CN109164255A - 一种超灵敏检测小分子物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种超灵敏检测小分子物质的方法，属于生物技术领域。该方法中待检小分子物质为抗原、配体、生物素、底物和多糖中的一种或两种以上,包括如下步骤：分别采用各待检测小分子标记固相载体；分别采用各荧光探针标记通过特异性作用识别所述各待检测小分子的物质，获得荧光标记物；将各待检测小分子标记的固相载体和各荧光标记物加入样品溶液中进行反应；反应结束后，分离固相载体，释放固相载体表面结合的荧光探针；采用单分子检测方法检测所述荧光探针，根据标准工作曲线，计算样品溶液中各待测小分子浓度。本发明超灵敏检测小分子物质的方法，可以快速、高灵敏度的检测多种小分子物质。

Description

一种超灵敏检测小分子物质的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种超灵敏检测小分子物质的方法。
背景技术
免疫检测通常是指通过抗体与抗原的特异性识别而用抗体(或抗原)来检测抗原(或抗体)的检测方法。这种通过特异性相互识别的检测方法也可以推广到其它物质的检测，如受体与配体，酶与底物，凝集素与多糖。免疫检测的最经典方法是酶联免疫吸附法(ELISA)。ELISA简单、经济，而且已广泛采用自动化操作，但是ELISA存在一定的局限性：一是灵敏度低，二是无法进行多重检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种超灵敏检测小分子物质的方法，可以快速、高灵敏度的检测小分子物质。
本发明的目的采用如下技术方案实现。
一种超灵敏检测小分子物质的方法，待检小分子物质为抗原、配体、生物素、底物和多糖中的一种或两种以上,包括如下步骤：
(1)分别采用各待检测小分子标记固相载体；分别采用各荧光探针标记通过特异性作用识别所述各待检测小分子的物质，获得荧光标记物；
(2)将各待检测小分子标记的固相载体和各荧光标记物加入样品溶液中进行反应；
(3)反应结束后，分离固相载体，释放固相载体表面结合的荧光探针；
(4)采用单分子检测方法检测所述荧光探针，根据标准工作曲线，计算样品溶液中各待测小分子浓度。
在本发明中，当所述待检小分子为抗原时，通过特异性作用识别待检测小分子的物质为抗体；当所述待检小分子为配体时，通过特异性作用识别所述待检测小分子的物质为受体；当所述待检小分子为底物时，通过特异性作用识别所述待检测小分子的物质为酶；当所述待检小分子为多糖时，通过特异性作用识别所述待检测小分子的物质为凝集素；当所述待检小分子为生物素时，通过特异性作用识别所述待检测小分子的物质为亲和素或链霉亲和素。
优选的技术方案中，所述固相载体为高吸附微孔板、磁珠、聚苯乙烯微球、乳胶微球、碳纳米管或金属纳米颗粒。
在本发明中，通过共价或非共价的方式将各待检测小分子标记在固相载体表面、将荧光探针标记通过特异性作用识别各待检测小分子的物质；所述共价方式包括通过活化羧基与氨基反应、点化学反应、醛基与氨基反应或巯基与马来酰亚胺反应；所述非共价方式为通过物理吸附或通过生物素与亲和素相互作用。
优选的技术方案中，通过加入释放缓冲液或者加热的方法释放固相载体表面结合的荧光探针或者通过使用巯基化合物切断二硫键、高碘酸钠氧化切断邻位二羟基或光切割邻位硝基苯衍生物的方法释放固相载体表面结合的荧光探针。
在本发明中，所述标准工作曲线的自变量为各待检小分子的浓度，因变量为检测信号值。
优选的技术方案中，步骤(2)的反应体系中标记在固相载体表面的待检测小分子的终浓度为0.1pg/mL-1mg/mL，荧光标记物的终浓度为0.1pg/mL-1mg/mL,所述反应体系是将各待检测小分子标记的固相载体和各荧光标记物加入样品溶液后形成的。
优选的技术方案中，所述小分子物质为黄曲霉毒素B1。
