CN116298240A - 一种免疫检测方法及系统 - Google Patents
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Abstract
一种免疫检测方法及系统，该方法包括：检测步骤，包括提供含有载体免疫复合物的待测溶液，所述载体免疫复合物包含固相载体、发光材料以及待测物，在鞘流作用下，所述待测溶液流经检测区，采集检测区的固相载体的散射信号M以及发光材料的发光信号N；计算步骤，包括根据采集自固相载体的散射信号M与采集自发光材料的发光信号N，计算得到所述待测溶液中待测物的浓度。本发明通过水力聚焦，从物理原理上实现数字化分割，不需要微孔板耗材，同时固相载体用量更少，方便易获取，可以实现5个数量级的动态检测范围。
Description
技术领域
本发明涉及单分子免疫检测技术领域，具体涉及一种免疫检测方法及系统。
背景技术
随着科学技术发展和人类探索的进度，科研和临床领域对重大疾病相关的早期生物标志物的检测有着迫切的需求。这些生物标志物在疾病发生的早期阶段含量较低，如对阿尔兹海默症有指向意义的神经标志物，由于人体血脑屏障的存在，在血浆中的含量要比脑脊液中低三四个数量级，如何检测痕量标志物对现有传统方法是一个极大的挑战。
传统的检测方法，如用于蛋白质检测的化学发光法、酶联免疫显色法的检测均在一容积为数百微升的反应池中进行，检测整个反应池内溶液所产生的光信号。一般而言，反应池中有数十万甚至百万以上数量的被测蛋白，在光子计数器的检测下，信号很容易被检测出。
当样品中的被测蛋白浓度低至一定程度时，如数千以及数万的水平，此时反应池中被测蛋白所发出的光信号将会被背景噪声所掩盖，如溶液分子的热运动引起的光子损耗、探测器件的热噪声、背景杂散光的影响等，导致不能检测到有效信号。因此传统检测方法在检测极低浓度样本时，由于系统背景噪声的存在，检测的精度受到的限制，难以实现高灵敏度的检测。为此单分子检测技术应运而生。
单分子检测是一种全新的检测理念，起源于数字ELISA及数字PCR技术，其核心在于将极低浓度的磁珠免疫复合物通过物理手段分离出来，在极低浓度被测蛋白反应体系下，大部分磁珠未捕获到抗原或捕获到1个抗原，小部分磁珠捕获到2个或多个抗原，捕获到特定个数抗原的磁珠所占比例符合泊松分布理论。分离出的单个磁珠免疫复合物进行信号增强(数字PCR为核酸扩增)，从而实现对个体被测蛋白的检测。
目前市面上有两种主流的单分子检测方法，一种是飞升微阵列(Femtoliterarray)的方式，即将反应后的磁珠免疫复合物通过重力作用沉降到一个刻蚀有数十万个凹坑的微孔板，每个凹坑的容积在飞升水平，正好容纳单个磁珠，当磁珠进入凹坑后，表面用油封处理，这样通过微孔板上间隔分布的凹坑在空间上将反应物分为成了数十万份。每个凹坑中磁珠上结合的酶将凹坑中的底物进行激发以产生光信号，通过CCD或者CMOS等成像设备对微孔板进行拍照，通过分析所拍图像中凹坑的荧光信号进行分析。该方式的不足包括：1)飞升微孔板的制造工艺复杂以及作为耗材成本高昂，不利于普及，其二是单个凹坑所发出的光信号较弱，需要增加CCD或者CMOS的曝光时间；2)增加了检测时间；3)需要增加制冷装置以避免高曝光时间带来的暗计数增加，这在一定程度上也增加了仪器的复杂度和成本。
现有技术中，有的通过聚焦光斑的微小检测区域来实现被测蛋白数字化个体检测。该方式的不足在于无法预测荧光免疫复合物的位置，随机性大，且扫描和检测光路设计实现复杂，精度要求高，难以推广。
综上所述，现有的单分子检测技术存在检测系统复杂、检测设备以及耗材昂贵等缺陷，如飞升微孔板的精密度要求高等所带来的成本高昂，难以大量推广的问题。这些问题极大程度地阻碍了单分子检测技术在科研和医疗诊断市场中的应用。
发明内容
根据第一方面，在一实施例中，提供一种免疫检测方法，包括：
检测步骤，包括提供含有载体免疫复合物的待测溶液，所述载体免疫复合物包含固相载体、发光材料以及待测物，在鞘流作用下，所述待测溶液流经检测区，采集检测区的固相载体的散射信号M以及发光材料的发光信号N；
计算步骤，包括根据采集自固相载体的散射信号M与采集自发光材料的发光信号N，计算得到所述待测溶液中待测物的浓度。
根据第二方面，在一实施例中，提供一种免疫检测系统，包括：
检测模块，用于在鞘流作用下，使得包含载体免疫复合物的待测溶液流经检测区，所述载体免疫复合物包含固相载体、发光材料以及待测物，采集检测区固相载体的散射信号M以及发光材料的发光信号N；
计算步骤，用于根据采集自固相载体的散射信号M与采集自发光材料的发光信号N，计算得到所述待测溶液中待测物的浓度。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种免疫检测装置，包括：
