CN101038286B - 汞离子检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种Hg离子检测方法，该检测方法包括：在载体蛋白上构建二硫代氨基团，形成二硫代氨基-载体蛋白的复合物，使该复合物作为检测抗原包被在酶标板内；构建含Hg和酶的竞争抗原；利用酶联免疫吸附测定方法检测待测样品中的Hg离子。该检测方法的检测限接近传统的重金属检测方法以及免疫学检测方法，而且能承受较宽的pH范围(5.8-7.2)，费用低廉。

Description

汞离子检测方法

【技术领域】

本发明涉及一种汞(Hg)离子检测技术，尤其涉及一种利用酶联免疫吸附方法对Hg离子进行检测的方法。

【背景技术】

现已知至少20种左右的重金属具有很大的毒性，它们中又有一半以上被大量地释放到环境中，重金属属于永久型污染物质，不能通过物理、化学、生物方法得到有效降解，只能从一种形式转移到另一种形式，并且在环境适宜的情况下，其又能转变成毒性更大的形态，并通过食物链的传递对人类健康构成严重威胁。由于重金属污染物较难治理，而且具有较大毒性，因而对重金属迁移、转化等监测显得尤为重要。

目前常用的重金属检测方法包括石墨炉原子吸收光谱法、ICP-AES、X射线荧光光谱法等。现有重金属检测方法存在着检测相对费力、费时、费用昂贵，需要进行大量的样品预处理。近年来建立起来的重金属免疫学检测方法虽能克服上述缺点，但需要制备针对小分子重金属特异性单克隆抗体，筛选难度比较大，周期长，开发费用昂贵，pH检测范围较窄(例如，两步法检测Cd的pH范围为7.0-7.2；一步法检测pH范围7.0-7.6)。

【发明内容】

为了解决现有技术的重金属检测方法的检测周期长、成本高的技术问题，本发明提供了一种利用酶联免疫吸附方法对Hg离子进行检测的方法。

本发明解决现有技术的重金属检测方法的检测周期长、成本高的技术问题所采用的技术方案是提供一种Hg离子检测方法，该检测方法包括：a.在载体蛋白上构建二硫代氨基团，形成二硫代氨基-载体蛋白的复合物，使所述复合物作为检测抗原包被在酶标板内；b.构建含Hg离子和酶的竞争抗原；c.利用酶联免疫吸附测定方法检测待侧样品中的Hg离子。

根据本发明的一优选实施例，载体蛋白包括牛血清白蛋白，复合物为二硫代氨基-牛血清蛋白复合物。

根据本发明的一优选实施例，步骤a包括：将牛血清白蛋白在PB缓冲体系中与异丁醛室温反应；将NaBH₄溶于NaOH溶液中，分两次加入，搅拌反应；再分两次加入NaBH₄，搅拌反应，用PBS缓冲液透析；用NaOH将pH之调至11，加入CS₂，室温反应，用PBS缓冲液透析。

根据本发明的一优选实施例，竞争抗原包括十一烯酸汞-辣根过氧化物酶。

根据本发明的一优选实施例，步骤b包括：将乙酸汞溶于无水甲醇中，加入十一烯酸，室温反应，吸出离心后烘干；在烘干物中加入干燥过的二甲基甲酰胺，搅拌并依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、EDC-HCl，室温反应，透析；加入辣根过氧化物酶，室温反应。

根据本发明的一优选实施例，检测抗原的包被浓度为1μg/ml。

根据本发明的一优选实施例，竞争抗原的浓度为1μg/ml。

上述检测方法的有益效果是：该检测方法通过化学合成的方法，在较短的时间内(一周左右)在载体蛋白上构建二硫代氨基这种对Hg离子有较高亲和力的基团以及在十一烯酸上构建酶标记的含Hg竞争抗原，运用ELISA方法进行检测，检测限为1ppb，此检测限接近传统的重金属检测方法和免疫学检测方法，而且能承受较宽的pH范围(5.8-7.2)，费用低廉。

【附图说明】

图1是是制备二硫代氨基-BSA复合物的反应流程示意图；

图2是制备十一烯酸汞反应流程示意图；

图3是依据本发明进行的检测原理图；

图4是根据本发明测得的Hg标准检测曲线。

【具体实施方式】

酶联免疫吸附法(ELISA)是将免疫技术用于检测液体中微量物质的固相免疫测定方法，其采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。测量时，抗原(抗体)先结合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体(抗原)与酶结合成的偶联物(标记物)，此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原(抗体)反应结合后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。其所生成的颜色深浅与欲测的抗原(抗体)含量成正比。这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计(酶标仪)加以测定。其方法简单，方便讯速，特异性强。

