CN105445453B

CN105445453B - 一种基于纳米金生长的可视化免疫分析方法

Info

Publication number: CN105445453B
Application number: CN201510814220.2A
Authority: CN
Inventors: 郭隆华; 李言言; 马小明; 林振宇; 邱彬; 陈国南
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2015-11-23
Filing date: 2015-11-23
Publication date: 2017-04-12
Anticipated expiration: 2035-11-23
Also published as: CN105445453A

Abstract

本发明公开了一种基于纳米金生长的可视化免疫分析方法，包括如下步骤：（1）向已包被有目标捕获抗体的酶标板中加入不同浓度的能与之特异性结合的抗原；（2）向该酶标板中加入酶标记的检测抗体；（3）向该酶标板中加入抗坏血酸过磷酸酯，使之与标记的酶发生反应产生抗坏血酸；（4）将所得到的反应液取出20 μL加至220μL金棒生长液中，随后加入10μL的金核溶液，反应完成后，使用酶标仪测量其吸收光谱，并用数码相机记录下溶液的颜色；（5）处理数据，并绘制工作曲线；（6）按照上述实验步骤，检测模拟待测样品。该方法具有操作简单、适用性广、反应快速、能够产生多种色彩的颜色变化等优点，可以实现对目标物的可视化定量检测。

Description

一种基于纳米金生长的可视化免疫分析方法

技术领域

本发明涉及一种基于纳米金生长的可视化免疫分析方法，属于分析化学和纳米科技领域。

背景技术

比色传感器由于它的简单和实用性已经广泛应用于科研和工业领域。该传感器可以用紫外仪器检测，甚至可以肉眼检查，因此非常适用，例如应用在即时测试和环境食品检测方面。一个理想的比色传感器应该至少满足以下几个方面：高灵敏性，适用的分析物范围广，裸眼检测。本发明中我们展示了一种比色传感器，基于传统酶联免疫反应和酶诱导的金棒生长相结合，几乎可以满足以上提到的所有条件。

酶联免疫反应是一种广泛应用的免疫分析方法，它利用了酶的生物特性和抗体抗原的特异性结合。由于酶较高的生物特性和抗体抗原的特异性识别，保证了该免疫方法具有较高的灵敏性和特异性，因此酶联免疫反应能够用于检测较宽范围的目标物。该方法已经广泛的应用于很多方面，例如，临床诊断，环境监测，食品质量监控，科研研究等。传统的酶联免疫反应，信号的产生是由于酶底物转变为有色物质，并且随着目标物浓度的升高，溶剂的颜色逐渐加深。单一颜色的强度变化人眼不易观察，因此裸眼只能定性检测，需要借助酶标仪来定量检测，限制了即时检测的实用性。

目前，关于可视化检测抗体-抗原反应的方法已有很多相关报道，例如蒋兴宇等2014年公开了一种新型抗体-抗原检测方法的专利CN 104089950 A，该方法结合了酶联免疫反应和点击化学反应，利用贵金属特殊的光学性质，实现对目标物的可视化检测。该发明的重点在于，利用酶催化底物产生抗坏血酸，它能将二价铜离子还原为一价铜离子，通过表面功能化的金纳米粒子和一价铜催化的点击化学反应来可视化地分析碱性磷酸酶的含量；结合酶标记抗体技术，将碱性磷酸酶标记的抗体用于抗原-抗体相互作用的免疫分析中，利用上述可视化分析碱性磷酸酶的方法可达到可视化分析抗原-抗体相互作用的目的，通过肉眼观察金纳米粒子的溶液颜色从红色变成蓝色或紫色，从而实现对待检测样品中抗原抗体反应的可视化检测。