存储器，用于存储程序；
处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现如第一方面任意一项所述的免疫检测方法。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如第一方面任意一项所述的免疫检测方法。
根据第五方面，在一实施例中，提供一种免疫检测系统，包括：
鞘流形成模块，用于形成层流，使得待测溶液中的载体免疫复合物在鞘流包裹下经过检测区，所述载体免疫复合物包含可提供散射信号的固相载体、可提供发光信号的发光材料以及待测物；
激光发光检测模块，用于激发经过检测区的载体免疫复合物产生散射信号和发光信号；
以及算法分析模块，用于分析所述激光发光检测模块产生的信号所形成的散点图，根据所述散点图中的散射信号和发光信号，计算得到待测溶液中待测物的浓度。
根据第六方面，在一实施例中，提供一种载体免疫复合物，包括固相载体、第一结合物、直接或间接耦联有发光材料的第二结合物；
所述第一结合物结合至所述固相载体；
所述第一结合物特异性结合至所述待测物的第一位点，所述第二结合物特异性结合至所述待测物的第二位点。
根据第七方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，包含第六方面任意一项的载体免疫复合物。
依据上述实施例的一种免疫检测方法及系统，本发明通过水力聚焦，从物理原理上实现数字化分割，不需要微孔板耗材，同时固相载体用量更少，方便易获取。
在一实施例中，可以实现5个数量级的动态检测范围。
在一实施例中，可通过改变磁珠的特征，如包被多种荧光染料即能够实现高通量、多标志物的检测。
附图说明
图1为一种实施例的磁珠反应示意图；
图2为一种实施例的鞘流检测示意图；
图3为一种实施例的检测光路示意图；
图4.1为单独磁珠的散点图；
图4.2为0.02pg/mL样本的散点图；
图4.3为抗原浓度为0.1pg/mL时的散点图；
图4.4为抗原浓度为2pg/mL时的散点图；
图4.5为抗原浓度为200pg/mL时的散点图；
图5为一种实施例中AFN与抗原浓度的定标曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中，很多细节描述是为了使得本申请能被更好的理解。然而，本领域技术人员可以毫不费力的认识到，其中部分特征在不同情况下是可以省略的，或者可以由其他材料、方法所替代。在某些情况下，本申请相关的一些操作并没有在说明书中显示或者描述，这是为了避免本申请的核心部分被过多的描述所淹没，而对于本领域技术人员而言，详细描述这些相关操作并不是必要的，他们根据说明书中的描述以及本领域的一般技术知识即可完整了解相关操作。
另外，说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时，方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此，说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例，并不意味着是必须的顺序，除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为部件所编序号本身，例如“第一”、“第二”等，仅用于区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。
如本文所用，“抗原”(antigen，缩写Ag)是指能引起抗体生成的物质，是任何可诱发免疫反应的物质。
如本文所用，“鞘流”是指一种层流的流体状态，即在层流下，流体之间不存在交互，按照预定的流线运动。在本发明中，层流由两种液体构成，一种是待测物所形成的溶液，另一种为鞘液，即包裹待测物液体的溶液，鞘流指的是这种包裹的特征，鞘流包裹的好处在于能够让待测物溶液的流线稳定，便于激光检测，同时待测物不会与检测池接触，避免上一个样本对下一个样本的污染。
为解决现有技术存在的问题，在一实施例中，本发明提供了一种基于水力聚焦鞘流技术的单分子检测方法，结合激光荧光检测技术，能够实现对极低浓度被测物如蛋白、核酸等的高通量、低成本的检测。
根据第一方面，在一实施例中，提供一种免疫检测方法，包括：
检测步骤，包括提供含有载体免疫复合物的待测溶液，载体免疫复合物包含固相载体、发光材料以及待测物，在鞘流作用下，待测溶液流经检测区，采集检测区的固相载体的散射信号M以及发光材料的发光信号N；
计算步骤，包括根据采集自固相载体的散射信号M与采集自发光材料的发光信号N，计算得到待测溶液中待测物的浓度。
本发明的免疫检测方法既可以是单分子检测，也可以是常规浓度的免疫检测。
