KR20080013057A - 금-결합 이차항체를 이용한 면역조직화학 염색 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 새로운 면역조직화학 염색방법, 더 구체적으로 금이 결합된 (Gold-Conjugated) 이차항체를 이용한 면역조직화학 염색방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 면역조직화학 염색방법에 사용되는 금-결합 이차항체에 관한 것이다.

본 발명의 방법에 따르면, 조직 또는 검체 내에 원래 존재하는 항원을 효소작용이나 증폭단계 없이 면역조직화학 염색을 시행함으로써 기존의 방법에 비하여 정확한 정량이 가능하고, 조직의 효소 작용에 의한 배경염색이 적어서 깨끗한 결과를 나타낼 수 있으며, 면역조직화학 염색시간을 단축하게 된다. 또한, 본 발명에 따른 간단한 방법으로 면역조직화학 염색을 시행함으로써 슬라이드를 관찰하기까지의 시간과 인력을 단축하는 이점을 갖는다.

면역조직화학 염색, 금-결합 (Gold-Conjugated), 이차항체

Description

금-결합 이차항체를 이용한 면역조직화학 염색 방법 {Immunohistochemical Staining Method Using Gold-Conjugated Secondary Antibody}

도 1은 본 발명의 면역조직화학 염색 원리를 나타낸 그림이다.

도 2는 일차항체의 농도에 따라 금이 부착된 (gold-conjugated) bead를 이용하여 이차 항체의 발색 정도를 나타낸 사진이다.

도 3은 기존의 효소면역조직화학 염색방법에 따른 이차항체의 발색 정도를 나타낸 사진이다.

도 4는 다발성 골수종 골수 표본에 Ki-67에 대한 일차항체로 염색하고 금-부착 2차 항체로 색깔 발현을 검출한 면역조직화학 염색 결과를 나타낸 사진이다.

도 5는 정상 골수에 CD14 일차항체로 염색하고 금-부착 2차 항체로 색깔 발현을 검출한 면역조직화학 염색 결과를 나타낸 사진이다. 정확하게 대식세포에만 붉게 염색됨을 나타낸다.

도 6은 정상 말초혈액 백혈구를 항-CD5로 염색 후 gold-conjugated 이차항체로 발색시킨 사진이다. CD5 양성 세포들은 붉은색 gold 색깔을 나타낸다.

본 발명은 새로운 면역조직화학 염색방법에 관한 것으로, 더 구체적으로 금-표지 (Gold Conjugated) 이차항체를 이용한 면역조직화학 염색방법으로, 조직 또는 검체 내에 원래 존재하는 항원을 효소작용이나 증폭단계 없이 정확하게 시각적으로 정량할 수 있으면서도 또한, 간단한 방법으로 면역조직화학 염색을 시행함으로써 슬라이드를 관찰하기까지의 시간과 인력을 단축할 수 있고, 조직에서 정상적으로 함유하고 있는 효소 활성에 의한 배경염색이 없어서 깨끗한 결과를 나타낸다는 이점을 제공한다.

효소 면역조직화학 염색법은 각종 종양의 기원, 종양의 분류, 예후판정 등의 목적으로 매우 광범위하게 이용되고 있는 방법이다. 특히, 최근에는 어떤 항원의 존재 여부 뿐 아니라 조직이나 세포에 존재하는 항원의 양이 암의 예후나 항암제에 대한 반응성을 결정짓는데 중요하다는 사실이 알려지면서 정량적인 면역조직화학 염색의 필요성이 대두되었다.

그러나 현재 이용 가능한 면역조직화학 염색법은 항원에 대한 일차 항체를 반응시켜 붙인 다음 직접 효소가 붙은 이차 항체를 붙이고 효소의 기질액을 반응시켜 발색을 시키거나, 바이오틴 (biotin)이 붙은 이차항체를 반응시키고 이후에 바이오틴과 강력하게 붙는 성질이 있는 아비딘 (avidin)에 효소가 달라 붙어있는 시약을 반응시키고 (예를 들어, ABC 법) 이후에 이 효소에 대한 기질액을 반응시켜서 색깔을 발색시켜 현미경하에서 원래 항원의 존재를 관찰하는 방법을 사용하고 있다. 또한 아비딘-바이오틴 이외에 폴리머를 이용하여 많은 수의 효소를 이차항체에 부착시킨 것을 사용하기도 한다.

