ml、15-25 μg/ml或較佳地約20 µg/ml之濃度。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述二級抗體係綴合至一經標記的聚合物。
- 如請求項65之方法，其中所述經標記的聚合物係一經辣根過氧化酶標記的聚合物。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述二級抗體係一抗小鼠抗體。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述與一二級抗體進行培養係執行1-120分鐘、10-110分鐘、20-100分鐘、30-90分鐘、40-80分鐘、50-70分鐘或約60分鐘。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述與一二級抗體進行培養係執行1-240分鐘、10-230分鐘，20-220分鐘、30-210分鐘、40-200分鐘、50-190分鐘、60-180分鐘、70-170分鐘、80-160分鐘、90-150分鐘、100-140分鐘、110-130分鐘或較佳地約120分鐘。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述染色劑係一聯苯胺。
- 如請求項70之方法，其中所述聯苯胺係3,3’-二胺基聯苯胺。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述使用一染色劑進行培養係係執行1-6分鐘、1.5-5.5分鐘、2-5分鐘、2.5-4.5分鐘、3-4分鐘或約3分鐘。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述使用一染色劑進行培養係執行約1-10分鐘、約1-9分鐘、約2-7分鐘或較佳地約3-5分鐘。
- 如前述請求項中任一項之方法，其包含一步驟，其中所述組織樣品係使用一複染劑進行複染。
- 如請求項74之方法，其中所述複染劑係蘇木精以及可選地伊紅。
- 如請求項74至75中任一項之方法，其中所述樣品係在複染之後脫水。
- 如請求項74至76中任一項之方法，其中所述組織樣品係在脫水之後被蓋上蓋玻片。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述步驟中之一或多個或所有係藉由根據前述請求項中任一項之至少一次洗滌來分離。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述步驟係按照以下順序進行： i. 使用一酶阻斷物質進行酶的阻斷， ii. 使用一蛋白質阻斷物質進行蛋白質的阻斷， iii. 與一一級抗體結合， iv. 與一二級抗體進行培養，以及 v. 使用一染色劑進行染色。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述組織樣品之製備包含一或多個或所有以下步驟： 1.1 整體整修(Gross trimming)， 1.2 透過分級系列之酒精進行加工， 1.3 組織定位，以及 1.4 包埋在石蠟中。 其中所述步驟係接續著根據前述請求項中任一項之任何步驟。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該方法包含一或多個或所有以下步驟： 2.1 以切片機切片一石蠟包埋樣品， 2.2 固定於玻片， 2.3 準備染色以及抗體染色，以及 2.4 複染。
- 如請求項80至81中任一項之方法，其中所述石蠟包埋樣品係經切片機切片成厚度為1至7 μm厚、2至6 μm厚或約3至5 μm厚。
- 如請求項80至82中任一項之方法，其中所述組織樣品係固定於玻片。
- 如請求項81至83中任一項之方法，其中所述準備染色以及染色包含一或多個或所有以下步驟： 3.1 去石蠟作用， 3.2 水合作用， 3.3 抗原修復，以及 其中所述步驟係接續著請求項2之步驟。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述樣品先前已被包埋在石蠟中。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述樣品已被或係被包埋在石蠟中及/或經福馬林固定。
- 如請求項86之方法，其中所述樣品係經去石蠟。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述抗原修復係藉由一緩衝液來執行。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述緩衝液係Tris-EDTA緩衝液。
- 如請求項89之方法，其中所述Tris-EDTA緩衝液具有7-10、7.5-9.5、8-9或約9之pH值。
- 如請求項89至90中任一項之方法，其中所述Tris-EDTA緩衝液係60-140°C、65-135°C、70-130°C、75-125°C、80-120°C、85-115°C、90-110°C、95-105°C或約100°C。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述抗原修復係執行1-60分鐘、2-55分鐘、3-50分鐘、4-45分鐘、5-40分鐘、6-35分鐘、7-30分鐘、8-25分鐘、9-20分鐘、10-15分鐘或約15分鐘。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述步驟係在0-8°C、0.5-7.5°C、1-7°C、1.5-6.5°C、2-6°C、2.5-5.5°C、3-5°C、3.5-4.5°C或約4°C下進行。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述步驟係進行1-48小時、4-44小時、8-40小時、12-36小時、16-32小時、20-28小時或約24小時。