在一实施例中，参与计算的散射信号M、发光信号N可以包括信号幅度、信号宽度或信号的个数。
在一实施例中，计算步骤中，根据发光信号N与散射信号M所形成的散点图，计算超出发光信号阈值的发光信号个数占所有固相载体总数的比例R，当R≤预设阈值时，计算平均每个固相载体结合的发光材料数量AFN(Average Fluorophore Number)，根据AFN，计算得到待测溶液中待测物的浓度。
在一实施例中，计算步骤中，根据发光信号N与散射信号M所形成的散点图，计算超出(即≥)发光信号阈值的发光信号个数占所有固相载体总数的比例R，当R≤预设阈值时，根据如下公式计算平均每个固相载体结合的发光材料个数AFN(Average FluorophoreNumb er)：
AFN＝-ln(1-R) (1)。
此处的公式仅为示例性列举，具体算法不受限制，其他能够计算出平均每个固相载体结合的发光材料数量的算法均在本发明的保护范围内。在一实施例中，载体免疫复合物包括固相载体、第一结合物、直接或间接耦联有发光材料的第二结合物；发光材料可以直接耦联至第二结合物，即形成发光材料-第二结合物的形式，也可以通过至少一种第三结合物耦联至第二结合物，例如，可以是发光材料-第三结合物1-第三结合物2-第二结合物的形式，第三结合物1、第三结合物2为不同种类的第三结合物；
第一结合物结合至固相载体；
第一结合物特异性结合至待测物的第一位点，第二结合物特异性结合至待测物的第二位点。
在一实施例中，待测物包括蛋白或小分子，第一结合物包括捕获抗体，用于特异性结合至待测物的第一位点。
在一实施例中，蛋白包括但不限于抗原。
在一实施例中，蛋白包括但不限于心肌肌钙蛋白I(cTnI)、降钙素原(PCT，procalcit onin)、细胞因子等等中的至少一种。
在一实施例中，蛋白包括但不限于小分子。
在一实施例中，小分子可以包括分子量低于1000道尔顿的分子，如维生素D、总甲状腺素TT4，一般小分子的检测采用竞争法。
在一实施例中，待测物包括核酸，第一结合物包括用于捕获核酸的探针，即探针中包含可与核酸中的靶标序列反向互补配对的核苷酸序列。
在一实施例中，核酸包括但不限于DNA、RNA，可以是单链核酸、双链核酸中的至少一种。
在一实施例中，第二结合物包括检测抗体，用于特异性结合至待测物的第二位点。
在一实施例中，发光材料包括荧光团(亦称荧光物质)或上转换光致发光材料。
在一实施例中，荧光团包括具备光谱发射特性的标记物。
在一实施例中，荧光团可被可见光激发。
在一实施例中，荧光团的量子效率≥40％。
在一实施例中，荧光团的荧光信号强度值分布在仪器测量动态范围的10-2～10-5之间。
在一实施例中，荧光团包括但不限于荧光染料、荧光微球、量子点中的至少一种。
在一实施例中，固相载体包括但不限于磁珠、微球中的至少一种。
在一实施例中，磁珠的粒径≤3μm，包括但不限于0.5μm、1μm、2μm、3μm。磁珠的粒径相当于水力直径，也相当于平均直径。
在一实施例中，反应体系中可以只有单一粒径的磁珠，也可以含有多种粒径的磁珠。
在一实施例中，反应体系中可以含有单一种类的荧光染料，也可以含有多个种类的荧光染料。
在一实施例中，磁珠的粒径为1～3μm。
在一实施例中，检测步骤中，载体免疫复合物在鞘流包裹下经过检测区。
在一实施例中，检测步骤中，载体免疫复合物在鞘流包裹下逐个经过检测区。
在一实施例中，对于单分子浓度水平的免疫检测，检测步骤中，反应体系中固相载体的数目与待测物数目的比值≥5。即固相载体的数目相对待测物数目是过量的。
在一实施例中，对于常规或者高浓度样本，检测步骤中，待测物数目多于固相载体。
在一实施例中，检测步骤中，采集检测区的固相载体的散射信号M时，固相载体包括载体免疫复合物中的固相载体以及游离的固相载体。
在一实施例中，检测步骤中，载体免疫复合物在鞘流包裹下逐个经过检测区时，计算步骤中，单次测量过程中所统计的固相载体数目≥1万个。在一实施例中，检测步骤中的载体免疫复合物的制备方法包括：
第一复合物制备步骤，包括将第一结合物固化至固相载体，将固化有第一结合物的固相载体与待测样本混合，第一结合物特异性结合至待测样本中的待测物的第一位点，获得复合有固相载体、第一结合物、待测物的第一复合物；
第一清洗步骤，包括将固相载体固定，清洗去除反应体系中游离物；游离物主要为未结合至固相载体的第一结合物、未结合至第一结合物的待测物；
耦联步骤，包括将发光材料直接或间接耦联至第二结合物；
第二复合物制备步骤，包括将耦联有发光材料的第二结合物与第一复合物混合，第二结合物特异性结合至待测物的第二位点，获得复合有第一复合物、耦联有发光分子的第二结合物的第二复合物，即为载体免疫复合物；
第二清洗步骤，包括将固相载体固定，清洗去除反应体系中游离的第二结合物以及发光材料，获得清洗后的载体免疫复合物；