이와 같은 방법은 효소의 반응 정도를 결정짓는 여러 가지 요소들에 의해 최종 발색 정도가 달라지고 특히 가장 흔히 이용되고 있는 ABC 법이나 폴리머 법에서는 여러 단계를 거쳐서 염색하므로 원래 존재하는 항원은 여러 단계로 증폭되어 선명한 색깔로 나타날 수 있게되나 정량적인 정보를 얻기에는 오히려 단점이 되고 있다.

즉, 기존 방법의 문제점을 열거하면 아래와 같다.

1. 슬라이드를 관찰할 수 있게 되기까지 시간이 많이 소요된다. (3시간 이상).

2. 슬라이드를 관찰할 수 있게 되기까지 여러 단계의 작업이 요구되므로 인력 소모가 많다.

3. 항원의 존재를 효소의 작용에 의해 검출하므로 정량적으로 보고하는데 한계가 있다.

4. 조직 내의 효소 활성에 의해 배경염색이 생겨서 깨끗한 결과를 얻지 못하는 경우가 있다.

이에 좀 더 간단한 단계로 세포나 조직 내의 항원을 정량적으로 깨끗하게 나타낼 수 있는 면역조직화학 염색법이 필요하다.

이에 본 발명의 발명자는 항원의 존재 여부를 단순하면서도 짧은 시간에 제작할 수 있으며, 더 나아가 항원의 존재를 시각적으로 정량적으로 알 수 있는 방법을 착안하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 목적은 효소작용이나 증폭과정 없이 조직 또는 검체 내의 항원 존재 여부를 간편하면서도 빠르게 확인할 수 있고, 시각적으로 정량이 가능한 면역조직염색방법을 제공하려는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 면역조직화학 염색에 사용되는 금 (gold)이 부착된 이차항체를 제공하려는데 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위한 면역조직화학 염색방법은 검체를 준비하는 제1단계; 상기 검체에 일차항체를 반응시킨 후 1차 세척하는 제2단계; 및 상기 일차항체에 대한 이차항체를 반응시킨 후 2차 세척한 후 발색을 확인하는 제3단계로 이루어지며, 상기 이차항체에 금 (gold)이 부착된 것을 특징으로 한다.

다른 한편으로, 본 발명은 면역조직화학 염색방법에 사용되는 금 입자가 부 착된 이차항체를 제공한다.

이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.

본 발명에 따른 면역조직화학 염색방법은 조직 (또는 검체) 준비, 일차항체 반응 및 세척과정, 이차 항체 반응과정 및 세척과정으로 이루어지는 통상적인 면역조직화학 염색방법의 과정을 포함하며, 특히 상기 이차항체로 금-부착된 (gold conjugated) 이차항체를 사용하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 면역조직화학 염색방법은 다음과 같이 실시되면 바람직하다. 우선, 조직 (검체)을 준비한다. 본 발명에 사용되는 검체의 종류는 Paraffin Embedded Tissues, Frozen Tissues, Formalin Fixed Tissues, Cell Smear 등의 것이 있으며 항원 의 보존을 위하여 가능한 신선한 조직을 4℃에서 고정한다.

다음으로, 검체의 준비 과정은 신선한 조직의 냉동 절편이나 고정액에 고정된 조직을 파라핀에 포매하여 3~4 마이크론 (micron) 두께로 박절하여 sialinated coating 된 slide 혹은 probe on plus slide에 붙여 놓는다. 냉동 절편의 경우는 -20℃ 아세톤에서 약 5분 고정한 후 PBS로 수세하여 조직을 준비하거나, -70℃의 냉동고에 보관하거나 즉시 이용할 수 있다.

정확한 검사결과를 얻기 위해서는 항원을 보존하여야 한다. 일차항체가 냉동 조직 절편에서만 항원의 검출이 가능한 경우는 생검 조직을 가능한 한 빨리 냉동시킨 후 냉동 조직 절편을 제작하여 실험에 이용하는 것이 바람직하다. 조직은 항원성의 보존을 위하여 포르말린에 고정할 수 있다. 포르말린은 단백질이나 펩타이드를 교차결합시킴으로 형태학적 구조가 잘 유지되나 오랜 시간 고정할 경우 항원성이 손상될 수가 있다. 또한, 알콜 또는 아세톤 등에 고정할 수 있으나, 이들은 단백질을 응고 침전하는 방법으로 고정시키므로 고분자 단백질의 항원성이 잘 유지되고 세포내의 불용성 물질을 동정하는데 우수하지만 항원의 부동화가 불완전하고 조직의 수축이 강하다. 따라서 항원성의 보존을 위하여 적절한 고정액의 선택과 고정시간을 알맞게 해야 한다.