- 如請求項80至94中任一項之方法，其中該等步驟係接續著如請求項37至79中任一項之步驟中的一或多個或所有。
- 如請求項84至95中任一項之方法，其中所述步驟係按照以下順序進行： 4.1 去石蠟作用 4.2 水合作用 4.3 抗原修復 4.4 根據請求項2之步驟。
- 如請求項80至96之方法，其中該等步驟係按照根據請求項79之順序進行。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述組織樣品之製備包含一或多個或所有以下步驟： A.1 將所述組織樣品包埋在最佳切割溫度介質中， A.2 製備一塊所述樣品， A.3 將所述樣品放置在一密封的塑膠袋或其他合適的容器中，以及 A.4 將所述樣品維持在-20°C以下， 其中所述組織樣品係一冷凍樣品或一解凍樣品。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述組織樣品係一解凍樣品。
- 如請求項98至99中任一項之方法，其中所述最佳切割溫度介質包含以下一或多個或全部：聚乙烯醇、聚乙二醇，或非反應性成分。
- 如請求項98至100中任一項之方法，其中所述樣品係維持在-30°C、-35°C、-40°C、-45°C、-50°C、-55°C、-60°C、-65°C、-70°C、-75°C、-80°C、-85°C、-90°C、-95°C以下或-100°C以下。
- 如請求項98至101中任一項之方法，其中所述樣品係被切片成厚度為1-10 μm厚、1.5-9.5 μm厚、2-9 μm厚、2.5-8.5 μm厚、3-8 μm厚、3.5-7.5 μm厚、4-7 μm厚、4.5-6.5 μm厚、5-6 μm厚，或約5 µm厚度。
- 如請求項98至102中任一項之方法，其中所述樣品係使用冷凍切片機進行切片。
- 如請求項98至103中任一項之方法，其中所述樣品係被轉移至一帶電的玻片上。
- 如請求項98至104中任一項之方法，其中所述樣品係被風乾。
- 如請求項98至105中任一項之方法，其中所述樣品係在室溫下被風乾，其中所述室溫係10°C至40°C。
- 如請求項106之方法，其中所述室溫係選自於10-40°C、15-35°C、17-33°C、18-30°C、19-27°C或約20- 25°C。
- 如請求項98至107中任一項之方法，其中所述樣品係被風乾1-48小時、4-44小時、8-40小時、12-36小時、16-32小時、20-28小時或約24小時。
- 如請求項98至108中任一項之方法，其中該方法包含一或多個或所有以下步驟： B.1 將一組織樣品暴露於室溫，其中所述室溫係10-40°C B.2 固定該樣品， 其中所述步驟係接續著請求項2之步驟。
- 如請求項109之方法，其中所述室溫係選自於10-40°C、15-35°C、17-33°C、18-30°C、19-27°C或約20-25°C。
- 如請求項109至110中任一項之方法，其中所述暴露於室溫係執行1-60分鐘、5-55分鐘、10-50分鐘、15-45分鐘、20-40分鐘、25-35分鐘或約30分鐘。
- 如請求項109至111中任一項之方法，其中所述樣品係在多聚甲醛中固定。
- 如請求項109至111中任一項之方法，其中所述樣品係在丙酮中固定。
- 如請求項113之方法，其中所述丙酮係-10-20°C、-5-15°C、0-10°C、0.5-7°C、1-6°C或2-5°C。
- 如請求項109至114中任一項之方法，其中所述固定係執行1-20分鐘、5-15分鐘或約10分鐘。
- 如請求項109至115中任一項之方法，其中所述步驟係接續著如請求項37至79中任一項之步驟中的一或多個或所有。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述癌細胞係來自於表現或可能表現B7-H3之任何癌症類型的癌細胞。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述癌細胞係選自於癌瘤、肉瘤，淋巴瘤及白血病癌細胞。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述癌細胞係選自於神經母細胞瘤、髓母細胞瘤、神經膠質母細胞瘤、小細胞肺癌、非小細胞癌瘤、一小兒肉瘤、一成人肉瘤、乳癌、肝癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌瘤、肺腺癌或胃腸癌細胞。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述癌細胞係卵巢癌細胞。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述卵巢癌細胞係腺癌細胞。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述腺癌細胞係漿液性腺癌細胞。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述腺癌細胞係漿液性乳頭狀腺癌細胞。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述癌細胞係胃癌細胞。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述胃癌細胞係胃癌瘤細胞。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述胃癌瘤細胞係胃腺癌細胞。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述胃癌瘤細胞係胃囊腺癌細胞。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述癌細胞係神經母細胞瘤癌細胞。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述癌細胞係來自於一轉移瘤、一高風險癌症及/或一復發性癌症。