CN104569380A

CN104569380A - 一种用于检测黄曲霉毒素b1的方法及酶联免疫试剂盒

Info

Publication number: CN104569380A
Application number: CN201510036133.9A
Authority: CN
Inventors: 王飞
Original assignee: Tianjin Boke Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Tianjin Boke Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-01-23
Filing date: 2015-01-23
Publication date: 2015-04-29

Abstract

本发明公开一种检测样品中黄曲霉毒素B1含量的方法及酶联免疫试剂盒，采用直接竞争ELISA检测模式，采用高特异性、高亲合力的抗体，减少了操作步骤，提高了检测的灵敏度、准确度；采用包被抗原进行酶标板的包被，相对于抗体包被，更有利于达到较好的包被效果与较长的保存时间，从而提高了试剂盒检测的精密度与稳定性；另外试剂盒利用酶标板标记抗体技术，且采用改良后的过碘酸盐氧化法进行标记，将酶直接标记于黄曲霉毒素B1特异性抗体上，将黄曲霉毒素B1特异性抗体与酶两种最重要的反应物合二为一，提高了标记效率，节省了酶与抗体的用量，保证标记后酶与抗体具有良好的活性，无需在试剂盒内再配置抗抗体，大大降低了试剂盒的成。

Description

一种用于检测黄曲霉毒素B1的方法及酶联免疫试剂盒

技术领域

本发明涉及一种用于检测黄曲霉毒素B1的方法及酶联免疫试剂盒。

背景技术

黄曲霉毒素是曲霉菌属的黄曲霉和寄生曲霉的二次代谢产物。这些霉菌来源于潮湿的热带地区，大面积种植的粮食作物会被其污染。黄曲霉毒素是自然界最危险的致癌物质。

黄曲霉毒素中毒性最强的是黄曲霉毒素B1，其几乎一直和黄曲霉毒素B2、G1和G2共存。他们主要存在于玉米、花生、坚果、棉籽等食物中。美国食品和药品监督管理局(FDA)已对食品和饲料中的黄曲霉毒素最高允许水平作了规定，因此，准确测定黄曲霉毒素含量对于食品和饲料的品质监控具有重要意义。

目前，黄曲霉毒素B1国家标准所采取的方法是薄层分析、分光光度计法以及高效液相分析法。这些方法虽能达到国家标准检测要求，但检测花费比较昂贵，且不能大批量快速的检测，不能满足市场上实地检测的要求。近年来，我国科研工作者在黄曲霉毒素B1检测方面做了大量的工作，但都主要集中在理化检测方面，文献检索尚未发现关于黄曲霉毒素B1的EL ISA检测方法的报道，鉴于此，本发明研究和建立了黄曲霉毒素B1的直接竞争EL ISA检测方法，研制了检测黄曲霉毒素B1的方法及酶联免疫试剂盒。

发明内容

本发明的目的是为解决目前黄曲霉毒素B1检测费用比较昂贵，且不能大批量快速检测，不能满足实地检测要求的技术问题。

为了解决上述技术问题，本发明提供一种检测样品中黄曲霉毒素B1含量的方法，包括以下步骤：

1)用黄曲霉毒素B1特异性抗体包被酶标板；

2)加入标准品或待测样品以及酶标记的黄曲霉毒素B1半抗原，孵育，洗涤；

3)加入底物显色液显色；

4)加入反应终止液终止反应；

5)通过比较黄曲霉毒素B1标准品与待测样品的颜色，推测出待测样品中的黄曲霉毒素B1含量；或者，测定各孔的吸光度，建立黄曲霉毒素B1浓度相对于吸光度的标准曲线，并根据该标准曲线由待测样品的吸光度推算出待测样品中的黄曲霉毒素B1含量。

本发明还提供另一种检测样品中黄曲霉毒素B1含量的方法，包括以下步骤：

1)用黄曲霉毒素B1半抗原或黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物包被酶标板；

2)加入黄曲霉毒素B1标准品或待测样品；

3)加入黄曲霉毒素B1特异性抗体，孵育，洗涤；

4)加入酶标记的抗体，孵育，洗涤；

5)加入底物显色液显色；

6)加入反应终止液终止反应；

7)通过比较黄曲霉毒素B1标准品与待测样品的颜色，推测出待测样品中的黄曲霉毒素B1含量；或者，测定各孔的吸光度，建立黄曲霉毒素B1浓度相对于吸光度的标准曲线，并根据该标准曲线由待测样品的吸光度推算出待测样品中的黄曲霉毒素B1含量。