本发明中，我们展示了一种酶诱导纳米金棒生长的等离子体共振酶联免疫分析方法。贵金属纳米粒子由于其独特的光学性质应用于研究的各个方面，金棒作为一种颜色变化较为丰富的种类，更是备受喜爱。该方法的发明基于商业化的碱性磷酸酶酶联免疫反应体系，碱性磷酸酶是一种水解酶，它能够从许多分子上脱去磷酸基团。该发明体系中，碱性磷酸酶用于去除抗坏血酸过磷酸酯上的磷酸基团产生还原剂抗坏血酸。一定量的金核和金棒生长液存在下，反应产生的不同量的抗坏血酸用于还原氯金酸，能够形成不同尺寸和纵横比的纳米金棒，因此，当体系中存在不同浓度目标物时，金棒的形态不同，对应的颜色也不同，从而实现对目标物的可视化定量检测。

发明内容

本发明针对现有仪器操作复杂、价格昂贵，传统可视化酶联免疫吸附法显色单一、定量效果差等问题，提出了一种快速、灵敏、多色彩的可视化检测分析方法。

为了实现上述目的，本发明所述的一种可视化酶联免疫分析方法，利用碱性磷酸酶（ALP）与抗坏血过磷酸酯（AA-P）反应生成还原剂抗坏血酸（AA），在金棒生长液和金核同时存在下，利用生成的不同量的AA还原氯金酸生成单质金沉积在金核表面，从而得到不同大小的金棒，表现出溶液颜色和紫外吸收光谱图特征随目标物浓度变化，用于目标物的可视化定量测定。

一种可视化酶联免疫分析方法包括以下步骤：

（1）向已包被有目标捕获抗体的酶标板中加入不同浓度的能与之特异性结合的抗原100 μL，反应1 h；

（2）向步骤（1）中加入ALP标记的100 μL试剂盒自身配带的已经标记有碱性磷酸酶的检测抗体，反应1-2 h；

（3）向步骤（2）中加入50μL 抗坏血酸过磷酸酯（购自于sigma公司）与ALP反应1 h；

（4）移取步骤（3）所得到的反应液20 μL至220μL金棒生长液中，随后加入10μL预先采用NaBH₄还原法合成好的纳米金核溶液，混匀反应1 h后，使用酶标仪测吸收光谱，并使用数码相机记录下溶液的颜色；

（5）处理步骤（4）所得到的数据，并绘制工作曲线。

（6）按照上述实验步骤，检测模拟待测样品。

所述的金棒生长液为包含有终浓度为0.1M CTAB、0.06mM AgNO₃、0.5mM HAuCl₄的混合液。

纳米金核溶液的制备方法为: 首先将5 mL 0.20 M的CTAB加入到15mL的玻璃瓶中，再加入0.25 mL 0.01 M HAuCl₄和4.75 mL的水，剧烈搅拌混匀；再往此溶液中添加0.6mL、0.01 M NaBH₄，最后产物为棕黄色纳米金核溶液；快速混匀2 min，在室温下静置10 min以上备用。