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述方法包含在所述組織樣品上進行之以下步驟： i. 去石蠟作用 ii. 使用Tris-EDTA緩衝液進行抗原修復，其中所述緩衝液具有9之pH值以及100°C之溫度，且其中所述抗原修復係執行約15分鐘 iii. 冷卻約30分鐘 iv. 在d2H2O中沖洗約1分鐘 v. 使用過氧化酶阻斷物阻斷酶，其中所述過氧化酶阻斷物係配於d2H2O的3% H2 O2 ，且其中所述暴露係執行約10分鐘 vi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水沖洗約1分鐘 vii. 使用酪蛋白溶液進行蛋白質的阻斷約30分鐘 viii. 與一一級抗體結合，其中所述一級抗體包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列，或者係一MsIgG1抗體，且其中所述抗體具有30 µg/ml之濃度，且其中所述暴露係將執行約24小時，且其中所述暴露係將在約4°C下執行 ix. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯進行沖洗約2分鐘 x. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯進行沖洗約2分鐘 xi. 與一綴合至一辣根過氧化酶的二級抗體進行培養，其中所述二級抗體係一抗小鼠抗體，且其中所述暴露係執行約60分鐘 xii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯進行沖洗約2分鐘 xiii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯進行沖洗約2分鐘 xiv. 使用3,3’-二胺基聯苯胺進行染色約3分鐘 xv. 使用水沖洗約1分鐘 xvi. 蘇木精複染。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述方法包含在所述組織樣品上進行之以下步驟： i. 從-80°C取出該冷凍樣品並保持在室溫下，其中所述室溫係選自於如請求項110之任何溫度，且其中所述樣品係保持在室溫下約30分鐘 ii. 在4%多聚甲醛或丙酮中固定約10分鐘 iii. 在d2H2O中沖洗約1分鐘 iv. 使用過氧化酶阻斷物進行酶的阻斷，其中所述過氧化酶阻斷物係配於d2H2O的3% H2 O2 ，且其中所述暴露係執行約10分鐘 v. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行沖洗約1分鐘 vi. 使用酪蛋白溶液進行蛋白質的阻斷約30分鐘 vii. 與一級抗體結合，其中所述一級抗體包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列，或者係一MsIgG1抗體，且其中所述抗體具有30 µg/ml之濃度，且其中所述暴露係將執行約120分鐘 viii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯進行沖洗約2分鐘 ix. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯進行沖洗約2分鐘 x. 與一綴合至一辣根過氧化酶的二級抗體進行培養，其中所述二級抗體係一抗小鼠抗體，且其中所述暴露係執行約60分鐘 xi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯沖進行洗約2分鐘 xii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯沖進行洗約2分鐘 xiii. 使用3,3’-二胺基聯苯胺進行染色約3分鐘 xiv. 使用水沖洗約1分鐘 xv. 蘇木精複染。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述方法包含在所述組織樣品上進行之以下步驟： i. 去石蠟作用 ii. 使用Tris-EDTA緩衝液進行抗原修復，其中所述緩衝液具有9之pH值，且其中所述抗原修復係執行約20分鐘 iii. 冷卻約20分鐘 iv. 在d2H2O中進行第一次沖洗約1分鐘 v. 在d2H2O中進行第二次沖洗約1分鐘 vi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第一次洗滌約2分鐘 vii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第二次洗滌約2分鐘 viii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第三次洗滌約2分鐘 ix. 使用過氧化酶阻斷物來阻斷酶，其中所述過氧化酶阻斷物係配於d2H2O的3% H2 O2 ，且其中所述暴露係執行約10分鐘 x. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第一次洗滌約2分鐘 xi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第二次洗滌約2分鐘 xii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第三次洗滌約2分鐘 xiii. 使用酪蛋白溶液進行蛋白質的阻斷約30分鐘 xiv. 與一一級抗體結合，其中所述一級抗體包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列，或者係一MsIgG1抗體，且其中所述抗體具有20 µg/ml之濃度，且其中所述暴露係將執行約24小時，且其中所述暴露係將在約4°C下執行 xv. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第一次洗滌約2分鐘 xvi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽進行水第二次洗滌約2分鐘 xvii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第三次洗滌約2分鐘 xviii. 與一擴增該一級抗體之訊號的試劑進行培養，其中所述培養係執行約15分鐘 xix. 與一綴合至一辣根過氧化酶的二級抗體進行培養，其中所述二級抗體係一抗小鼠抗體，且其中所述暴露係執行約60分鐘 xx. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第一次洗滌約2分鐘 xxi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第二次洗滌約2分鐘 xxii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第三次洗滌約2分鐘 xxiii. 使用3,3’-二胺基聯苯胺進行染色約3-5分鐘 xxiv. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行沖洗約2分鐘 xxv. 蘇木精複染。
- 如請求項132之方法，其中所述組織樣品係一卵巢組織樣品。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述方法包含在所述組織樣品上進行之以下步驟： i. 去石蠟作用 ii. 使用Tris-EDTA緩衝液進行抗原修復，其中所述緩衝液具有9之pH值，且其中所述抗原修復係執行約20分鐘 iii. 冷卻約20分鐘 iv. 在d2H2O中進行第一次沖洗約1分鐘 v. 在d2H2O中進行第二次沖洗約1分鐘 vi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第一次洗滌約2分鐘 vii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第二次洗滌約2分鐘 viii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第三次洗滌約2分鐘 ix. 使用過氧化酶阻斷物來阻斷酶，其中所述過氧化酶阻斷物係配於d2H2O的3% H2 O2 ，且其中所述暴露係執行約10分鐘 x. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第一次洗滌約2分鐘 xi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第二次洗滌約2分鐘 xii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第三次洗滌約2分鐘 xiii. 使用酪蛋白溶液進行蛋白質的阻斷約30分鐘 xiv. 與一一級抗體結合，其中所述一級抗體包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列，或者係一MsIgG1抗體，且其中所述抗體具有30 µg/ml之濃度，且其中所述暴露係將執行約24小時，且其中所述暴露係將在約4°C下執行 xv. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第一次洗滌約2分鐘 xvi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第二次洗滌約2分鐘 xvii. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第三次洗滌約2分鐘 xviii. 與一綴合至一辣根過氧化酶的二級抗體進行培養，其中所述二級抗體係一抗小鼠抗體，且其中所述暴露係執行約120分鐘 xix. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第一次洗滌約2分鐘 xx. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第二次洗滌約2分鐘 xxi. 使用0.01M磷酸鹽緩衝鹽水進行第三次洗滌約2分鐘 xxii. 使用3,3’-二胺基聯苯胺進行染色約3-5分鐘 xxiii. 使用水沖洗約1分鐘 xxiv. 蘇木精複染。
- 如請求項134之方法，其中所述組織樣品係一胃組織樣品。
- 一種用於提供及/或測量一抗體或其抗原結合片段在治療一個體中的癌症之功效及/或安全性之一生物標記物的方法，其中所述方法包含使用根據前述請求項中任一項之方法，且其中所述方法係在一包含癌細胞之組織樣品上進行。
- 一種用於檢測一抗體或其抗原結合片段在治療一個體中的癌症之臨床益處的方法，其中所述方法包含使用根據前述請求項中任一項之方法，且其中所述方法係在一包含癌細胞之組織樣品上進行。
- 一種用於提供及/或測量一抗體或其抗原結合片段在治療癌症的一適應症之功效及/或安全性之一生物標記物的方法，其中所述方法包含使用根據前述請求項中任一項之方法，且其中所述方法係在包含癌細胞之組織樣品上進行。
- 一種嵌合抗原受體(CAR)，其包含根據請求項17至36中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中所述嵌合抗原受體係用於根據前述請求項中任一項之方法中。
- 一種CAR-T細胞，其表現根據請求項139之CAR。
- 一種根據請求項140之CAR-T細胞的群體。
- 一種組成物，包含如請求項141之CAR-T細胞的群體的。
- 一種治療一個體中的癌症的方法，其中該方法包含提供根據前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段之功效及/或安全性的一生物標記物，且其中所述抗體或其抗原結合片段係用於所述治療中。
- 一種用於治療一個體中的癌症的方法，其中該方法包含使用一抗體或其抗原結合片段，且其中該適應症，諸如卵巢癌，供用於所述抗體或其抗原結合片段來治療所述癌症係藉由根據前述請求項中任一項之方法來確定或確認。