进一步地，在本发明所提供的检测样品中黄曲霉毒素B1含量的方法，还可以包括样品前处理步骤：

当所述样品为谷物时，所述样品前处理方法为：将样品粉碎后与样品稀释液以质量体积比1∶5-10混合均匀，强力振荡，离心后取上清液待测；

当所述样品为非奶油蛋糕时，所述样品前处理方法为：将样品粉碎后与50％甲醇以质量体积比为1∶3-6混合均匀，强力振荡，离心后取一定体积的下层液体，将下层液体与一定体积的样品稀释液以体积比1∶1-2混合均匀，取稀释后液体待测；

当所述样品为花生或奶油蛋糕时，所述样品前处理方法为：将样品粉碎后与石油醚以质量体积比为1∶3-6混合均匀，强力振荡，离心后取一定体积的下层液体，将下层液体与一定体积的样品稀释液以体积比1∶1-2混合均匀，取稀释后液体待测；

当所述样品为食用油时，所述样品前处理方法为：将样品与石油醚以质量体积比为1∶3-6混合均匀，再加入与样品质量体积比为3-6∶1的50％甲醇混合均匀，振荡，静置后取一定体积的下层液体，将下层液体与一定体积的样品稀释液以体积比1∶1-2混合均匀，取稀释后液体待测；

当所述样品为饲料、面粉或汤圆时，所述样品前处理方法为：将样品粉碎后与80％甲醇以质量体积比为1∶2-5混合均匀，强力振荡，离心后取一定体积的上层清液，将上层清液与一定体积的样品稀释液以体积比1∶5-10混合均匀，取稀释后液体待测；

当所述样品为啤酒时，所述样品前处理方法为：将样品去除气体后与样品稀释液以体积比1∶5-10混合均匀，振荡，取稀释后液体待测；

当所述样品为酱油、醋或葡萄酒时，所述样品前处理方法为：将样品与蒸馏水及三氯甲烷以体积比为1∶1：6-10混合均匀，振荡，离心后取一定体积的下层液体，用60℃氮气将下层液体吹干成干燥物，加入与下层液体的体积比为0.8-1:1的乙腈溶解干燥物，再加入与乙腈的体积比为8-10:1的的样品稀释液混合均匀，取稀释后液体待测。

本发明还提供一种检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，包括黄曲霉毒素B1半抗原和黄曲霉毒素B1的特异性抗体；所述特异性抗体为黄曲霉毒素B1的多克隆抗体或单克隆抗体。

进一步地，所述黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白偶联，得到的黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物作为包被原，所述特异性抗体为酶标记的；所述特异性抗体作为包被原，所述半抗原为酶标记的。

进一步地，所述黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白偶联，得到的黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物作为包被原；所述半抗原为酶标记的。

进一步地，还包括酶标板、黄曲霉毒素B1标准溶液、底物液、底物缓冲液、反应终止液、浓缩洗涤液、样品稀释液中的至少一种。

进一步地，所述浓缩洗涤液为pH值为7.2-7.6、含有终浓度为4.0-6.0％(质量)的吐温-20、0.1-0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，优选地，所述浓缩洗涤液为pH值为7.4、含有终浓度为5％(质量)的吐温-20的0.1mol/L磷酸盐缓冲液；所述反应终止液为1-2mol/L的硫酸溶液或2mol/L的盐酸溶液。

进一步地，所述酶标记中所用的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；

当标记酶为辣根过氧化物酶时，所述底物液为含有3,3,5,5-四甲基联苯胺或邻苯二胺的pH＝5.0的磷酸-柠檬酸缓冲溶液，所述底物缓冲液为含有过氧化氢或过氧化脲的pH＝5.0的磷酸-柠檬酸缓冲溶液；

当标记酶为碱性磷酸酯酶时，所述底物液为对硝基磷酸盐缓冲液，所述底物缓冲液为含有过氧化氢或氧化脲的pH＝5.0的磷酸-柠檬酸缓冲溶液。

进一步地，所述黄曲霉毒素B1半抗原或黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物、所述黄曲霉毒素B1的特异性抗体的任意一种已包被在酶标板上。

