CN1153908A - 一种检测黄曲霉毒素b1的试剂盒及其检测方法 - Google Patents
一种检测黄曲霉毒素b1的试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1153908A CN1153908A CN 96116802 CN96116802A CN1153908A CN 1153908 A CN1153908 A CN 1153908A CN 96116802 CN96116802 CN 96116802 CN 96116802 A CN96116802 A CN 96116802A CN 1153908 A CN1153908 A CN 1153908A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reagent
- afb
- enzyme
- add
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒及其检测方法用于对粮食、饲料及食品中黄曲霉毒素B1含量的检测。本发明配制试剂盒，并采用酶联免疫吸附(ELISA)竞争法检测AFB1，利用抗原免疫家兔，获得含有抗体的血清。经过生化提纯分离出家兔免疫球蛋白将抗体吸附于酶标板孔中，温育后洗涤，加入样品提取液及酶标抗原，使两者进行反应，洗涤，加酶底物反应显色。本发明灵敏度高，特异性好，操作简便，结果易判读，价格低廉，尤其适用于粮食，食品，饲料中黄曲霉毒素B1的检测。
Description
一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒及其检测方法，用于对粮食、饲料及食品中黄曲霉毒素B1(AFB1)含量的检测。
由于黄曲霉毒素具有毒性大，致癌力强，含量低(通常0-200μg/Kg，即0-200PPb)和结构相似等特点，这就要求检测方法灵敏度高，特异性强，集分离与检测为一体，目前黄曲霉毒素的测定方法有多种，概括起来有化学分析法，仪器分析法，生物鉴定法及免疫分析法等。上述这些分析方法也是紧密相联的，它们之间没有绝然的分界线。免疫分析法中的酶联免疫吸附法(ELISA)是70年代出现的新的免疫测定技术。正如1994年《粮食与饲料工业》杂志中已报道，酶联免疫吸附法其原理是抗原(或抗体)吸附于载体上的免疫吸附剂和用酶标记的抗体(或抗原)与标本中的待测物(抗原或抗体)起特异的免疫学反应，最后用测定酶活力的方法来增加测定的敏感度。这一技术应用于黄曲霉毒素的测定大体为二类：一是用双抗体夹心法检测样本中的黄曲霉毒素，如Sashidha将黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白涂覆于酶标板孔穴中，经初步培养后，加兔的AFB1抗体和游离AFB1，用磷酸4-硝基苯酯作基质，以碱性磷酸酶-抗兔免疫球蛋白检测第一抗体的结合：二是用竞争法检测样本中的黄曲霉毒素，如在涂抗体的孔穴中，用乙烷萃取黄曲霉毒素B1，并与结合辣根过氧化物酶的黄曲霉素B1交联物混合，37℃下培养10分钟后，用水洗除去未结合的黄曲霉毒素B1交联物，再加底物，在波长405nm进行检测。为得到特异性更强的ELISA法，发展了AFB1单克隆抗体的酶标记免疫吸附测定法，Kawamura用间接和直接竞争ELISA法分析AFB1检出限小于1ng。上述所讲的黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(酶标抗原)的中间体是用Adsorbosil-柱层析法来提纯，部分材料需进口，操作要求较严格，费用也较高。如采用薄层层析制备来提纯，其中的硅胶吸附能力较强，在层析分离产物AFB1-Oxime和原料AFB1时，洗脱比较困难，其产率低，而且洗脱时间较长。
本发明的目的在于提供一种结构简单，使用方便，廉价，携带方便的检测黄曲霉毒素B1的试剂盒。
本发明的另一个目的是克服上述不足之处，从而提供一种样品前处理简单，提取后就可直接测定，不需要净化过程；一次可测定大量样本，而且简便，快速、灵敏、准确、廉价的检测黄曲霉毒素B1的方法。
本发明试剂盒主要由盒体(1)，酶标板(2)，A试剂瓶(稀释液)(3)，B试剂瓶(标准AFB1试剂)(4)，C试剂瓶(酶标抗原试剂)(5)，D试剂瓶(酶标抗原稀释液)(6)，E试剂瓶(含吐温20的PBS缓冲液)(7)，F试剂瓶(四甲基联苯胺试剂)(8)、G试剂瓶(H2O2溶液)(9)，H试剂瓶(醋酸钠-柠檬酸缓冲液)(10)，I试剂瓶(硫酸溶液)(11)、海棉托架(12)所组成，海棉托架(12)上制有孔及凹槽，上述A、B、C、D、E、F、G、H、I试剂瓶安装在海棉托架(12)的孔和凹槽内，海棉托架(12)酶标板(2)安装在盒体(1)内。
本发明主要采用酶联免疫吸附(ELISA)竞争法来检测AFB1。采用ELISA竞争法的技术主要有两个方面。特异性抗体(多克隆或单克隆)的制备，利用抗原免疫家免，获得含有抗体的血清，经过生化提纯分离免疫球蛋白；第二，抗原-酶交联物(即酶标抗原)的制备。由于AFB1(黄曲霉毒素B1)不脂直接与酶结合，必须先将AFB1修饰，引入一个-COOH修饰基团，然后和酶的氨基反应，使其具有酶的活性，即能催化底物的显色反应。