- 一種用於治療一個體中的癌症的方法，其中該方法包含評估一抗體或其抗原結合片段的臨床益處，其包含使用根據前述請求項中任一項之方法，且其中該臨床益處係對一患者的臨床益處，且其中所述抗體或其抗原結合片段係用於所述治療中。
- 一種用於治療一個體中的癌症的方法，其中該方法包含提供一抗體或其抗原結合片段在一包含癌細胞之組織樣品中之功效及/或安全性的一生物標記物，其包含使用根據前述請求項中任一項之方法，且其中所述抗體或其抗原結合片段係用於所述治療中。
- 一種診斷一個體中的癌症的方法，其中該方法包含提供根據前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段之功效及/或安全性的一生物標記物，且其中所述抗體或其抗原結合片段係用於所述診斷中。
- 一種用於診斷一個體中的癌症的方法，其中該方法包含使用一抗體或其抗原結合片段，且其中使用所述抗體或其抗原結合片段診斷所述癌症係藉由根據前述請求項中任一項之方法來確定或確認。
- 一種用於診斷一個體中的癌症的方法，其中該方法包含評估一抗體或其抗原結合片段的臨床益處，其包含使用根據前述請求項中任一項之方法，且其中該臨床益處係對一患者的臨床益處，且其中所述抗體或其抗原結合片段係用於所述診斷中。
- 一種用於診斷一個體中的癌症的方法，其中該方法包含提供一抗體或其抗原結合片段在一包含癌細胞之組織樣品中之功效及/或安全性的一生物標記物，其包含使用根據前述請求項中任一項之方法，且其中所述抗體或其抗原結合片段係用於所述診斷中。
- 如請求項146或150之方法，其中所述組織樣品係一來自於所述個體的組織樣品。
- 如請求項143至151中任一項之方法，其中所述方法評估B7-H3之過度表現。
- 如請求項146或150中任一項之方法，其中所述癌細胞係選自於如請求項117至129之任合癌細胞。
- 如請求項143至153中任一項之方法，其中所述抗體或其抗原結合片段係如請求項17至36中任一項之任何抗體或抗原結合片段。
- 如請求項143至154中任一項之方法，其中所述癌症係表現或可能表現B7-H3之任何癌症類型。
- 如請求項143至155中任一項之方法，其中所述癌症係選自於一癌瘤、一肉瘤、一淋巴瘤及一白血病。
- 如請求項143至156中任一項之方法，其中所述癌症係選自於神經母細胞瘤、髓母細胞瘤、神經膠質母細胞瘤、小細胞肺癌、非小細胞癌瘤、一小兒肉瘤、一成人肉瘤、乳癌、肝癌、黑色素瘤、非小細胞肺癌瘤、肺腺癌或一胃腸癌。
- 如請求項143至157中任一項之方法，其中所述癌症係一卵巢癌。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述卵巢癌係一腺癌。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述腺癌係一漿液性腺癌。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述腺癌係一漿液性乳頭狀腺癌。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述癌症係一胃癌。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述胃癌係一癌瘤。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述癌瘤係一腺癌。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述癌瘤係一囊腺癌。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述癌症係神經母細胞瘤。
- 如請求項143至158中任一項之方法，其中所述癌症係一轉移瘤、一高風險癌症及/或一復發性癌症。
- 如請求項143至167中任一項之方法，其中所述治療係結合化學療法及/或手術。
- 一種適用於執行如前述請求項中任一項或多項之方法的部件套組。
- 一種部件套組，其中所述套組係將用於確定或定性一抗體或其抗原結合片段之功效及/或安全性的一生物標記物，其中所述抗體或其抗原結合片段係將用於治療一癌症。
- 一種部件套組，其中所述套組係將用於確定或定性一患者從使用一抗原或其抗原結合片段之治療所具有或將具有的臨床益處，且其中所述患者係一癌症患者。
- 一種部件套組，其中所述套組係將用於確定或定性一抗體或其抗原結合片段在治療癌症的一適應症之功效及/或安全性的一生物標記物。
- 一種部件套組，其中所述套組係用於檢測在一包含癌細胞之組織樣品中的B7-H3表現，且其中所述樣品係選自於一已被包埋在石蠟中的樣品以及一已被冷凍的樣品。
- 如前述請求項中任一項之套組，其中所述套組包含執行根據前述請求項中任一項之方法的操作說明。
- 如請求項169至173中任一項之套組，其包含一用於檢測B7-H3表現之抗B7-H3抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項169至175中任一項之套組，其中所述套組包含一一級抗體。
- 如請求項169至176之套組，其中所述抗B7-H3抗體或其抗原結合片段，或者所述一級抗體係如請求項17至36之任何抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項169至177中任一項之套組，其中所述套組使用抗體以檢測在所述組織樣品之細胞中的蛋白質。
- 如請求項169至178中任一項之套組，其中所述套組包含一二級抗體。
- 如請求項179之套組，其中所述二級抗體係一抗小鼠抗體。
- 如請求項179至180中任一項之套組，其中所述二級抗體係綴合至一酶。
- 如請求項181之套組，其中所述酶係一過氧化酶。
- 如請求項182之套組，其中所述過氧化酶係辣根過氧化酶。
- 如請求項169至183中任一項之套組，其中所述套組包含一酶阻斷物。