本发明的有益效果：
通过数学建模，建立理论模型研究竞争免疫，申请人发现竞争免疫分析灵敏度(半抑制浓度，IC50)存在理论最小值，可以通过降低竞争物浓度和检测抗体浓度来提高竞争免疫分析的灵敏度，使其接近于理论极限，从而可以超灵敏地检测目标小分子物质。与传统检测方法如ELISA相比，本发明采用先进的免疫磁珠技术，磁珠均匀的分散在待检测溶液中，免疫反应不受扩散限速，待测小分子标记磁珠可以快速高效地和样品中的目标分析物竞争与荧光标记抗体反应，大大缩短免疫反应达到平衡所需的时间。另外，本发明将不同发射波长的荧光探针直接连接到不同的检测抗体分子上，合成工艺简单，可以有效提高荧光标记效率，减少磁分离洗涤次数，提高检测灵敏度。同时，用单分子检测技术可以同时定量检测多种荧光标记的检测抗体，实现多重目标物同时检测，降低检测成本。根据本发明方法可以制备一系列高灵敏检测试剂盒，用于抗原小分子化合物如真菌毒素、微囊藻素、抗生素、环境有机污染物、氨基酸、寡核苷酸、脂质小分子、荷尔蒙、农药、兽药残留、食品添加剂和芳香族硝基化合物等的检测。
附图说明
图1显示了本发明超灵敏检测小分子方法的原理。
图2显示了本发明检测多目标物的原理。
图3显示了用共价和非共价方式荧光标记检测抗体。
图4是解离磁珠上的免疫复合物(a)或切断荧光标记物(b)的示意图。
图5是单分子计数装置的结构示意图。
图6是黄曲霉毒素B1检测的标准曲线，横坐标为黄曲霉素B1浓度，纵坐标为归一化响应值(I/I0)。
具体实施方式
实施例1
本发明方法检测的小分子物质是指是可以通过特异性作用被其他物质识别的物质，如可以被抗体识别的抗原，可以被受体识别的配体，可以被酶识别的底物，可以被凝集素识别的多糖，可以被亲和素或链霉亲和素识别的生物素。因原理相同，以抗体-抗原免疫反应为例，来证明竞争免疫分析灵敏度(半抑制浓度，IC50)存在理论最小值，可以通过降低竞争物浓度和检测抗体浓度来提高竞争免疫分析的灵敏度，使其接近于理论极限。
通过数学建模，建立理论模型研究竞争免疫分析，申请人发现竞争免疫分析灵敏度(半抑制浓度，IC50)存在理论最小值，可以通过降低竞争物浓度和检测抗体浓度来提高竞争免疫分析的灵敏度，使其接近于理论极限。IC50是衡量竞争免疫分析灵敏度最主要的参数，通过理论计算，我们发现可以通过降低检测抗体浓度，降低标记抗原浓度，使用高亲和性抗体三种方法来降低IC50，从而提高检测的灵敏度。基于此理论，我们进行了实验验证，理论与实际结果符合，该方法切实有效。
推导过程如下：
竞争免疫分析是基于目标抗原(Ag)与标记的目标抗原(Ag*，以下缩写为标记抗原)竞争结合检测抗体(Ab)有限的结合位点。通常，控制检测抗体和标记抗原的浓度不变，由于竞争抑制，随着目标抗原浓度的逐渐增加，越来越少的标记抗原与检测抗体结合，检测信号逐渐降低。因此，对于竞争免疫分析，目标抗原的浓度与检测信号一般成负相关。竞争免疫在达到热力学平衡时遵循下面两个方程：
其中Kd是目标抗原-检测抗体免疫复合物的解离常数，[AbAg]是目标抗原-检测抗体免疫复合物的浓度，[Ab]为自由检测抗体的浓度，[Ag]是自由目标抗原的浓度，*代表相应的标记抗原。
因为目标抗原(Ag)与标记抗原(Ag*)结构类似，所以我们设定：
Kd*＝Kd (3)，
将(3)代入(1)、(2)得到：
另外，
[Ag0]＝[Ag]+[AbAg] (5)
[Ag0*]＝[Ag*]+[AbAg*] (6)
[Ab0]＝[Ab]+[AbAg]+[AbAg*] (7)
其中[Ag0]是目标抗原的初始浓度，即样品中目标分析物的浓度。[Ag0*]是加入的标记抗原的初始浓度，[Ab0]是加入的检测抗体的初始浓度。将方程5-6代入方程4可得到：
因此，得到
根据方程1、2、3和9得到：
因此，
所以，
当目标分析物浓度为0时，假定[AbAg*]＝a,则：
根据定义，检测信号为0.5a对应的目标抗原浓度即为半抑制浓度IC50。