首先将多克隆(或单克隆)抗体包被在酶标板(2)上，酶标板(2)放在4℃左右冰箱过夜。再进行试剂及酶底物混合液的配制，在B试剂(标准AFB1中)加20-30mlA试剂混匀，在C试剂(酶标抗原)中加入10-20mlD试剂(无酶标抗原稀释液)，溶解、混匀，在2-8℃下保存，E试剂(含吐温20的PBS固体)中加入蒸馏水配制成洗涤液，用E洗涤液洗酶标板2-4次，洗液不得溢出，每次间隔0.5-1.5分钟，放在吸水纸上拍干，在酶标板小孔中加入配制好的试剂及样品稀释液进行竞争免疫反应，在37-38℃放置28-35分钟，再用洗涤液洗板4-6次，每次间隔1-2分钟，拍干，再加入酶底物混合液，混匀，在37-38℃放置13-18分钟，显色，最后加入I终止液(硫酸溶液)中止反应，测定。
黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备：
1、黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(B1-Oxime)的制备：(中间体)
(1)合成：
取20-30mg黄曲霉毒素B1，30-40mg羧甲基羟胺半盐酸盐于圆底瓶中，加入10-20ml吡啶甲醇的反应溶剂，回流2-4小时，再室温搅拌15-20小时，减压挥干溶剂，得固体。
(2)、提纯：
在上述固体中加入5-10ml蒸馏水，采用0.1-0.5N碳酸氢钠调pH至碱性，转移至分液漏斗中，2-5ml氯仿萃取，静置分层，得水相层，再用0.1-0.5N盐酸调水相层至酸性，用4-8ml氯仿萃取，得氯仿层，用0.5-2ml蒸馏水洗氯仿层，弃去水层，减压蒸馏，挥干溶剂，得淡桔黄色固体。
2、黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备：
(1)、合成：取0.5-1.0mg黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)淡桔黄色固体溶于10-20ml的乙醇液中，混匀，依次加入150-200mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐及5-10mg的辣根过氧化物酶，慢速搅拌15-30分钟，再加150-200mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐，在2-8℃搅拌15-18小时，并在5000-10000转/分钟，离心5-10分钟，取上清液。
(2)、提纯：
将上述上清液通过pH7.0-8.0磷酸盐缓冲液平衡的Sephadex层析柱，并用该缓冲液洗脱，部分收集器收集，洗脱液分别在波长350-370nm和390-420nm处测定吸光度值，绘制洗脱曲线，收集双峰并存的洗脱液，在pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液透析3-5天，得含黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)的溶液，小瓶分装冷冻干燥，得粉状固体。
实施例1：
本发明主要采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测黄曲霉毒素B1的含量。具体操作步骤如下：
一、多克隆抗黄曲霉毒素B1抗体的制备
1、免疫用抗原：首次免疫用5ml黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白与5ml完全福氏佐剂混合后作为免疫抗原，加强免疫时取5ml黄曲霉毒素B1-牛血清白蛋白与5ml不完全福氏佐剂混合作为免疫抗原。
2、免疫程序：先将购买的新西兰大白免饲养数周后，在背部脊柱两侧脱毛区取5-10个接种点，每点内接种完全佐剂抗原0.2-0.3ml，然后每隔4周四肢肌肉加强接种不完全佐剂抗原1ml，共加强免疫2次。
3、采血：
首先免疫前可取耳缘静脉采血，以后每次加强免疫前各采血1次，第二次加强免疫后第四周再采血一次，测定血清抗体效价后颈动脉放血。
4、分离血清：
分别以30％和60％的硫酸铵分级沉淀血清中杂蛋白与抗体免疫球蛋白，离心后得含有抗黄曲霉毒素B1多克隆抗体的溶液。
二、单克隆抗黄曲霉毒素B1的制备：
1、抗原制备：
通过黄曲霉毒素B1的肟化反应和交联反应制备免疫用人工抗原黄曲霉毒素B1-羧甲基肟-牛血清白蛋白人工抗原(AFB1-Oxime-BSA)。
2、免疫动物：
采用BALB/C小白鼠作为免疫动物，免疫抗原剂量为10-100ng，经腹腔注射，在4-6周后静脉加强免疫2-4次，取脾细胞。
3、细胞融合：
取对数生长期的骨髓瘤细胞SP2/0与脾细胞在聚乙二醇(4000)的溶剂中进行细胞融合，在HAT培养液中作选择培养。
4、杂交瘤细胞克隆化：
采用有限稀释法筛选杂交瘤细胞，直至得到完全同质的单克隆抗体和稳定的单克隆杂交瘤细胞株。
