CN116773798A - 多肽的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种多肽的应用，包括多肽或结合多肽的自身抗体进行肺癌的诊断或预后评估，与对照多肽相比，诊断的特异度和灵敏度很高。
Description
技术领域
本发明涉及体外诊断及蛋白检测技术领域，具体涉及一种多肽的应用，尤其在诊断或预后评估肺癌中的应用。
背景技术
早在100多年前人们已经认识到机体的免疫系统可能对癌症防治发挥作用。在致癌过程中，由于遗传物质改变导致突变的、异常高表达水平的蛋白的产生，这些蛋白不被当做“自身”，而被当做抗原对待，称为自身抗原，机体免疫系统识别这些抗原并产生相应的抗体激发免疫反应消除这些抗原，产生的抗体称为自身抗体。在许多人类恶性肿瘤的早期和晚期疾病中发现了肿瘤相关(TA)自身抗体。并非所有TA抗原都会在所有个体中引发免疫反应，也并非所有免疫反应都是肿瘤特异性的。肿瘤相关自身抗体检测可以成为癌症检测的一种替代方法，前提是癌症患者血清内检测到高水平(相对于健康人和良性肿瘤的人)的自身抗体。当前，TA抗原是肿瘤筛查中最常检测的生物标志物，但是，TA抗原血清中水平是随着肿瘤大小的增长而增加的，在癌症早期通常几乎没有检测价值。利用免疫系统生物信号放大、记忆的特点，自身抗体可在临床症状出现及通过影像学检测出的前5年检测到。自身抗体在体内循环中持续存在，半衰期通常长达30天，并且在体外比其他生物标志物更稳定。自身抗体检测具有高通量、快速、操作简单等优点，可以作为癌症诊断、疾病进程监测、治疗效果评估的辅助手段。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种多肽在制备诊断或辅助诊断或预后评估肺癌的产品中的应用，所述的多肽包括DLWKLLPENNVLSPL(SEQ ID NO：1)或PSQAMDDLMLSPDDI(SEQ IDNO：2)。
本发明的第二方面，提供了结合多肽的自身抗体作为标志物在制备诊断或辅助诊断或预后评估肺癌的产品中的应用，所述的多肽包括DLWKLLPENNVLSPL(SEQ ID NO：1)或PSQAMDDLMLSPDDI(SEQ ID NO：2)。
优选的，所述的多肽长度为15-30aa，优选15-20aa。例如可以为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30aa。
优选的，所述的多肽为SEQ ID NO：1或2。优选的，所述的多肽可以包含修饰或标记，例如生物素等。
优选的，所述的诊断或辅助诊断或预后评估肺癌包括利用多肽检测自身抗体。优选为检测自身抗体的存在或含量。优选为检测血清或血浆中的自身抗体。
优选的，所述的自身抗体为lgG和/或lgA。
优选的，所述诊断或辅助诊断或预后评估的对象可以为人或非人动物。
优选的，所述的诊断或辅助诊断或预后评估肺癌包括将多肽与待检测样本接触，检测与多肽结合的自身抗体的量。
具体为将多肽包被在固相载体上，然后加入待检测样本以及标记物(优选为抗人IgA花青染料(Cy5)标记的二抗或者抗人IgG花青染料(Cy3)标记)，检测标记物的信号分子强度。其中，所述的信号分子强度的检测方法包括可见光显色法、化学发光法、荧光发光法。例如通过微阵列扫描仪检测。其中，信号的强弱与与多肽结合的自身抗体的量呈正相关。
优选的，所述的待检测样本为血清或血浆。
优选的，所述的产品包括多肽和固相载体；
优选的，所述的固相载体选自酶标微孔板、微粒、微球、亲和膜、液相芯片、载玻片、试纸条和塑料球中的一种或两种以上的组合；
进一步优选的，所述的产品为试剂盒或芯片。
优选的，所述的产品还包含试剂，例如有标记物的二抗、封闭缓冲液和/或清洗缓冲液。
优选的，所述的肺癌包括肺腺癌、肺鳞状细胞癌、大细胞肺癌或小细胞肺癌中的一种或两种以上的组合。
本发明的第三方面，提供了一种多肽，所述的多肽包括DLWKLLPENNVLSPL(SEQ IDNO：1)或PSQAMDDLMLSPDDI(SEQ ID NO：2)。
优选的，所述的多肽长度为15-30aa，优选15-20aa。例如可以为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30aa。
优选的，所述的多肽为SEQ ID NO：1或2。
优选的，所述的多肽可以包含修饰或标记，例如生物素等。
优选的，所述的多肽可以与自身抗体结合。进一步优选与肺癌患者(例如血清或血浆)中的自身抗体结合。
优选的，所述的多肽可以用于检测自身抗体。
优选的，所述的多肽可以用于诊断或辅助诊断或预后评估肺癌。
优选的，所述的多肽或结合多肽的自身抗体可以作为肺癌诊断或辅助诊断或预后评估的标志物。例如检测结合多肽的自身抗体的有无或含量可以评价肺癌。所述的评价例如诊断、辅助诊断、预后评估或临床分型。
所述的多肽可以采用现有技术常规的方法进行制备。例如化学合成或者原核或真核表达等等。
