CN103226144A - 邻苯二甲酸二丁酯快速检测试剂盒的制备及检测方法 - Google Patents

邻苯二甲酸二丁酯快速检测试剂盒的制备及检测方法 Download PDF

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CN103226144A CN2013100872142A CN201310087214A CN103226144A CN 103226144 A CN103226144 A CN 103226144A CN 2013100872142 A CN2013100872142 A CN 2013100872142A CN 201310087214 A CN201310087214 A CN 201310087214A CN 103226144 A CN103226144 A CN 103226144A
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孙清
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Abstract

本发明公开了一种检测邻苯二甲酸二丁酯(Dibutyl phthalate，DBP)的酶联免疫分析测定试剂盒，所述试剂盒包括邻苯二甲酸二丁酯(DBP)标准溶液，固相载体，酶标记物，DBP抗试剂，底物显色液，包被液，酶稀释工作液，终止液及浓缩洗涤液。本发明还公开了一种邻苯二甲酸二丁酯酶联免疫分析测定试剂盒的制备方法及检测方法。使用本发明制备的邻苯二甲酸二丁酯试剂盒，具有操作简单，灵敏度高，特异性好，线性好等特点。

Description

邻苯二甲酸二丁酯快速检测试剂盒的制备及检测方法
技术领域
本发明涉及分析检测技术领域，更具体地讲，涉及一种检测邻苯二甲酸二丁酯(Dibutylphthalate，DBP)的酶联免疫分析测定试剂盒及其制备、使用方法。
背景技术
邻苯二甲酸酯类(PAEs)是增塑剂的主体，广泛应用于农膜、黏合剂、服装、农药、肥料、油漆、化妆品、儿童玩具等行业，具有三致(致癌、致畸、致突)作用，属于环境内分泌干扰物，是环境中常见的痕量有机污染物之一。最常使用的为邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、邻苯二甲酸二丁酯(DBP)、邻苯二甲酸二辛酯(DOP)、邻苯二甲酸二异辛酯(DHEP)和邻苯二甲酸二甲酯(DMP)等。这几种化合物已被美国国家环保局(USEPA)列为“优先监控污染物”。中国已将DMP、DBP、DOP列入优先控制污染物黑名单。《国家饮用水标准》(GB5749-2006)要求DOP＜0.008mg/L，DBP＜0.003mg/L，DEP＜0.3mg/L。《食品容器、包装材料用添加剂使用卫生标准》(GB9685-2008)规定食品、食品添加剂中的DOP＜1.5mg/kg、DINP＜9.0mg/kg、DBP＜0.3mg/kg。由此可见，急需研制出方便、快捷、检出限低的DBP测试方法已迫在眉睫。
目前最引起广泛关注的是DBP的生殖毒性和发育毒性(包括胚胎毒性)。美国NTP的一系列研究表明，DBP可致雄性啮齿类动物睾丸标志酶活性下降、重量减轻、曲细精管变萎缩、生殖道畸形等。2006年11月起，DBP被列入California Proposition65(1986)可疑致畸物清单中，是一种可疑的内分泌干扰素，曾用在指甲油中。所有主要生产商都从2006年秋季开始减少这种物质在指甲油中的使用。DBP在儿童玩具和儿童保育用品中被永久禁止使用超过1000ppm的浓度，在《2008年消费品安全改善法》(Consumer Product SafetyImprovement Act of 2008，CPSIA)中section108已有规定。DBP已广泛渗透到人类生活的各个领域，所带来的危害逐步被认可，因此DBP测试方法及测试技术的研究也在逐步的深入。
