CN102072958A - 检测黄曲霉毒素b1的化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备、使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测黄曲霉毒素B1的化学发光免疫分析测定试剂盒，所述试剂盒包括黄曲霉毒素B1校准液，固体载体，酶标记结合物，化学发光底物液A、B，及浓缩洗涤液，其中，所述固体载体为微孔板，且所述微孔板由黄曲霉毒素B1单克隆抗体包被，所述酶标记结合物是辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1完全抗原，所述化学发光底物液A含鲁米诺或异鲁米诺。本发明还公开了一种黄曲霉毒素B1的化学发光免疫分析测定试剂盒的制备方法及检测黄曲霉毒素B1的方法。使用本发明制备的试剂盒检测黄曲霉毒素B1，具有操作简便，灵敏度高，特异性好，高效、线性范围宽，与病原学检验结果符合度极高等特点，为把好食物及饲料入口关提供保证。
Description
技术领域
本发明涉及医学免疫体外诊断试剂领域，更具体地说，涉及一种检测黄曲霉毒素B1的化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备、使用方法。
背景技术
黄曲霉毒素(aflatoxin，AF)是一种强致癌性极毒物质，是黄曲霉和寄生曲霉中产毒菌株的代谢产物，普遍存在于霉变的粮食及饲料制品中。黄曲霉毒素根据分子结构差别主要分为四类：B1、B2、G1、G2，其中，黄曲霉毒素B1简称AFB1是目前最常见也是毒性最强的化学致癌毒物，它在WTO确定的重点研究毒物中被列为首位。
黄曲霉毒素B1分子式为C17H12O6，化学结构式：
其结构式中含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮(香豆素)，前者为基本毒性结构，后者与致癌性能有关。其半数致死量仅为0.36mg/kg体重，属特剧毒的毒物范围。其毒性为氯化钾的10倍，砒霜的68倍。当食品、饲料制品未能及时晒干或储藏不当时极易受到黄曲霉毒素B1污染，黄曲霉毒素B1可通过直接或间接进入人类食物链，在机体内干扰信息RNA和DNA的合成，进而影响细胞蛋白质的合成，导致机体全身性的损害，其主要靶器官是肝脏，严重时可引起肝硬化、肝癌甚至死亡。并且，黄曲霉毒素B1十分耐热，分解温度为268℃，故在烹调过程中很难将其破坏。因此，把好食物及饲料入口关，建立简便、快速、灵敏的黄曲霉毒素B1检测方法显得至关重要。
国内早期检测黄曲霉毒素常用的方法有薄层色谱法(TLC)和高效液相色谱法(HPLC)，但二者均存在着检测时间长、仪器设备昂贵、操作复杂且不适于大批量样品的检测、需专业人员进行操作等缺点。
免疫化学分析法的应用开辟了黄曲霉毒素B1检测的新领域，目前常用的方法有放射免疫分析法、荧光免疫分析法和酶联免疫分析法等。其中，放射免疫分析虽然高灵敏、高特异，但存在有效期短、具有放射性污染的缺点；荧光免疫分析法虽然特异性强、敏感性高、速度快，但非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，程序也比较复杂；酶联免疫分析法是70年代出现的新的免疫测定技术，其原理是抗原(或抗体)吸附于载体上的免疫吸附剂和用酶标记的抗体(或抗原)与标本中的待测物(抗原或抗体)起特异的免疫学反应，然后加入酶底物进行显色反应，通过颜色的深浅来判断样品中待测物的含量，虽然灵敏度高、特异性强，但存在内源性酶干扰、终止液为具有腐蚀性的硫酸、底物大部分有毒或为致癌物质、吸光度的检测易受到划痕等多种外在因素的影响等缺点。
为了解决上述问题，本发明采用化学发光免疫分析(ChemiluminescenceImmunoassay，CLIA)检测黄曲霉毒素B1，化学发光免疫分析是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析，是继放射免疫分析和酶免疫分析之后发展起来的一种超高灵敏度的微量测定技术。化学发光免疫分析将抗原与抗体的高特异性免疫反应与高灵敏的化学发光检测技术相结合，用化学发光物质标记抗原或抗体，再进行免疫结合反应，即可进行定性、定量测定。该方法具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定、无污染、仪器简单经济等优点。它是放射性免疫分析与普通酶免疫分析理想的取代者，是目前免疫定量分析最理想的方法。