通过理论计算分析，发明人发现，竞争免疫分析的灵敏度(IC50)存在理论最小值即Kd。可以通过三种方法降低IC50，从而提高免疫分析的灵敏度：(1)降低检测抗体浓度，从而减小a的值，提高检测灵敏度；(2)降低标记抗原初始浓度[Ag0 *]，从而降低IC50，提高灵敏度；(3)使用高亲和性抗体，抗体亲和性越高，Kd值越小。
在传统ELISA中，反应体系中的竞争物(标记抗原)和检测抗体的浓度通常为纳摩尔每升至微摩尔每升范围。如果继续降低竞争物和抗体浓度，则用传统的检测手段如光密度分析无法检测出信号变化。用超灵敏检测方法，如单分子检测技术，则可有效解决这一问题。目前，常用的单分子检测技术多是采用荧光检测模式，如全内反射荧光显微成像技术(TIRF)和共聚焦成像技术。单分子计数(SMC)技术是近年来开发出的一种成熟的超灵敏检测技术。该技术利用毛细管进荧光标记分子的上样，并以激光聚焦的方式进行激发检测。当荧光标记分子通过高能量的激光焦点时，荧光染料所发射的光闪烁信号被检测器测得。光闪烁信号的次数和强度与分子浓度呈正相关性，从而能建立标准曲线。通过对一定时间之内光闪烁信号进行统计，可以对溶液浓度进行定量检测。因为该技术可直接检测单个分子，因此有非常高的灵敏度。单分子计数技术已经用于蛋白质、DNA的超灵敏检测。通常是用一对抗体或寡核苷酸探针采用“三明治”夹心的方法捕获目标分析物，然后用单分子检测平台检测相应的荧光信号。然而，夹心法不能用于半抗原小分子的检测。本发明结合竞争免疫分析技术和单分子技术，开发出一种可以超灵敏检测小分子分析物的方法：单分子竞争免疫。如图1所示，用半抗原标记的磁珠(即半抗原标记磁珠)与样品中的目标分析物(即目标物)竞争结合荧光标记的检测抗体。免疫反应结束后，磁分离洗去多余未结合的检测抗体，然后加入释放缓冲液，解离免疫复合物。磁分离后取上清液进行单分子检测。由于竞争抑制，样品中目标分析物的浓度越高，结合到磁珠表面的检测抗体越少，信号越弱。因此，目标分析物的浓度与信号强度成反比。因为单分子检测灵敏度高，可以降低反应体系中竞争物或检测抗体的浓度至皮摩每升，大大提高检测竞争免疫的灵敏度。该方法可用于一系列小分子化合物的检测，如真菌毒素，微囊藻素，抗生素，环境有机污染物，氨基酸，寡核苷酸，脂质小分子，荷尔蒙，农药、兽药残留，食品添加剂，芳香族硝基化合物等一系列半抗原的检测。另外，通过使用不同荧光发射波长标记的检测探针，可以实现单个样品中多个目标物的检测，大大提高检测通量并降低检测成本。另外，该方法也可用于超灵敏小分子检测试剂盒的开发。
实施例2本发明检测小分子的方法
本发明中方法检测的小分子物质是指是可以通过特异性作用被其他物质识别的物质，如可以被抗体识别的抗原，可以被受体识别的配体，可以被酶识别的底物，可以被凝集素识别的多糖，可以被亲和素或链霉亲和素识别的生物素。因原理相同，本实施例以检测抗体-抗原免疫反应为例，对本发明超灵敏检测小分子物质的方法进行说明。
当小分子为半抗原时，检测该半抗原的方法包括如下步骤：
1.制备半抗原标记的固相载体
固相载体可以选择直径为10nm～100μm磁珠。可以通过共价或非共价的方式将半抗原连接到磁珠表面。共价方式：包括通过活化磁珠表面修饰的羧基与氨基反应，点化学反应(click chemistry)、醛基与氨基反应、巯基与马来酰亚胺反应等。非共价方式如通过物理吸附、通过生物素-亲和素相互作用等。
除磁珠颗粒，固相载体还可使用其他材料如微孔板或纳米、微米级的颗粒，包括但不限于高吸附微孔板、聚苯乙烯微球、乳胶微球、碳纳米管和金属纳米颗粒等。所用微粒可以为球形、线状、管状、圆柱体、三角体和不规则多面体等。
2.制备荧光标记的抗体
若待检测小分子为多个时，用具有不同荧光发射波长的探针(即荧光探针)标记各小分子的检测抗体，不同荧光探针的发射谱带应无明显重叠。荧光标记探针的数目与需检测的抗原数相同。如需要同时检测三种抗原，应分别使用三种荧光探针标记三种不同的检测抗体(图2)。
荧光标记可以通过共价方式(a)或非共价(b)方式。共价方式(a)如通过活化羧基与氨基反应，醛基与氨基反应，点化学反应，巯基与马来酰亚胺反应等。非共价(b)方式，如生物素-亲和素相互作用，连接到抗体分子上。
用到的荧光标记探针包括但不限于有机荧光染料、荧光蛋白类、无机量子点和荧光纳米材料。有机荧光染料：如荧光素类、罗丹明类、菁染料、吖啶橙类、氟硼吡咯类(BODIPY)和萘酰亚胺类等；荧光蛋白类如绿色荧光蛋白、藻红蛋白等；无机量子点：如碳点、半导体量子点；荧光纳米材料：氧化石墨烯、聚苯乙烯荧光颗粒和荧光硅纳米颗粒等。
3.免疫反应
将半抗原标记的磁珠加入到待测样品中，然后加入荧光标记的检测抗体，混匀，在0-50℃条件下孵育5min-16h。反应结束后，磁分离，吸去上清液，洗涤磁珠3-5次，然后加入释放缓冲液，在0-50℃条件下孵育5min-2h，磁分离，吸取上清液，用于单分子分析检测。释放缓冲液可以解离固相载体表面的免疫复合物(即抗体抗原复合物)。释放缓冲液可以是强酸、强碱溶液或高浓度尿素溶液(图4中(a))，另外也可以使用加热等方法解离免疫复合物。或者也可切断固相载体表面的检测抗体与荧光探针的连接(图4中(b))，包括但不限于：化学反应如用巯基化合物切断二硫键，用高碘酸钠氧化切断邻位二羟基，光切割邻位硝基苯衍生物等。
4.单分子分析
可以用不同的单分子检测技术检测固相载体表面释放的荧光探针，根据标准工作曲线，计算样品溶液这各待检小分子浓度。如使用全内反射荧光显微镜，首先将从磁珠上释放的荧光标记物均匀涂抹在玻璃片上，后用消逝波激发，计数荧光分子的个数。另外也可以用单分子计数装置进行检测。如图5所示，单分子计数装置通常包括激发系统，液流控制系统和检测系统。激发光源通常为激光器。激发光经过物镜聚焦于毛细管。通过微量注射泵控制通过毛细管的溶液流度。由于激光的聚焦效应，会形成一个非常狭小的检测空间“爱里斑”，这个空间集中了多达84％的激光能量，能够最有效地照射和激发单个荧光分子。若激发光聚焦处有荧光分子通过，则荧光探针受激发发射出荧光，经过二色镜和滤光片滤去杂光，相应的荧光信号被检测器记录。检测器通常为光电倍增管或雪崩二极管，有非常高的检测灵敏度。单位时间内峰高超过阈值的荧光信号会被统计为数字信号，并将检测到的数字信号进行汇总，可以显著地提高检测灵敏度。单分子计数装置可以自己搭建，也有商品化的仪器，如Merck Millipore公司已经推出商品化的检测仪器平台，可以方便进行单分子计数检测。
其中标准曲线的自变量为各待检小分子的浓度，应变量为检测信号值。
实施例3采用本发明方法检测黄曲霉毒素B1
1.材料和方法
牛血清蛋白(BSA)，牛血清蛋白-黄曲霉毒素B1偶联物(BSA-Aflatoxin B1)，黄曲霉毒素B1乙腈溶液，PBS缓冲液，三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，氯化钠(NaCl)，乙基[3-(二甲氨基)丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)，2-(N-吗啉)乙烷磺酸(MES)，Tween-20购自Sigma公司。黄曲霉毒素B1单克隆抗体(公开于Journal of Immunological Methods 329(2008)112–124)。DynabeadsTM MyOneTM羧基修饰磁珠(以下简称为羧基修饰磁珠)和Alexa647活性酯购自美国Thermofisher公司。
2.检测黄曲霉毒素B1的具体方法
(1)半抗原标记磁珠的制备
取100μL羧基修饰磁珠(10mg/mL，直径为1μm)于1.5mL离心管中，在涡流器上涡流30秒使磁珠混匀；将离心管放置于磁分离架上，待磁珠完全分离后，把上清液吸掉；加入200μL PBST(含有0.9％ NaCl和0.1％ Tween-20的10mM PBS缓冲液，pH 7.4，下同)洗涤羧基修饰磁珠，一共洗涤三次；加入200μL MES缓冲液(50mM，pH 6.0)溶液洗涤磁珠，一共洗涤两次；用190μL浓度为50mM、pH 6.0的MES溶液重悬磁珠，再加入10μL 10mg/mL的EDC溶液，混匀，将磁珠在室温条件下震荡30min，将磁珠活化。
用200μL 50mM、pH 6.0的MES缓冲液洗涤活化后的磁珠两遍，然后往磁珠中加入180μL MES缓冲液，加入20μL 1mg/mL的牛血清蛋白-黄曲霉毒素B1偶联物(BSA-AflatoxinB1)，混匀，室温下震荡孵育2h进行反应。将反应后的磁珠用PBST洗涤三次，磁分离，加入10mg/mL的BSA溶液(溶剂是含0.9％NaCl的10mM PBS缓冲液，pH 7.4)进行封闭，混匀后室温孵育1h，磁分离，用PBST洗涤三次，得到半抗原标记磁珠。将半抗原标记磁珠分散在200μLPBST中，4℃保存备用。
(2)用荧光探针标记检测抗体
将100μg黄曲霉毒素B1单克隆抗体(缩写为AFB1抗体)溶于100μL含有0.9％NaCl的10mM PBS缓冲液(pH7.4)中，加入6.7μL的4mM Alexa647活性酯DMSO溶液，混匀，在室温、震荡条件下反应45min。然后用透析或超滤离心除去未连接的荧光探针，将纯化后的荧光标记AFB1抗体溶于含有0.9％NaCl的10mM、pH7.4的PBS缓冲液中，4℃保存备用。
(3)制作标准曲线
制作标准曲线：配制浓度分别为0ng/mL、0.01ng/mL、0.03ng/mL、0.1ng/mL、0.3ng/mL、1ng/mL、3ng/mL和10ng/mL的黄曲霉毒素B1标准溶液。取100μL黄曲霉毒素B1标准溶液，加入25μL 0.1mg/mL的半抗原标记磁珠和25μL 90ng/mL荧光标记AFB1抗体，混匀，25℃震荡条件下反应1h，然后磁分离，用PBST洗涤磁珠3-5次。在洗涤后的磁珠中加入50μL 100mM、pH3.0的甘氨酸-盐酸缓冲液(释放缓冲液)，25℃下孵育30min，然后加入1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.2)调节pH至8.0。磁分离，吸取上清液，在单分子计数平台Singulex ErennaTM系统上进行测试，得到不同浓度黄曲霉毒素B1标准溶液反应后的响应值(detected events)。
以黄曲霉毒素B1标准溶液浓度为0时的信号值(I0)为基准，计算I/I0(其中I为不同浓度下的信号值)，对不同浓度下的信号值(I)进行归一化。以黄曲霉毒素B1浓度为横坐标，归一化响应信号为纵坐标，使用OriginLab软件通过四参数方程拟合：y＝A2+(A1-A2)/[1+(x/x0)p]，其中x为自变量，代表黄曲霉毒素B1的浓度(单位是ng/mL)；y为因变量，代表信号值；A1是黄曲霉毒素B1标准溶液浓度为0时的信号值，A2是黄曲霉毒素B1标准溶液浓度为无限大时的信号值，p为拟合曲线拐点处的斜率，x0为半抑制浓度IC50(单位是ng/mL)，半抑制浓度越低，检测越灵敏。最终得到黄曲霉毒素B1的标准曲线(图6)：
其中x为自变量，代表黄曲霉毒素B1的浓度(单位是ng/mL)，y为因变量，代表信号值。上述标准曲线中，x的检测下限(基于10％信号抑制)为0.022ng/mL；IC50为0.188ng/mL，远低于商品化ELISA试剂盒的IC50(从3.72ng/mL到7.22ng/mL,参考文献Asian-Australas JAnim Sci.2015May；28(5):691–696.)，证明该方法可以超灵敏检测黄曲霉素B1。
(4)样品检测
取1g粉碎的玉米样品，加入5mL的10％甲醇水溶液，涡流2min，后在1920g下离心15min，取上清用含有0.9％NaCl的10mM PBS缓冲液(pH 7.4)1:10倍稀释后，分成两份，分别加入终浓度为0.1ng/mL和0.5ng/mL的黄曲霉素B1，按照标准曲线制作方法进行检测，将样品检测获得的响应值代入标准曲线，检测得到的浓度分别为0.092±0.006ng/mL和0.508±0.010ng/mL，回收率分别为92.0％和101.6％，证明该方法可以用于实际样品中黄曲霉素B1的检测。

Claims (8)

1.一种超灵敏检测小分子物质的方法，待检小分子物质为抗原、配体、生物素、底物和多糖中的一种或两种以上,其特征在于包括如下步骤：
（1）分别采用各待检测小分子标记固相载体；分别采用各荧光探针标记通过特异性作用识别所述各待检测小分子的物质，获得荧光标记物；
（2）将各待检测小分子标记的固相载体和各荧光标记物加入样品溶液中进行反应；
（3）反应结束后，分离固相载体，释放固相载体表面结合的荧光探针；
（4）采用单分子检测方法检测所述荧光探针，根据标准工作曲线，计算样品溶液中各待测小分子浓度。
2.根据权利要求1所述超灵敏检测小分子物质的方法，其特征在于：当所述待检小分子为抗原时，通过特异性作用识别待检测小分子的物质为抗体；当所述待检小分子为配体时，通过特异性作用识别所述待检测小分子的物质为受体；当所述待检小分子为底物时，通过特异性作用识别所述待检测小分子的物质为酶；当所述待检小分子为多糖时，通过特异性作用识别所述待检测小分子的物质为凝集素；当所述待检小分子为生物素时，通过特异性作用识别所述待检测小分子的物质为亲和素或链霉亲和素。
3.根据权利要求1或2所述超灵敏检测小分子物质的方法，其特征在于所述固相载体为高吸附微孔板、磁珠、聚苯乙烯微球、乳胶微球、碳纳米管或金属纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述超灵敏检测小分子物质的方法，其特征在于通过共价或非共价的方式将各待检测小分子标记在固相载体表面、将荧光探针标记通过特异性作用识别各待检测小分子的物质；所述共价方式包括通过活化羧基与氨基反应、点化学反应、醛基与氨基反应或巯基与马来酰亚胺反应；所述非共价方式为通过物理吸附或通过生物素与亲和素相互作用。
5.根据权利要求4所述超灵敏检测小分子物质的方法，其特征在于通过加入释放缓冲液或者加热的方法释放固相载体表面结合的荧光探针或者通过使用巯基化合物切断二硫键、高碘酸钠氧化切断邻位二羟基或光切割邻位硝基苯衍生物的方法释放固相载体表面结合的荧光探针。
6.根据权利要求5所述超灵敏检测小分子物质的方法，其特征在于所述标准工作曲线的自变量为各待检小分子的浓度，因变量为检测信号值。
7.根据权利要求6所述超灵敏检测小分子物质的方法，其特征在于步骤（2）的反应体系中标记在固相载体表面的待检测小分子的终浓度为0.1 pg/mL-1mg/mL，荧光标记物的终浓度为0.1 pg/mL-1mg/mL，所述反应体系是将各待检测小分子标记的固相载体和各荧光标记物加入样品溶液后形成的。
8.根据权利要求4所述超灵敏检测小分子物质的方法，其特征在于所述小分子物质为黄曲霉毒素B1。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109765165A (zh) * 2019-02-22 2019-05-17 英诺维尔智能科技（苏州）有限公司 一种适用于细胞样本流式检测的磁珠
WO2020156029A1 (zh) * 2019-01-30 2020-08-06 苏州宇测生物科技有限公司 一种单分子定量检测方法及检测系统
CN111735964A (zh) * 2020-06-24 2020-10-02 深圳市光与生物科技有限公司 一种基于上转换荧光探针的单分子免疫检测方法
CN114235772A (zh) * 2022-02-23 2022-03-25 北京吉天仪器有限公司 基于聚焦技术的单分子检测方法
CN116298240A (zh) * 2022-12-30 2023-06-23 深圳远瑞生物医疗有限公司 一种免疫检测方法及系统
CN117347621A (zh) * 2023-08-25 2024-01-05 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种用蛋白模拟抗原-纳米抗体检测黄曲霉毒素b1的方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030099940A1 (en) * 2000-02-16 2003-05-29 Empedocles Stephen A. Single target counting assays using semiconductor nanocrystals
CN101672841A (zh) * 2008-09-09 2010-03-17 北京朔望科技有限公司 用于生物样品的检测仪器和检测方法
CN102072958A (zh) * 2010-11-09 2011-05-25 北京科美东雅生物技术有限公司 检测黄曲霉毒素b1的化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备、使用方法
CN102216778A (zh) * 2008-09-19 2011-10-12 神谷来克斯公司 单分子测定
CN102653558A (zh) * 2012-05-22 2012-09-05 中国农业大学 一种单链抗体及其在检测黄曲霉毒素中的应用
CN103018458A (zh) * 2012-12-06 2013-04-03 北京普赞生物技术有限公司 超灵敏黄曲霉毒素b1酶联免疫检测试剂盒
US20160178520A1 (en) * 2014-12-17 2016-06-23 Singulex, Inc. Multiplexed Single Molecule Analyzer
CA2954115A1 (en) * 2016-10-16 2018-04-16 Neil Gordon Ultra-sensitive bioanalyte quantification from self-assembled quadruplex tags

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030099940A1 (en) * 2000-02-16 2003-05-29 Empedocles Stephen A. Single target counting assays using semiconductor nanocrystals
CN101672841A (zh) * 2008-09-09 2010-03-17 北京朔望科技有限公司 用于生物样品的检测仪器和检测方法
CN102216778A (zh) * 2008-09-19 2011-10-12 神谷来克斯公司 单分子测定
CN102072958A (zh) * 2010-11-09 2011-05-25 北京科美东雅生物技术有限公司 检测黄曲霉毒素b1的化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备、使用方法
CN102653558A (zh) * 2012-05-22 2012-09-05 中国农业大学 一种单链抗体及其在检测黄曲霉毒素中的应用
CN103018458A (zh) * 2012-12-06 2013-04-03 北京普赞生物技术有限公司 超灵敏黄曲霉毒素b1酶联免疫检测试剂盒
US20160178520A1 (en) * 2014-12-17 2016-06-23 Singulex, Inc. Multiplexed Single Molecule Analyzer