本发明采用直接竞争ELISA检测模式，采用高特异性、高亲合力的抗体，减少了操作步骤，提高了检测的灵敏度、准确度；采用包被抗原进行酶标板的包被，相对于抗体包被，更有利于达到较好的包被效果与较长的保存时间，从而提高了试剂盒检测的精密度与稳定性；另外本试剂盒利用酶标板标记抗体技术，且采用改良后的过碘酸盐氧化法进行标记，将酶直接标记于黄曲霉毒素B1特异性抗体上，将黄曲霉毒素B1特异性抗体与酶两种最重要的反应物合二为一，提高了标记效率，节省了酶与抗体的用量，保证标记后酶与抗体具有良好的活性，不仅大大简化了操作步骤和反应时间，减少了因操作复杂引起的误差，而且无需在试剂盒内再配置抗抗体，同时也节约了黄曲霉毒素B1特异性抗体与酶的用量，从而大大降低了试剂盒的成本。基于以上优点，本发明非常适用于黄曲霉毒素B1残留的痕量分析与批量检测，具有重要的现实意义。

附图说明

图1为黄曲霉毒素B1的ELISA检测标准曲线。

具体实施方式

现在结合附图对本发明作进一步详细的说明。这些附图均为简化的示意图，仅以示意方式说明本发明的基本结构，因此其仅显示与本发明有关的构成，且其不应理解为对本发明的限制。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、以黄曲霉毒素B1半抗原为包被原的试剂盒的制备及ELISA检测方法

一、检测原理：

当在酶标板微孔条上的包被原为黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物时，向酶标板微孔中加入标准品溶液或样品溶液后，加入黄曲霉毒素B1特异性抗体，样品中的黄曲霉毒素B1与酶标板上黄曲霉毒素B1偶联抗原竞争黄曲霉毒素B1特异性抗体，洗板，再加入酶标记抗体进行放大作用，用显色液显色，样品吸光度值与黄曲霉毒素B1的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样品中黄曲霉毒素B1的含量。同时也可根据酶标板上颜色的深浅，通过与系列浓度黄曲霉毒素B1标准品溶液颜色的比较粗略判断样品中黄曲霉毒素B1的浓度范围。

二、试剂盒一般可以包括：

1、包被有黄曲霉毒素B1半抗原的酶标板，酶标板采用96或40孔酶标板，所用的包被液为pH7.4、0.05mol/L的碳酸盐缓冲溶液，碳酸盐缓冲溶液含1-2g碳酸钠、2-4g碳酸氢钠和双蒸水1L，封闭液为pH7.4，含有5％山羊血清、10g/L酪蛋白的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

2、酶标记黄曲霉毒素B1抗体工作液：采用过碘酸盐法将酶与黄曲霉毒素B1抗体进行偶联得到的。所用标记酶可为辣根过氧化物酶或细菌中提取的碱性磷酸酯酶，本发明优选为辣根过氧化物酶，且采用改良后的过碘酸盐氧化法进行标记，提高了标记效率，节省了酶与抗体的用量，保证标记后酶与抗体具有良好的活性。

3、黄曲霉毒素B1特异性抗体工作液：可以为黄曲霉毒素B1多克隆抗体或黄曲霉毒素B1单克隆抗体工作液；用稀释液将黄曲霉毒素B1单克隆抗体稀释3000倍，得到特异性抗体工作液，所述稀释液为pH值为7.4、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。

4、黄曲霉毒素B1标准品溶液6瓶，1ml/瓶，浓度分别为0μg/mL、0.1μg/mL、0.3μg/mL、0.9μg/mL、2.7μg/mL、8.1μg/mL。配制标准品的溶液为终浓度为pH为7.4、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。

5、底物显色液：底物显色液为过氧化氢或过氧化脲、四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液，7ml/瓶，1瓶。

6、终止液：2mol/L的硫酸溶液或氢氧化钠溶液，7ml/瓶，1瓶。

7、浓缩洗涤液：pH值为7.4，含有在洗涤液中的终浓度为0.03％(质量百分含量)叠氮化钠、在洗涤液中的终浓度为0.05％(质量百分含量)吐温-20、0.02mol/L磷酸盐缓冲液；50ml/瓶，1瓶。

