CN104360076B - 基于酶诱导亚硫酸根作为激活剂的免疫分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于酶诱导亚硫酸根作为激活剂的免疫分析方法，属于纳米材料和生物分析技术领域。该方法通过目标物结合的酶标纳米探针上的葡萄糖氧化酶催化葡萄糖产生过氧化氢，再依次加入硝酸、亚硫酸钠、硝酸银和TMB显色液，用于紫外可见分光光度计进行定量检测。本发明的目的在于提供一种基于酶诱导亚硫酸根作为激活剂的免疫分析方法，该分析方法主要用于血清中低丰度蛋白含量的检测。由于酶诱导亚硫酸根作为激活剂能够导致溶液显色。利用这个特点，可以建立一种高灵敏且性能稳定的比色免疫分析方法。本方法成本低，比色检测方法简便、显色快速、灵敏度高，为临床免疫学检测提供了一种灵敏且性能稳定的方法。

Description

基于酶诱导亚硫酸根作为激活剂的免疫分析方法
技术领域
本发明涉及一种基于酶诱导亚硫酸根作为激活剂的免疫分析方法，属于纳米材料和生物分析技术领域。
背景技术
免疫分析技术因其独有的特异性，在临床诊断和环境检测等方面得到广泛地应用。酶联免疫分析技术(ELISA)自1971年建立以来，便由于其所具有的快速、灵敏、简便、易于标准化等优点，得到迅速的发展和应用，逐步成为应用最广泛的免疫分析方法之一，涉及免疫学检验的各个领域。一般，比色免疫分析所采用的显色剂为邻苯二胺，联苯胺和3,3',5,5'-四甲基联苯胺。其中，3,3',5,5'-四甲基联苯胺因为非致癌性，不突变，好的稳定性和高的灵敏度的特性成为最广泛应用的显色剂。但是，在传统的检测中，3,3',5,5'-四甲基联苯胺是通过酶（过氧化物酶）或模拟酶来在过氧化氢的帮助下催化显色。在显色过程中极易受外部条件（pH和温度）的影响，影响显色的稳定性。因此，在比色免疫分析中，设计一种在显色阶段不易受外界环境干扰的免疫传感器是有重要的意义。
根据报道，我们发现3,3',5,5'-四甲基联苯胺能够直接和银离子进行反应，达到显色的目的[S.Liuetal.,SensorActuat.B-Chem.2012,165:44][R.González-Fuenzalidaetal.,Anal.Chem.2013,85:10013]。而且亚硫酸根和硫酸根对于银离子的稳定常数是有显著分别的，这使亚硫酸根相当于抑制剂的性能能够抑制3,3',5,5'-四甲基联苯胺和银离子反应。此外，过氧化氢能够把亚硫酸根氧化为硫酸根。这些反应涉及到的仅是简单的化学反应。因此，我们整合这些反应，把酶作为诱导亚硫酸根的激活剂，设计出一种更稳定的显色策略进行比色免疫分析具有重大的实际意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于酶诱导亚硫酸根作为激活剂的免疫分析方法，该分析方法主要用于血清中低丰度蛋白含量的检测。由于酶诱导亚硫酸根作为激活剂能够导致溶液显色。利用这个特点，可以建立一种高灵敏且性能稳定的比色免疫分析方法。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种基于酶诱导亚硫酸根作为激活剂的免疫分析方法包括如下步骤：
（1）制备金纳米粒子；
（2）将抗体固载在磁珠上作载体，葡萄糖氧化酶和抗体同时固载在金纳米颗粒上制成酶标抗体纳米探针；
（3）将已固载在磁珠上的抗体、待测样品以及酶标抗体纳米探针通过夹心型免疫分析反应模式形成抗体-抗原-抗体夹心型免疫磁珠复合物；将所述抗体-抗原-抗体夹心型免疫磁珠复合物用磁铁分离出来，加入葡萄糖反应，磁性分离，液体转移到酶标板中；
（4）在酶标板中，按顺序依次加入硝酸、亚硫酸钠、硝酸银和TMB显色液，用酶标仪检测各个微孔的吸光度值。
更具体地，
步骤（1）所述的金纳米颗粒是通过柠檬酸三钠还原氯金酸得到的；所述的金纳米颗粒粒径为16nm，其表面带负电荷。
步骤（2）所述载体中磁珠与抗体的结合为化学键结合；所述金纳米颗粒与抗体和葡萄糖氧化酶的结合为正负电荷相吸作用结合、疏水作用结合和化学键作用结合。
步骤（3）所述待测样品为大分子目标物；所述夹心型免疫分析模式的完成采取两步法：即待测样品、固载在磁珠上的抗体混合发生免疫反应形成一种免疫磁珠复合物，再与酶标抗体纳米探针混合发生免疫反应形成抗体-抗原-抗体夹心型免疫磁珠复合物。
步骤（3）所用葡萄糖的量为50μL，浓度为4mM。
步骤（4）所述硝酸用量为40μL，浓度为1mM；亚硫酸钠用量为50μL，浓度为1mM；硝酸银用量为50μL，浓度为2mM；TMB显色液为100μL含有浓度为1mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的pH值为4.0。