发明内容
为了解决上述现有技术存在的缺陷，本发明提供了一种灵敏度高、检测范围宽、操作简便快速、无毒无污染且所用仪器简单经济的检测黄曲霉毒素B1的化学发光免疫分析测定试剂盒，同时提供了其制备方法，以及检测样品中黄曲霉毒素B1的方法。
本发明的一个目的是提供一种检测黄曲霉毒素B1的化学发光免疫分析测定试剂盒，所述试剂盒包括黄曲霉毒素B1校准液，固体载体，酶标记结合物，化学发光底物液A、B，及浓缩洗涤液，其中，所述固体载体为微孔板，所述微孔板由黄曲霉毒素B1单克隆抗体包被，所述酶标记结合物是辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1完全抗原，所述化学发光底物液A含鲁米诺或异鲁米诺。
优选地，所述校准液、酶标记结合物与化学发光底物液的体积比是1∶1∶2。
优选地，所述化学发光底物液A含有：
鲁米诺或异鲁米诺 1～20mmol/L
4-羟基联苯 0.1～0.5mmol/L
4-碘代苯基硼酸 0.01～0.1mmol/L
硼酸缓冲溶液 50～500mmol/L pH 8.0～10.0；
所述的化学发光底物液B含有：
过氧化脲 1～5mmol/L
吐温20 0.05～0.5％(体积)
磷酸盐缓冲溶液 10～50mmol/L pH 7.0～7.6；
所述化学发光底物液A与B的体积比为1∶1。
优选地，所述的化学发光底物液A含有：
鲁米诺或异鲁米诺 10mmol/L
4-羟基联苯 0.3mmol/L
4-碘代苯基硼酸 0.05mmol/L
硼酸缓冲溶液 200mmol/L pH 8.0～10.0；
所述的化学发光底物液B含有：
过氧化脲 3.5mmol/L
吐温20 0.1％(体积)
磷酸盐缓冲溶液 20mmol/L pH 7.0～7.6。
优选地，所述浓缩洗涤液含有：
NaCl 12～20％(重量)
KCl 0.1～0.7％(重量)
吐温20 0.05～0.2％(体积)
Tris-HCl缓冲液 50～500mmol/L pH 7.2～7.6。
优选地，所述浓缩洗涤液含有：
NaCl 16％(重量)
KCl 0.4％(重量)
吐温20 0.1％(体积)
Tris-HCl缓冲液 200mmol/L pH 7.2～7.6。
本发明的又一目的是提供一种检测黄曲霉毒素B1的化学发光免疫分析测定试剂盒的制备方法，所述方法包括如下步骤：
A、制备包被微孔板：将含7.30g/L的柠檬酸三钠和4.45g/L的柠檬酸，pH值为4.5～4.8的包被液与黄曲霉毒素B1的单克隆抗体混合，并将所得混合液负载于载体上，用生理盐水洗涤后，用含0.2g/L NaH2PO4·2H2O，2.9g/LNaH2PO4·12H2O、10g/L BSA、和1mL/L生物防腐剂，pH值为7.0～7.5的封闭液封闭上述洗涤后的载体；
B、制备辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1：采用改良过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1完全抗原溶液，采用棋盘滴定法选择最佳的酶标抗原工作浓度，并溶解于1％(重量)牛血清白蛋白，10mmol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液中以制备酶标抗原工作溶液；
C、制备发光底物液：
化学发光底物液A含有：
鲁米诺或异鲁米诺 1～20mmol/L
4-羟基联苯 0.1～0.5mmol/L
4-碘代苯基硼酸 0.01～0.1mmol/L
硼酸缓冲溶液 50～500mmol/L pH 8.0～10.0；
化学发光底物液B含有：
过氧化脲 1～5mmol/L
吐温20 0.05～0.5％(体积)
磷酸盐缓冲溶液 10～50mmol/L pH 7.0～7.6；
D、制备浓缩洗涤液：
浓缩洗涤液含有：
NaCl 12～20％(重量)