目前，ELISA主要包括以下几种常用方法：

间接法，此法将已知抗原吸附于固相载体。加入待检标本(含相应抗体)与之结合。洗涤后，加入酶标抗球蛋白抗体(酶标抗抗体)和底物进行测定。

双抗体夹心法，此法已知抗体吸附于固相载体，加入待检标本(含相应抗原)与之结合。温育后洗涤，加入酶标板中。

竞争法，此法将特异性抗体吸附于固相载体。加入待测抗原和一定量的酶标已知抗原，使二者竞争与固相抗体结合；经过洗涤分离，最后结合于固相的酶标抗原与待测抗原含量呈负相关。

本发明采用竞争酶联免疫吸附分析法，利用二硫代氨基对Hg离子的高亲和力和ELISA信号放大原理，在载体蛋白上构建二硫代氨基团，形成二硫代氨基-载体蛋白的复合物，使之作为检测抗原包被在酶标板内；再构建含Hg离子和酶的竞争抗原，在本发明中使用十一烯酸汞-辣根过氧化物酶(HRP)，其与待测样品中Hg离子竞争包被在酶标板内的二硫代氨基，运用ELISA方法检测出待测样品中的Hg离子含量。

本发明的检测方法主要包括以下步骤：

首先，参见图1，图1是制备二硫代氨基-BSA复合物的反应流程示意图。取牛血清(BSA)50mg，在0.1M PB(pH 7.2)缓冲体系中与15μl异丁醛室温反应4h；另取20mg NaBH₄溶于30μl 0.1M NaOH溶液中，分两次加入到上述溶液中，搅拌反应1h；再加入20mg NaBH₄，步骤同上，搅拌2h，用PBS缓冲液(pH7.4)透析。取3ml反应产物，用1N NaOH调pH至11，加入8μl CS₂，室温反应5h，用PBS缓冲液(pH7.4)透析，并将反应物作为检测抗原。

接着，参见图2，图2是制备十一烯酸汞-HRP偶联产物的反应流程示意图。取100mg乙酸汞溶于1.5ml无水甲醇中，加入63.5μl十一烯酸，室温反应4h，吸出离心后烘干；取20mg烘干物，加入3ml干燥过的二甲基甲酰胺，搅拌依次加入22mg N-羟基琥珀酰亚胺、27.5mg EDC-HCl，室温反应5h，透析后，加入2mg HRP，室温反应4h后，透析，将反应物作为竞争抗原。

随后，参见图3，图3是依据本发明进行的检测原理图。十一烯酸汞-辣根过氧化物酶(HRP)与待测样品中Hg离子竞争包被在酶标板内的二硫代氨基，运用ELISA方法检测出待测样品中的Hg离子含量。

在本发明的方法中，不同的检测抗原包被浓度和竞争抗原浓度可能会对检测结果产生影响。因而，可利用方阵滴定方法确定最佳包被浓度和最佳竞争抗原浓度。具体步骤如下：提前用pH9.6的碳酸盐包被液分别包被10μg/ml、5μg/ml、1μg/ml、0.2μg/ml浓度的检测抗原，4℃过夜；用HEPES缓冲液(pH7.2)稀释配制竞争抗原，其浓度分别为4μg/ml、2μg/ml、1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml。取上述各浓度的竞争抗原100μl加入到已包被检测抗原的微孔板内，做两个平行以及两个空白对照，37℃反应1h，用PBS-T洗液洗板三次，每次三分钟，用TMB底物液显色15min后，加入50μl终止液，终止5分钟，于450nm波长处读OD值(吸光度值)(洗板、显色、终止、读取OD值步骤下同)。此步骤确定的最佳包被浓度和最佳竞争抗原浓度作为其后检测实验浓度。

此外，不同pH值缓冲体系也可能对检测结果产生影响，根据已确定的最佳包被浓度和最佳竞争抗原浓度，在不同pH值(pH3.6、pH 4.4、pH 5.8、pH7.2，下进行空白检测实验。具体步骤如下：分别用不同pH值缓冲体系稀释竞争抗原至1μg/ml，取100μl与50μl超纯水混合，做两个平行，震荡均匀，37℃反应1h，洗板、显色、读取OD值。不同pH值缓冲体系配方见下表：

另外，用HEPES缓冲液(pH7.2)分别配制浓度为0.01、0.1、1、10、50、100、500、1000ppb浓度的Hg标准样品。分别取50μl上述各浓度的Hg标准样品与100μl十一烯酸汞-HRP(HEPES缓冲液稀释至1μg/ml，pH7.2)混匀，37℃反应1h，洗板、显色、读取OD值步骤同上，以绘制重金属Hg标准检测曲线。