- 如請求項184之套組，其中所述酶阻斷物係一過氧化酶阻斷物。
- 如請求項185之套組，其中所述過氧化酶阻斷物係配於d2H2O的3% H2 O2 。
- 如請求項169至186中任一項之套組，其中所述套組包含一蛋白質阻斷物。
- 如請求項187之套組，其中所述蛋白質阻斷物係酪蛋白溶液。
- 如請求項169至188中任一項之套組，其中所述套組包含一用於顯色染色之物質。
- 如請求項189之套組，其中所述用於顯色染色之物質係一聯苯胺。
- 如請求項190之套組，其中所述聯苯胺係3,3’-二胺基聯苯胺。
- 如請求項189至191中任一項之套組，其中所述用於顯色染色之物質係一複染劑。
- 如請求項192之套組，其中所述複染劑係蘇木精以及可選地伊紅。
- 如前述請求項中任一項之套組，其中所述套組進一步包含一擴增該一級抗體之訊號的試劑。
- 如前述請求項中任一項之套組，其中所述擴增該一級抗體之訊號的試劑係一抗體聚合物。
- 如請求項169至193中任一項之套組，其中所述套組包含一用於洗滌之物質。
- 如請求項196之套組，其中所述用於洗滌之物質係一洗滌緩衝液。
- 如請求項197之套組，其中所述洗滌緩衝液係磷酸鹽緩衝鹽水。
- 如請求項196至198中任一項之套組，其中所述洗滌緩衝液係0.01M磷酸鹽緩衝鹽水-0.05%聚氧乙烯山梨醇酐單月桂酸酯。
- 如請求項169至199中任一項之套組，其中該套組進一步包含水。
- 如請求項200之套組，其中所述水係d2H2O。
- 如請求項169至201中任一項之套組，其中所述癌細胞係選自於如請求項117至129之任何癌細胞。
- 如請求項169至202中任一項之套組，其中所述癌症係選自於如請求項155至167之任何癌症。
- 一種用於治療一個體中的癌症的方法，其中該方法包含使用如請求項169至203中任一項之套組。
- 如請求項204之方法，其中所述癌症係選自於如請求項155至167之任何癌症。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述癌症係一胃癌。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述胃癌係一癌瘤。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述癌瘤係一腺癌。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述癌瘤係一囊腺癌。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述癌症係一卵巢癌。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述卵巢癌係一腺癌。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述腺癌係一漿液性腺癌。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述腺癌係一漿液性乳頭狀腺癌。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中所述癌症係一神經母細胞瘤。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中細胞之分佈係選自於由瀰漫性及多處局部性所組成之群組，較佳地係藉由實施例2之方法所確定。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該發生率係1，較佳地係2，更佳地係3，較佳地係4，較佳地係藉由實施例2之方法所確定。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該發生率係2-4，較佳地係3-4，較佳地係藉由實施例2之方法所確定。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該染色強度係1，較佳地係2，更佳地係3，較佳地係4，較佳地係藉由實施例2之方法所確定。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該染色強度係2-4，較佳地係3-4，較佳地係藉由實施例2之方法所確定。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該染色係顆粒狀，較佳地係藉由實施例2之方法所確定。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該染色係位在膜上或細胞質，較佳地係藉由實施例2之方法所確定。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該染色係位在膜上，較佳地係藉由實施例2之方法所確定。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中該亞細胞位置係選自於由顆粒(G)、膜(M)、細胞質(C)、細胞外(E)、脈管系統(V)、核內(In)、頂部(A)及基部(B)所組成之群組，較佳地係藉由實施例3之方法所確定。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中陽性腫瘤細胞的量以百分比計係選自於由29%、30-49%、50-74%及75-100%所組成之群組，較佳地係藉由實施例3之方法所確定。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中陽性腫瘤細胞的量以百分比計係高於10%、高於20%，較佳地係高於30%，較佳地係藉由實施例3之方法所確定。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中陽性腫瘤細胞之發生率係選自於由正常、最小、輕度、中度及重度所組成之群組，較佳地係藉由實施例3之方法所確定。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中在細胞水平上陽性染色的強度係選自於由不明確、輕度(微弱)、中度、強烈及極度所組成之群組，較佳地係藉由實施例3之方法所確定。
- 如前述請求項中任一項之方法，其中染色之發生率代表陽性腫瘤細胞的一輕度至重度分佈，較佳地係藉由實施例3之方法所確定。
- 一種於癌症之治療中使用的如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該使用包含提供根據前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段之功效及/或安全性的一生物標記物。
- 一種於癌症之治療中使用的如前述請求項中任一項之用於治療癌症之抗體或其抗原結合片段，其中使用所述抗體或其抗原結合片段治療所述癌症係藉由根據前述請求項中任一項之方法所確定或確認。
- 一種於癌症之治療中使用的如前述請求項中任一項之用於治療癌症之抗體或其抗原結合片段，其中該使用包含評估該抗體或其抗原結合片段的臨床益處，其包含使用根據前述請求項中任一項之方法，且其中該臨床益處係對一患者的臨床益處。
- 一種於癌症之治療中使用的如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該使用包含提供該抗體或其抗原結合片段在一包含癌細胞之組織樣品中之功效及/或安全性的一生物標記物，其包含使用根據前述請求項中任一項之方法。
- 一種於癌症診斷方法中使用的如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該使用包含提供根據前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段之功效及/或安全性的一生物標記物。
- 一種於癌症診斷方法中使用的如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，且其中使用所述抗體或其抗原結合片段診斷所述癌症係藉由根據前述請求項中任一項之方法所確定或確認。
- 一種於癌症診斷方法中使用的如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該使用包含評估該抗體或其抗原結合片段的臨床益處，其包含使用根據前述請求項中任一項之方法，且其中該臨床益處係對一患者的臨床益處。
- 一種於癌症診斷方法中使用的如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其中該使用包含提供一抗體或其抗原結合片段在一包含癌細胞之組織樣品中之功效及/或安全性的一生物標記物，其包含使用根據前述請求項中任一項之方法。
- 一種治療卵巢癌之方法，其包含向有需要之患者投與一治療有效量之根據前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項237之方法，其中所述卵巢癌係一腺癌。
- 如請求項238之方法，其中所述腺癌係一漿液性腺癌。
- 如請求項238至239中任一項之方法，其中所述腺癌係一漿液性乳頭狀腺癌。
- 如請求項237之方法，其中所述卵巢癌係選自於由下列所組成之群組：上皮癌瘤、漿液性癌瘤、原發性腹膜癌瘤、透明細胞癌瘤、透明細胞腺癌、子宮內膜樣、惡性混合穆勒氏腫瘤(癌肉瘤)、黏液性腫瘤、黏液性腺癌、腹膜假黏液瘤、未分化之上皮癌、惡性布倫納氏腫瘤、移行細胞癌瘤、性索基質腫瘤、顆粒層細胞腫瘤、成年型顆粒層細胞腫瘤、幼年型顆粒層細胞腫瘤、塞特利氏-雷迪格氏細胞腫瘤、硬化性基質腫瘤、生殖細胞腫瘤、惡性胚胎瘤、絨毛膜癌瘤、未成熟(固體)畸胎瘤、成熟畸胎瘤(皮樣囊腫)、卵黃囊腫瘤/內胚竇腫瘤、胚胎性癌瘤、多胚瘤、鱗狀細胞癌瘤、混合性腫瘤、繼發性卵巢癌，以及交界性腫瘤。
- 一種治療胃癌之方法，其包含向有需要之患者投與一治療有效量之根據前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段。
- 如請求項242之方法，其中所述胃癌係一癌瘤。
- 如請求項243之方法，其中所述癌瘤係一腺癌。
- 如請求項243至244中任一項之方法，其中所述癌瘤係一囊腺癌。
- 如請求項242之方法，其中所述胃癌係選自於由腺癌、淋巴瘤、胃腸基質腫瘤(GIST)、類癌腫瘤及其他癌症所組成之群組。
- 一種抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含選自於下列中的至少一者：根據SEQ ID No. 3之重鏈可變區CDR1、根據SEQ IN No. 4或19之重鏈可變區CDR2、根據SEQ ID No. 5之重鏈可變區CD3、根據SEQ ID No. 6之輕鏈可變區CDR1、根據SEQ ID No. 7之輕鏈可變區CDR2及根據SEQ ID No. 8之輕鏈可變區CDR3。
- 一種抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含根據SEQ ID No. 1之重鏈序列及根據SEQ ID No. 2之輕鏈序列。
- 一種抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段包含一重鏈序列及/或一輕鏈序列，所述重鏈序列係與SEQ ID No. 1所示之序列具有至少約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約 97%、約98%或約99%的序列一致性，所述輕鏈序列係與SEQ ID No. 2所示之序列具有至少約80%、約81%、約82%、約83%、約84%、約85%、約86%、約87%、約88%、約89%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約 97%、約98%或約99%的序列一致性。
- 如前述請求項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述其抗原結合片段係一單鏈可變片段(scFv)。