酶标记的检测抗体是试剂盒本身配带的，厂家标记好的，商业化的产品。

步骤（1）、（2）中的捕获抗体、检测抗体均为ELISA检测方法中所涉及的抗原和抗体；与目标物结合方式为双抗体夹心法。

步骤（1）中酶标板上抗体的量是一定的，加入的抗原量为一系列不同浓度。

步骤（1）、（2）中在加入反应液孵化结束之后，均需用洗涤液PBST洗涤2~4次，并用吸水纸拍干。

步骤（2）中的酶标记的检测抗体为碱性磷酸酶（ALP）标记的抗体；所述的ALP标记的抗体能够与待测物特异性结合。

步骤（2）中的酶联免疫孵化时间为1~2 h，优选1 h。

步骤（3）中的抗坏血酸过磷酸酯与ALP反应生成抗坏血酸可以作为还原剂，还原氯金酸至单质金。

步骤（4）中，最后的反应体系中金棒生长液中CTAB的浓度一定要达到0.1M，才能保证金棒的形成。

步骤（4）、（5）中不同浓度目标物的工作曲线建立的原理为：首先抗坏血酸过磷酸酯与碱性磷酸酶会生成抗坏血酸，当体系中存在不同量的目标物时，对应的碱性磷酸酶也会不同量，就会产生相应量的抗坏血酸；在金棒的生长过程中，抗坏血酸还原氯金酸至单质金沉积在金核表面，存在一定浓度CTAB（0.1M）作为表面活性剂，抗坏血酸量不同，就会得到不同大小的纳米金棒，对应的溶液颜色也不同，最后用紫外表征其吸收光谱，同时相机记录溶液颜色，从而对目标物实现可视化定量检测。

步骤（6）中检测模拟待测样品采用加标法，即在正常人血清中人为加入已知浓度的PSA样品作为阳性样本，正常人血清作为阴性样本，然后用本发明方法去检测，同时验证该方法的可靠性。

步骤（6）中待测样品的加入方法为每个孔中加入100 μL 500倍稀释的阳性样本血清（含PSA 10 pg/mL）、阴性样本血清和空白对照(Tris-HCl缓冲液)，37℃孵育1小时。

本发明的有益效果：

（1）纳米金棒的制备方法比较成熟，而且材料的LSPR峰在600~900 nm连续可调，这一范围是理想的光学传感区域；

（2）以ALP作为信标分子的修饰方法，已经实现商业化，该产品方便易得，在科研工作中使用较为广泛；

（3）抗坏血酸过磷酸酯和碱性磷酸酶反应可以高效的生成抗坏血酸，它作为一种还原剂已经普遍地应用在很多方面；

（4）ELISA方法是较为经典的生物样品检测方法，具有普遍的适用性，易于实现；

（5）本发明实现了多种颜色（无色、红色、黄色、蓝色、紫色、褐色、红褐色等）变化，解决了传统比色方法中颜色变化单一的缺点，能够实现对目标物的准确测定，并且反应速度快，显色效果好；

（6）本发明可在目前大部分商业上已有的以碱性磷酸酶为信号标记物的酶联免疫检测试剂盒的基础上进行改造，因此易于推广。

附图说明

图1为该纳米可视化免疫分析方法的示意图。其中左半部分为传统的酶联免疫反应示意图，右半部分为等离子体传感示意图。

图2为工作曲线建立的相关数据图（紫外图、线形图及相应比色图），其中a为不同形态的金棒的比色图（无色、紫色、蓝色、褐色、深褐色、红褐色）；b为紫外吸收光谱图；c为线性工作曲线。

图3为加标法检测模拟待测样品的相关数据图（比色图、紫外图），其中a为比色图；b为紫外吸收光谱图。

具体实施方式

实施例1：纳米金核的合成

首先将5 mL 0.20 M的CTAB加入到15mL的玻璃瓶中，再加入0.25 mL 0.01 MHAuCl₄和4.75 mL的水，剧烈搅拌混匀。再往此溶液中添加0.6 mL新制冷冻的0.01 M NaBH₄，最后产物为棕黄色纳米金核溶液。快速混匀2 min，在室温下静置10 min以上备用。

实施例2：工作曲线的建立

首先，在pH9.6的碳酸盐缓冲体系中，一抗加入到微孔板中，4℃放置过夜。随后用PBST洗涤三次，5wt.%的BSA作为一种封堵剂加入到每个孔中。预先分散在血清中的PSA加入到微孔板中，浓度变化范围从10^-3到 200 pg/mL，只有血清的溶剂作为空白对照，37℃下孵育1小时。用PBST洗涤三次，之后100 μL的碱性磷酸酶标记的二抗加入到每个孔中，孵育30min，再洗涤三次。50 μL (20 mM)抗坏血酸过磷酸酯加入到每个孔中，37℃下孵育1小时，随后取出20 μL与金棒生长液混合均匀，再加入10 μL的金核溶液。这些混合溶液需要室温下孵育1小时，之后用酶标仪测长成的金棒的吸收光谱，并用相机记录下对应的照片。