本发明的基于酶诱导亚硫酸根作为激活剂的免疫分析方法的测定原理是，首先将待测样品加入到固载抗体的磁珠上，再加入酶标抗体金纳米探针孵育，从而在磁珠载体上形成抗体-抗原-抗体夹心型免疫复合物。当待测样品含量低时，结合在载体上的酶标抗体金纳米探针就少，酶催化葡萄糖产生的过氧化氢就少，从而导致还有大量的亚硫酸根没被激活，阻碍了银离子与3,3',5,5'-四甲基联苯胺的反应，显色反应减弱；吸光度值降低，反之结合在载体上的酶标抗体金纳米探针就多，酶催化葡萄糖产生的过氧化氢就多，从而导致大量的亚硫酸根被激活氧化为硫酸根，阻碍不了银离子与3,3',5,5'-四甲基联苯胺的反应，显色反应增强，吸光度值升高。从而达到定量分析的目的。
本发明的优点如下：
（1）本发明设计了一种比色免疫分析策略代替传统的比色策略应用于比色免疫分析检测大分子目标物(主要用于血清中低丰度蛋白含量的检测)的方法。本方法具有检测线低、灵敏度和稳定性高等优点。
（2）本发明通过亚硫酸根与硫酸根的转换来控制显色剂的显色程度，克服了在显色阶段传统生物活性酶易失活、易变性等缺点，可望为疾病早期诊断等重要领域提供技术基础，具备显著的经济效益和社会效益。
（3）与辣根过氧化物酶催化相比，亚硫酸根氧化为硫酸根是一种简单的化学反应，它在可控性上更稳定、操作更方便，并且易于在户外使用。
（4）与已报道的基于酶的免疫分析相比，本发明的基于酶诱导亚硫酸根作为激活剂的免疫分析具有更低的检测线、更高的灵敏度。本发明方法对于前列腺特异抗原的检出限为0.5pgmL-1，线性范围是0.5pgmL-1到10ngmL-1。
附图说明
图1是基于酶诱导亚硫酸根作为激活剂的免疫分析的示意图；
图2是比色免疫分析的机理图（a：葡萄糖+葡萄糖氧化酶+亚硫酸钠+硝酸银+TMB显色液；b：葡萄糖氧化酶+亚硫酸钠+硝酸银+TMB显色液；c：葡萄糖+亚硫酸钠+硝酸银+TMB显色液；d：葡萄糖+葡萄糖氧化酶+硝酸银+TMB显色液；e：葡萄糖+葡萄糖氧化酶+亚硫酸钠+TMB显色液；f：葡萄糖+葡萄糖氧化酶+亚硫酸钠+硝酸银。）；
图3是与图2曲线相对应的溶液照片；
图4是基于酶诱导亚硫酸根作为激活剂的免疫分析显色前列腺特异抗原标准工作曲线图（插图为相对应的溶液照片）。
具体实施方式
下面通过具体实施示例对本发明的技术方案做进一步说明，但是不能以此限制本发明的范围。
实施例1
1.抗体固载在磁珠上的制备
50mgFe3O4磁珠加入1mL无水乙醇中，溶液在室温下超声10分钟。30μL3-氨基丙基三乙氧基硅烷加入其中，在室温下搅拌6小时。结果溶液磁控分离，分散在1mL磷酸缓冲液(PBS，pH7.4，300μL戊二醛)中，继续搅拌6小时。在磁控分离后，沉淀溶解在1mL碳酸缓冲液（pH9.6，100μg前列腺特异抗体）中，在4℃下振摇过夜。然后分离除去多余的抗体，加入10wt%牛白蛋白(BSA)-PBS(1mL，pH7.4），在4℃下反应2小时。最后，加入50μL硼氢化氰钠，在4℃下孵育1小时。所得固载抗体的磁珠沉淀分散在0.5mLPBS(pH7.4,1.0wt%BSA，0.1wt%叠氮化钠)中。
2.酶标抗体纳米探针复合物的制备
首先，将1.0mL所制备的16nm金纳米颗粒用浓度为0.1M的碳酸钠溶液调节pH值到9.0-9.5。第二，将1μL浓度为1mg/mL的前列腺特异抗体和10μL浓度为1mg/mL的葡萄糖氧化酶加入上述金纳米颗粒溶液中，然后将混合液在4℃搅拌下孵育过夜。最后，将上述混合液在14000g转速和4℃下离心20分钟，小心去除上层清夜，得到的沉淀再分散在1mL含有1.0wt%BSA和0.1wt%叠氮化钠的PBS(pH=7.4)中，储存于4℃。
3.比色免疫分析的机理探究
首先，在高亲和力的96孔酶标微孔板上一个孔上加入10μL葡萄糖氧化酶(1mg/mL)和50μL葡萄糖(4mM)，在37℃下孵育30分钟。然后加入40μL硝酸(1mM)和50μL亚硫酸钠(1mM)，反应1分钟。其次，加入50μL硝酸银(2mM)，反应1分钟。最后，加入100μLTMB显色液（含有1mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺，所用缓冲液为pH4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液），室温下显色30min后，用酶标仪在652nm处读取吸光度值。在另外的五个孔中分别不加入葡萄糖氧化酶，葡萄糖，亚硫酸钠，硝酸银和3,3',5,5'-四甲基联苯胺，按上述方法一样进行检测。结果如图2所示。曲线b和c分别没有加入葡萄糖氧化酶和葡萄糖；而曲线e和f分别没有加入硝酸银和3,3',5,5'-四甲基联苯胺；曲线d没有加入亚硫酸钠。图3为与图2曲线相对应的照片。实验结果表明，显色的来源是硝酸银和3,3',5,5'-四甲基联苯胺相互作用的结果；亚硫酸钠是作为该显色反应的模拟抑制剂存在；葡萄糖氧化酶能够激活亚硫酸钠，消除对显色反应的影响。这么，当葡萄糖氧化酶的浓度变化时，吸光度也会发生变化，因此，我们可以把它应用于免疫分析中。
