CN109030472A - 一种可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的方法，通过先在板上固定一层纤维素用于抗原的吸附，然后加入邻苯二甲酸二丁酯标准液与固定在酶标板上的邻苯二甲酸二丁酯竞争一抗，使固定在板上的一抗进一步与辣根过氧化酶（HRP）修饰的二抗复合物结合，形成竞争型的免疫传感器；在HRP催化下，TMB被H2O2氧化成TMB2+（酸性条件）；加入TMB2+将金纳米棒刻蚀成不同的长径比,从而呈现出丰富多彩的颜色。随着目标物邻苯二甲酸二丁酯的增加，固定在板上的HRP量反而减少,使得金纳米棒被刻蚀的程度减小，从而呈现不同的颜色；该方法可以通过裸眼判断酶标板的颜色，进行邻苯二甲酸二丁酯的半定量分析，具有操作简单，灵敏度高，特异性好等特点。

Description

一种可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的方法
技术领域
本发明属于分析化学领域，尤其是涉及一种可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的方法。
背景技术
聚氯乙烯(PVC)材料生产过程中,常用邻苯二甲酸二丁酯(邻苯二甲酸二丁酯)作为增塑剂来提高产品的柔软性和稳定性。过量摄入邻苯二甲酸二丁酯对人体健康造成严重的危害，如腹部肥胖，生殖系统异常，癌症等。相关的权威部门对食品中邻苯二甲酸二丁酯含量进行限定，欧盟规定婴儿食品中应不能含有邻苯二甲酸二丁酯，并且迁移到食品中的邻苯二甲酸二丁酯的含量应低于0.3mg/kg。中国国家标准规定食品中邻苯二甲酸二丁酯的最大残留为0.3mg/kg。由于PVC制品在白酒生产过程中经常被用作输送管道，所以PVC材料中的邻苯二甲酸二丁酯可能会迁移到白酒中，造成食品污染。因此，有必要开发简单且灵敏的传感器用于邻苯二甲酸二丁酯的现场检测。
目前检测邻苯二甲酸二丁酯的方法有气相色谱-质谱联用、液相色谱-质谱联用、免疫组织化学、气相色谱-火焰电离检测器、化学发光等。但这些方法需要大型的设备，从而限制其现场检测的应用。免疫分析由于抗原-抗体的高特异识别能力而被广泛的研究,并与其他的信号读取技术进行联用，如电化学法，荧光法,比色法。除比色法外，其他方法都需要特殊的读出设备，这也限制了它们在现场的应用。由于比色法的信号可直接用肉眼进行读取进行读出，因而受到极大的关注。
商业化的免疫检测试剂盒常被用于邻苯二甲酸二丁酯含量的现场检测。样品中邻苯二甲酸二丁酯的浓度与酶标板呈现出的颜色强度相关。由于人眼很难区分单色的强度变化，,因此仍需精确仪器进行定性分析。近年来，贵金属纳米结构由于其独特的光学性质而受到人们的关注。局部表面等离子体共振(LSPR)的产生与贵金属纳米结构的形貌有关。金纳米棒(GNRs)常被视为理想的比色法的显色底物。
发明内容
针对现有技术的情况，本发明的目的在于提供一种裸眼可视、便携、快速的可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的方法，该方法具有高灵敏度，高特异性检测邻苯二甲酸二丁酯，在150ppb～8100ppb范围内的检测结果呈现良好的线性关系。
为了实现上述的技术目的，本发明采用的技术方案为：
一种可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的方法，其包括如下具体步骤：
(1)金纳米棒的制备：在双表面活性剂系统中合成金纳米棒溶液；
(2)将步骤(1)合成的金纳米棒溶液进行离心处理，然后将分离出的沉淀物分散在终浓度为0.1M的CTAB溶液；
(3)酶联免疫吸附试验：取酶标板且在其底层固定一层纤维素，然后将不同浓度的邻苯二甲酸二丁酯吸附在酶标板的孔板上，再依序加入一抗和修饰辣根过氧化酶(HRP)的二抗，以使其形成竞争型的免疫传感器；
(4)用洗涤液洗去步骤(3)未被固定到酶标板上的一抗和过氧化氢酶的二抗；
(5)往经步骤(4)处理的酶标板的各孔板中加入过氧化氢和TMB的混合溶液，使其产生TMB+；
(6)往经步骤(5)处理过的酶标板的各孔板中加入盐酸，在酸性条件下，将TMB+质子化产生TMB2+；
(7)将步骤(2)制得的金纳米棒溶液加入到经步骤(6)处理后的酶标板上，使酶标板中的TMB2+对金纳米棒进行刻蚀并呈现出若干种颜色；
(8)通过酶标仪对经步骤(7)处理所得酶标板的各孔板进行测量其光谱且采用图像摄取装置对其酶标板的孔板进行图像摄取，并记录数据；
根据酶标板上各孔板的邻苯二甲酸二丁酯浓度和对应酶标仪检测的光谱仪数据进行拟合进线性方程Δλ＝-135.58lgcDBP+517.99中，其中，Δλ为刻蚀前后紫外可见吸收峰的差值；cDBP为其所对应的邻苯二甲酸二丁酯浓度,单位为ppb。
进一步，步骤(1)中在双表面活性剂系统中合成金纳米棒的具体步骤如下：
(A)金种溶液的合成：在30℃条件下，将1mL用冰水配置的浓度为6mM NaBH4溶液加入到10mL含有0.1M CTAB和5mM HAuCl4混合溶液中，在持续剧烈搅拌2min后形成棕黄色溶液，然后再将所制得的棕黄色溶液置于30℃的由于环境下静置，获得金种溶液；
(B)生长液的合成：将7.2mL浓度为4mM AgNO3溶液、100mL浓度为1mM HAuCl4溶液，加入到100mL含有浓度为0.077M CTAB和浓度为0.016M油酸钠的双表面活性剂系统中，然后持续搅棒90min后,再加入0.84mL浓HCl后继续搅15min；最后加入0.5mL浓度为4mM Vc，制得生长液；
(C)金纳米棒的生长制备：将160μL步骤(A)制得的金种溶液加入到步骤(B)制得的生长液中，然后在30℃水浴调节下静置12h，即可制得金纳米棒溶液。
进一步，步骤(1)至(9)中所涉及使用到的玻璃器皿均使用王水浸泡处理后，再用水洗涤。
进一步，步骤(1)中，金纳米棒溶液的纵向等离子共振峰为771nm。
进一步，步骤(2)中离心处理的转速为8000rpm，处理时间为15min。
进一步，步骤(3)加入的邻苯二甲酸二丁酯标准液、一抗和修饰辣根过氧化酶的二抗均为50μL，且其反应时间为40min，反应温度为37℃。
优选的，步骤(5)加入的过氧化氢和TMB的混合溶液体积为100μL，反应时间为40min，反应温度为37℃。
优选的，步骤(6)加入盐酸的体积为10μL。
优选的，步骤(7)中，加入到经步骤(6)处理后的酶标板上的金纳米棒溶液体积为100μL。
优选的，步骤(7)中酶标板上的TMB2+对金纳米棒溶液进行刻蚀处理的时间为7min，反应温度为37℃。
采用上述的技术方案，本发明的有益效果为：
(1)本发明方案进行检测邻苯二甲酸二丁酯可呈现裸眼可视化的显色反应，根据邻苯二甲酸二丁酯浓度的高低，可显出丰富多彩颜色(如：粉色、紫色、蓝色、蓝绿色、绿色、棕色等)，将其用于目标物的半定量分析，有利于提高肉眼检测的准确度；
(2)本发明方案的操作步骤简单、成本低、特异性强和灵敏度高；
(3)本发明的结果可用裸眼进行信号的读取，方便且快速，分别且可用于现场可靠检测；
(4)本发明方案的原料易得，也可以将该方法运用于其他类似理化性质的目标物的检测，其具有普遍的适用性，易于实现商品化生产。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步的阐述：