8、样品稀释液：pH为7.4，0.01mol/L磷酸盐缓冲液，70ml/瓶，1瓶。

实施例2、以黄曲霉毒素B1特异性抗体为包被原、抗原为酶标记物的试剂盒的制备及ELISA检测方法

一、以黄曲霉毒素B1特异性抗体为包被原、抗原为酶标记物的ELISA检测原理：

当在酶标板微孔条上的包被原为黄曲霉毒素B1特异性抗体时，向酶板微孔中加入标准品溶液或样品溶液后，及酶标记物，样品中的黄曲霉毒素B1与酶标记物竞争结合微孔板上黄曲霉毒素B1特异性抗体，洗板，显色，样品吸光值与样品或标准品中黄曲霉毒素B1的含量呈负相关，与标准曲线比较即可得出样品中黄曲霉毒素B1的含量。同时也可根据酶标板上颜色的深浅，通过与系列浓度黄曲霉毒素B1标准品溶液颜色的比较粗略判断样品中黄曲霉毒素B1的含量。

二、以黄曲霉毒素B1特异性抗体为包被原、抗原为酶标记物的试剂盒一般可以包括：

1、包被有黄曲霉毒素B1特异性抗体的酶标板，包被液的浓度可以为0.15-0.25μg/ml。

2、酶标记抗原工作液：酶标抗原为用辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1抗原；酶标抗原的稀释液为含有在稀释液中的终浓度为6-8％(质量百分含量)的山羊血清、pH为6-8、0.2-0.3mol/L磷酸盐缓冲液，酶标抗原工作稀释度为1∶1000。

3、黄曲霉毒素B1标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/mL、0.1μg/mL、0.3μg/mL、0.9μg/mL、2.7μg/mL、8.1μg/mL。配制标准品的溶液为终浓度为pH为7.0-7.5、0.1-0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。

4、底物显色液：底物显色液为过氧化氢或过氧化脲、四甲基联苯胺硫酸盐混合溶液，7ml/瓶，1瓶。

5、终止液：1-2mol/L盐酸或硫酸。

6、浓缩洗涤液：pH值为7.2-7.6、含有在洗涤液中的终浓度为1.0-2.0％(质量百分含量)的吐温-20、0.1-0.2mol/L的磷酸盐缓冲液；40ml/瓶，1瓶。

7、样品稀释液：pH为7.4，0.01mol/L磷酸盐缓冲液，70ml/瓶，1瓶。

三、以黄曲霉毒素B1特异性抗体为包被原、抗原为酶标记物的试剂盒的具体组成及其制备：

(一)组成

1、包被有黄曲霉毒素B1特异性抗体的酶标板，包被原的浓度可以为0.20μg/ml。

2、酶标抗原工作液：酶标抗原为用辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1与载体蛋白的偶联物；酶标抗原的稀释液为含有在稀释液中的终浓度为6％(质量百分含量)的山羊血清、pH为7.4、0.2mol/L磷酸盐缓冲液，酶标记抗体工作稀释度为1∶1000。

3、黄曲霉毒素B1标准品溶液6瓶，浓度分别为0μg/mL、1μ鸰_％3_jg/mL、3μg/mL、9μg/mL、27μg/mL、81μg/mL，配制标准品的溶液为在配制标准品溶液中终浓度为pH为7.2、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液。

5、终止液：2mol/L硫酸。

6、浓缩洗涤液：pH值为7.4，含有在洗涤液中的终浓度为1.5％(质量百分含量)吐温-20、0.2mol/L磷酸盐缓冲液；40ml/瓶，1瓶。

(二)制备

1、黄曲霉毒素B1抗原的制备：

a.10mg纯化的黄曲霉毒素B1和1.4mg无水碳酸钾溶于0.5ml无水丙酮，加入3mg 6-溴已酸乙酯，混合过夜，氮气吹干；

b.上述样品用3ml乙酸乙酯溶解，依次用1mol/L NaOH溶液，4mol/L溶液和蒸馏水多次洗涤，取上层液体，室温氮气吹干；

c.上述残余物再用3ml 1mol/L NaOH溶解，50℃搅拌30min，后用5ml浓盐酸酸化，再用3ml乙酸乙酯萃取两次，取有机层氮气吹干；

d.将上述六溴已酸乙酯法合成的半抗原溶于1mlDMF，加入50μmol DCC和50μmolNHS，4℃条件下反应过夜；

e.将上述反应液离心，取上清缓慢滴入到4ml0.25mg/mlBSA磷酸缓冲液中，4℃下反应4h，然后用0.1mol/L pH7.2的PBS透析3d，每天换透析液3次，分装冻干后，-20℃保存。

