CN113358863A - 一种多聚酶标记的制作方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多聚酶标记的制作方法，包括酶‑抗体复合物，所述酶‑抗体复合物引入了修饰的微球载体，所用微球载体可为天然高分子材料、半合成高分子材料、合成高分子材料、磁性微球等优选超顺磁微球，微球大小20nm、30nm、200nm、300nm、400nm以及微米级磁珠等优选20‑30nm磁性微球渗透性更好，微球为基团修饰的表面，修饰基团可以是：氨基、巯基、羧基、羟基、醛基等活性基团。有益效果是：多聚酶标记物与常规的酶标记相比，信号多倍放大，信号强度远胜于常规方法标记的酶抗体复合物。

Description

一种多聚酶标记的制作方法
技术领域
本发明属于技术领域，具体涉及一种多聚酶标记的制作方法。
背景技术
免疫组织化学(IHC)是组织学诊断以及形态学研究的重要工具，IHC广泛应用与临床和诊断应用中，IHC通过采用特异性结合试剂比如抗体检测组织中存在的蛋白，对其进行定量、定性以及定位研究，例如：用于来自癌症受试者的样品诊断。
对于组织学和细胞学样品的检验，高度期待开发提供快速的理想的结果和无背景干扰的方法。一种方法涉及一种水溶性聚合物分子------右旋糖酐，通过多个联乙烯砜将抗原、半抗原、抗体等标记物标记，如：Dako公司在美国申请了一项发明专利(US005543332A1996)，公开了使用右旋糖酐将多个标记物聚合达到信号放大的作用。再比如美国专利6，593，100，公开了一种使用CARD或者TSA方法增强酶的催化。
尽管如此，诸如以上所述方法来增强放大方法，但这些方法导致信号物质分子量过大对细胞内部分子的信号敏感度降低、相应背景的放大对真是信号的干扰以及某些方法反应时间较长。因此，存在对可以产生最佳效果而不产生背景，并且渗透性好的信号放大方法的需求。
为此我们提出一种多聚酶标记的制作方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多聚酶标记的制作方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种多聚酶标记的制作方法，包括酶-抗体复合物，所述酶-抗体复合物引入了修饰的微球载体，所用微球载体可为天然高分子材料、半合成高分子材料、合成高分子材料、磁性微球等优选超顺磁微球。
优选的，所述微球大小20nm、30nm、200nm、300nm、400nm以及微米级磁珠等优选20-30nm磁性微球渗透性更好。
优选的，所述微球为基团修饰的表面，修饰基团可以是：氨基、巯基、羧基、羟基、醛基等活性基团。
优选的，所述酶--抗体复合物中的酶为过氧化物酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶。
优选的，所述磁珠-酶-抗体符合制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a、取10mg—20mgHRP加入等体积15-60mM高碘酸钠溶液，4度反应20-30min，得到醛基化的HRP备用；
b、将醛基化的HRP加入到氨基微球中4度反应16小时，得到磁珠酶复合物；
c、对复合物使用硼氢化钠进行还原胺化，得到稳定磁珠-酶符合物；
d、加入足量的EMCS和磁珠上剩余的氨基结合室温反应1h；
e、Fab'抗体片段制备，使用胃蛋白酶将IgG消化后，使用DTT/巯基乙醇、巯基乙胺等将二硫键还原，形成带有游离二硫键的Fab'抗体片段备用；
f、将Fab'抗体片段加入磁珠-酶-EMCs中反应16h。
优选的，所述酶--抗体复合物中的抗体为任意种类抗体蛋白。
优选的，所述抗体为使用已知方法获取的Fab'抗体片段，分子量更小更易于进入细胞内部。
优选的，所述抗体符合物涉及引入双功能交联剂，例如：SMCC、EMCS、 SATA、SPDP、SMPB、Sulfo-MBS、BMPS、SBA等。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：多聚酶标记物与常规的酶标记相比，信号多倍放大，信号强度远胜于常规方法标记的酶抗体复合物。
1、通过使用CK-pan作为一抗对食道鳞癌进行染色，首先将组织切片进行脱蜡水化抗原修复并灭活内源性酶，然后一抗孵育30min分钟，使用相同浓度样品B和本发明所制造的复合物A，进行染色，得到的多聚酶标记物与常规的酶标记相比，信号多倍放大，信号强度远胜于常规方法标记的酶抗体复合物。
附图说明
图1为本发明样品A的示意图；
图2为本发明样品B的示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-2，本发明提供一种技术方案：一种多聚酶标记的制作方法，包括酶-抗体复合物，其特征在于：所述酶-抗体复合物引入了修饰的微球载体，所用微球载体可为天然高分子材料、半合成高分子材料、合成高分子材料、磁性微球等优选超顺磁微球，微球大小20nm、30nm、200nm、300nm、400nm 以及微米级磁珠等优选20-30nm磁性微球渗透性更好，微球为基团修饰的表面，修饰基团可以是：氨基、巯基、羧基、羟基、醛基等活性基团，酶--抗体复合物中的酶为过氧化物酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶，酶--抗体复合物中的抗体为任意种类抗体蛋白，抗体为使用已知方法获取的Fab'抗体片段，分子量更小更易于进入细胞内部，抗体符合物涉及引入双功能交联剂，例如：SMCC、EMCS、SATA、SPDP、SMPB、Sulfo-MBS、BMPS、SBA等。
具体的，磁珠-酶-抗体符合制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a、取10mg—20mgHRP加入等体积15-60mM高碘酸钠溶液，4度反应20-30min，得到醛基化的HRP备用；
b、将醛基化的HRP加入到氨基微球中4度反应16小时，得到磁珠酶复合物；
c、对复合物使用硼氢化钠进行还原胺化，得到稳定磁珠-酶符合物；
d、加入足量的EMCS和磁珠上剩余的氨基结合室温反应1h；
e、Fab'抗体片段制备，使用胃蛋白酶将IgG消化后，使用DTT/巯基乙醇、巯基乙胺等将二硫键还原，形成带有游离二硫键的Fab'抗体片段备用；
f、将Fab'抗体片段加入磁珠-酶-EMCs中反应16h。
实施例1：
S1、取20mgHRP干粉在ph7.2的不PBS中透析备用；
S2、取4mg氨基磁珠微球在磁力加上使用PH9.5CBS清洗3次，后在 PH9.5CBS中混匀备用；
S3、将1.1中hrp加入等体积30mM高碘酸钠溶液4度反应25min；
S4、G25脱盐柱脱盐收集醛基化的HRP；
S5、将HRP加入氨基磁珠微球中4度反应16h后在磁力架上清清洗三次去除未结合的HRP，用PH7.2的PBS重悬；
Fab'抗体片段制备：
S1、取5mg抗体用PH3的PBS缓冲液平衡；
S2、用PH3的PBS溶解胃蛋白酶至1mg/ml；
S3、按照抗体：胃蛋白酶＝20:1混合37℃反应得到其F(ab')2片段，在含有10mM的EDTA的PBS中平衡；
S4、在10mM的EDTA中溶解1M半胱胺盐酸盐，5mg IgG中加入20ul，37 度反应90min，G25脱盐柱脱盐浓缩备用；
巯基化酶-磁珠复合物制备：
S1、将1.5中复合物加入过量的EMCS室温反应半小时，得到含有巯基的复合物；
S2、G25脱盐柱脱盐浓缩备用；
S3、将1.5和1.6中的复合物混合反应16小时；
S4、使用过量N-Ethylmaleimide在pH6-7之间与1.8中物质反应封闭未反应巯基；
S5、透析后得到样品A备用。
实施列2
常规方法制备HRP-IgG复合物：
S1、取20mgHRP干粉在ph7.2的不PBS中透析备用；
S2、加入等体积30mM高碘酸钠溶液4度反应25min；
S3、G25脱盐柱脱盐收集醛基化的HRP；
S4、取5mg抗体加入醛基化HRP中反应16h；
S5、4mg/ml硼氢化钠还原胺化；
S6、透析后得到样品B备用。
结果：使用CK-pan作为一抗对食道鳞癌进行染色，首先将组织切片进行脱蜡水化抗原修复并灭活内源性酶，然后一抗孵育30min分钟，使用相同浓度样品B和本发明所制造的复合物A，进行染色，得到的多聚酶标记物与常规的酶标记相比，信号多倍放大，信号强度远胜于常规方法标记的酶抗体复合物。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (8)

1.一种多聚酶标记的制作方法，包括酶-抗体复合物，其特征在于：所述酶-抗体复合物引入了修饰的微球载体，所用微球载体可为天然高分子材料、半合成高分子材料、合成高分子材料、磁性微球等优选超顺磁微球。
2.根据权利要求1所述的一种多聚酶标记的制作方法，其特征在于：所述微球大小20nm、30nm、200nm、300nm、400nm以及微米级磁珠等优选20-30nm磁性微球渗透性更好。
3.根据权利要求1所述的一种多聚酶标记的制作方法，其特征在于：所述微球为基团修饰的表面，修饰基团可以是：氨基、巯基、羧基、羟基、醛基等活性基团。
4.根据权利要求1所述的一种多聚酶标记的制作方法，其特征在于：所述酶--抗体复合物中的酶为过氧化物酶、碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶。
5.根据权利要求1所述的一种多聚酶标记的制作方法，其特征在于：所述磁珠-酶-抗体符合制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a、取10mg—20mgHRP加入等体积15-60mM高碘酸钠溶液，4度反应20-30min，得到醛基化的HRP备用；
b、将醛基化的HRP加入到氨基微球中4度反应16小时，得到磁珠酶复合物；
c、对复合物使用硼氢化钠进行还原胺化，得到稳定磁珠-酶符合物；
d、加入足量的EMCS和磁珠上剩余的氨基结合室温反应1h；
e、Fab'抗体片段制备，使用胃蛋白酶将IgG消化后，使用DTT/巯基乙醇、巯基乙胺等将二硫键还原，形成带有游离二硫键的Fab'抗体片段备用；
f、将Fab'抗体片段加入磁珠-酶-EMCs中反应16h。
6.根据权利要求1所述的一种多聚酶标记的制作方法，其特征在于：所述酶--抗体复合物中的抗体为任意种类抗体蛋白。
7.根据权利要求1所述的一种多聚酶标记的制作方法，其特征在于：所述抗体为使用已知方法获取的Fab'抗体片段，分子量更小更易于进入细胞内部。
8.根据权利要求1所述的一种多聚酶标记的制作方法，其特征在于：所述抗体符合物涉及引入双功能交联剂，例如：SMCC、EMCS、SATA、SPDP、SMPB、Sulfo-MBS、BMPS、SBA等。
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