KCl 0.1～0.7％(重量)
吐温20 0.05～0.2％(体积)
Tris-HCl缓冲液 50～500mmol/L pH 7.2～7.6；
E、制备黄曲霉毒素B1校准液：用黄曲霉毒素B1的纯品配制，分装0.05、0.15、0.5、2.5、7.5、10ng/ml共6瓶，过滤除菌、分装、低温储存。
优选地，所述化学发光底物液A含有：
鲁米诺或异鲁米诺 10mmol/L
4-羟基联苯 0.3mmol/L
4-碘代苯基硼酸 0.05mmol/L
硼酸缓冲溶液 200mmol/L pH 8.0～10.0；
所述化学发光底物液B含有：
过氧化脲 3.5mmol/L
吐温20 0.1％(体积)
磷酸盐缓冲溶液 20mmol/L pH 7.0～7.6；
所述浓缩洗涤液含有：
NaCl 16％(重量)
KCl 0.4％(重量)
吐温20 0.1％(体积)
Tris-HCl缓冲液 200mmol/L pH 7.2～7.6。
本发明的再一目的是提供一种检测黄曲霉毒素B1的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
1)样品前处理：
将所述样品粉碎成粉末，过筛后用20％乙醇提取，取上层液4℃保存，使用时用PBS-BSA等体积稀释为样品液；
2)使用前述1～6任一项所述试剂盒及化学发光免疫分析仪检测定量所述样品液黄曲霉毒素B1的含量。
优选地，所述步骤2)包括
A、加样进行免疫反应：在包被好的微孔板中加入黄曲霉毒素B1校准品或样品液25～100μL/孔，然后加入酶标记结合物50～150μL/孔，混匀后20～37℃温育20～160min；
B、加底物液：将上述微孔板洗涤干燥后，加化学发光底物液25～200μL/孔，避光反应0～15min；
C、读值定量：在微孔板发光仪上测量发光强度值，与根据校准品发光强度值所作的标准曲线对比，确定样品液中黄曲霉毒素B1的含量。
优选地，所述步骤2)中反应温度为37℃；所述黄曲霉毒素B1校准品或样品液的加入体积为50μL/孔，所述酶标记结合物的加入体积为50μL/孔，所述化学发光底物液的加入体积为100μL/孔；温育时间为60min，避光反应时间为5min。
本发明化学发光免疫分析法测定黄曲霉毒素B1的原理为：待测样品中的黄曲霉毒素B1与辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1完全抗原竞争性结合的微孔板上包被的黄曲霉毒素B1单克隆抗体，通过洗涤去除未结合的抗原，最后加入化学发光底物液，利用化学反应释放的自由能激发中间体发光，从而检测样品中的黄曲霉毒素B1的含量。在一定范围内，发光强度与待测样品中的黄曲霉毒素B1的含量成反比。
本发明提供了一种化学发光免疫分析测定试剂盒及其检测方法，与现有技术相比，具有以下有益效果：
1、环保经济：与现有的检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒相比，不需要再使用具有腐蚀性的硫酸、以及大部分有毒或为致癌物质的底物，更加环保经济；
2、高灵敏度、高特异性、高效、高稳定性：与现有的检测黄曲霉毒素B1的酶联免疫试剂盒相比，克服了试剂盒检测过程中易受到内源性酶干扰、吸光度的检测也易受到划痕等多种外在因素的影响的弊端，本发明检测黄曲霉毒素B1的试剂盒灵敏度更高，可达到0.06ng/ml；
3、线性范围宽：因我国规定的粮食食品等中AFB1的含量为0、5、20μg/kg，因此本发明确定的试剂盒的线性范围为0～15ng/ml，相对范围较宽，可减少标本稀释重测的机会；
4、使用成本低、易推广：现有技术中的化学发光免疫分析试剂盒均为封闭式全自动化学发光测量系统，需要昂贵的全自动化学发光测量仪，从而限制了推广使用，无法广泛地应用于临床诊断和科研工作；本发明的试剂盒可应用于开放式的化学发光测量仪，使用成本低，更易推广应用。
本发明同时提供了一种黄曲霉毒素B1化学发光免疫分析测定试剂盒的制备方法，该方法简单易行，稳定性高，批间差异较小，适于批量化生产和质量控制。
附图说明
图1为分别使用本发明的试剂盒与酶联免疫试剂盒测定黄曲霉毒素B1的对比图。
具体实施方式