6、单克隆抗体的保存：
在液氮-20℃下保存，37℃水浴快速解冻，使细胞存活率保持80％以上。
7、单克隆抗体大量生长及提纯：在小鼠腹腔内注射一定量的杂交瘤细胞，采集腹水，经HPLC提纯后小瓶分装待用。
三、黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备：(试剂盒中C试剂瓶)。
1、黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)的制备
(1)：合成：
称取20mg黄曲霉毒素B1(AFB1)和30mg羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)放在30-50ml圆底蒸馏瓶中，再加入10ml吡啶∶甲醇(1∶3-1∶6)的反应溶剂，回流2小时，再室温搅拌15小时。当黄曲霉毒素B1(AFB1)已大部分转化为其衍生物羧甲基黄曲霉毒素肟时，停止反应，减压挥干反应溶剂，得黄色固体。
(2)、提纯：
在含上述黄色固体的圆底蒸馏瓶中，加入5ml蒸馏水，用0.1N碳酸氢纳(NaHCO3)调PH至碱性，使固体全部溶解，然后转移至分液漏斗中，用2ml氯份(CHCl3)萃取，静置分层，弃氯仿(CHCl3)层，得水相层，再用0.1N盐酸(HCl)调水相层至酸性，出现沉淀，用4ml氯仿(CHCl3)萃取，沉淀溶解在氯仿(CHCl3)层中，得氯仿(CHCl3)层，用0.5ml蒸馏水洗氯仿层，弃去水层，减压蒸馏挥干溶剂得淡桔黄色固体。
2、黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)(酶标抗原)的制备。
(1)、合成：
称取上述0.5mg黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)固体溶于10ml的乙醇溶液中，混匀，依次加入150mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)和5.0mg的辣根过氧化物酶(HRP)混匀，慢速搅拌15分钟，再加入150ml乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，在2℃温度下搅拌15小时，在转速为5000-10000转/分下离心5分钟，取上清液。
(2)、提纯：
将上清液通过pH7.0磷酸盐缓冲液(PBS)平衡的Sephadex层析柱，再用该缓冲液洗脱，采用BS-100A自动部分收集器收集。洗脱液分别在波长350-370nm和390-420nm处测定吸光度值，绘制洗脱曲线，见图3所示。收集双峰并存的洗脱液，在pH7.0的磷酸盐缓冲液(PBS)透折3天，得含AFB1-HRP的溶液，小瓶分装冷冻干燥得粉状固体，为黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)。
图4为酶标抗原合成原理反应式：
可以看出，其反应分两步进行，即AFB1-Oxime的肟化反应和AFB1-O-HRP交联反应。
具体检测步骤如下：
将多克隆(或单克降)抗黄曲霉毒素B1抗体包装在酶标板上，然后进行样品的处理。
1、先将样品粉碎至20目，称取5g样品于磨口的50ml试管中，加入提取液25ml(甲醇∶水为7∶3)，加塞振荡5-10min，过滤。滤液按下表用A试剂适当稀释。
样品 滤液量(ml) A试剂量(ml) 稀释倍数豆类发酵食品，其它粮食 0.1 0 0大米食用油、肉鸡、生长 0.1 0.1 1∶1鸡饲料玉米(食品用)、混合、 0.05 0.15 1∶3配合饲料玉米(饲料用)、花生饼、粕 0.02 0.18 1∶9
2、试剂的配制：
(1)标准黄曲霉毒素B1(AFB1)：B试剂中加入稀释液A试剂20ml混匀；(2)酶标抗原(AFB1-HRP)：C试剂中加入10ml酶标抗原稀释液D试剂，溶解，混匀，在2-8℃下保存；(3)在含0.05％吐温-20(Tween-20)的磷酸盐(PBS)的E试剂中加入200ml蒸馏水配制洗涤液；(4)底物混合液配制：根据每次测定所需底物混合液用量，用醋酸钠-柠檬酸缓冲液H试剂：四甲基联苯胺F试剂按H∶F＝7-9.5∶3-0.5的比例稀释F试剂，再按每毫升此稀释液需加入14μl的双氧水G试剂配成底物混合液(临用前半小时内配制)。
3、将试剂盒平衡至室温
4、用E洗涤液洗酶板2次，洗液不得溢出，每次间隙0.5分钟，放在吸水纸上拍干。
5、反应物组成：按下表所列，依次加入配制好的试剂及待测样品稀释液。1-3号孔为标准对照孔。4-12号孔为样品孔。
| 次序 | 加入量 | 孔号 |
| 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 | ||
| 1 | 25μl | A、B、A …… 稀释后样品液 ……… |
| 2 | 摇匀 | |
| 3 | 25μl | C C D C C C C C C C C C |
| 4 | 摇匀 |
6、反应：按上表所列加入各试剂在38℃放置28分钟。