实施例3：加标法检测模拟待测样品

整个过程采用加标法检测模拟待测样品，即在正常人血清中人为加入已知浓度的PSA样品作为阳性样本，正常人血清作为阴性样本，然后用我们的方法去检测，验证该方法的可靠性。首先，在pH9.6的碳酸盐缓冲体系中，一抗100 μL加入到96孔微孔板中，4℃放置过夜。随后用PBST洗涤三次，5wt.%的BSA作为封堵剂加入到每个孔中。每个孔中加入100 μL500倍稀释的阳性样本血清（含PSA 10 pg/mL）、阴性样本血清和空白对照(Tris-HCl缓冲液)，37℃孵育1小时。用PBST洗涤三次，之后100 μL的碱性磷酸酶标记的二抗加入到每个孔中，孵育30min，再洗涤三次。50 μL (20 mM)抗坏血酸过磷酸酯加入到每个孔中，37℃下孵育1小时，随后各取出20 μL最后的反应液与金棒生长液混合均匀，再加入10 μL的金核溶液。在室温下孵育1小时，之后用酶标仪测长成的金棒的吸收光谱，并用相机记录下对应的照片，结果见图3。

从图3可以看出，阴性样本和空白对照中的溶液呈无色，含有阳性样本血清的溶液变为褐色。这是由于抗原-抗体之间的特异性识别和相互作用的结果，阳性样品中含有PSA抗原，能与相应抗体特异性结合，通过加入碱性磷酸酶标记的二抗，抗坏血酸过磷酸酯被还原生成抗坏血酸，用于金棒的生长，所以呈现褐色。而阴性样本和空白对照中不含有与抗体特异性结合的PSA抗原，因此不会导致金棒的生成，溶液为无色。观察相应的紫外吸收光谱，阳性样本在500nm和720nm处出现金棒特征吸收峰。对照发现，该阳性样本的紫外光谱图和比色图与图2中相应浓度（10 pg/mL）的相关数据完全符合，证明了该方法的可行性和可靠性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

Claims

1.一种基于纳米金生长的可视化免疫分析方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：

（1）向已包被有目标捕获抗体的酶标板中加入能与之特异性结合的抗原100μL，反应1h；

（2）向步骤（1）中加入100 μL试剂盒自身配带的已经标记有碱性磷酸酶的检测抗体，反应1-2 h；

（3）向步骤（2）中加入50μL 抗坏血酸过磷酸酯与碱性磷酸酶反应1 h；

（5）处理步骤（4）所得到的数据，并绘制工作曲线；

（6）按照上述实验步骤，检测待测样品；

2.根据权利要求1所述的一种基于纳米金生长的可视化免疫分析方法，其特征在于：步骤（1）、（2）中的捕获抗体、检测抗体均为传统ELISA检测方法中所涉及的抗原和抗体；与目标物结合方式为双抗体夹心法。

3.根据权利要求1所述的一种基于纳米金生长的可视化免疫分析方法，其特征在于：步骤（1）中酶标板上抗体的量为100μL。

4.根据权利要求1所述的一种基于纳米金生长的可视化免疫分析方法，其特征在于：步骤（3）中的抗坏血酸过磷酸酯与碱性磷酸酶反应生成抗坏血酸可以作为还原剂，还原氯金酸至单质金。

5.根据权利要求1所述的一种基于纳米金生长的可视化免疫分析方法，其特征在于：纳米金核溶液的制备方法为: 首先将5 mL 0.20 M的CTAB加入到15mL的玻璃瓶中，再加入0.25 mL 0.01 M HAuCl₄和4.75 mL的水，剧烈搅拌混匀；再往此溶液中添加0.6 mL、0.01 MNaBH₄，最后产物为棕黄色纳米金核溶液；快速混匀2 min，在室温下静置10 min以上备用。