待测溶液制备步骤，包括将稀释液与第二清洗步骤获得的载体免疫复合物混合，制得可用于检测步骤的待测溶液。稀释液是一种液体，具体可以是悬浮液，能将清洗后的载体免疫复合物，以及固相载体(例如磁珠)制备成分布均匀的悬浮(suspension)液体状态。
在一实施例中，第一清洗步骤、第二清洗步骤中，在磁场作用下将载体免疫复合物，以及固相载体固定。
在一实施例中，第一清洗步骤、第二清洗步骤中，在磁场作用下将载体免疫复合物，以及固相载体固定至容器壁。
在一实施例中，计算步骤中，根据发光信号N与散射信号M所形成的散点图，计算超出发光信号阈值的发光信号个数占所有固相载体总数的比例R，当R＞预设阈值时，计算平均每个固相载体结合的发光材料个数AFN，根据AFN，计算得到待测溶液中待测物的浓度。
在一实施例中，计算步骤中，根据发光信号N与散射信号M所形成的散点图，计算超出(即≥)发光信号阈值的发光信号个数占所有载体免疫复合物信号的比例R，当R＞预设阈值时，根据如下公式计算得到平均每个固相载体结合的发光材料个数AFN(AverageFluorop hore Number)：
式(2)中，Iaverage是指散点图中超出(即≥)发光信号阈值的载体免疫复合物中发光材料所产生的平均发光信号脉冲高度或者脉冲面积；
Iaverage single是指固相载体平均结合一个发光材料时，载体免疫复合物中发光材料所产生的发光信号脉冲高度或者脉冲面积；
根据AFN，计算得到待测溶液中待测物的浓度。
根据第二方面，在一实施例中，提供一种单分子检测系统，包括：
检测模块，用于在鞘流作用下，使得包含载体免疫复合物的待测溶液流经检测区，载体免疫复合物包含固相载体、发光材料以及待测物，采集检测区固相载体的散射信号M以及发光材料的发光信号N；
计算步骤，用于根据采集自固相载体的散射信号M与采集自发光材料的发光信号N，计算得到待测溶液中待测物的浓度。
根据第三方面，在一实施例中，提供一种单分子检测装置，包括：
存储器，用于存储程序；
处理器，用于通过执行存储器存储的程序以实现如第一方面任意一项的方法。
根据第四方面，在一实施例中，提供一种计算机可读存储介质，介质上存储有程序，程序能够被处理器执行以实现如第一方面任意一项的免疫检测方法。
根据第五方面，在一实施例中，提供一种免疫检测系统，包括：
鞘流形成模块，用于形成层流，使得包含载体免疫复合物的待测溶液在鞘流包裹下经过检测区，载体免疫复合物包含可提供散射信号的固相载体、可提供发光信号的发光材料以及待测物；
激光发光检测模块，用于激发经过检测区的待测溶液中的物质产生散射信号和发光信号；
以及算法分析模块，用于分析激光发光检测模块产生的信号所形成的散点图，根据散点图中的散射信号和发光信号，计算得到待测溶液中待测物的浓度。
在一实施例中，算法分子模块还用于绘制定标曲线，根待测溶液中的物质产生的散射信号和发光信号，以及定标曲线，计算得到待测溶液中待测物的浓度。
在一实施例中，载体免疫复合物包括固相载体、第一结合物、直接或间接耦联有发光材料的第二结合物；
第一结合物结合至固相载体；
第一结合物特异性结合至待测物的第一位点，第二结合物特异性结合至待测物的第二位点。
根据第六方面，在一实施例中，提供一种载体免疫复合物，包括固相载体、第一结合物、直接或间接耦联有发光材料的第二结合物；
第一结合物结合至固相载体；
第一结合物用于特异性结合至待测物的第一位点，第二结合物用于特异性结合至待测物的第二位点。由于配制和检测的时间间隔相对较短，因此，该载体免疫复合物优选为现配现用。
在一实施例中，在能够保存的情况下，也可以预先配制载体免疫复合物，使用时从保藏设备中取出即可。
在一实施例中，载体免疫复合物的制备方法包括：
第一复合物制备步骤，包括将第一结合物固化至固相载体，将固化有第一结合物的固相载体与待测样本混合，第一结合物特异性结合至待测样本中的待测物的第一位点，获得复合有载体、第一结合物、待测物的第一复合物；
第一清洗步骤，包括将固相载体固定，清洗去除反应体系中的游离物，主要为游离的第一结合物；
耦联步骤，包括将发光材料直接或间接耦联至第二结合物；
第二复合物制备步骤，包括将耦联有发光材料的第二结合物与第一复合物混合，第二结合物特异性结合至待测物的第二位点，获得复合有第一复合物、耦联有发光材料的第二结合物的第二复合物，即为载体免疫复合物；
第二清洗步骤，包括将固相载体固定，清洗去除反应体系中的游离物，主要为游离的第二结合物以及发光材料，获得清洗后的载体免疫复合物；
待测溶液制备步骤，包括将稀释液与第二清洗步骤获得的载体免疫复合物混合，制得可用于检测步骤的待测溶液。
在一实施例中，第一清洗步骤、第二清洗步骤中，在磁场作用下将固相载体固定。
在一实施例中，第一清洗步骤、第二清洗步骤中，在磁场作用下将固相载体固定至容器壁。