7、洗涤显色：用E洗涤液洗酶标板4次，加入50μl底物混合液，混匀，在38℃放置13分钟。
8、中止：加底物液I试剂50μl中止反应。
9、测定：先比较1-3号孔颜色，若1号最深，2号孔次之，3号孔按近无色，说明标准准确。
(1)、目视法：比较样品孔与2号孔颜色，若浅者，则为阳性，反之为阴性，若颜色接近，则用仪器法或国标法验证。
(2)、仪器法：用酶标仪(通用)测定吸光度值，通过标准曲线确定样品中黄曲霉毒素B1的含量(定量)。
10、结果判读：若样品经目视法为阳性
则AFB1含量如下表：
稀释倍数 AFB1含量(PPb)
0 ＞5
1∶1 ＞10
1∶3 ＞20
1∶9 ＞50
本发明试剂盒体(1)内装有海棉托架(12)，酶标板(2)，有塑料支架和各自分开的带孔穴的塑料条组成，海棉托架(12)上制有孔及凹槽，孔及凹槽内放有A试剂瓶(稀释液)(3)，B试剂瓶(标准AFB，试剂)(4)，C试剂瓶(酶标抗原试剂)(5)，D试剂瓶(酶标抗原稀释液试剂)(6)，E试剂瓶(含吐温20的PBS固体)(7)，F试剂瓶(四甲基联苯胺)(8)，G试剂瓶(H2O2溶液)(9)，H试剂瓶(醋酸钠-柠檬酸缓冲液)(10)，I试剂瓶(硫酸溶液)(11)。试剂盒放在2-8℃贮存，忌0℃下冻存，有效期12个月。详见：图1、图2
实施例2：
1、多克隆(或单克隆)抗黄曲霉毒素B1抗体的制备与实施例1相同，略。
二、黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备：(试剂盒中C试剂瓶)。
1、黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)的制备：
(1)、合成：
称取25mg黄曲霉毒素B1(AFB1)，35mg羧甲基羟胺半盐酸醇盐(CMO)回流3小时，室温搅拌18小时，其它工艺条件操作步骤同实施例1。
(2)、提纯：
蒸馏水取7.5ml，0.3N碳酸氢钠(NaHCO3)，3ml氯仿(CHCl3)萃取，0.3N盐酸(HCl)
再取6ml氯仿(CHCL3)萃取，用1.2ml蒸馏水洗氯仿层，其它工艺流程条件操作步骤相同于实施例1。
2，黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备。
(1)、合成：
取0.75mg上述固体，乙醇溶液15ml
175mg乙二醇3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)7.5mg辣根过氧化物酶(HRP)，搅拌25分钟再加入175mg(EDC·HCL)乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸胺，4℃搅拌16.5小时，离心7.5分钟，其它工艺条件操作步骤同实施例1。
(2)、提纯：
pH7.5透析4天，其它工艺条件、操作步骤同实施例1。
检测步骤：
样品处理同实施例1。
试剂配制：B试剂中加入A试剂25ml
C试剂中加入15mlD试剂，洗涤液洗酶板3次，每次间隔1分钟，在37.5℃下放置30分钟，第二次洗酶板5次，每次间隔1.5分钟，在37.5℃下放置15分钟，其它工艺条件操作步骤同于实施例1。
实施例3
一、多克隆(或单支隆)抗黄曲霉毒素B抗体的制备同实施例1，略。
二、黄曲霉毒素B1-辣根过氧化酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备(试剂盒中C试剂瓶)
1、黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)的制备：
(1)、合成
称取30mg黄曲霉毒素B1(AFB1)，40mg羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)，回流4小时，室温搅拌20小时，其它工艺条件操作步骤相同实施例1
(2)、提纯：
蒸馏水取10ml，0.5N碳酸氢钠(NaHCO3)，5ml氯仿(CHCl3)萃取，0.5N盐酸(HCl)，再取6ml氯仿(CHCl3)萃取，用2ml蒸馏水洗氯仿层，其它工艺条件制作步骤相同于实施例1。
2、黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备：
1、合成：
取1.0mg上述固体，乙醇溶液20ml，200mg乙二醇3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐(EDC· HCl)、10mg辣根过氧化物酶(HRP)，搅拌30分钟，再加入200mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)，8℃搅拌18小时，离心10分钟，其它操作步骤同于实施例1。
(2)、提纯
pH8.0透析5天，其它工艺条件制作步骤相同于实施例1
检测步骤
样品处理同于实施例1
试剂配制：B试剂中加入A试剂30ml，C试剂中加入20mlD试剂，洗涤液洗板4次，每次间隔1.5分钟，在37℃下放置35分钟，第二次洗酶板6次，每次间隔2分钟，在37℃下放置18分钟，其它操作步骤同于实施例1。