CA2954115A1 (en) * 2016-10-16 2018-04-16 Neil Gordon Ultra-sensitive bioanalyte quantification from self-assembled quadruplex tags

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOHN TODD 等: "Ultrasensitive flow-based immunoassays using single-molecule counting", 《CLIN CHEM》 *
KATSUMI AOYAGI,ET AL: "《HENRY’S CLINICAL DIAGNOSIS AND MANAGEMENT BY LABORATORY METHODS》", 31 December 2017 *
YI ZHANG，HIROYUKI NOJI: "Digital Bioassays: Theory, Applications, and Perspectives", 《ANAL CHEM》 *
车振明 等: "《微生物学》", 30 June 2008 *
饶美芳 等: "小分子化合物开放夹心免疫分析研究进展", 《食品科学》 *

Cited By (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020156029A1 (zh) * 2019-01-30 2020-08-06 苏州宇测生物科技有限公司 一种单分子定量检测方法及检测系统
CN111771126A (zh) * 2019-01-30 2020-10-13 苏州宇测生物科技有限公司 一种单分子定量检测方法及检测系统
US20210025879A1 (en) * 2019-01-30 2021-01-28 Suzhou Astrabio Technology Co., Ltd. Single molecule quantitative detection method and detection system
CN111771126B (zh) * 2019-01-30 2022-05-06 苏州宇测生物科技有限公司 一种单分子定量检测方法及检测系统
CN109765165A (zh) * 2019-02-22 2019-05-17 英诺维尔智能科技（苏州）有限公司 一种适用于细胞样本流式检测的磁珠
CN109765165B (zh) * 2019-02-22 2021-06-04 英诺维尔智能科技（苏州）有限公司 一种适用于细胞样本流式检测的方法
CN111735964A (zh) * 2020-06-24 2020-10-02 深圳市光与生物科技有限公司 一种基于上转换荧光探针的单分子免疫检测方法
CN114235772A (zh) * 2022-02-23 2022-03-25 北京吉天仪器有限公司 基于聚焦技术的单分子检测方法
CN116298240A (zh) * 2022-12-30 2023-06-23 深圳远瑞生物医疗有限公司 一种免疫检测方法及系统
CN117347621A (zh) * 2023-08-25 2024-01-05 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种用蛋白模拟抗原-纳米抗体检测黄曲霉毒素b1的方法
CN117347621B (zh) * 2023-08-25 2024-03-12 广东省农业科学院农业生物基因研究中心 一种用蛋白模拟抗原-纳米抗体检测黄曲霉毒素b1的方法

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