根据第七方面，在一实施例中，提供一种试剂盒，包含第六方面任意一项的载体免疫复合物。
在一实施例中，磁珠为固相载体，具体实现步骤如下：
一、如图1所示为磁珠反应示意图，根据目标蛋白的特性，形成磁珠免疫复合物。
1.1将能与待测物(包括但不限于待测蛋白)101特异性结合的捕获抗体100a固化到磁珠100上，捕获抗体100a和待测物101的第一位点结合，从而捕获样品中的待测物，形成磁珠-捕获抗体-待测蛋白复合物。
1.2在磁场作用下将磁珠100固定在反应杯壁，清洗掉未结合的捕获抗体。
1.3将荧光微球102a耦联到检测抗体上，形成荧光二抗102。
1.4在反应体系中加入耦联后的检测抗体，检测抗体与待测物101的第二位点结合，形成磁珠抗原抗体-荧光微球免疫复合物。
1.5在磁场作用下将磁珠固定在反应杯壁，清洗掉未结合的检测抗体以及荧光微球。
1.6加入悬浮液，悬浮液可以是清洗液、底物等，使用不影响反应体系，对光透明且折射率符合要求的悬浮液，形成一定体积的待测溶液，并进行混匀，形成磁珠单分散体系。
图1中，100是磁珠，粒径一般在0.5μm～5μm之间，小粒径磁珠有更好的表面结合效率，但不易清洗，大粒径存在容易沉降的问题，故本发明中磁珠尺寸要求为不超过3μm，优选为1～3μm。
100a是固化在磁珠上的捕获抗体，利用抗原抗体特异性结合的原理捕获待测物。
101是待测物，可以是抗原、抗体或者核酸分子。
102是荧光二抗，包括检测抗体以及标记在该检测抗体上的荧光分子102a，荧光分子102a可在激发光的照射下发射出荧光，荧光分子可以是荧光微球、量子点或荧光染料等具备光谱发射特性的标记物质。
103为反应后的免疫复合物，包含有磁珠100、待测物101以及荧光二抗102。
图1所示的示意图仅是示意反应过程，可根据实际需要，将上述反应步骤拆成一步法或两步法进行。一步法是在反应中同时加入被测物、固相载体、荧光标记等。二步法，即先加入被测物、固相载体，清洗后，再加入荧光标记反应，再清洗。两种方法在测量范围上有差异。优选采用二步法，准确性更高。
二、如图2所示为鞘流检测示意图，将反应后的溶液通过水力聚焦原理，在鞘流包裹传送到检测区。
2.1利用第一动力装置301a，如注射器、蠕动泵等，从反应杯300中吸取一定量的反应液体(即待测溶液)，通过注射器等组件推动反应液进入流动室检测区。
2.2同时利用第二动力装置301b推动鞘液进入检测区。
2.3利用水力聚焦原理，形成层流，即鞘液和反应液形成两种液流，且鞘液包裹反应液。
2.4如图2右上侧方法图所示，磁珠免疫复合物103在鞘流的作用下，逐一经过检测区，形成数字化分离。
图2中，300是反应杯，用于进行磁珠、待测物以及荧光微球反应的场所，可以是一次性反应杯或者是固定的反应容器，反应杯300内的反应后的悬浮液在第一动力装置301a的作用下进入鞘流形成单元202a的样本针，302是鞘液池，其在第二动力装置301b的作用下进入鞘流形成单元202的鞘液通道，进入样本针的反应液体在鞘液的作用下，形成层流303，其中层流中的磁珠免疫复合物103，在光学系统整形光束201a的照射下，产生相应的散射信号和荧光信号。
三、检测磁珠免疫复合物经过检测区的散射信号和荧光信号。
如图3所示为检测光路示意图，检测磁珠免疫复合物的光学散射信号，至少包含一路前向散射信号和一路侧向散射信号，其中前向散射信号角度在1°～20°以内，侧向散射角度有别于前向散射收集信号，一般以90°垂直激光入射方向为收集中心线。
检测磁珠免疫复合物的荧光信号，其中荧光波长大于入射波长，检测信号包含脉冲的数量、峰值以及脉冲的面积等。
图3中，200是激光光源，可以是半导体激光或者固体激光器，201是光束整形模块，用于将激光光源出射的光束整形到与磁珠匹配的尺寸，本发明中，整形后的光束尺寸，在平行样本流动方向不超过300μm，在垂直样本流动方向不超过20μm，优选为5μm*200μm。
202是鞘流组件，包括有鞘流形成单元202a和光学检测单元202b，光学检测单元的材质一般是石英材料，在可见光波段具有良好的光谱通过率，其内孔是正方形或者长方形，边长一般在100～500μm之间。
203是前向散射光收集模块，204是荧光探测模块，205是侧向散射光收集模块。
四、算法分析
4.1形成至少两个散点图，散点图维度包含散射信号以及荧光信号。
4.2根据散点图信息，算法统计得到散射信号M以及荧光信号N，本实施例中，通过散射信号M可以得到所统计的固相载体的有效总数量，荧光信号N可以得到磁珠免疫复合物的有效数量。“有效”是指摒弃异常信号磁珠后得到的统计值。
计算说明如下：
在单分子级别检测中，被测物(即待测物)含量很低，如果加入过量的固相载体如磁珠，(本发明中参与反应的固相载体数目与被测物数目的比值不低于5，即参与反应的固相载体数目至少为被测物数目的5倍)，反应后大部分磁珠未结合被测物，少部分结合一个被测物，还有极少部分结合两个或三个被测物，这种结合的分布规律符合泊松分布。