DBP与其他邻苯二甲酸酯一样，能引起中枢神经和周围神经系统的功能性变化，进一步引起组织上的改变，有趋肝性，可引起轻度致敏作用。对人：最敏感的人可嗅到的阈浓度为0.00026mg/L，对眼的光感反射作用的阈浓度为0.00016mg/L，对脑生物电活动的阈浓度为0.00011～0.00012mg/L。对皮肤和眼睛的作用：可经完整皮肤吸收少量；皮肤及眼粘膜一次接触后，并不引起刺激作用，而反复接触则可见到严重的刺激。某些实验资料表明，它可引起烃度的致敏作用。对动物：小白鼠吸入2小时气雾剂的LD50＝25mg/L。中毒期间可见对眼粘膜及上呼吸道粘膜的强烈刺激，呼吸困难，共济失调，后肢麻痹；部分动物呈现浅表的麻醉，阵挛性惊厥。DBP还具有中等程度的蓄积作用和轻度刺激作用。因此建立简便、快捷的邻苯二甲酸二丁酯(DBP)检测方法显得尤为重要。
近年来国内外对食品塑料包装材料中PAEs分析比较重视，研究较多，主要是提高检测效率。其中前处理技术主要有净化体积阻滞色谱(SEC)、凝胶色谱(GPC)、超临界萃取(SFE)、固相萃取(SPE)、加速容积萃取(ASE)；测试技术主要采用液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱发(LC-MS)、气相色谱发(GC)、气相色谱-质谱法(GC-MS)等，但检测费用昂贵，需要专业人员操作，样品前处理繁琐，难以进行批量处理，很难满足酒水、饮料行业快速诊断的需求。为此，研发灵敏度高、检测线低、操作简便的快速诊断试剂盒显得极为迫切。
对城市污水和工业废水中邻苯二甲酸酯类物质的测定已有不少报道。然而，这些内分泌干扰物在饮用水中的浓度通常在ng/L甚至更低，通常的气相色谱和液相色谱方法由于灵敏度有限难于检测。常用的方法是经过溶剂萃取等富集手段后，采用GC/MS或GC/MS-MS测定。这种方法用于测定极性较强的酚类和高沸点的组分时，往往需要进行烦琐的前处理过程，难于适应快速分析的需要。随着生物技术的不断发展，免疫分析越来越受青睐，但国内外有关免疫分析检测邻苯二甲酸酯类的较少。免疫分析具有特异性强，灵敏度高，方便快捷，分析容量大检测成本低，安全可靠等优点可满足简单、快速、灵敏检测的需要。因此，开发了快速检测邻苯二甲酸二丁酯试剂盒。本试剂盒的灵敏度可达0.09ppm，在低浓度的饮用水、饮料、酒类的检测中很占优势。
发明内容
为了检测在酒水中常见增塑剂污染现状，解决现有技术存在的不足，本发明提供一种邻苯二甲酸二丁酯检测试剂盒，同时提供其制备方法及检测方法。该方法简捷、快速、准确、灵敏，检测限和适用范围完全满足目前检测限量的要求。
本发明的一个目的是提供一种检测邻苯二甲酸二丁酯(DBP)酶联免疫检测试剂盒，所述试剂盒包括邻苯二甲酸二丁酯(DBP)标准溶液，固相载体，酶标记物，DBP抗试剂，底物显色液，包被液，酶稀释工作液，终止液及浓缩洗涤液。
试剂盒的实现形式：其中，所述固相载体为微孔板，所述微孔板由邻苯二甲酸二丁酯(DBP)抗原包被，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，所述DBP抗试剂为DBP抗体，所述底物显色液含四甲基联苯胺(TMB)，所述包被液为碳酸盐缓冲液，所述酶稀释工作液为含Tween20的PBS溶液，所述终止液含浓硫酸，所述浓缩洗涤液为磷酸盐缓冲液。
优选地，所述抗原为邻苯二甲酸二丁酯的高亲和力的完全抗原
优选地，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的DBP抗抗体
优选地，DBP酶标物的浓度：250ng/mL
优选地，DBP抗体浓度：200ng/ml
优选地，样品稀释液：PH9.6
所述底物显色液含有：
四甲基联苯胺(TMB)
所述包被液含有：
碳酸钠          0.1～0.3％
碳酸氢钠        0.2～0.5％
PH              8.5～10
优选地，所述包被液含有：
碳酸钠          0.15％
碳酸氢钠        0.30％
PH              9.6
所述酶稀释工作液含有：
Teen20
PBS
优选地，所述酶稀释工作液含有：
含0.1％Teen20的PBS溶液
所述终止液含有：
硫酸            5％～25％
优选地，所述终止液含有：
硫酸            15％
所述浓缩洗涤液含有：
Figure BSA00000866026000031
优选地，所述浓缩洗涤液含有：
Figure BSA00000866026000032
本发明的另一目的是提供一种检测邻苯二甲酸二丁酯(DBP)试剂盒的制备方法，所述方法包括如下步骤：
A.制备固相载体：将0.05mol/L的包被液与邻苯二甲酸二丁酯(DBP)完全抗原以适当比例混合，将混合液负载与载体上，用洗涤液清洗酶标板，拍干后用酶标板保护液封闭保护上述洗涤后的载体。
B.制备辣根过氧化物标记的羊抗鼠二抗：采用棋盘滴定法选择最佳的酶标记物的工作浓度。酶标二抗溶于酶稀释液中以制备二抗工作液。
C.制备DBP抗试剂：用一抗稀释液配制200ng/ml的一抗溶液。
D.制备底物显色液：以DMSO为稀释液配制成较低浓度的TMB溶液即成。
E.制备浓缩洗涤液：
所述浓缩洗涤液含有：
Figure BSA00000866026000033
优选地，所述浓缩洗涤液含有：
Figure BSA00000866026000034
F.制备邻苯二甲酸二丁酯(DBP)标准溶液：用含10％甲醇的超纯水稀释成0ppm、0.09ppm、0.27ppm、0.81ppm、2.43ppm、7.29ppm共六个浓度的DBP标准品。
G.制备终止液：
终止液含有：
硫酸            15％(质量)
H.制备样品提取液：
所述样品提取液含有：
正己烷          色谱纯
甲醇            35％
本发明的再一目的是提供一种检测邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的方法，其所述方法包括以下步骤：
A.样品前处理：
a.瓶装或桶装饮用水
加入浓缩样品稀释液使其样品稀释成1.5倍即为待测液。
b.瓶装或罐装饮料、酒
取5ml样品加入2ml色谱纯正己烷混匀后静止，取上清液1ml挥干，用1ml的35％的甲醇重溶即稀释成0.4倍的待测液。
B.使用前述试剂盒及微孔板酶标分析仪检测定量样品液邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的含量。
优选地，所述步骤B包括：
a.加标准品或样品：加标准品或样品40～60μL到对应微孔板中，加入DBP抗试剂40～60μL/孔，再加入酶标物40～60μL/孔，混匀，用盖板膜盖板后室温或37℃反应30～60min。
b.洗板：揭开膜后，将孔内液体甩干，用洗涤工作液200～400μL/孔，充分洗涤数次，每隔30s，用吸水纸拍干。
c.显色：加入显色液50～100μL/孔，用盖板膜盖板后室温或37℃反应10～15min。
d.测定：加入终止液40～60μL/孔，混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。
e.结果判定：在微孔板酶标仪上测定OD值，与根据标准品OD值的标准曲线对比，确定样品中邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的含量。
优选地，所述步骤B)中反应温度为37℃，所述DBP标准品或样品的加入体积50μL/孔，所述DBP抗试剂的加入体积为50μL/孔，所述酶标物加入体积为50μL/孔，所述显色液的加入体积为100μL/孔，所述洗涤工作液加入体积为300μL/孔，所述终止液的加入体积为50μL/孔，所述反应时间40min，所述显色时间10min。
f.标准曲线的绘制
使用前述试剂盒，采用检测方法中步骤B进行测试，得到6种浓度DBP标准溶液的OD值。以标准品百分吸光率为纵坐标，以邻苯二甲酸二丁酯(DBP)标准品浓度(ppm)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。
本发明酶联免疫分析法测定邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的原理：本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被邻苯二甲酸二丁酯(DBP)抗原，样本中邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和此抗原竞争抗邻苯二甲酸二丁酯(DBP)抗体(抗试剂)，同时抗邻苯二甲酸二丁酯(DBP)抗体与酶标二抗(酶标物)相结合，经TMB底物显色，样本吸光值与其含有的邻苯二甲酸二丁酯(DBP)成负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的含量。