图1是本发明可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的原理简要示意图，其中，左半部分为传统的酶联免疫吸附试验示意图，右半部分为多色呈现的示意图；
图2是本发明方案中不同长径比的金纳米棒的透射电镜图和比色卡片图；
图3是本发明应用酶联免疫比色法进行邻苯二甲酸二丁酯含量的检测的紫外光谱(A)和对应的图比色卡片(B)，其中，邻苯二甲酸二丁酯浓度从a到l，依次为150，200，300，400，500，600，800，1200，1400，1500，2700，8100ppb；
图4为本发明方案制得的传感器对邻苯二甲酸二丁酯检测的特异性检测，柱状图(A)，比色卡片(B)；从左到右分别为邻苯二甲酸二烯丙酯，邻苯二甲酸二甲酯，邻苯二甲酸二乙酯，邻苯二甲酸二异丁酯，邻苯二甲酸二正辛酯，邻苯二甲酸二丁酯；邻苯二甲酸二丁酯的浓度为800ppb，其他干扰物质的浓度均为8000ppb。
具体实施方式
实施例1
一种可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的方法，其包括如下步骤：
(1)将所需涉及使用到的玻璃器皿均使用王水浸泡处理后，再用水洗涤；
(2)金纳米棒的制备：在双表面活性剂系统中合成金纳米棒溶液,其包括具体如下步骤；
(A)金种溶液的合成：在30℃条件下，将1mL用冰水配置的浓度为6mM NaBH4溶液加入到10mL含有0.1M CTAB和5mM HAuCl4混合溶液中，在持续剧烈搅拌2min后形成棕黄色溶液，然后再将所制得的棕黄色溶液置于30℃的由于环境下静置，获得金种溶液；
(B)生长液的合成：将7.2mL浓度为4mM AgNO3溶液、100mL浓度为1mM HAuCl4溶液，加入到100mL含有浓度为0.077M CTAB和浓度为0.016M油酸钠的双表面活性剂系统中，然后持续搅棒90min后,再加入0.84mL浓HCl后继续搅15min；最后加入0.5mL浓度为4mM Vc，制得生长液；
(C)金纳米棒的生长制备：将160μL步骤(A)制得的金种溶液加入到步骤(B)制得的生长液中，然后在30℃水浴调节下静置12h，即可制得金纳米棒溶液，其中，金纳米棒的纵向等离子吸收波长约为771nm；
(3)将步骤(2)合成的金纳米棒溶液进行以8000rpm的转速离心处理15min，然后将分离出的沉淀物分散在终浓度为0.1M的CTAB溶液；
(4)酶联免疫吸附试验：取酶标板且在其底层固定一层纤维素，然后将50μL不同浓度的邻苯二甲酸二丁酯吸附在酶标板的孔板上，接着，再依序加入一抗和修饰辣根过氧化酶的二抗各50μL并在37℃条件下反应40min，以使其形成竞争型的免疫传感器；
(5)用洗涤液对酶标板洗涤三次，以洗去步骤(4)未被固定到酶标板上的一抗和过氧化氢酶的二抗，制得抗体、抗原，其大致图示如图1左半部分图示；
(6)往经步骤(5)处理的酶标板的孔板上加入100μL体积比为1∶1过氧化氢(H2O2)和TMB的混合溶液，并在37℃条件下反应40min，使其产生TMB+；
(7)往经步骤(6)处理过的酶标板的各孔板中加入10μL浓度为5M的盐酸，在酸性条件下，将TMB+质子化产生TMB2+；
(8)将100μL步骤(3)制得的金纳米棒溶液加入到经步骤(7)处理后的酶标板上，并在37℃的反应温度下，使酶标板上的TMB2+对金纳米棒溶液进行刻蚀处理7min并呈现出若干种颜色；
(9)通过酶标仪对经步骤(8)处理所得酶标板的各孔板进行测量其光谱且采用图像摄取装置对其酶标板的孔板进行图像摄取，并记录数据，其中，图像摄取装置可以是照相机或摄像机等；在图像采集过程中，随着邻苯二甲酸二丁酯浓度的增加，金棒长径比变大，其表面等离子共振吸收峰发生红移，使得随浓度的增加酶标板孔板中的溶液依次呈现出粉色,紫色、蓝色、绿色、棕色等。