以测试一个浓度为10fg/mL的心肌肌钙蛋白I(cTn I)样本为例，cTnI分子量约为24K，若参与反应的血清体积为100μL，则样本内所含cTnI分子总数约为2.5万个，若磁珠的数目选择为50万个，此时磁珠的数目与cTnI分子数目之比为20：1，即平均一个磁珠结合的cTn I分子以及发光材料的数目为0.05。
根据泊松分布，可以知道结合一个cTnI分子的磁珠占总磁珠的比例约为4.76％，结合两个cTnI分子的磁珠占总磁珠比例约为0.12％。
由此可知尽管结合两个及上cTnI分子的磁珠占总的比例很低，但直接统计结合一个cTn I分子的磁珠占总磁珠的比例4.76％，与实际的平均结合数目0.05相比仍有一定的偏差。
根据泊松分布的特点，我们可以采用未结合的比例进行换算，此例中，理论上结合数量的比例为(4.76％+0.12％)＝4.88％，根据公式(1)计算可以得到：
AFN＝-ln(1-4.88％)＝0.05
因此，通过计算出有效的发光信号N，根据公式(1)可以准确的计算出平均发光结合数目。
4.4根据预先绘制的AFN与待测物的标准曲线，计算得到待测物的浓度。
实施例1
本实施例设计一套利用磁珠法检测cTnI抗原分子的方法。
试剂体系信息如下：
被测抗原，采用重组人心肌肌钙蛋白复合物(I-C)，浓度为0.6mg/mL，缓冲液体系为10mM PBS，pH为7.4。
磁珠粒径为1μm，cTnI人源化单抗HAb209，磁珠已预先封闭以减少非特异性吸附，荧光二抗为cTnI人源化单抗HAb210荧光微球，粒径300nm，激发波长480nm，发射波长525nm
以及用于样本稀释液和清洗液，以上试剂盒采购于南京华鼎生物。
检测步骤如下：
①样本稀释：用样本稀释液将抗原稀释成0pg/mL、0.02pg/mL、0.1pg/mL、2pg/mL、200pg/mL；
②在反应杯中加入50μL各浓度梯度样本；
③加入混匀后的磁珠试剂20μL；
④混匀后在37℃下孵育15分钟；
⑤清洗液清洗3次；
⑥再加入100μL稀释后的荧光微球抗体(按体积计，稀释比例为1：10)；
⑦混匀后在37℃下孵育15分钟；
⑧清洗液清洗3次；
⑨加入100μL稀释液制备成悬浮待测试样本。
将上述待测样本在Beckman Cytoflex机型上进行检测，通道选择FITC，样本流选择中速30μL/min，检测时间为20s。
图4.1为单独磁珠的散点图，图4.2为0.02pg/mL样本的散点图。
对比两个图，可以看出，单独磁珠在FITC通道基本上无荧光信号，在结合抗原形成磁珠免疫复合物后，被激光照射后，在FITC通道产生荧光信号。
经过统计得到有效荧光信号的比例R为0.8％。
当抗原浓度逐步增加时，FITC通道的粒子个数逐步增加。图4.3和图4.4分别是抗原浓度为0.1pg/mL、2pg/mL时的散点图，计算得到的比例R分别是1.5％和4.5％
当浓度增加至200pg/mL时，此时绝大部分磁珠均已结合一个或多个cTnI抗原，在激光照射下，FITC通道荧光信号整体增强，如图4.5所示，其中FITC的峰值均值为6551，其中在0.1pg/mL时，由于抗原浓度水平较低，大部分磁珠未结合抗原，少部分磁珠结合一个抗原，结合两个以上的占比很少，因此可以以0.1pg/mL时荧光通道的信号均值作为平均结合一个荧光微球时的荧光强度，其值为3184，此时根据公式(2)可计算得到AFN＝6551/3184＝2.06。
表1
| 浓度 | AFN |
| 0 | 0.004 |
| 0.02pg/mL | 0.008 |
| 0.1pg/mL | 0.015 |
| 2pg/mL | 0.046 |
| 200pg/mL | 2.06 |
将上述AFN与抗原浓度绘制成图5所示的曲线，可知本发明能够检测到单分子水平的被测物。
在一实施例中，本发明解决现有技术方案存在的设计复杂、成本高的问题，本发明通过水力聚焦从物理原理上实现数字化分割，不需要微孔板耗材，同时磁珠用量更少，方便易获取，整个方案可以实现5个数量级的动态检测范围，同时通过改变磁珠的特征，如包被多种荧光染料即能够实现高通量、多标志物的检测。
在一实施例中，提供一种单分子检测装置，包含：
试剂加注模块，用于加注样本液以及反应试剂至反应模块；
反应模块，用于抗原抗体免疫反应；
磁珠清洗模块，用于清洗未形成免疫反应复合物的其余试剂成分；
鞘流形成模块，用于形成层流，其中磁珠在鞘流包裹下逐个经过检测区；
激光荧光检测模块，用于激发经过检测区的磁珠免疫复合物产生散射和荧光信号；
以及算法分析模块，用于分析上述激光荧光检测模块产生的信号所形成的散点图，以及定标曲线，计算待测蛋白的浓度信息。