本发明提供了一种快速检测邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的试剂盒及其检测方法，与现有技术相比具有如下有益效果：
1.检测时间短，操作简便，误差较小，可同时检测42个样本，整体检测时间短于60min。
2.检测回收率稳定，变异系数小于10％，结果准确，与仪器检测数据吻合性较好。
3.使用成本低，易推广，不需要大型设备，只需配合较小的酶标仪方可检测，操作简便，携带便捷，适合规模较小的实验室、社区家庭使用，有较好的推广前景。
4.此外还提供了一种邻苯二甲酸二丁酯(DBP)酶联免疫检测试剂盒的制备方法，该法简单易行，特异性好，批间差异小，测试准确，适于批量生产和质量控制。
附图说明
图1为检测邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的抑制标准曲线图。
具体实施方式
一下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。
实施例1
一种快速检测邻苯二甲酸二丁酯(DBP)酶联免疫试剂盒的制备
1.制备邻苯二甲酸二丁酯(DBP)标准溶液：
用邻苯二甲酸二丁酯(DBP)标准品配制，用含10％甲醇的超纯水稀释成0ppm、0.09ppm、0.27ppm、0.81ppm、2.43ppm、7.29ppm六个浓度，分装成6瓶，低温避光保存。
2.用邻苯二甲酸二丁酯(DBP)完全抗原预包被微孔板：
1)包被
将0.05mol/L的包被液与邻苯二甲酸二丁酯(DBP)完全抗原以适当比例混合，将混合液负载与载体上，4℃过液(约16h)。
2)洗板
用含有0.5％的Tween20(体积)的磷酸盐缓冲液清洗2次。
3)封闭保护
将1％的牛血清蛋白封闭保护液加入到洗涤好的固相载体上，每孔200μL，37℃静止1h。甩到保护液，用吸水纸拍干，放入37℃干燥箱中干燥1h。将干燥后的酶标板装入试剂盒铝箔袋中，每袋放一枚干燥剂，真空包装封口，贴上酶标板批号。
3.酶标记物的制备
采用棋盘滴定法选择最佳的酶标二抗工作浓度。将酶标二抗溶于酶稀释液中。
4.DBP抗试剂的制备
用一抗稀释液配制200ng/ml的一抗溶液。
5.底物显色液的制备
以DMSO为稀释液配制成较低浓度的TMB溶液即成。
6.浓缩洗涤液的制备
所述浓缩洗涤液含有：
Figure BSA00000866026000051
优选地，所述浓缩洗涤液含有：
Figure BSA00000866026000052
7.终止液的制备
用超纯水将浓硫酸配制成15％的硫酸溶液(质量体积分数)。
将上述步骤所得产品分装即得半成品，经抽检合格后组装为成品，4℃保存。
实施例2
使用本发明实施例1所制备的酶联免疫试剂盒绘制DBP工作曲线
1.包被步骤
将0.05mol/L的包被液与邻苯二甲酸二丁酯(DBP)完全抗原以适当比例混合，将混合液负载与载体上，4℃过液(约16h)。
2.封闭步骤
将1％的牛血清蛋白封闭保护液加入到洗涤好的固相载体上，每孔200μL，37℃静止1h。甩到保护液，用吸水纸拍干，放入37℃干燥箱中干燥1h。将干燥后的酶标板装入试剂盒铝箔袋中，每袋放一枚干燥剂，真空包装封口。
3.竞争步骤
每孔加入50μLDBP标准溶液，50μLDBP抗体和50μL酶标二抗，使之发生竞争反应。37℃温育40min后，从培养箱中取出，甩掉孔内溶液，用洗涤工作液300μL/孔，充分洗涤数次，除去游离的DBP及抗体结合物。
4.显色步骤
将洗涤后的微孔板加入显色液100μL/孔，用盖膜板盖板37℃温育10min。
5.检测步骤
在上述微孔板中加入终止液50μL/孔，用多功能酶标仪测定各孔在激发波长为450nm，发射波长为630nm时的吸光值。根据标准溶液的吸光值作出标准曲线。以标准品百分吸光率为纵坐标，以邻苯二甲酸二丁酯(DBP)标准品浓度(ppm)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图，如图1。作出的标准曲线方程为y＝-17.905Ln(x)+160.12R2＝0.9896(X为标准溶液浓度值)。采用最佳条件制作的工作曲线，试验数据表明标准品的百分吸光率与标准品浓度的半对数值有良好的线性关系。
表1制作工作曲线的试验数据
标准溶液浓度 吸光值 相对吸光值
0 1.835 100.0
90 1.471 80.1
270 1.137 62.0
810 0.698 38.0
2430 0.301 16.4
7290 0.084 4.6
实施例3
使用本发明实施例1所制备的酶联免疫试剂盒，实施例2绘制的标准曲线检测邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的方法。
1.样品前处理
1.1瓶装或桶装饮用水
加入浓缩样品稀释液使其样品稀释成1.5倍即为待测液。
1.2瓶装或罐装饮料、酒
取5ml样品加入2ml色谱纯正己烷混匀后静止，取上清液1ml挥干，用1ml的35％的甲醇重溶即稀释成0.4倍的待测液。
2.使用快速检测邻苯二甲酸二丁酯(DBP)酶联免疫试剂盒检测所述样品邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的含量。
2.1将试剂盒从4℃取出，恢复至室温，在包被好的微孔板中加入邻苯二甲酸二丁酯(DBP)标准溶液或待测液50μL/孔，DBP抗体50μL/孔，酶标二抗50μL/孔，混匀后37℃温育40min。
2.2将上述微孔板洗涤后，加底物显色液100μL/孔，用盖膜板盖板37℃温育10min。
2.3在上述微孔板中加入终止液50μL/孔，用多功能酶标仪测定各孔在激发波长为450nm，发射波长为630nm时的吸光值。根据标准溶液的吸光值作出标准曲线。以标准品百分吸光率为纵坐标，以邻苯二甲酸二丁酯(DBP)标准品浓度(ppm)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图，如图1。作出的标准曲线方程为y＝-17.905Ln(x)+160.12R2＝0.9896(X为标准溶液浓度值)。将样品吸光值与标准曲线进行对比，确定样品中邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的含量。
实施例4
使用本发明实施例1所制备的酶联免疫试剂盒，实施例2绘制的标准曲线检测邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的方法。
1.样品前处理
1.1瓶装或桶装饮用水
加入浓缩样品稀释液使其样品稀释成1.2倍即为待测液。
1.2瓶装或罐装饮料、酒
取5ml样品加入2ml色谱纯正己烷混匀后静止，取上清液1ml挥干，用1ml的25％的甲醇重溶即稀释成0.4倍的待测液。
2.使用快速检测邻苯二甲酸二丁酯(DBP)酶联免疫试剂盒检测所述样品邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的含量。
2.1将试剂盒从4℃取出，恢复至室温，在包被好的微孔板中加入邻苯二甲酸二丁酯(DBP)标准溶液或待测液50μL/孔，DBP抗体50μL/孔，酶标二抗50μL/孔，混匀后25℃温育30min。
2.2将上述微孔板洗涤后，加底物显色液100μL/孔，用盖膜板盖板25℃温育15min。
2.3在上述微孔板中加入终止液50μL/孔，用多功能酶标仪测定各孔在激发波长为450nm，发射波长为630nm时的吸光值。根据标准溶液的吸光值作出标准曲线。以标准品百分吸光率为纵坐标，以邻苯二甲酸二丁酯(DBP)标准品浓度(ppm)的半对数为横坐标，绘制标准曲线图，如图1。作出的标准曲线方程为y＝-17.905Ln(x)+160.12R2＝0.9896(X为标准溶液浓度值)。将样品吸光值与标准曲线进行对比，确定样品中邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的含量。
实施例5
本发明试剂盒的方法学鉴定
本发明对实施例1所制备的试剂盒进行方法学鉴定
表2不同白酒样品HPLC-MS/MS仪器检测与本发明试剂盒检测结果对比数据