4.比色免疫分析检测PSA（本实施例前列腺特异性抗原作为模型目标分析物）
图1是本发明的基于酶诱导亚硫酸根作为激活剂的免疫分析过程示意图。首先，50μLPSA加入0.5mL的离心管（含25μL抗体固载的磁珠）中，在37℃下孵育30分钟。在磁控分离后，加入50μL酶标金纳米粒子溶液，在4℃下孵育30分钟，磁控分离。50μL葡萄糖(4mM)加入其中，在37℃下反应30分钟。其次，加入40μL硝酸(1mM)和50μL亚硫酸钠(1mM)，反应1分钟。然后加入50μL硝酸银(2mM)，反应1分钟。最后，每个离心管加入100μLTMB显色液（含有1mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺，所用缓冲液为pH4.0的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液），室温下显色30min后，用酶标仪在652nm处读取吸光度值。根据吸光度值和PSA浓度变化的关系绘制标准工作曲线，如图4所示。实验结果表明，该方法对于前列腺特异性抗原的检出限为0.5pgmL-1，线性范围是0.5pgmL-1至10ngmL-1。该方法与传统生物活性酶标记的方法相比，本发明使用亚硫酸根作为模拟抑制剂，克服了在显色阶段传统生物活性酶易失活、易变性等缺点，可望为疾病早期诊断等重要领域提供技术基础。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (6)

1.一种基于酶诱导亚硫酸根作为激活剂的免疫分析方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：
（1）制备金纳米粒子；
（2）将抗体固载在磁珠上作载体，葡萄糖氧化酶和抗体同时固载在金纳米颗粒上制成酶标抗体纳米探针；
（3）将已固载在磁珠上的抗体、待测样品以及酶标抗体纳米探针通过夹心型免疫分析反应模式形成抗体-抗原-抗体夹心型免疫磁珠复合物；将所述抗体-抗原-抗体夹心型免疫磁珠复合物用磁铁分离出来，加入葡萄糖反应，磁性分离，液体转移到酶标板中；
（4）在酶标板中，按顺序依次加入硝酸、亚硫酸钠、硝酸银和TMB显色液，用酶标仪检测各个微孔的吸光度值。
2.根据权利要求1所述的基于酶诱导亚硫酸根作为激活剂的免疫分析方法，其特征在于：步骤（1）所述的金纳米颗粒是通过柠檬酸三钠还原氯金酸得到的；所述的金纳米颗粒粒径为16nm，其表面带负电荷。
3.根据权利要求1所述的基于酶诱导亚硫酸根作为激活剂的免疫分析方法其特征在于：步骤（2）所述载体中磁珠与抗体的结合为化学键结合所述金纳米颗粒与抗体和葡萄糖氧化酶的结合为正负电荷相吸作用结合、化学键作用结合中的一种或两种。
4.根据权利要求1所述的基于酶诱导亚硫酸根作为激活剂的免疫分析方法，其特征在于：步骤（3）所述待测样品为大分子目标物；所述夹心型免疫分析模式的完成采取两步法：即待测样品、固载在磁珠上的抗体混合发生免疫反应形成一种免疫磁珠复合物，再与酶标抗体纳米探针混合发生免疫反应形成抗体-抗原-抗体夹心型免疫磁珠复合物。
5.根据权利要求1所述的基于酶诱导亚硫酸根作为激活剂的免疫分析方法，其特征在于：步骤（3）所用葡萄糖的量为50μL，浓度为4mM。
6.根据权利要求1所述的基于酶诱导亚硫酸根作为激活剂的免疫分析方法，其特征在于：步骤（4）所述硝酸用量为40μL，浓度为1mM；亚硫酸钠用量为50μL，浓度为1mM；硝酸银用量为50μL，浓度为2mM；TMB显色液为100μL含有浓度为1mM的3,3',5,5'-四甲基联苯胺的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液；所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的pH值为4.0。
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