其中，还可以根据酶标板上各孔板的邻苯二甲酸二丁酯浓度和对应酶标仪检测的光谱仪数据进行拟合得到线性方程Δλ＝-135.58lgcDBP+517.99其中，Δλ为刻蚀前后紫外可见吸收峰的差值；cDBP为其所对应的邻苯二甲酸二丁酯浓度,单位为ppb。
另外，图2示出了不同长径比的金纳米棒的透射电镜图和比色卡片图，图3示出了针对本发明应用酶联免疫比色法进行邻苯二甲酸二丁酯含量的检测的紫外光谱(A)和对应的图比色卡片(B)，其中，邻苯二甲酸二丁酯浓度从a到l，依次为150，200，300，400，500，600，800，1200，1400，1500，2700，8100ppb。
实施例2
白酒样品中邻苯二甲酸二丁酯的检测，其具体步骤如下：
(1)二锅头实际样的预处理
用2mL的正己烷萃取5mL二锅头中的邻苯二甲酸二丁酯，然后取上清液并用氮气吹干，接着用1mL 35％甲醇溶解得到含有邻苯二甲酸二丁酯的溶液；
(2)实际样的检测
取50uL步骤(1)制得的含有邻苯二甲酸二丁酯的溶液加入到酶标板中，接着加入一抗和修饰有辣根过氧化酶的二抗各50μL，然后在37℃下孵育40min；再用洗涤液洗板三次；再接着加入100μL体积比为1：1的H2O2和TMB的混合溶液，在37℃下反应40min；然后用10μL浓度为5M HCl终止上述反应，并加入100μL金纳米棒溶液(CTAB)，令其反应7min；然后用酶标仪测量每个孔板的光谱，并用照相机拍摄孔板颜色，记录数据。
上述步骤重复进行4组实际样检测，检测结果显示，测得4组二锅头样品中邻苯二甲酸二丁酯浓度分别为226.58；229.47；238.11；235.42ppb。
本发明所述方法制备多色邻苯二甲酸二丁酯传感器对邻苯二甲酸二丁酯检测的特异性，具体步骤如下：
为了检测本发明所述的多色邻苯二甲酸二丁酯传感器的特异性，将实施例2的步骤(2)中所使用的邻苯二甲酸二丁酯换成其他干扰物质。邻苯二甲酸二丁酯的浓度为800ppb，其他干扰物质的浓度均为8000ppb。如图4(A)所示，从左到右分别为邻苯二甲酸二烯丙酯，邻苯二甲酸二甲酯，邻苯二甲酸二乙酯，邻苯二甲酸二异丁酯，邻苯二甲酸二正辛酯，邻苯二甲酸二丁酯，其相应的比色卡片如图4(B)所示，除了邻苯二甲酸二丁酯所对应的卡片呈紫色外，其他卡片均为粉色，结果说明本发明所述方法制备多色邻苯二甲酸二丁酯传感器对邻苯二甲酸二丁酯的检测有较好的特异性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例,凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰,皆应属本发明的涵盖范围。

Claims (10)

1.一种可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的方法，其特征在于：其包括如下具体步骤：
（1）金纳米棒的制备：在双表面活性剂系统中合成金纳米棒溶液；
（2）将步骤（1）合成的金纳米棒溶液进行离心处理，然后将分离出的沉淀物分散在终浓度为0.1 M的CTAB溶液；
（3）酶联免疫吸附试验：在酶标板底层固定一层纤维素，然后将不同浓度的邻苯二甲酸二丁酯吸附在酶标板的孔板上，再依序加入一抗和修饰辣根过氧化酶的二抗，以使其形成竞争型的免疫传感器；
（4）用洗涤液洗去步骤（3）未被固定到酶标板上的一抗和过氧化氢酶修饰的二抗；
（5）往经步骤（4）处理的酶标板的各孔板中加入过氧化氢和TMB的混合溶液，使其产生TMB+；
（6）往经步骤（5）处理过的酶标板的各孔板中加入盐酸，在酸性条件下，将TMB+质子化产生TMB2+；
（7）将步骤（2）制得的金棒溶液加入到经步骤（6）处理后的酶标板上，使酶标板中的TMB2 +对金纳米棒溶液进行刻蚀并呈现出若干种颜色；
（8）通过酶标仪对经步骤（7）处理所得酶标板的各孔板进行测量其光谱且采用图像摄取装置对其酶标板的孔板进行图像摄取，并记录数据。
2.根据权利要求1所述的一种可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的方法，其特征在于：步骤（1）中在双表面活性剂系统中合成金纳米棒的具体步骤如下：
（A）金种溶液的合成：在30 ℃条件下，将1 mL用冰水配置的浓度为6 mM NaBH4溶液加入到10 mL含有0.1 M CTAB和5 mM HAuCl4混合溶液中，在持续剧烈搅拌2 min后形成棕黄色溶液，然后再将所制得的棕黄色溶液置于30℃的由于环境下静置，获得金种溶液；
（B）生长液的合成：将7.2 mL浓度为4 mM AgNO3溶液、100 mL浓度为1 mM HAuCl4溶液，加入到100 mL含有浓度为0.077 M CTAB和浓度为0.016 M 油酸钠的双表面活性剂系统中，然后持续搅棒90 min后,再加入0.84 mL 浓HCl后继续搅15 min；最后加入0.5 mL浓度为4mM Vc，制得生长液；
（C）金纳米棒的生长制备：将160 µL步骤（A）制得的金种溶液加入到步骤（B）制得的生长液中，然后在30℃水浴调节下静置12 h，即可制得金纳米棒溶液。
3.根据权利要求1所述的一种可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的方法，其特征在于：步骤（1）中，金纳米棒溶液的纵向等离子共振峰为771 nm。
4.根据权利要求1所述的一种可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的方法，其特征在于：步骤（2）中离心处理的转速为8000 rpm，处理时间为15 min。
5.根据权利要求1所述的一种可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的方法，其特征在于：步骤（3）加入的邻苯二甲酸二丁酯标准液、一抗和修饰辣根过氧化酶的二抗均为50 µL，且其反应时间为40 min，反应温度为37 ℃。
6.根据权利要求5所述的一种可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的方法，其特征在于：步骤（5）加入的过氧化氢和TMB的混合溶液体积为100 µL，反应时间为40 min，反应温度为37 ℃。
7.根据权利要求6所述的一种可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的方法，其特征在于：步骤（6）加入盐酸的体积为10 µL。
8.根据权利要求7所述的一种可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的方法，其特征在于：步骤（7）中，加入到经步骤（6）处理后的酶标板上的金纳米棒溶液体积为100 µL。
9.根据权利要求8所述的一种可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的方法，其特征在于：步骤（7）中酶标板上的TMB2+对金纳米棒溶液进行刻蚀处理的时间为7 min，反应温度为37℃。
10.根据权利要求1所述的一种可视化检测邻苯二甲酸二丁酯含量的方法，其特征在于：步骤（1）至（8）中所涉及使用到的玻璃器皿均使用王水浸泡处理后，再用水洗涤。
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