用HEPES缓冲液(pH7.2)分别配制浓度为1、5、10、20、40、80、160、320ppb的重金属(Cu²⁺、Cd²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、Al³⁺、Ca²⁺、Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Cr⁶⁺)，分别取上述各浓度组重金属溶液50μl与100μ的十一烯酸汞-HRP(HEPES缓冲液，pH7.2)混匀，37℃反应1h，洗板、显色、读取OD值，以确定其他重金属离子的干扰反应。。

用超纯水配制1M、10^-1M、10^-2M、10^-3M、10^-4M、10^-5M NaCl标准溶液，设置一个空白对照，两个平行，分别取上述溶液50μl与100μl十一烯酸汞-HRP(用HEPES缓冲液稀释至1μg/ml，pH7.2)混匀，37℃反应1h，洗板、显色、读取OD值，以确定离子强度对反应体系的影响。

【实验结果】

最佳包被检测抗原浓度和最佳竞争抗原浓度

方阵滴定确定最佳抗原包被浓度和竞争抗原浓度见下表：

方阵滴定结果显示在检测抗原浓度和竞争检测抗原浓度分别为1μg/ml、1μg/ml时为最佳，其OD均值为1.673。

不同pH值对检测体系的影响

在pH值分别为7.2、5.8、4.4、3.6的缓冲体系下，其检测结果均值分别为1.419、1.152、0.713、0.288。可见在pH为7.2的HEPES缓冲体系下效果最好。

绘制标准检测曲线

根据0.01、0.1、1、10、50、100、500、1000ppb浓度的Hg标准样品与十一烯酸汞-HRP竞争后OD值绘制Hg标准曲线(见图4)，由图4可知，在Hg标准样品浓度范围1-1000ppb范围内其OD值呈直线下降趋势，对此范围内浓度取对数与OD值进行回归分析，二者呈现较好的线形相关关系，R²＝0.9719。本方法的检测限为1ppb。

其他重金属离子的干扰

在所检测浓度范围内只有Cu²⁺在高浓度时(320ppb)对十一烯酸汞-HRP有明显的抑制作用(23％)，而对于Cd²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺、Al³⁺Ca²⁺、Fe²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Cr³⁺、Cr⁶⁺等金属离子未见到明显抑制作用产生。

离子强度对反应体系的影响

反应体系中的离子强度是否对检测造成影响，这关系到在现场检验时能否进行pH值调节。离子强度对反应体系影响很小，只是在较高的离子强度(1M)时有少许抑制，离子强度对反应体系影响的检测结果见下表：

本发明的Hg离子检测方法通过化学合成的方法，在较短的时间内(一周左右)在载体蛋白上构建二硫代氨基这种对Hg离子有较高亲和力的基团以及在十一烯酸上构建酶标记的含Hg竞争抗原，运用ELISA方法进行检测，检测限为1ppb，此检测限接近传统的重金属检测方法和免疫学检测方法，而且能承受较宽的pH范围(5.8-7.2)，费用低廉。本方法能应用于快速判定样品中的Hg残留是否超标，对于低于1ppb的Hg含量的样品，可以通过添加标准浓度的Hg后进行检测。

上述的详细描述仅是示范性描述，本领域技术人员在不脱离本发明所保护的范围和精神的情况下，可根据不同的实际需要设计出各种实施方式。

Claims (5)

1.一种汞离子检测方法，所述检测方法包括：

a.在载体蛋白上构建二硫代氨基团，形成二硫代氨基-载体蛋白的复合物，使所述复合物作为检测抗原包被在酶标板内；

b.构建含Hg离子和酶的竞争抗原；

c.利用酶联免疫吸附测定方法检测待测样品中的Hg离子；

其中，所述载体蛋白是牛血清白蛋白，所述复合物为二硫代氨基-牛血清蛋白复合物；所述竞争抗原是十一烯酸汞-辣根过氧化物酶。

2.根据权利要求1所述的的检测方法，其特征在于：所述步骤a包括：将牛血清白蛋白在PB缓冲体系中与异丁醛室温反应；将NaBH₄溶于NaOH溶液中，分两次加入到上述溶液中，搅拌反应；再次分两次加入NaBH₄，步骤同上，搅拌反应，用PBS缓冲液透析；用NaOH将pH值调至11，加入CS₂，室温反应，用PBS缓冲液透析。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述步骤b包括：将乙酸汞溶于无水甲醇中，加入十一烯酸，室温反应，吸出沉淀离心后烘干；在烘干物中加入干燥过的二甲基甲酰胺，搅拌并依次加入N-羟基琥珀酰亚胺、EDC-HCl，室温反应，透析得反应产物；加入辣根过氧化物酶，室温反应。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述检测抗原的包被浓度为1μg/ml。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于：所述竞争抗原的浓度为1μg/ml。

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