- 如前述請求項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述scFv包含SEQ ID No. 9、SEQ ID No. 13或SEQ ID No. 14所示之胺基酸序列的一部分。
- 如前述請求項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述scFv包含胺基酸取代K13E、R18Q、R45Q、K103E及K107E中之至少一者。
- 如前述請求項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述抗B7-H3抗體或其抗原結合片段係一鼠類8H9抗體或其抗原結合片段。
- 如前述請求項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段係經人源化。
- 如前述請求項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段係一嵌合抗體或其抗原結合片段。
- 如前述請求項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段係經放射性標記。
- 如前述請求項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述放射性標記係選自於一PET標記以及一SPECT標記。
- 如前述請求項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述PET標記係選自於124 I、225 Ac及89 Zr。
- 如前述請求項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述SPECT標記係選自於131 I、177 Lu、99 mTc、64 Cu及89 Zr。
- 如前述請求項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段係綴合至一螯合劑化合物。
- 如前述請求項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述螯合劑化合物係結合至一放射性同位素。
- 如前述請求項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述放射性同位素係選自於124 I、131 I及177 Lu或99 mTc、64 Cu (螯合至NOTA)及89 Zr (螯合至DFO)。
- 如前述請求項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述螯合劑化合物係選自於DOTA、DTPA、NOTA及DFO。
- 如前述請求項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述DOTA係DOTA的一變異體。
- 如前述請求項中任一項之抗體或抗原結合片段，其中所述DTPA係DTPA的一變異體。
- 一種如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用於在卵巢癌之治療中使用。
- 一種如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用於如請求項266之使用，其中所述卵巢癌係一腺癌。
- 一種如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用於如請求項267之使用，其中所述腺癌係一漿液性腺癌。
- 一種如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用於如請求項267至268中任一項之使用，其中所述腺癌係一漿液性乳頭狀腺癌。
- 一種如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用於如請求項266之使用，其中所述卵巢癌係選自於由下列所組成之群組：上皮癌瘤、漿液性癌瘤、原發性腹膜癌瘤、透明細胞癌瘤、透明細胞腺癌、子宮內膜樣、惡性混合穆勒氏腫瘤(癌肉瘤)、黏液性腫瘤、黏液性腺癌、腹膜假黏液瘤、未分化之上皮癌、惡性布倫納氏腫瘤、移行細胞癌瘤、性索基質腫瘤、顆粒層細胞腫瘤、成年型顆粒層細胞腫瘤、幼年型顆粒層細胞腫瘤、塞特利氏-雷迪格氏細胞腫瘤、硬化性基質腫瘤、生殖細胞腫瘤、惡性胚胎瘤、絨毛膜癌瘤、未成熟(固體)畸胎瘤、成熟畸胎瘤(皮樣囊腫)、卵黃囊腫瘤/內胚竇腫瘤、胚胎性癌瘤、多胚瘤、鱗狀細胞癌瘤、混合性腫瘤、繼發性卵巢癌，以及交界性腫瘤。
- 一種如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用於在胃癌之治療中使用。
- 一種如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用於如請求項271之使用，其中所述胃癌係一癌瘤。
- 一種如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用於如請求項272之使用，其中所述癌瘤係一腺癌。
- 一種如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用於如請求項272至273中任一項之使用，其中所述腺癌係一囊腺癌。
- 一種如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段，其用於如請求項271之使用，其中所述胃癌係選自於由腺癌、淋巴瘤、胃腸基質腫瘤(GIST)、類癌腫瘤，及其他癌症所組成之群組。
- 一種如前述請求項中任一項之抗體或其抗原結合片段之用途，其係用於製備治療如前述請求項中任一項之適應症的醫藥品。
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