다음으로, 조직 (검체) 내에 존재하는 항원에 반응할 일차항체 (primary antibody)로 조직 또는 검체를 반응시키는데, 일차항체로는 단클론항체 또는 다클론항체가 사용될 수 있으며, 농축형태와 희석형태가 있다. 특히, 농축항체의 경우 냉동건조된 것과 액체로 된 것을 포함한다. 통상 단위는 함량 (㎎)과 용량 (㎖)으로 구분될 수 있으며 현재 미국 Chemicon 사, BioGenex 사 등으로부터 입수할 수 있는 다양한 항체가 사용될 수 있다.

상기 일차항체로 반응시킨 후 세척과정은 조직 또는 검체와 결합되지 않은 일차항체를 제거하기 위하여 세척과정을 수행할 수 있으며, 세척에는 PBS-Tween 액 이나 Tris buffer rinse를 사용할 수 있다. 그 이후, 본 발명에 따른 이차항체 (secondary antibody)를 반응시킨 후 현미경 하에서 발색을 확인한다.

본 발명의 이차항체는 일차 항체를 제조한 동물의 면역글로불린을 항원으로 하여 제조한 다른 동물의 면역글로불린 (immunoglobulin)에 금 입자 (gold colloide)가 부착된 것을 특징으로 한다. 상기 이차항체는 해당 면역글로불린에 금 입자를 부착시켜 제조하거나 상업적으로 입수가능한 것을 사용할 수 있다. 본 발명의 이차항체는 일차항체와 반응하며 특정 일차항체에 대해서만 특이적일 필요는 없으며, 토끼, 양, 마우스 또는 다른 동물의 면역글로불린에 대한 항체를 포함한다.

도 1은 본 발명에 따른 면역조직화학 염색원리를 도시한 것으로, 조직 또는 검체 내에 존재하는 항원의 존재 여부, 더 나아가 존재의 정도를 검사하기 위하여 항원과 결합하는 일차항체와 반응시키고, 일차항체의 Fc (crystallizable fragment)에 대한 이차항체를 추가로 반응시켜 이차항체에 부착된 금이 표시하는 색깔을 육안으로 확인함으로써 조직 또는 검체 내에 항원의 존재여부 및 시각적 정량이 가능하게 한다.

이와 같이 본 발명에 따르면, 면역조직화학 염색을 단시간에 제작할 수 있을 뿐 아니라 일차항체에 부착된 이차 항체양을 부착된 금 (gold) 자체의 색깔로 표현함으로써 간편하게 정확한 정량보고가 가능하다는 이점을 갖는다.

이하, 본 발명의 실시예를 도면을 참조하여 상세하게 설명한다. 본 실시예는 본 발명을 예시하고자 하는 것으로, 본 발명을 이에 한정하려는 것은 아니다.

<실시예>

비교예 -일차항체의 농도에 따른 발색 정도의 비교

본 발명에 따른 금-부착 이차항체의 발색 정도를 확인하기 위하여, 부착된 일차항체의 농도를 달리하여 이차항체를 반응시켰다. 조직에 존재하는 항원의 양이 알려져 있는 것은 없기 때문에 유세포 정량분석용으로 시판되고 있는 인위적으로 비드 위에 일정양의 mouse IgG가 붙어있는 제품 (DakoCytomation사)을 이용하였다. 즉, 5단계의 알려진 개수의 일차항체가 붙어있는 비드 (bead)를 본 발명에 따른 금-부착 항체를 반응시킨 결과 일차항체의 농도에 따라 발색 정도가 달라짐을 확인할 수 있었다.(도 2)

도 2에서 보는 바와 같이, 일차항체 분자가 없는 경우 (번호 1)에는 색을 나타내지 않은 반면, 일차항체가 있는 경우 발색을 나타내었으며 일차항체의 농도가 증가함에 따라 (번호 2의 경우 3200, 번호 3의 경우 14000, 번호 4의 경우 69000, 번호 5의 경우 212000, 번호 6의 경우 649000개의 일차항체 분자/비드)에 발색 정도도 진하게 됨을 알 수 있다.

본 발명에 따른 염색방법과 기존의 효소면역화학 염색과의 차이를 확인하기 위해, 상기와 동일한 비드를 효소면역화학 염색을 실시하였다. 그 결과, 비드 위의 일차항체를 폴리머에 부착된 다수의 효소로 증폭시켜 색깔이 진하고 비드 위에 발색된 기질 덩어리들이 관찰되었다. 하지만, 6단계의 일차항체 농도였지만 약 4가지 정도로만 감별되었다 (도 3). 즉, 본 비교실험을 통해 본 발명에 따른 면역조직화학 염색방법이 기존의 방법에 비하여 항원의 존재와 그 정량적 판별이 더 명확함을 확인할 수 있었다.