在一实施例中，提供一种单分子检测系统，包括：
磁珠，其直径不超过3μm，优选2μm，且反应体系中磁珠的数目与待测蛋白分子数目的比值不低于5，且单次测量过程中所统计的磁珠数量不低于1万个；
荧光染料，可被可见光激发，量子效率不低于40％，且荧光信号强度值分布在仪器测量动态范围的10-2～10-5之间；
光学检测模块，包含至少一个可见光波段激光，且激光检测区域的容积不超过1000飞升；
至少收集两路散射信号和一路荧光信号，散射收集角度可以根据实际需要确定，前向散射信号收集角度可以为1°～20°，侧向散射信号收集角度可以为90°±28°；
鞘流形成模块，其中鞘流形成速度不超过10m/s，鞘流宽度不超过50μm；
算法处理模块，基于散点图信息做处理。
在一实施例中，关于光源激发方式，可将激光替换为LED、氙灯等非相干光源，配合滤光片使用。
在一实施例中，关于标记方式，可将荧光机理替换为上转发光机理，即激发波长比发光的发射波长要短，可以降低本底，但激发效率较低。
在一实施例中，荧光染料包括但不限于荧光微球、量子点以及荧光蛋白等等。
在一实施例中，检测方式包括但不限于如下方式：
一是同步检测：例如，由现有光电二极管、光电倍增管(PMT)、雪崩光电二极管(APD)等单阵元检测元器件，变为电荷耦合器件(CCD)、硅光电倍增管(Silicon photomultiplier，国际上简称SiPM)等多阵元光电探测器；
二是异步检测：如果标记的荧光染料寿命长，即可以通过时间分辨的方法来检测，即等激光关断后，在一定的时间内检测所激发的荧光信号；
三是单散射+荧光检测，即不同时采集前向散射和侧向散射信号，通过增加荧光的通道数量也可以达到类似目的。
在一实施例中，鞘流可以通过微流控的方式实现。
本领域技术人员可以理解，上述实施方式中各种方法的全部或部分功能可以通过硬件的方式实现，也可以通过计算机程序的方式实现。当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序可以存储于一计算机可读存储介质中，存储介质可以包括：只读存储器、随机存储器、磁盘、光盘、硬盘等，通过计算机执行该程序以实现上述功能。例如，将程序存储在设备的存储器中，当通过处理器执行存储器中程序，即可实现上述全部或部分功能。另外，当上述实施方式中全部或部分功能通过计算机程序的方式实现时，该程序也可以存储在服务器、另一计算机、磁盘、光盘、闪存盘或移动硬盘等存储介质中，通过下载或复制保存到本地设备的存储器中，或对本地设备的系统进行版本更新，当通过处理器执行存储器中的程序时，即可实现上述实施方式中全部或部分功能。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
Claims (10)
1.一种免疫检测方法，其特征在于，包括：
检测步骤，包括提供含有载体免疫复合物的待测溶液，所述载体免疫复合物包含固相载体、发光材料以及待测物，在鞘流作用下，所述待测溶液流经检测区，采集检测区的固相载体的散射信号M以及发光材料的发光信号N；
计算步骤，包括根据采集自固相载体的散射信号M与采集自发光材料的发光信号N，计算得到所述待测溶液中待测物的浓度。
2.如权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，计算步骤中，根据发光信号N与散射信号M所形成的散点图，计算超出发光信号阈值的发光信号个数占所有固相载体总数的比例R，当R≤预设阈值时，计算平均每个固相载体结合的发光材料数量AFN(Average Fluorophore Number)，根据所述AFN，计算得到所述待测溶液中待测物的浓度。
3.如权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，计算步骤中，根据发光信号N与散射信号M所形成的散点图，计算超出发光信号阈值的发光信号个数占所有固相载体总数的比例R，当R≤预设阈值时，根据如下公式计算得到平均固相载体结合发光材料个数AFN：
AFN＝-ln(1-R) (1)；
优选地，检测步骤中，所述载体免疫复合物包括固相载体、第一结合物、直接或间接耦联有发光材料的第二结合物；
所述第一结合物结合至所述固相载体；
所述第一结合物特异性结合至所述待测物的第一位点，所述第二结合物特异性结合至所述待测物的第二位点；
优选地，检测步骤中，所述待测物包括蛋白，所述第一结合物包括捕获抗体，用于特异性结合至所述待测物的第一位点；
优选地，所述待测物包括核酸，所述第一结合物包括用于捕获所述核酸的探针；
优选地，所述第二结合物包括检测抗体，用于特异性结合至待测物的第二位点；
优选地，所述发光材料包括荧光团或上转换光致发光材料；
优选地，所述荧光团包括具备光谱发射特性的标记物；