以下所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。
实施例1
一种黄曲霉毒素B1化学发光免疫分析试剂盒的制备
1)黄曲霉毒素B1校准液的制备
用黄曲霉毒素B1的纯品配制，分装0.05、0.15、0.5、2.5、7.5、10ng/ml共6瓶，过滤除菌、分装、低温储存；
2)黄曲霉毒素B1抗体包被微孔板的制备：
(1)包被
采用0.046M pH值为4.6的柠檬酸缓冲液与适当浓度的黄曲霉毒素B1单克隆抗体混合制成包被液，并将其负载于固相载体上；
具体地，所述包被方法可以包括：
柠檬酸 4.45g
柠檬酸三钠 7.3g
双蒸水 1000mL
溶解混匀后，调整pH值至4.5～4.8，加入mg黄曲霉毒素B1单克隆抗体混匀，然后加入微孔板各孔中，每孔110μL，4℃过夜。
(2)洗涤：用生理盐水洗三次。
(3)封闭
配制封闭液：
NaH2PO4·2H2O 0.2g
Na2HPO4·12H2O 2.9g
BSA 10g
Proclin 300 1mL
双蒸水 定容至1000mL
将上述试剂称量好放入洁净容器中，加双蒸水定容，溶解混匀，调pH值至7.0～7.5。
每孔分别加入封闭液300μL，室温放置3小时。甩掉封闭液，在吸水纸上拍干。室温除湿干燥24小时。立即进行真空封袋。封袋后放置15分钟检查无漏气，如果有漏气需重新封袋。贴签后置2～8℃保存。
3)制备辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B 1完全抗原溶液：
采用改良过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1完全抗原溶液，采用棋盘滴定法选择最佳的酶标抗原工作浓度，并溶解于1％(重量)牛血清白蛋白，10mmol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液中以制备酶标抗原工作溶液；
4)制备发光底物液：
本发明采用的是辣根过氧化物酶的化学发光底物液：
a)化学发光底物液A采用如下配方：
鲁米诺或异鲁米诺 10mmol/L
4-羟基联苯 0.3mmol/L
4-碘代苯基硼酸 0.05mmol/L
硼酸缓冲溶液 200mmol/L PH 8.0～10.0，
即将1.7716g鲁米诺、0.051g 4-羟基联苯、0.012g 4-碘代苯基硼酸、11.4g硼酸、4.9g硼砂加入洁净容器中用双蒸水溶解，调整pH值为8.0～10.0，用双蒸水定容至1000mL备用。
b)化学发光底物液B采用如下配方：
过氧化脲 3.5mmol/L
吐温20 0.1％(体积)
磷酸盐缓冲溶液 20mmol/L pH 7.0～7.6；
即将0.329g过氧化脲、1ml Tween20、51.58g Na2HPO4·12H2O、8.74gNaH2PO4·2H2O加入洁净容器中用双蒸水溶解，调整pH值为7.0～7.6，用双蒸水定容至1000mL。
使用时将底物液A、B等体积混合。
E、浓缩洗涤液采用如下配方：
NaCl 16％(重量)
KCl 0.4％(重量)
吐温20 0.1％(体积)
Tris-HCl缓冲液 200mmol/L pH 7.2～7.6；
即将160g NaCl、4g KCl、24.2g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1ml吐温20溶于900ml双蒸水中，用HCl调整pH至7.4，用双蒸水定容至1000mL。
使用时用双蒸水20倍稀释。
将上述步骤所得产品分装即为半成品，经抽检合格后组装为成品，4℃保存。
在上述成品试剂盒中，所述校准液、酶标记结合物与化学发光底物液的体积比是1∶1∶2。
实施例2
一种检测黄曲霉毒素B1的化学发光免疫分析诊断试剂盒的制备：
(1)、发光底物液的制备：
a)、化学发光底物液A采用如下配方：
鲁米诺 1mmol/L
4-羟基联苯 0.1mmol/L
4-碘代苯基硼酸 0.01mmol/L
硼酸缓冲液 50mmol/L pH 8.0～10.0；
即将0.177g鲁米诺、0.017g 4-羟基联苯、0.0025g 4-碘代苯基硼酸、2.85g硼酸、1.225g硼砂加入洁净容器中用双蒸水溶解，调整pH值为8.0-10，用双蒸水定容至1000mL。
b)、化学发光底物液B采用如下配方：
过氧化脲 1mmol/L
吐温20 0.05％(体积)
磷酸盐缓冲液 10mmol/L pH 7.0～7.6；
即将0.094g过氧化脲、0.5ml Tween20、25.79g Na2HPO4·12H2O、4.37gNaH2PO4·2H2O加入洁净容器中用双蒸水溶解，调整pH值为7.0-7.6，用双蒸水定容至1000mL。
使用时将底物液A、B等体积混合。
(2)、浓缩洗涤液的制备采用如下配方：
NaCl 12％(重量)
KCl 0.1％(重量)
吐温20 0.05％(体积)
Tris-HCl缓冲液 50mmol/L pH 7.4；
即将120g NaCl、1g KCl、6.05g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、0.5ml吐温20溶于900ml双蒸水中，用HCl调整pH至7.2，用双蒸水定容至1000mL。
使用时用双蒸水20倍稀释。
其余步骤同实施例1。
实施例3
一种检测黄曲霉毒素B1的化学发光免疫分析诊断试剂盒的制备：
(1)、发光底物液的制备：
a)、化学发光底物液A采用如下配方：
鲁米诺 20mmol/L、
4-羟基联苯 0.5mmol/L、
4-碘代苯基硼酸 0.1mmol/L、
硼酸缓冲液 500mmol/L pH 8.0～10.0；
即将3.54g鲁米诺、0.0857g 4-羟基联苯、0.025g 4-碘代苯基硼酸、28.5g硼酸、12.25g硼砂加入洁净容器中用双蒸水溶解，调整pH值为8.0-10，用双蒸水定容至1000mL。
b)、化学发光底物液B采用如下配方：
过氧化脲 5mmol/L
吐温20 0.5％(体积)
磷酸盐缓冲液 50mmol/L pH7.0～7.6；
即将0.47g过氧化脲、5ml Tween20、128.95g Na2HPO4·12H2O、21.85gNaH2PO4·2H2O加入洁净容器中用双蒸水溶解，调整pH值为7.0-7.6，用双蒸水定容至1000mL。
使用时将底物液A、B等体积混合。
(2)、浓缩洗涤液的制备采用如下配方：
NaCl 20％(重量)
KCl 0.7％(重量)
吐温20 0.2％(体积)
Tris-HCl缓冲液 50mmol/L pH 7.4；
即将200g NaCl、7g KCl、60.5g三羟甲基氨基甲烷(Tris)、2ml吐温20溶于900ml双蒸水中，用HCl调整pH至7.6，用双蒸水定容至1000mL。
使用时用双蒸水20倍稀释。
其余步骤同实施例1。
实施例4
使用实施例1～3的化学发光免疫分析测定试剂盒检测黄曲霉毒素B1的方法
1)样品前处理：
将所述样品粉碎成粉末，过筛后用20％乙醇提取，取上层液4℃保存，使用时用PBS-BSA等体积稀释为样品液；
2)使用化学发光免疫分析测定试剂盒及化学发光免疫分析仪检测定量所述样品液黄曲霉毒素B1的含量：
A、加样进行免疫反应：在包被好的微孔板中加入黄曲霉毒素B1校准品或样品液50μL/孔，然后加入酶标记结合物50μL/孔，混匀后37℃温育60min；
B、加底物液：将上述微孔板洗涤干燥后，加化学发光底物液100μL/孔，避光反应5min；
C、读值定量：在微孔板发光仪上测量发光强度值，与根据校准品发光强度值所作的标准曲线对比，确定样品液中黄曲霉毒素B1的含量。
实施例5
使用实施例1～3的化学发光免疫分析测定试剂盒检测黄曲霉毒素B1的方法
1)样品前处理：
将所述样品粉碎成粉末，过筛后用20％乙醇提取，取上层液4℃保存，使用时用PBS-BSA等体积稀释为样品液；
2)使用化学发光免疫分析测定试剂盒及化学发光免疫分析仪检测定量所述样品液黄曲霉毒素B1的含量：
A、加样进行免疫反应：在包被好的微孔板中加入黄曲霉毒素B1校准品或样品液25μL/孔，然后加入酶标记结合物70μL/孔，混匀后20℃温育20min；
B、加底物液：将上述微孔板洗涤干燥后，加化学发光底物液25μL/孔，避光反应0min；
C、读值定量：在微孔板发光仪上测量发光强度值，与根据校准品发光强度值所作的标准曲线对比，确定样品液中黄曲霉毒素B1的含量。
实施例6
使用实施例1～3的化学发光免疫分析测定试剂盒检测黄曲霉毒素B1的方法
1)样品前处理：
将所述样品粉碎成粉末，过筛后用20％乙醇提取，取上层液4℃保存，使用时用PBS-BSA等体积稀释为样品液；
2)使用化学发光免疫分析测定试剂盒及化学发光免疫分析仪检测定量所述样品液黄曲霉毒素B1的含量：
A、加样进行免疫反应：在包被好的微孔板中加入黄曲霉毒素B1校准品或样品液100μL/孔，然后加入酶标记结合物150μL/孔，混匀后30℃温育160min；
B、加底物液：将上述微孔板洗涤干燥后，加化学发光底物液200μL/孔，避光反应15min；
C、读值定量：在微孔板发光仪上测量发光强度值，与根据校准品发光强度值所作的标准曲线对比，确定样品液中黄曲霉毒素B1的含量。
实施例7本发明制备的试剂盒的方法学鉴定
对本发明实施例1～3所制备的试剂盒进行了方法学鉴定，结果如下表1：
表1试剂盒的技术指标检测结果
从上述检测鉴定结果可知，本发明化学发光免疫分析测定试剂盒比现有酶联试剂盒精密度高，即CV值相对较小，灵敏度也高一个数量级，可达到0.06ng/mL。
实施例8
本发明化学发光免疫分析试剂盒与进口酶联免疫分析试剂盒的相关性比较
采用实施例1中所制备的黄曲霉毒素B1的化学发光免疫分析测定试剂盒按实施例6所述方法对15份粮食或饲料样品进行检测，同时采用美国柏尔生产的黄体霉毒素B1的ELISA检测试剂盒(酶联免疫法)作为对照，比较检测结果。
结果(ng/ml)如下表2：
表2本发明CLIA试剂盒与ELISA试剂盒测定黄体霉毒素B1结果比较
以两种方法的测值做线性比对，具体比较结果见附图1。附图1以ELISA试剂盒测值为横坐标，本发明CLIA试剂盒测值为纵坐标，得到线性方程为：Y＝1.8872X-0.0094，r2＝0.8277，表明相关性良好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种检测黄曲霉毒素B1的化学发光免疫分析测定试剂盒，所述试剂盒包括黄曲霉毒素B1校准液，固体载体，酶标记结合物，化学发光底物液A、B，及浓缩洗涤液，其特征在于，所述固体载体为微孔板，且所述微孔板由黄曲霉毒素B1单克隆抗体包被，所述酶标记结合物是辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B 1完全抗原，所述化学发光底物液A含鲁米诺或异鲁米诺。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述校准液、酶标记结合物与化学发光底物液A、B总和的体积比是1∶1∶2。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物液A含有：
鲁米诺或异鲁米诺 1～20mmol/L
4-羟基联苯 0.1～0.5mmol/L
4-碘代苯基硼酸 0.01～0.1mmol/L
硼酸缓冲溶液 50～500mmol/L pH 8.0～10.0；
所述的化学发光底物液B含有：
过氧化脲 1～5mmol/L
吐温20 0.05～0.5％(体积)
磷酸盐缓冲溶液 10～50mmol/L pH 7.0～7.6；
所述化学发光底物液A与B的体积比为1∶1。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的化学发光底物液A含有：
鲁米诺或异鲁米诺 10mmol/L
4-羟基联苯 0.3mmol/L
4-碘代苯基硼酸 0.05mmol/L
硼酸缓冲溶液 200mmol/L pH 8.0～10.0；
所述的化学发光底物液B含有：
过氧化脲 3.5mmol/L
吐温20 0.1％(体积)
磷酸盐缓冲溶液 20mmol/L pH 7.0～7.6。
5.根据权利要求1～4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液含有：
NaCl 12～20％(重量)
KCl 0.1～0.7％(重量)
吐温20 0.05～0.2％(体积)
Tris-HCl缓冲液 50～500mmol/L pH 7.2～7.6。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液含有：
NaCl 16％(重量)
KCl 0.4％(重量)
吐温20 0.1％(体积)
Tris-HCl缓冲液 200mmol/L pH 7.2～7.6。
7.一种检测黄曲霉毒素B1的化学发光免疫分析测定试剂盒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
A、制备包被微孔板：将含7.30g/L的柠檬酸三钠和4.45g/L的柠檬酸，pH值为4.5～4.8的包被液与黄曲霉毒素B1的单克隆抗体混合，并将所得混合液负载于载体上，用生理盐水洗涤后，用含0.2g/L NaH2PO4·2H2O，2.9g/LNaH2PO4·12H2O、10g/L BSA、和1mL/L生物防腐剂，pH值为7.0～7.5的封闭液封闭上述洗涤后的载体；
B、制备辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1：采用改良过碘酸钠法制备辣根过氧化物酶标记的黄曲霉毒素B1完全抗原溶液，采用棋盘滴定法选择最佳的酶标抗原工作浓度，并溶解于1％(重量)牛血清白蛋白，10mmol/L pH 7.2磷酸盐缓冲液中以制备酶标抗原工作溶液；
C、制备发光底物液：
化学发光底物液A含有：
鲁米诺或异鲁米诺 1～20mmol/L
4-羟基联苯 0.1～0.5mmol/L
4-碘代苯基硼酸 0.01～0.1mmol/L
硼酸缓冲溶液 50～500mmol/L pH 8.0～10.0；
化学发光底物液B含有：
过氧化脲 1～5mmol/L
吐温20 0.05～0.5％(体积)
磷酸盐缓冲溶液 10～50mmol/L pH 7.0～7.6；
D、制备浓缩洗涤液：
浓缩洗涤液含有：
NaCl 12～20％(重量)
KCl 0.1～0.7％(重量)
吐温20 0.05～0.2％(体积)
Tris-HCl缓冲液 50～500mmol/L pH 7.2～7.6；
E、制备黄曲霉毒素B1校准液：用黄曲霉毒素B1的纯品配制，分装0.05、0.15、0.5、2.5、7.5、10ng/ml共6瓶，过滤除菌、分装、低温储存。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述化学发光底物液A含有：
鲁米诺或异鲁米诺 10mmol/L
4-羟基联苯 0.3mmol/L
4-碘代苯基硼酸 0.05mmol/L
硼酸缓冲溶液 200mmol/L pH 8.0～10.0；
所述化学发光底物液B含有：
过氧化脲 3.5mmol/L
吐温20 0.1％(体积)
磷酸盐缓冲溶液 20mmol/L pH 7.0～7.6；
所述浓缩洗涤液含有：
NaCl 16％(重量)
KCl 0.4％(重量)
吐温20 0.1％(体积)
Tris-HCl缓冲液 200mmol/L pH 7.2～7.6。
9.一种检测黄曲霉毒素B1的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)样品前处理：
将所述样品粉碎成粉末，过筛后用20％乙醇提取，取上层液4℃保存，使用时用PBS-BSA等体积稀释为样品液；
2)使用前述1～6任一项所述试剂盒及化学发光免疫分析仪检测定量所述样品液黄曲霉毒素B1的含量；
其中，所述步骤2)包括
A、加样进行免疫反应：在包被好的微孔板中加入黄曲霉毒素B1校准品或样品液25～100μL/孔，然后加入酶标记结合物50～150μL/孔，混匀后20～37℃温育20～160min；
B、加底物液：将上述微孔板洗涤干燥后，加化学发光底物液25～200μL/孔，避光反应0～15min；
C、读值定量：在微孔板发光仪上测量发光强度值，与根据校准品发光强度值所作的标准曲线对比，确定样品液中黄曲霉毒素B1的含量。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中反应温度为37℃；所述黄曲霉毒素B1校准品或样品液的加入体积为50μL/孔，所述酶标记结合物的加入体积为50μL/孔，所述化学发光底物液的加入体积为100μL/孔；温育时间为60min，避光反应时间为5min。
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