2、黄曲霉毒素B1鼠单克隆抗体制备：

动物免疫程序：采用Balb/c小鼠作为免疫动物，以黄曲霉毒素B1半抗原与牛血清白蛋白偶联物为免疫原，免疫剂量为60u g/只，首次免疫时将免疫原与等量的弗氏完全佐剂混合制成乳化剂，腹腔注射，间隔3周取相同剂量免疫原加等量弗氏不完全佐剂湿合乳化，加强免疫一次，四次免疫后腹腔加强免疫一次，3天后取脾细胞。

细胞融合与克隆化：取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按4：1比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，采用间接竞争酶联免疫方法测定细胞上清液，筛选阳性孔。利用显微克隆法对阳性孔进行克隆化，直到得到稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

细胞冻存和复苏：取处于对数生长期的杂交瘤细胞用冻存液制成5×106个/mL的细胞悬液，分装于冻存管，在-70℃超低温冰箱中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

单克隆抗体的制备与纯化：采用体内诱生法，将Balb/c 8周龄的小鼠腹腔注射杂交瘤细胞5×106个/只，7-10天后采集腹水。用免疫层析法进行腹水纯化，小瓶分装，-20℃保存。

3、酶标记黄曲霉毒素B1抗体的制备

将黄曲霉毒素B1抗体与辣根过氧化物(HRP)采用过碘酸钠法进行偶联。具体方法为：溶解5mgHRP于1ml超纯水中，加入新配制的0.1mol/L多碘酸钠75μL，置室温或4℃冰箱反应20min或30min。

反应完后装入透析袋，0.001mol/LpH＝4.0醋酸缓冲液4℃透析过夜，期间需要更换透析液几次。

将抗体用0.01mol/L碳酸缓冲液稀释至10mg/mL，另外用0.01mol/L碳酸缓冲液将活化好的HRP的溶液pH调至9.5。将0.5ml抗体加入HRP溶液中，置室温或4℃冰箱反应2h。

加入100μL 4mg/mL硼氢化钠，4℃冰箱反应2h。

对0.01mol/LPBS透析过夜，加入保存液-20℃保藏备用。

4、包被有黄曲霉毒素B1特异性抗体的酶标板的制备

用包被缓冲液将抗体稀释成0.15-0.25μg/ml，每孔加入100μl，37℃温育2小时，再4℃过夜，倾去包被液，用洗涤液洗涤5次，每次30秒，拍干，然后在每孔中入200-300μl封闭液，37℃温育1-2小时，倾去孔内液体拍干，干燥后用铝膜真空密保存。

其中，所用的包被缓冲液是pH值为9.5、0.05mol/L碳酸盐缓冲液；所用封闭液为pH7.4，含有5％山羊血清、10g/L酪蛋白的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

5、辣根过氧化物酶标记抗原：

将黄曲霉毒素B1半抗原与辣根过氧化物(HRP)采用过碘酸钠法进行偶联。具体方法为：

a)称取3mg黄曲霉毒素B1，溶于400ul水中，加入100μl 1M HCL于该溶液中，pH＜1.5；

b)称取3mg NaNO2，溶于200μl水中；

c)将b)缓慢加入a)中，在水浴条件下反应1小时，溶液由无色慢慢变为浅黄色；

d)称25mg HRP，溶于5ml PBS中；

e)将c)所得溶液分批滴加到d)中，保持pH7-8之间；

f)PBS透析过夜；

g)加入保存液，分装，-20℃备用。

使用辣根过氧化物酶标记单克隆抗体或多克隆抗体。

四、以黄曲霉毒素B1特异性抗体为包被原的酶联免疫试剂盒的应用

1、本发明提供待测样品前处理方法为：

1)谷物(大米、玉米、小米等低脂含量)(稀释倍数：8)

取1.0g粉碎的样品与8ml谷物稀释液混合均匀；

强力振荡3min；

5000g离心10min；

取上清液50μl待测。

2)非奶油蛋糕(稀释倍数：10)