실시예 -다발성 골수종 골수와 정상 골수의 면역조직화학 염색

다발성 골수종 골수에 Ki-67의 존재 여부를 확인하기 위해 본 발명의 이차항체를 사용한 면역조직화학 염색을 수행하였다.

먼저, 골수 생검 조직을 10% 포르말린에 고정 후 탈회한 다음 파라핀 포매블록을 제작하고 그 박절면을 따라 약 4μm 두께의 절편을 제작하였다. 탈-파라핀 과정을 거친 다음, 항-Ki67 항체 (Novocastra 사)를 1:50으로 희석하여 반응시킨 후 PBS로 세척한 다음 금-부착 rat anti-mouse IgG를 이차항체로 하여 10분간 실온에서 반응시킨 후 발색 여부를 확인하였다. 그 반응결과는 도 4에서 보는 바와 같이, 양성 세포들이 붉은 색으로 발색됨을 알 수 있었다.

정상 골수에 존재하는 대식세포를 확인하기 위해 본 발명의 이차항체를 사용한 면역조직화학 염색을 수행하였다. 조직의 처리는 상기한 바와 같았고, 일차항체는 항 CD14 (Labvision 사)항체를 1:50으로 희석하여 반응시킨 후 PBS로 세척한 다음 금-부착 rat anti-mouse IgG 를 이차항체로 하여 10분간 실온에서 반응시킨 후 발색여부를 확인하였다. 그 반응결과는 도 5에서 보는 바와 같이, 양성 세포들만이 선명한 붉은 색으로 발색됨을 알 수 있었다.

실시예 -정상 말초혈액 백혈구의 면역조직화학 염색

정상 골수에 존재하는 CD5 양성 T세포를 확인하기 위해 본 발명의 이차항체를 사용한 면역세포화학 염색을 수행하였다. 혈액은 EDTA로 항-응고시킨 후 50㎕의 혈액에, 일차항체인 항 CD5 (Becton Dickinson 사)항체 10㎕를 혼합하여 상온에서 15분 반응시킨 후 적혈구 용해액 2㎖ (Becton Dickinson 사)를 첨가하여 적혈구를 용해시키고 PBS로 세척한 다음 금-부착 rat anti-mouse IgG 를 이차항체로 하여 10분간 실온에서 반응시킨 후 발색 여부를 현미경으로 확인하였다.

그 반응결과는 도 6에서 보는 바와 같이, 양성 세포들만이 세포막이 선명한 붉은 색으로 발색됨을 알 수 있었다.

이러한 결과를 통해 본 발명에 따른 면역조직화학 염색방법은 조직 내 항원, 세포막위의 항원 등의 양을 간편하면서도 간단하게 정량적으로 발색시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

본 발명의 방법에 따르면, 면역조직화학 염색 슬라이드를 관찰할 수 있게 되기까지 시간이 적게 소요되어 (약 1시간 정도) 의뢰 당일 조직의 관찰이 가능하며, 원래 존재하는 항원을 효소 작용이나 증폭과정 없이 면역조직화학 염색을 시행하여 일차항체에 부착된 이차항체양을 금 콜로이드 (gold colloide) 자체의 색깔로 표현함으로써 기존 방법에 비하여 정확한 정량보고가 가능하게 한다.

Claims (4)

1. 조직 또는 검체를 준비하는 제1단계;

   상기 조직 또는 검체에 일차항체를 반응시킨 후 세척하는 제2단계; 및

   상기 일차항체에 대한 이차항체를 반응시킨 후 발색을 확인하는 제3단계; 로 이루어지는 면역조직화학 염색방법에 있어서, 상기 이차항체로 금-부착 (gold conjugated)항체를 사용하는 것을 특징으로 하는 면역조직화학 염색방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 금-부착 이차항체가 일차항체를 제조한 동물의 면역글로불린에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 면역조직화학 염색방법.
3. 면역조직화학 염색에서 조직 또는 검체의 항원과 결합하는 일차항체에 대한 이차항체로 사용되며, 금 (gold)이 부착된 것을 특징으로 하는 항체.
4. 제 3항에 있어서, 상기 이차항체가 일차항체를 제조한 동물의 면역글로불린에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 항체.

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