样品号 HPLC-MS/MS(mg/kg) 本发明试剂盒(mg/kg)
S1 0.18 0.15
S2 0.24 0.21
S3 1.06 0.97
S4 0.06 0.06
S5 0.24 0.23
S6 0.38 0.31
S7 0.03 0.02
S8 0.30 0.33
表3不同白酒样品GC-MS/MS仪器检测与本发明试剂盒检测结果对比数据
样品号 GC-MS/MS(mg/kg) 本发明试剂盒(mg/kg)
S9 0.31 0.38
S10 0.47 0.41
S11 1.76 2.04
S12 0.87 0.91
S13 1.03 1.31
S14 0.68 1.07
S15 0.45 0.56
S16 0.62 0.73
从上述实验检测鉴定结果得知，本发明试剂盒检测结果与仪器检测结果有很好的相关性，表明本发明试剂盒检测结果可信度高，有利于普遍推广使用。
实施例6
检测饮用水、饮料、酒中邻苯二甲酸二丁酯的加标回收率实验
1.样品前处理
1.1瓶装或桶装饮用水
加入浓缩样品稀释液使其样品稀释成1.2倍即为待测液。
1.2瓶装或罐装饮料、酒
取5ml样品加入2ml色谱纯正己烷混匀后静止，取上清液1ml挥干，用1ml的25％的甲醇重溶即稀释成0.4倍的待测液。
2.饮用水、饮料、酒中邻苯二甲酸二丁酯的加标回收率实验
2.1步骤：每孔加入25μL处理过的饮用水/饮料/酒溶液、25μL指定浓度的DBP标准溶液(0.3ppm、1ppm)和50μL的DBP酶标二抗试剂，使之发生竞争反应。37℃温育40min后，从培养箱中取出，甩掉孔内溶液，同上洗涤，除去游离的DBP及抗体结合物。其余步骤与实施例3相同。
将实施例取得的吸光值转化为数值，计算结果如表4所示。
表4
Figure BSA00000866026000081
注：XXX+数字代表不同品牌名
表4显示：样品加标回收率在参考范围(80％～120％)内，符合实验要求，说明该发明技术准确度及精密度好。
实施例7
抗体的特异性测定
分别测定其他结构与DBP相似的邻苯二甲酸酯，如邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP)、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二辛酯(DEHP)、对羟基苯甲酸酯类、甲酸丁酯，与抗体的交叉反应情况，从而考察抗体的特异性。取上述5种邻苯二甲酸酯标准物质50μL分别溶解在少量无水乙醇中，用0.01mol/L pH7.5的PBS定容至100mL后，配制成一系列浓度(0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000nm/mL)。竞争反应时用这些标准品代替DBP竞争抗体结合位点，测定其吸光值，以吸光值为纵坐标，以标准品浓度的半对数值为横坐标绘制标准曲线，计算出上述5种标准物质的IC50，根据一下公式计算出各物质的交叉反应率。交叉反应率(CR)＝(IC50时DBP浓度/IC50时其他结构类似物浓度)×100％，计算结果如表5所示。
表5：五种邻苯二甲酸酯与抗DBP抗体的交叉反应率
结构类似物 交叉反应率(％)
邻苯二甲酸二异丁酯(DIBP) 36.9
邻苯二甲酸丁苄酯(BBP) 10.7
邻苯二甲酸二辛酯(DEHP) ＜0.01
对羟基苯甲酸酯类 ＜1
甲酸丁酯 ＜0.1
从表5的结果可知，五种邻苯二甲酸酯与抗体的交叉反应率比较小，说明试剂盒的特异性高。

Claims (9)

1.一种检测邻苯二甲酸二丁酯(DBP)酶联免疫检测试剂盒，所述试剂盒包括邻苯二甲酸二丁酯(DBP)标准溶液，固相载体，酶标记物，DBP抗试剂，底物显色液，包被液，酶稀释工作液，终止液及浓缩洗涤液。 
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为微孔板，所述微孔板由邻苯二甲酸二丁酯(DBP)抗原包被，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，所述DBP抗试剂为DBP抗体，所述底物显色液含四甲基联苯胺(TMB)，所述包被液为碳酸盐缓冲液，所述酶稀释工作液为含Tween20的PBS溶液，所述终止液含浓硫酸，所述浓缩洗涤液为磷酸盐缓冲液。 