本发明与已有技术相比具以下优点：1、试剂盒结构简单，携带使用配制方便，2、灵敏度高，特异性好，操作简单、方便，3、检测结果易判读，4、试剂来源方便，价格低廉，尤其适用于粮食、食品、饲料中黄曲霉毒素B1的检测。
Claims (6)
1. 一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒由盒体(1)，酶标板(2)、A试剂瓶(稀释液)(3)，B试剂瓶(标准AFB1试剂)(4)，C试剂瓶(酶标抗原试剂)(5)，D试剂瓶(酶标抗原稀释液试剂)(6)，E试剂瓶(含吐温-20的PBS固体)(7)，F试剂瓶(四甲基联苯胺试剂(8)，G试剂瓶(H2O2溶液)(9)、H试剂瓶(醋酸钠-柠檬酸缓冲液)(10)，I试剂瓶(硫酸溶液)(11)，海棉托架(12)所组成，海棉托架(12)内装有上述A、B、C、D、E、F、G、H、I试剂瓶，海棉托架(12)及酶标板(2)均安装在盒体(1)内。
2、根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，其特征在于所述的海棉托架(12)上制有孔和凹槽。
3、根据权利要求1所述的检测黄曲霉毒素B1的试剂盒，其特征在于所述的酶标板(2)有塑料支架和各自分开的带孔穴的塑料条组成。
4、一种检测黄曲霉毒素B1的试剂盒及用该试剂盒检测黄曲霉毒素B1的方法，先进行样品处理，将样品粉碎至20目，取样品。放在50ml试管中，加入提取液(甲醇∶水为7∶3)。加塞振荡5-10分钟，过滤，滤液采用A试剂液适当稀释，其特征为：首先采用多克隆(或单克隆)抗体包被在酶标板(2)上，酶标板(2)放在4℃冰箱过夜，然后进行试剂及酶底物混合液的配制：在B试剂(标准AFB1)中加20-30mlA试剂混匀，在C试剂(酶标抗原)中加入10-20mlD试剂(酶标抗原稀释液)，溶解混匀，在2-8℃下保存，E试剂(含吐温-20的PBS固体)中加入蒸馏水配制成洗涤液，用E洗涤液洗酶板2-4次，洗液不得溢出，每次间隔0.5-1.5分钟，放在吸水纸上拍干，在酶板小孔中加入配制好的试剂及样品稀释液进行竞争免疫反应，在37-38℃放置28-35分钟，再用洗涤液洗板4-6次，每次间隔1-2分钟，拍干，再加入酶底物混合液，混匀，在37-38℃放置13-18分钟显色，最后加入I终止液(硫酸溶液)中止反应，测定。
5、根据权利要求4所述的检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征是C试剂为黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原，(酶标抗原)分二步进行制备：
①黄曲霉毒素B1-羧甲基肟(AFB1-Oxime)(中间体)的制备：
(1)、合成：
取20-30mg黄曲霉毒素B1、30-40mg羧甲基羟胺半盐酸盐于圆底蒸馏瓶中，加入10-20ml吡啶甲醇的反应溶剂，回流2-4小时，再室温搅拌15-20小时，减压挥干溶剂，得固体。
(2)，提纯：
在上述固体中加入5-10ml蒸馏水，采用0.1-0.5N碳酸氢钠调pH至碱性，转移至分液漏斗中，2-5ml氯仿萃取，静置分层，得水相层，再用0.1-0.5N盐酸调水相层至酸性，再用4-8ml氯仿萃取，得氯仿层，用0.5-2ml蒸馏水洗氯仿层，弃去水层，减压蒸馏，挥干溶剂得淡桔黄色固体
②黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)酶标抗原的制备。
(1)、合成：
取0.5-1.0mg黄曲霉毒素B-羧甲基肟(AFB1-Oxime)淡桔黄色固体溶于10-20ml的乙醇液中，混匀，依次加入150-200mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐及5-10mg的辣根过氧化物酶，混匀，慢速搅拌15-30分钟，再加入150-200mg乙二胺3，3-二甲胺丙基-碳化二亚胺盐酸盐，在2-8℃搅拌15-18小时，并在5000-10000转/分钟，离心5-10分钟，取上清液。
(2)、提纯：
将上述上清液通过pH7.0-8.0磷酸盐缓冲液平衡的Sephadex层析柱，再用该缓冲液洗脱，部分收集器收集，洗脱液分别在波长350-370nm和390-420nm处测定吸光度值，绘制洗脱曲线，收集双峰并存的洗脱液，在pH7.0-8.0的磷酸盐缓冲液透析3-5天，将含黄曲霉毒素B1-辣根过氧化物酶(AFB1-HRP)的溶液，小瓶分装冷冻干燥得粉状固体。