本发明的第四方面，提供了一种编码上述多肽的核酸。
本发明的第五方面，提供了一种包含上述核酸的载体。
本发明的第六方面，提供了一种包含上述核酸或上述载体的细胞。
本发明的第七方面，提供了一种试剂盒或芯片，所述的试剂盒或芯片包含上述的多肽、核酸、载体或细胞。
优选的，所述的多肽包含修饰或标记，例如生物素。
优选的，所述的试剂盒或芯片还包含固相载体。
优选的，所述的固相载体选自酶标微孔板、微粒、微球、亲和膜、液相芯片、载玻片、试纸条和塑料球中的一种或两种以上的组合。
优选的，所述的试剂盒或芯片还包括试剂，所述的试剂例如有标记物的二抗、封闭缓冲液和/或清洗缓冲液。
本发明的第八方面，提供了一种试剂盒或芯片的制备方法，所述的制备方法包括将上述的多肽包被在固相载体上。
优选的，所述的包被可以为直接包被法和间接包被法。所述的直接包被法是将多肽直接固定于固相载体上，间接包被法是通过先使其与无关蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)等偶联，借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。
本发明的第九方面，提供了一种肺癌的生物标志物，所述的肺癌的生物标志物为多肽或结合上述多肽的自身抗体。
优选的，所述的自身抗体为lgG和/或lgA。
优选的，所述的自身抗体来源于血清或血浆。
本发明的第十方面，提供了一种检测自身抗体的方法，所述的方法包括使用上述的多肽或上述的试剂盒或芯片。
优选的，包括将多肽与待检测样本接触，检测与多肽结合的自身抗体的量。
具体为将多肽包被在固相载体上，然后加入待检测样本以及标记物(优选为抗人IgA花青染料(Cy5)标记的二抗或者抗人IgG花青染料(Cy3)标记)，检测标记物的信号分子强度。其中，所述的信号分子强度的检测方法包括可见光显色法、化学发光法、荧光发光法。例如通过微阵列扫描仪检测。其中，信号的强弱与与多肽结合的自身抗体的量呈正相关。
优选的，所述的待检测样本为血清或血浆。
本发明的第十一方面，提供了一种肺癌的诊断方法，所述的诊断方法包括使用上述的多肽或上述的试剂盒或芯片。
优选的，包括将多肽与待检测样本接触，检测与多肽结合的自身抗体的量。
具体为将多肽包被在固相载体上，然后加入待检测样本以及标记物(优选为抗人IgA花青染料(Cy5)标记的二抗或者抗人IgG花青染料(Cy3)标记)，检测标记物的信号分子强度。其中，所述的信号分子强度的检测方法包括可见光显色法、化学发光法、荧光发光法。例如通过微阵列扫描仪检测。其中，信号的强弱与与多肽结合的自身抗体的量呈正相关。
优选的，所述的待检测样本为血清或血浆。
本发明所述的“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展。所述诊断的对象可以为人或非人动物，其中，所述的非人动物优选为非人哺乳动物。进一步优选的，所述的非人哺乳动物可以为野生动物、动物园动物、经济动物、宠物、实验动物等等。优选的，所述的非人哺乳动物包括但不限于猪、牛、羊、马、驴、狐、貉、貂、骆驼、狗、猫、兔、鼠(例如大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠)或猴等等。
本发明所述的“辅助诊断”是指包括本申请的方法以及现有技术中常规的方法或步骤。
本发明所述的“预后评估”指评估患者对治疗的反应，及将来患病的风险度。
本发明所述的“包含”或“包括”为开放式写法，当用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有与原序列相同或相似的活性。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：血浆中结合多肽P005的lgG型自身抗体的表达水平，其中，SNR为信噪比，N是健康人，LC是肺癌患者，EC是食管癌患者，GC是胃癌患者，DC是其他7种癌症患者。
图2：血浆中结合多肽P005的lgA型自身抗体的表达水平，其中，SNR为信噪比，N是健康人，LC是肺癌患者，EC是食管癌患者，GC是胃癌患者，DC是其他7种癌症患者。
图3：血浆中结合多肽P008的lgG型自身抗体的表达水平，其中，SNR为信噪比，N是健康人，LC是肺癌患者，EC是食管癌患者，GC是胃癌患者，DC是其他7种癌症患者。
图4：血浆中结合多肽P008的lgA型自身抗体的表达水平，其中，SNR为信噪比，N是健康人，LC是肺癌患者，EC是食管癌患者，GC是胃癌患者，DC是其他7种癌症患者。
图5：肺癌患者与健康组的针对多肽P005的IgG型自身抗体ROC曲线。
图6：肺癌患者与健康组的针对多肽P005的IgA型自身抗体ROC曲线。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例中使用的试剂配方如下：
磷酸盐缓冲液(PBS)：137mM NaCl、2.7mM KCl、10mM Na2HPO4、2mM KH2PO4，pH 7.4。
洗涤缓冲液(PBST)：pH7.4的1×PBST。
封闭缓冲液：含5％BSA的1×PBST。
实施例1
1、筛选的多肽或对照多肽序列见表1。
表1：多肽序列
| 编号 | SEQ ID NO：x | P53多肽序列 | 位置信息 |
| P005 | 1 | D-L-W-K-L-L-P-E-N-N-V-L-S-P-L | 21-35 |
| P008 | 2 | P-S-Q-A-M-D-D-L-M-L-S-P-D-D-I | 36-50 |
2、临床样本见表2。
表2：临床样本
表3：肺腺癌样本患者情况
表4：肺鳞状细胞癌样本患者情况
表5：大细胞肺癌样本患者情况
表6：小细胞肺癌样本患者情况
表7：正常体检样本患者情况
3、检测步骤
1)P53多肽阵列打印：用PBS将表1中P53多肽稀释，然后使用Arrayjet微阵列点样仪将P53多肽重复四次打印到载玻片表面，制备的P53多肽微阵列存放在-20℃直至准备使用；
2)复温：将P53多肽载玻片从-20℃冰箱取出平衡至室温；
3)封闭：将P53多肽载玻片组装到孵育托盘中，加入400μL封闭缓冲液，室温放置1h，轻轻摇晃；
4)血清样本制备：4℃解冻血清样品，14,000×g离心10min。以1:100的比例将4μL血清加入到400μL封闭缓冲液中制得血清样本；
5)加入血清样本：去除封闭缓冲液，加入400μL稀释的血清，然后室温孵育2.5h，轻轻摇动；孵育完成后，用400μL PBST清洗载玻片3次，每次10分钟；
6)加荧光标记抗体：采用封闭缓冲液稀释二抗(工作浓度为4μg/mL)。加入400μL稀释的二抗，室温孵育1h，轻轻摇动。用400μL PBST清洗载玻片3次，每次清洗10分钟，再用400μL蒸馏水清洗载玻片两次，每次清洗2分钟；
7)干燥载玻片：除去剩余的液体，用真空泵或移液管排空孵育托盘，然后干燥载玻片；
8)上机读数：使用GenePix 4300A微阵列扫描仪在532nm或635nm波长下扫描所有阵列。使用GenePix Pro7软件提取荧光信号强度的中值，并保存数据。
4、试验结果
结合表1中P005、P008多肽的自身抗体表达水平结果见图1-4及表8。具体的，结合多肽的自身抗体在肺癌患者和健康对照组具有显著统计学差异，代表其可以作为肺癌的特异性标志物。
表8：示例性的几种多肽在不同癌症中的表达水平显著性
另外，肺癌患者与健康组的结合多肽的自身抗体ROC分析结果见图5-6。具体的：
对于lgG型自身抗体，多肽P005的AUC分别为0.6812。多肽P005，根据约登指数确定Cutoff值为1.117时，特异度为63.16％，灵敏度为70.45％。
对于lgA型自身抗体，多肽P005的AUC分别为0.6483。多肽P005，根据约登指数确定Cutoff值为3.742时，特异度为94.74％，灵敏度为15.91％。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (10)
1.多肽在制备诊断或预后评估肺癌的产品中的应用，其特征在于，所述的多肽包括DLWKLLPENNVLSPL(SEQ ID NO：1)。
2.结合多肽的自身抗体作为标志物在制备诊断或预后评估肺癌的产品中的应用，其特征在于，所述的多肽包括DLWKLLPENNVLSPL(SEQ ID NO：1)。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述的多肽长度为15-30aa。
4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述的诊断或预后评估肺癌包括利用多肽检测自身抗体；
优选为检测自身抗体的存在或含量；
优选为检测血清或血浆中的自身抗体。
5.根据权利要求2或4所述的应用，其特征在于，所述的自身抗体为lgG和/或lgA。
6.根据权利要求1-5任一所述的应用，其特征在于，所述的肺癌包括肺腺癌、肺鳞状细胞癌、大细胞肺癌或小细胞肺癌中的一种或两种以上的组合。
7.一种多肽，其特征在于，所述的多肽包括DLWKLLPENNVLSPL(SEQ ID NO：1)。
8.一种试剂盒或芯片，其特征在于，所述的试剂盒或芯片包含权利要求7所述的多肽。
9.根据权利要求8所述的试剂盒或芯片，其特征在于，所述的试剂盒或芯片还包含固相载体；
优选的，所述的固相载体选自酶标微孔板、微粒、微球、亲和膜、液相芯片、载玻片、试纸条和塑料球中的一种或两种以上的组合。
10.一种检测自身抗体的方法，其特征在于，所述的方法包括使用权利要求7所述的多肽或权利要求8-9任一所述的试剂盒或芯片。
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