优选地，所述荧光团包括荧光染料、荧光微球、量子点中的至少一种。
4.如权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，所述检测步骤中，所述固相载体包括磁珠、微粒中的至少一种；
优选地，所述磁珠的粒径≤3μm；
优选地，所述检测步骤中，所述载体免疫复合物在鞘流包裹下经过检测区；
优选地，所述检测步骤中，所述载体免疫复合物在鞘流包裹下逐个经过检测区；
优选地，所述检测步骤中，反应体系中固相载体的数目与待测物数目的比值≥5；
优选地，所述检测步骤中，采集检测区的固相载体的散射信号M时，所述固相载体包括载体免疫复合物中的固相载体以及游离的固相载体。
5.如权利要求1所述的免疫检测方法，其特征在于，所述检测步骤中的载体免疫复合物的制备方法包括：
第一复合物制备步骤，包括将第一结合物固化至固相载体，将固化有第一结合物的固相载体与待测样本混合，所述第一结合物特异性结合至待测样本中的待测物的第一位点，获得复合有固相载体、第一结合物、待测物的第一复合物；
第一清洗步骤，包括将所述固相载体固定，清洗去除反应体系中的游离物；
耦联步骤，包括将发光材料直接或间接耦联至第二结合物；
第二复合物制备步骤，包括将耦联有发光材料的第二结合物与所述第一复合物混合，所述第二结合物特异性结合至待测物的第二位点，获得复合有第一复合物、耦联有发光材料的第二结合物的第二复合物，即为所述载体免疫复合物；
第二清洗步骤，包括将固相载体固定，清洗去除反应体系中游离的第二结合物以及发光材料，获得清洗后的载体免疫复合物；
待测溶液制备步骤，包括将稀释液与第二清洗步骤获得的载体免疫复合物混合，制得可用于检测步骤的待测溶液；
优选地，所述第一清洗步骤、第二清洗步骤中，在磁场作用下将所述固相载体固定；
优选地，所述计算步骤中，根据发光信号N与散射信号M所形成的散点图，计算超出发光信号阈值的发光信号个数占所有固相载体总数的比例R，当R＞预设阈值时，计算平均每个固相载体结合的发光材料个数AFN，根据所述AFN计算得到待测溶液中待测物的浓度；
优选地，所述计算步骤中，根据发光信号N与散射信号M所形成的散点图，计算超出发光信号阈值的发光信号个数占所有固相载体总数的比例R，当R＞预设阈值时，根据如下公式计算得到平均每个固相载体结合的发光材料个数AFN(Average Fluorophore Number)：
式(2)中，Iaverage是指散点图中超出发光信号阈值的载体免疫复合物中发光材料所产生的平均发光信号脉冲高度或者脉冲面积；
Iaveragesingle是指平均每个固相载体结合一个发光材料时，载体免疫复合物中发光材料所产生的发光信号脉冲高度或者脉冲面积；
根据所述AFN，计算得到待测溶液中待测物的浓度；
优选地，所述计算步骤中，根据采集自固相载体的散射信号M与采集自发光材料的发光信号N，以及预先绘制的定标曲线，计算得到待测溶液中待测物的浓度。
6.一种免疫检测系统，其特征在于，包括：
检测模块，用于在鞘流作用下，使得包含载体免疫复合物的待测溶液流经检测区，所述载体免疫复合物包含固相载体、发光材料以及待测物，采集检测区固相载体的散射信号M以及发光材料的发光信号N；
计算步骤，用于根据采集自固相载体的散射信号M与采集自发光材料的发光信号N，计算得到所述待测溶液中待测物的浓度。
7.一种免疫检测装置，其特征在于，包括：
存储器，用于存储程序；
处理器，用于通过执行所述存储器存储的程序以实现如权利要求1～5任意一项所述的免疫检测方法。
8.一种计算机可读存储介质，其特征在于，所述介质上存储有程序，所述程序能够被处理器执行以实现如权利要求1～5任意一项所述的免疫检测方法。
9.一种载体免疫复合物，其特征在于，包括固相载体、第一结合物、直接或间接耦联有发光材料的第二结合物；
所述第一结合物结合至所述固相载体；
所述第一结合物用于特异性结合至待测物的第一位点，所述第二结合物用于特异性结合至待测物的第二位点。
10.一种试剂盒，其特征在于，包含如权利要求9所述的载体免疫复合物。
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| CN202211721046.3A CN116298240A (zh) | 2022-12-30 | 2022-12-30 | 一种免疫检测方法及系统 |
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- 2022-12-30 CN CN202211721046.3A patent/CN116298240A/zh active Pending
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