6、根据权利要求4所述的的检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于所述的底物混合液，采用H试剂(醋酸钠-柠檬酸缓冲液)和F试剂(四甲基联苯胺)按H∶F＝7-9.5∶3-0.5和每毫升此稀释液加14μlG试剂(H2O2)混合配制而成。(临用前半小时内配制)。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 96116802 CN1153908A (zh) | 1996-01-04 | 1996-01-04 | 一种检测黄曲霉毒素b1的试剂盒及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN 96116802 CN1153908A (zh) | 1996-01-04 | 1996-01-04 | 一种检测黄曲霉毒素b1的试剂盒及其检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1153908A true CN1153908A (zh) | 1997-07-09 |
Family
ID=5123758
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN 96116802 Pending CN1153908A (zh) | 1996-01-04 | 1996-01-04 | 一种检测黄曲霉毒素b1的试剂盒及其检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1153908A (zh) |
Cited By (19)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1300584C (zh) * | 2002-12-05 | 2007-02-14 | 国家饲料质量监督检验中心(北京) | 盐酸克伦特罗检测试剂条及其制造方法 |
| CN1322010C (zh) * | 2005-04-26 | 2007-06-20 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种鼠抗黄曲霉毒素b1腹水多克隆抗体的制备方法 |
| CN100348979C (zh) * | 2004-06-11 | 2007-11-14 | 中国兽医药品监察所 | 一种检测链霉素药物的酶联免疫试剂盒 |
| CN101881771A (zh) * | 2010-05-15 | 2010-11-10 | 福建农林大学 | 基因工程单链抗体检测黄曲霉毒素b1的试剂盒及方法 |
| CN102072958A (zh) * | 2010-11-09 | 2011-05-25 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 检测黄曲霉毒素b1的化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备、使用方法 |
| CN102590519A (zh) * | 2012-02-24 | 2012-07-18 | 北京维德维康生物技术有限公司 | 检测黄曲霉素的试剂盒或试纸条 |
| CN103018458A (zh) * | 2012-12-06 | 2013-04-03 | 北京普赞生物技术有限公司 | 超灵敏黄曲霉毒素b1酶联免疫检测试剂盒 |
| CN103193884A (zh) * | 2013-04-19 | 2013-07-10 | 中华人民共和国台州出入境检验检疫局 | 一种检测杂色曲霉素的elisa试剂盒 |
| CN103513035A (zh) * | 2012-06-28 | 2014-01-15 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 一种检测黄曲霉毒素m1的试纸条及方法 |
| CN103808935A (zh) * | 2012-11-07 | 2014-05-21 | 江苏维赛科技生物发展有限公司 | 一种用于检测赭曲霉毒素的elisa试剂盒的制备 |
| CN103808934A (zh) * | 2012-11-07 | 2014-05-21 | 江苏维赛科技生物发展有限公司 | 用于检测呕吐毒素的elisa试剂盒的制备 |
| CN104569380A (zh) * | 2015-01-23 | 2015-04-29 | 天津伯克生物科技有限公司 | 一种用于检测黄曲霉毒素b1的方法及酶联免疫试剂盒 |
| CN106290889A (zh) * | 2016-08-16 | 2017-01-04 | 广东产品质量监督检验研究院 | 黄曲霉毒素b1的检测方法 |
| CN106290821A (zh) * | 2016-08-09 | 2017-01-04 | 安徽青松食品有限公司 | 一种花生糖中黄曲霉毒素潜在污染的鉴定方法 |
| CN106525797A (zh) * | 2016-11-09 | 2017-03-22 | 百奥森（江苏）食品安全科技有限公司 | 一种食品中黄曲霉素b1的检测试剂盒 |
| CN106645688A (zh) * | 2016-11-09 | 2017-05-10 | 百奥森（江苏）食品安全科技有限公司 | 一种快速检测黄曲霉毒素b1的方法及试剂盒 |