取1.0g粉碎的样品与4ml 50％甲醇混合均匀；

强力振荡3min；

5000g离心10min；

取400μl下层液体，加入600μl样品稀释液进行稀释，充分混匀；

取50μl稀释后液体待测。

3)花生、奶油蛋糕(稀释倍数：10)

取1.0g粉碎的样品与4.0ml石油醚混合均匀；

加入4ml 50％甲醇混合均匀；

强力振荡3min；

5000g离心10min；

取50μl稀释后液体待测。

4)食用油(稀释倍数：10)

取1.0g样品与4.0ml石油醚混合均匀；

加入4ml 50％甲醇混合，振荡1min；

静置10min；

取50μl稀释后液体待测。

5)饲料、面粉、汤圆(稀释倍数：24)

取3.0g粉碎的样品与9.0ml 80％甲醇混合均匀；

强力振荡3min；

2000g离心10min；

取上层清液100μl，加入700μl样品稀释液，混合均匀；

取50μl稀释后液体待测。

6)啤酒(稀释倍数：5)

取200μl啤酒样品(去除CO2)，加入800μl啤酒稀释液；

振荡3min；

取50μl稀释后液体待测。

7)酱油、醋、葡萄酒(稀释倍数：8)

取0.5ml样品，加入0.5ml蒸馏水并加入4.0ml三氯甲烷；

混匀振荡3min，5000g离心10min；

取1.0ml下层液，60℃氮气吹干；

加入100μl乙腈溶解干燥物，并加入900μl样品稀释液，充分混匀；

取50μl稀释后液体待测。

2、检测

将所需试剂及微孔板取出，放置室温(20～25℃)30min以上，液体试剂使用前均须摇匀。取出所需数量的微孔板，将不用的微孔板与干燥剂一起重新真空密封，放置于2～8℃。不可冷冻。洗涤工作液在使用前也需回温。将样本和标准品对应微孔编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。加标准品/样本50l到对应的微孔中，加入酶标物50l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应15min。小心揭开盖板膜，用洗涤工作液充分洗涤，300l/孔，洗板5次，每次间隔30s，用吸水纸拍干。加入显色液100l/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应15min。加终止液50l/孔，轻轻振荡混匀，用酶标仪波长设定在450nm处，测定每孔吸光度值(OD值)。

3、检测结果分析

用所获得的每个浓度的标准品溶液的吸光度平均值(B)除以第一个标准品液(0标准)的吸光度值(B₀)，再乘以100％，得到百分吸光度值。

百分吸光度值(％)＝(B/Bo)×100；

公式中B为标准品溶液或样品溶液的平均吸光度值，B₀为0μg/L标准品溶液的平均吸光度值。以所获标准样品吸光值的平均值计算百分吸光度值，以百分吸光度值为纵坐标，黄曲霉毒素B1标准品溶液浓度的半对数为横坐标绘制标准曲线，求出直线方程。见附图1。

Y＝-17.468X+99.381；R2＝0.9980。用同样的方法计算样品溶液的百分吸光度值，根据方程式求出对应样品的黄曲霉毒素B1浓度。

检测结果的分析还可以利用计算机专业软件进行计算与分析，对黄曲霉毒素B1线性检测范围为0-81μg/mL，检测限为1μg/L，整个检测过程只需30min就可以完成。

以黄曲霉毒素B1标准品浓度(μg/mL)值为X轴，百分吸光度值为Y轴，绘制标准曲线图。用同样的办法计算样品溶液的百分吸光度值，相对应每一个样品的浓度，则可从标准曲线上读出样品中黄曲霉毒素B1的含量。本发明中检测结果的分析也可以采用回归方程法，计算出样品溶液浓度。本发明中检测结果的分析还可利用计算机专业软件，此法更便于大量样品的快速分析，整个检测过程只需60分钟就可以完成。

实施例3、试剂盒精密度、准确度、保存性试验

1、试剂盒的精密度试验

(1)标准品溶液重复性试验

从3批按照实施例2中的方法制备的酶标板中，各抽出10个微孔，测定20μg/mL标准品溶液的吸光度值(OD值)，重复10次，计算变异系数CV，结果见表1。

表1标准品溶液重复性试验

结果表明试剂盒标准品检测的批内变异系数<10％，批间变异系数(6％)小于20％。

(2)样本重复性试验

对阴性谷物，油脂制品进行添加，添加终浓度为10ug/ml。分别取三个不同批次的试剂盒各三个，每个浓度重复五次，分别计算变异系数，结果见表2-3。

表2谷物类食品的可重复性试验

表3油脂类食品的可重复性试验

结果表明谷物类食品和油脂制品的变异系数均小于20％，符合农业部关于酶免试剂盒精密度的相关规定。

2、试剂盒的准确度试验

以阴性谷物，大米、小米、玉米进行添加，添加终浓度为1ug/ml、5ug/ml，每个浓度做三孔平行，计算其添加回收率，见表4。

表4

3、试剂盒保存期试验

(1)将试剂盒放置于2～8℃，分别取0、2、4、6、8、10、11和12个月的试剂盒，对黄曲霉毒素B1标准品的吸光度值、50％抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。

(2)将试剂盒在37℃保存的条件下放置12天，每天对黄曲霉毒素B1标准样品的吸光度值、50％抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。

(3)将试剂盒在-20℃冰箱保存12天，每天对黄曲霉毒素B1标准样品的吸光度值、50％抑制浓度、添加回收率、批内变异系数各参数进行测定。

从结果可看出，经过三种条件保存试验，黄曲霉毒素B1标准样品的吸光度值下降小于5％，前OD不低于1.5；50％抑制率在7-11μg/mL之间；添加回收率在70～105％之间；批内变异系数小于10％；各项指标均符合质量要求，因此，试剂盒可以在2～8℃保存12个月。

以上述依据本发明的理想实施例为启示，通过上述的说明内容，相关工作人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的变更以及修改。本项发明的技术性范围并不局限于说明书上的内容，必须要根据权利要求范围来确定其技术性范围。

Claims

1.一种检测样品中黄曲霉毒素B1含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)用黄曲霉毒素B1特异性抗体包被酶标板；

3)加入底物显色液显色；

4)加入反应终止液终止反应；

2.一种检测样品中黄曲霉毒素B1含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)加入黄曲霉毒素B1标准品或待测样品；

3)加入黄曲霉毒素B1特异性抗体，孵育，洗涤；

4)加入酶标记的抗体，孵育，洗涤；

5)加入底物显色液显色；

6)加入反应终止液终止反应；

3.根据权利要求1或2所述的检测样品中黄曲霉毒素B1含量的方法，其特征在于，还包括样品前处理步骤，其中：

4.一种检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，其特征在于，包括黄曲霉毒素B1半抗原和黄曲霉毒素B1的特异性抗体；所述特异性抗体为黄曲霉毒素B1的多克隆抗体或单克隆抗体。

5.根据权利要求4所述的检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，其特征在于：

1)所述黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白偶联，得到的黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物作为包被原，所述特异性抗体为酶标记的；

2)所述特异性抗体作为包被原，所述半抗原为酶标记的。

6.根据权利要求4所述的检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，其特征在于：

1)所述黄曲霉毒素B1半抗原与载体蛋白偶联，得到的黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物作为包被原；

2)所述半抗原为酶标记的。

7.根据权利要求4-6任一项所述的检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，其特征在于：还包括酶标板、黄曲霉毒素B1标准溶液、底物液、底物缓冲液、反应终止液、浓缩洗涤液、样品稀释液中的至少一种。

8.根据权利要求7所述的检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述浓缩洗涤液为pH值为7.2-7.6、含有终浓度为4.0-6.0％(质量)的吐温-20、0.1-0.2mol/L的磷酸盐缓冲液，优选地，所述浓缩洗涤液为pH值为7.4、含有终浓度为5％(质量)的吐温-20的0.1mol/L磷酸盐缓冲液；所述反应终止液为1-2mol/L的硫酸溶液或2mol/L的盐酸溶液。

9.根据权利要求7所述的检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，其特征在于：：所述酶标记中所用的标记酶为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶；

10.根据权利要求4-6任一项所述的检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒，其特征在于：所述黄曲霉毒素B1半抗原或黄曲霉毒素B1半抗原-载体蛋白偶联物、所述黄曲霉毒素B1的特异性抗体的任意一种已包被在酶标板上。