3.根据权利要求2所述试剂盒，其特征在于，所述抗原为邻苯二甲酸二丁酯的高亲和力的完全抗原，所述酶标记物为辣根过氧化物酶标记的DBP抗抗体，DBP酶标物的浓度：250ng/mL，DBP抗体浓度：200ng/ml，样品稀释液：PH9.6。 
4.根据权利要求1～3任一项所述试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液含有： 
Figure FSA00000866025900011
。
5.根据权利要求4所述试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液含有： 
Figure FSA00000866025900012
。
6.一种检测邻苯二甲酸二丁酯(DBP)试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤： 
A.制备固相载体：将0.05mol/L的包被液与邻苯二甲酸二丁酯(DBP)完全抗原以适当比例混合，将混合液负载与载体上，用洗涤液清洗酶标板，拍干后用酶标板保护液封闭保护上述洗涤后的载体。 
B.制备辣根过氧化物标记的羊抗鼠二抗：采用棋盘滴定法选择最佳的酶标记物的工作浓度。酶标二抗溶于酶稀释液中以制备二抗工作液。 
C.制备DBP抗试剂：用一抗稀释液配制200ng/ml的一抗溶液。 
D.制备底物显色液：以DMSO为稀释液配制成较低浓度的TMB溶液即成。 
E.制备浓缩洗涤液： 
所述浓缩洗涤液含有： 
Figure FSA00000866025900013
F.制备邻苯二甲酸二丁酯(DBP)标准溶液：用含10％甲醇的超纯水稀释成0ppm、0.09ppm、0.27ppm、0.81ppm、2.43ppm、7.29ppm共六个浓度的DBP标准品。 
G.制备终止液： 
终止液含有： 
硫酸    15％(质量) 
H.制备样品提取液： 
所述样品提取液含有： 
正己烷    色谱纯 
甲醇      35％。 
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述浓缩液含有： 
。
8.一种检测邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的方法，所述方法包括以下步骤： 
A.样品前处理： 
a.瓶装或桶装饮用水 
加入浓缩样品稀释液使其样品稀释成1.5倍即为待测液。 
b.瓶装或罐装饮料、酒 
取5ml样品加入2ml色谱纯正己烷混匀后静止，取上清液1ml挥干，用1ml的35％的甲醇重溶即稀释成0.4倍的待测液。 
B.使用前述试剂盒及微孔板酶标分析仪检测定量样品液邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的含量。 
优选地，所述步骤B包括： 
a.加标准品或样品：加标准品或样品40～60μL到对应微孔板中，加入DBP抗试剂40～60μL/孔，再加入酶标物40～60μL/孔，混匀，用盖板膜盖板后室温或37℃反应30～60min。 
b.洗板：揭开膜后，将孔内液体甩干，用洗涤工作液200～400μL/孔，充分洗涤数次，每隔30s，用吸水纸拍干。 
c.显色：加入显色液50～100μL/孔，用盖板膜盖板后室温或37℃反应10～15min。 
d.测定：加入终止液40～60μL/孔，混匀，设定酶标仪于450nm处，测定每孔OD值。 
e.结果判定：在微孔板酶标仪上测定OD值，与根据标准品OD值的标准曲线对比，确定样品中邻苯二甲酸二丁酯(DBP)的含量。 
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤B中反应温度为37℃，所述DBP标准品或样品的加入体积50μL/孔，所述DBP抗试剂的加入体积为50μL/孔，所述酶标物加入体积为50μL/孔，所述显色液的加入体积为100μL/孔，所述洗涤工作液加入体积为300μL/孔，所述终止液的加入体积为50μL/孔，所述反应时间40min，所述显色时间10min。 
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