| CN107490551A (zh) * | 2016-06-13 | 2017-12-19 | 武汉市农业科学技术研究院畜牧兽医科学研究所 | 一种生鲜乳是否合格的快速检测方法 |
| CN110568046A (zh) * | 2019-09-16 | 2019-12-13 | 南京工业大学 | 基于hrp催化聚苯胺原位生成用于afb1的检测方法 |
| CN113125734A (zh) * | 2021-04-19 | 2021-07-16 | 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 | 一种直接竞争elisa法快速检测afb1的方法及其试剂盒 |
-
1996
- 1996-01-04 CN CN 96116802 patent/CN1153908A/zh active Pending
Cited By (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1300584C (zh) * | 2002-12-05 | 2007-02-14 | 国家饲料质量监督检验中心(北京) | 盐酸克伦特罗检测试剂条及其制造方法 |
| CN100348979C (zh) * | 2004-06-11 | 2007-11-14 | 中国兽医药品监察所 | 一种检测链霉素药物的酶联免疫试剂盒 |
| CN1322010C (zh) * | 2005-04-26 | 2007-06-20 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种鼠抗黄曲霉毒素b1腹水多克隆抗体的制备方法 |
| CN101881771B (zh) * | 2010-05-15 | 2013-02-27 | 福建农林大学 | 基因工程单链抗体检测黄曲霉毒素b1的试剂盒及方法 |
| CN101881771A (zh) * | 2010-05-15 | 2010-11-10 | 福建农林大学 | 基因工程单链抗体检测黄曲霉毒素b1的试剂盒及方法 |
| CN102072958A (zh) * | 2010-11-09 | 2011-05-25 | 北京科美东雅生物技术有限公司 | 检测黄曲霉毒素b1的化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备、使用方法 |
| CN102590519B (zh) * | 2012-02-24 | 2014-06-25 | 北京维德维康生物技术有限公司 | 检测黄曲霉素的试剂盒或试纸条 |
| CN102590519A (zh) * | 2012-02-24 | 2012-07-18 | 北京维德维康生物技术有限公司 | 检测黄曲霉素的试剂盒或试纸条 |
| CN103513035B (zh) * | 2012-06-28 | 2016-09-21 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 一种检测黄曲霉毒素m1的试纸条及方法 |
| CN103513035A (zh) * | 2012-06-28 | 2014-01-15 | 北京勤邦生物技术有限公司 | 一种检测黄曲霉毒素m1的试纸条及方法 |
| CN103808934A (zh) * | 2012-11-07 | 2014-05-21 | 江苏维赛科技生物发展有限公司 | 用于检测呕吐毒素的elisa试剂盒的制备 |
| CN103808935A (zh) * | 2012-11-07 | 2014-05-21 | 江苏维赛科技生物发展有限公司 | 一种用于检测赭曲霉毒素的elisa试剂盒的制备 |
| CN103018458A (zh) * | 2012-12-06 | 2013-04-03 | 北京普赞生物技术有限公司 | 超灵敏黄曲霉毒素b1酶联免疫检测试剂盒 |
| CN103018458B (zh) * | 2012-12-06 | 2015-06-24 | 北京普赞生物技术有限公司 | 超灵敏黄曲霉毒素b1酶联免疫检测试剂盒 |
| CN103193884A (zh) * | 2013-04-19 | 2013-07-10 | 中华人民共和国台州出入境检验检疫局 | 一种检测杂色曲霉素的elisa试剂盒 |
| CN104569380A (zh) * | 2015-01-23 | 2015-04-29 | 天津伯克生物科技有限公司 | 一种用于检测黄曲霉毒素b1的方法及酶联免疫试剂盒 |
| CN107490551A (zh) * | 2016-06-13 | 2017-12-19 | 武汉市农业科学技术研究院畜牧兽医科学研究所 | 一种生鲜乳是否合格的快速检测方法 |
| CN107490551B (zh) * | 2016-06-13 | 2020-03-20 | 武汉市农业科学技术研究院畜牧兽医科学研究所 | 一种生鲜乳是否合格的快速检测方法 |
| CN106290821A (zh) * | 2016-08-09 | 2017-01-04 | 安徽青松食品有限公司 | 一种花生糖中黄曲霉毒素潜在污染的鉴定方法 |
| CN106290889A (zh) * | 2016-08-16 | 2017-01-04 | 广东产品质量监督检验研究院 | 黄曲霉毒素b1的检测方法 |
| CN106525797A (zh) * | 2016-11-09 | 2017-03-22 | 百奥森（江苏）食品安全科技有限公司 | 一种食品中黄曲霉素b1的检测试剂盒 |
| CN106645688A (zh) * | 2016-11-09 | 2017-05-10 | 百奥森（江苏）食品安全科技有限公司 | 一种快速检测黄曲霉毒素b1的方法及试剂盒 |
| CN110568046A (zh) * | 2019-09-16 | 2019-12-13 | 南京工业大学 | 基于hrp催化聚苯胺原位生成用于afb1的检测方法 |
| CN110568046B (zh) * | 2019-09-16 | 2022-05-13 | 南京工业大学 | 基于hrp催化聚苯胺原位生成用于afb1的检测方法 |
| CN113125734A (zh) * | 2021-04-19 | 2021-07-16 | 中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所 | 一种直接竞争elisa法快速检测afb1的方法及其试剂盒 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1153908A (zh) | 一种检测黄曲霉毒素b1的试剂盒及其检测方法 | |
| CN100403030C (zh) | 检测苏丹红药物的酶联免疫试剂盒及方法 | |
| CN100344971C (zh) | 一种检测动物源性食品中磺胺类药物残留的酶联免疫试剂盒 | |
| CN1766617A (zh) | 检测β－兴奋剂类药物的酶联免疫试剂盒及其方法 | |
| CN1766629A (zh) | 一种检测动物源性食品中氯霉素类药物的酶联免疫试剂盒 | |
| CN1811443A (zh) | 一种检测19－去甲睾酮的方法及其专用酶联免疫试剂盒 | |
| CN1908664A (zh) | 多簇抗原及制备方法、宽谱特异性多克隆抗体及其用途 | |
| CN1811436A (zh) | 一种检测恩诺沙星的方法及其专用酶联免疫试剂盒 | |
| CN102621329A (zh) | 燕窝酶联免疫试剂盒及其检测方法 | |
| CN1687783A (zh) | 莱克多巴胺的亲和层析－酶联免疫检测方法及其专用试剂盒 | |
| CN1811437A (zh) | 一种检测磺胺喹噁啉的方法及其专用酶联免疫试剂盒 | |
| Samsonova et al. | Enzyme-linked immunosorbent assay of ampicillin in milk | |
| Huet et al. | Screening methods and recent developments in the detection of anticoccidials | |
| CN1811442A (zh) | 一种检测泰乐菌素的方法及其专用酶联免疫试剂盒 | |
| CN1811440A (zh) | 一种检测伊维菌素的方法及其专用酶联免疫试剂盒 | |
| CN1766625A (zh) | 检测阿维菌素类药物的酶联免疫试剂盒及方法 | |
| CN1240685C (zh) | 二氯喹啉酸人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途 | |
| CN1696698A (zh) | Pat蛋白的亲和层析－酶联免疫检测方法及其专用试剂盒 | |
| CN1569840A (zh) | 吡虫啉人工半抗原、人工抗原、特异性抗体制备方法及其用途 | |
| CN108359642B (zh) | 一种虾原肌球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞及其应用 | |
| CN1389730A (zh) | 一种盐酸克伦特罗酶免疫检测试剂盒及其检测方法 | |
| CN1793108A (zh) | 一种克伦特罗半抗原化合物、合成方法及其用途 | |
| CN1557838A (zh) | Sars冠状病毒核衣壳蛋白单克隆抗体、产生该抗体的杂交瘤和含此抗体的检测试剂及其用途 | |
| CN87105153A (zh) | 霉菌毒素的测定试剂和测定方法 | |
| CN100338467C (zh) | 一种检测四环素类药物的酶联免疫试剂盒 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C01 | Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |