CN103193884A - 一种检测杂色曲霉素的elisa试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测杂色曲霉素的ELISA试剂盒，所述试剂盒包括抗杂色曲霉素抗体，所述抗体包括轻链和重链，其中轻链的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，重链的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示，本发明公开了制备上述抗体的方法。本发明所述的ELISA检测试剂盒，还包括辣根过氧化物酶底物缓冲液、蛋白标准品ST(100ug/ml，0.1ml)、包被原BSA-ST、阴性对照样品BSA，本发明同时还公开了上述试剂盒的使用方法。

Description

一种检测杂色曲霉素的ELISA试剂盒

技术领域

本发明涉及生物化学领域。具体而言，本发明涉及检测杂色曲霉素的ELISA试剂盒。

背景技术

杂色曲霉素(Sterigmatocys简称ST)是一种杂环化合物(图)具有很强的肝及肾脏毒素，能诱发多种肿瘤。南非某些地区的肝癌高发可能与ST有关。杂色曲霉素是，可导致胆管癌和肝癌，有致突变性，但对食品的污染频率较低。ST还可转化成更强烈的致癌物黄曲霉毒素。ST还能引起一些动物疾病。ST可有10多种真菌代谢产生，在人工培养基的产量高达10g/kg。已知可被ST污染的食品包括：大米、小麦、玉米、花生、大豆、火腿、奶酪、咖啡等。杂色曲霉素经三氯化铝喷雾后加热，可在365nm波长紫外光下呈黄色荧光。卫生研究所建立的检测杂色曲霉素的薄层色谱法已于1984年列为国家标准(GB/T5009.25-1996)。该法对大米、玉米、小麦的最低检出量为25μg/kg，黄豆、花生为50μg/kg。杂色曲霉素的结构如下：

由于ST危害大，分布广，要减少其对人畜的影响，有效而快速的检测食物及饲料中的ST就显得非常重要。确诊ST中毒则更有赖于从患者的组织或分泌物、排泄物中检出。与传统应用的生物学检测法、薄层层析法(TLC)、高效液相色谱法(HPLC)等相比，免疫化学检测法对真菌毒素的检测具有快速、特异、灵敏、准确、可以批量检测、样品处理简单、能实现自动化操作等优点。而免疫化学检测ST的前提则是需要具备针对ST的抗体。

因化学加工、人为添加而引入食品中的有毒化合物所造成的危害是可以被预防的；而以食品的天然组分形式存在的天然霉菌毒素则不易被识别，且由于潜在毒性大，从而会对消费者的健康造成很大的威胁。霉菌毒素是霉菌次级代谢产物，属于化学污染物，对人和动物都会产生非常严重的危害。拿黄曲霉毒素来说，含有黄曲霉毒素的食品被人误食后容易出现肝脏病变，甚至导致肝癌；所以，重视霉菌毒素检测是非常迫切的问题。

越早进行霉菌毒素检测就越容易将霉菌毒素产生的危害降到最低。如能从源头就发现霉菌毒素，则更便于及早采取合理的措施控制霉菌毒素，以免受霉菌毒素污染的饲料给养殖业带来危害，从而使企业包括食品安全蒙上阴影。实际操作中，如果在饲料原料采购环节就采用快速筛选的方法，查看饲料原料是否含有霉菌毒素，则可以使企业避免使用含霉菌毒素的原料生产饲料。所以，研制对霉菌毒素快速、高灵敏、高特异性的检测方法显得尤为重要.

高效液相色谱、质谱检测法，可做出精确定性定量测定，运用恰当甚至可测到各组分的含量，它们灵敏度高、选择性强，有极好的发展前景，但是样品前处理要求严格，标准品纯度有一定的要求，而且仪器昂贵，测试人员往往还要进行专门的培训，因此成本较高。所以，仅适合大型企业或对检测灵敏度要求较高的单位使用。为解决上述问题，本发明公开了一种杂色曲霉素检测ELISA试剂盒，所述试剂盒使用方便，灵敏度高，价格便宜便于大规模推广使用。

发明内容

本发明公开了一种杂色曲霉素的抗体，所述单克隆抗体包括轻链和重链，轻链和重链可变区氨基酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示。

本发明所述抗体是通过从噬菌体库筛选得到，具体方法如下：

1)将杂色曲霉素标准品以5μg/孔浓度用50μl0.1M NaHCO₃(PH8.6)溶液包被2孔，4℃过夜，用150ml3％BSA37℃封闭1小时，弃封闭液，每孔加入50μl新鲜噬菌体抗体库，37℃孵育2小时，弃未结合噬菌体，用0.5％TBST冲洗5次(第二次10次、第三、四次15次)，每次冲洗用移液器吹打10-20次；吸净液体后每孔加入1ml0.1M甘氨酸-HCl pH＝2.2洗脱，中间不时吹打，10min后加入40μl2mol/L Tris中和，将洗脱的噬菌体加入2ml新鲜制备的XL₁-Blue菌液(OD600＝1)中，室温孵育15分钟，加入6ml含有氨苄青霉素和四环素的SB培养基，37℃250rpm转摇2小时，加入91ml含有氨苄青霉素和四环素的SB培养基和1ml滴度为10¹²pfu/ml的辅助噬菌体VCSM13，37℃300rpm转摇2小时后加入卡那霉素至70μg/ml，37℃300rpm转摇过夜；3000g转离心15分钟后，上清用PEG8000沉淀，经15000g，4℃离心15分钟后用2ml含1％BSA的TBS PH7.4重悬沉淀，12000rpm离心5分钟，上清过滤保存，取50μl加入已包被杂色曲霉素标准品的酶标板中，如此反复富集4次；

2)将4次富集的噬菌体稀释10⁶、10⁷、10⁸倍，各取1μl加入到49μl新鲜制备的XL₁-Blue菌液，室温感染15分钟，涂氨苄抗性LB板；第二天选择合适菌落密度的板挑单克隆菌落，每个单克隆菌落加入到2ml含氨苄青霉素的SB培养基中37℃300rpm振荡培养6小时，各加入8μl0.5M IPTG，37℃300rpm转摇过夜；

3)将ST/BSA蛋白，及纯BSA蛋白作为阴性交叉分别进行ELSIA实验，以1μg/ml浓度用100μl0.1M NaHCO₃(PH8.6)溶液包被，4℃过夜；第二天用200ml3％BSA37℃封闭1小时，弃封闭液，0.05％PBST洗一遍，加入100μl过夜诱导的细菌上清，37℃孵育1小时，0.05％PBST洗三遍；加入100μl以1∶30000稀释的酶标抗人Fab二抗，37℃孵育1小时，0.05％PBST洗三遍；用TMB显色30分钟，2M H₂SO₄终止，酶标仪检测吸光度A值；本发明通过上述方法筛选得到只针对ST的噬菌体一株；

4)将上述第3)部得到噬菌体的噬菌粒载体为模板，通过下述抗体可变区基因扩增引物扩增得到抗杂色曲霉素抗体(命名为ASP1)的可变区；

将上述PCR扩增得到ASP1序列克隆到原核表达载体pET28a上，转化BL21菌株后，可以表达产生重组人ScFv抗体，经过SDS-PAGE电泳检测，显示得到了比较单一的条带；

Westem试验进一步证实，表达抗体ASP1可以被抗his标签酶标二抗特异性识别(见图4)，证明抗体ASP1分子得到有效表达；HIS单抗Westem Blot杂交纯化后的抗体ASP1，证明融合后的PET-28A-ScFv得到有效表达(图4各泳道是不同浓度的抗杂色曲霉素抗体ASP1的结果)；

Westem blot试验结果表明原核表达的ASP1抗体均能与BSA+ST有限反应，同时不识别纯的BSA，表明制备得到的ASP1抗体可以特异识别ST而不是载体BSA；Westem Blot试验证实：表达的ASP1抗体蛋白可以和ST单体结合，证明了抗体库筛选得到的ScFv抗体能在独立于噬菌体衣壳蛋白gIII的情况下，依然具有特异性识别ST的活性，Westem blot检测图见图5。

本发明公开了利用上述得到的ASP1抗体，制备一种检测杂色曲霉素的ELISA试剂盒。

本发明所述的一种检测杂色曲霉素的ELISA试剂盒，包括：HRP标记的抗杂色曲霉素ASP1抗体(HRP-Sulfo-SMCC-ASP1)、辣根过氧化物酶底物缓冲液、蛋白标准品ST(100ug/ml，0.1ml)、包被原BSA-ST、阴性对照样品BSA。其中辣根过氧化物酶底物缓冲液：称取10mg3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)溶于5ml无水乙醇中制备成TMB贮存液。待使用时取0.5ml TMB贮存液加到10ml磷酸柠檬酸底物缓冲液(0.2MNa₂HPO₄，0.1M柠檬酸)中，再加入32μl0.75％H₂O₂混匀，配置成辣根过氧化物酶底物缓冲液。

本发明还公开了上述ELISA试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

a)用包被液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液)稀释BSA-ST至浓度为2μg/ml，取稀释后的BSA-ST加入酶标板中，每孔100μl，4℃过夜；

b)洗涤液(PH7.4PBS)清洗酶标板3次，每次在摇床上摇5-8min；

c)将待测样品和100μl按1；3000-1；5000稀释的HRP-Sulfo-SMCC-ASP1稀释液，同时加入到包被的酶标板中，37℃孵育2h，每个样品包被2个孔，同时将标准品进行梯度稀释依次为5ng/ml、10ng/ml、40ng/ml、160ng/ml、640ng/ml、2560ng/ml，每孔100μl；

d)再用洗涤液清洗3次，加辣根过氧化物酶底物缓冲液100μl，显色5min后，加入终止液100μl，终止显色；

e)用酶标仪检测OD450的值，依据标准品的吸光值制备标准曲线，从而根据吸光值判断所测样品中ST的浓度。

本发明通过系列稀释标准品检测所述试剂盒的灵敏性，结果显示所述的试剂盒能检测的最低量为1ng，在0.5～256ng之间具有良好的线性关系。

本发明通过黄曲霉毒素M1(Aflatoxins M1，AFM1)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)、BSA、BSA-ST检测本发明ELISA试剂盒的特异性，结果显示本发明试剂盒能够特异性识别杂色曲霉素。

附图说明

图1抗杂色曲霉素抗体PCR扩增产物琼脂糖电泳图，1-4重复5：Maker，6：pET28a；

图2ASP1抗体的原核表达载体酶切鉴定琼脂糖电泳图，1-16重复，17：Maker；18-20：pET28a。

图3ASP1抗体原核表达及纯化SDS-PAGE电泳图，1：marker，2：诱导后的全菌裂解液，3：NI柱纯化洗脱1(ASP1抗体)，4：NI柱纯化洗脱2(ASP1抗体及杂蛋白)；

图4ASP1抗体用抗his标签酶标二抗的Westem Blot检测结果，各泳道是不同浓度的抗杂色曲霉素抗体ASP1；

图5不同浓度ASP1抗体分别与偶联了BSA的杂色曲霉素和BSA的WesternBlot的结合情况，二抗：羊抗人-HRP1∶10000稀释，1：BSA-ST泳道ASP1抗体浓度1∶5000；2：BSA-ST泳道ASP1抗体浓度1∶10000；3：纯BSA泳道ASP1抗体浓度1∶5000；4：纯BSA泳道ASP1抗体浓度1∶10000；ECL：Millipore(Merck)WBKLS0500曝光5秒；

图6标准品ST制备的标准曲线；

图7检测杂色曲霉素ELISA试剂盒的特异性检测，AFM1：黄曲霉毒素M1，ZEN：玉米赤霉烯酮，P：杂色曲霉素阳性样品，N：PBS，阴性对照：BSA，阳性对照：杂色曲霉素标准品。

具体实施方式

通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。

实施例1抗杂色曲霉素抗体的制备

一、材料

杂色曲霉素标准品购自FERMENTEK公司；辅助噬菌体VCSM13、甘氨酸、抗人Fab二抗、SB培养基、氨苄青霉素、四环素、卡那霉素、PEG8000、XL₁-Blue细；凡未说明的试剂和材料均为市购。

二、方法和结果

1.噬菌体库的扩增

50μl XLI-Blue加入50mlSB培养基中250rpm，37度振荡培养2h。加入10μl噬菌体原库，室温感染15min，加入25μl100mg/ml氨苄，300rpm，37度摇2h。加入148ml含有氨苄青霉素和四环素的SB培养基和2ml滴度为10¹²pfu/ml的辅助噬菌体VCSM13，37℃300rpm转摇2小时后加入卡那霉素至70μg/ml，37℃300rpm转摇过夜。3000g转离心15分钟后上清用PEG8000沉淀，经15000g4℃离心15分钟后用2ml含1％BSA的TBS PH7.4重悬沉淀，全速离心5分钟，上清为新鲜噬菌体抗体库

2.噬菌体抗体库的富集

将杂色曲霉素标准品以5μg/孔浓度用50μl0.1M NaHCO₃(PH8.6)溶液包被2孔，4℃过夜，用150ml3％BSA37℃封闭1小时，弃封闭液，每孔加入50μl新鲜噬菌体抗体库，37℃孵育2小时，弃未结合噬菌体，用0.5％TBST冲洗5次(第二次10次、第三、四次15次)，每次冲洗用移液器吹打10-20次；吸净液体后每孔加入1ml0.1M甘氨酸-HCl pH＝2.2洗脱，中间不时吹打，10min后加入40μl2mol/L Tris中和，将洗脱的噬菌体加入2ml新鲜制备的XL₁-Blue菌液(OD600＝1)中，室温孵育15分钟，加入6ml含有氨苄青霉素和四环素的SB培养基，37℃250rpm转摇2小时，加入91ml含有氨苄青霉素和四环素的SB培养基和1ml滴度为10¹²pfu/ml的辅助噬菌体VCSM13，37℃300rpm转摇2小时后加入卡那霉素至70μg/ml，37℃300rpm转摇过夜。3000g转离心15分钟后，上清用PEG8000沉淀，经15000g，4℃离心15分钟后用2ml含1％BSA的TBS PH7.4重悬沉淀，12000rpm离心5分钟，上清过滤保存，取50μl加入已包被杂色曲霉素标准品的酶标板中，如此反复富集4次。

3.ScFv段抗体的小量诱导表达

将4次富集的噬菌体稀释10⁶、10⁷、10⁸倍，各取1μl加入到49μl新鲜制备的XL₁-Blue菌液，室温感染15分钟，涂氨苄抗性LB板。第二天选择合适菌落密度的板挑单克隆菌落，每个单克隆菌落加入到2ml含氨苄青霉素的SB培养基中37℃300rpm振荡培养6小时，各加入8μl0.5M IPTG，37℃300rpm转摇过夜。

4.ELSA方法筛选阳性克隆

将ST/BSA蛋白，及纯BSA蛋白作为阴性交叉分别进行ELSIA实验，以1μg/ml浓度用100μl0.1M NaHCO₃(PH8.6)溶液包被，4℃过夜。第二天用200ml3％BSA37℃封闭1小时，弃封闭液，0.05％PBST洗一遍，加入100μl过夜诱导的细菌上清，37℃孵育1小时，0.05％PBST洗三遍。加入100μl以1；30000稀释的酶标抗人Fab二抗，37℃孵育1小时，0.05％PBST洗三遍。用TMB显色30分钟，2M H₂SO₄终止，酶标仪检测吸光度A值。

本发明通过上述方法筛选得到只针对ST的噬菌体一株。

实施例2抗杂色曲霉素抗体基因的钓取及其原核表达

一、材料

Promega；DNA聚合酶One Taq：New England Biolabs；DNA片段纯化试剂盒：OMEGA生物科技公司产品；T4DNA连接酶：New England Biolabs产品；感受态细菌JM109：购自Promega公司；pET28a载体。其余试剂或材料均为市购。

抗体可变区基因扩增引物见表1，由Invitorgen公司合成，

表1抗体可变区基因扩增引物

pAS：TTGCAAGCTTATGAGGAGACGGTGACCA
	pA2S：TGACGAATTCGAAATTGTGTTGACGCAGT
pA8S：CCTCGAATTCCAGTCTGTGCTGACTCAG
	pB2S：CGTAGAATTCTCCTCTGAGCTGACTCAGG

pC11S：CGATGAATTCCAGTCTGTGCTGACGCA

二、方法和结果

1、抗杂色曲霉素抗体基因的钓取：利用PCR技术，以上述特异性引物，以实施例1得到噬菌体的噬菌粒载体为模板扩增出抗杂色曲霉素抗体(命名为ASP1)的可变区，作为ScFv的表达基因，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，成功扩增出约750bp产物(见图1)，并送华大测序，轻链和重链可变区氨基酸序列分别如序列表SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2所示。

2、抗杂色曲霉素抗体基因克隆到表达载体上：将上述PCR产物经EcoRI/Hind III双酶切，与同样酶切pET28a载体连接，转化宿主菌JM109，挑取白色单克隆集落，震荡培养后提取质粒。经PCR及酶切处理，两种方法电泳鉴定结果均显示有约750bp大小的目的条带，与预期待插入片段的大小一致(见图2)，提示ScFv原核表达质粒构建成功。

3、抗杂色曲霉素抗体ASP1诱导表达纯化及检测：筛选出来的抗ST单克隆抗体ASP1的基因以ScFv形式插入pET28a载体，转化BL21菌株后，可以表达产生重组人ScFv抗体。经过SDS-PAGE电泳显示了比较单一的条带(电泳图见图3)。

Western试验进一步证实，表达抗体ASP1可以被抗his标签酶标二抗特异性识别(见图4)，证明抗体ASP1分子得到有效表达。HIS单抗Western Blot杂交纯化后的抗体ASP1，证明融合后的PET-28A-ScFv得到有效表达(图4各泳道是不同浓度的抗杂色曲霉素抗体ASP1的结果)。

4、原核表达抗杂色曲霉素抗体ASP1的检测：

Western blot试验结果表明原核表达的ASP1抗体均能与BSA+ST有限反应，同时不识别纯的BSA表明制备得到的ASP1抗体可以特异识别ST而不是载体BSA。Western Blot试验证实：表达的ASP1抗体蛋白可以和ST单体结合，证明了抗体库筛选得到的ScFv抗体能在独立于噬菌体衣壳蛋白gIII的情况下，依然具有特异性识别ST的活性，Western blot检测图见图5。

实施例3一种检测杂色曲霉素的ELISA检测试剂盒的制备

1、材料

抗杂色曲霉素ASP1抗体、辣根过氧化物酶(HRP)、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(sulfo-SMCC)、Sephadex G25、磷酸盐缓冲液(PBS)、BSA、ST、NaBH₄。

2、方法

2.1.抗杂色曲霉素ASP1抗体与辣根过氧化物酶的偶联

1)纯化好的ASP1抗体进行0.01M PBS透析去除所有可能的含有NH3的物质，比如TRIS碱等，3M NaOH调节PH值7左右。

2)按Sulfo-SMCC说明书，用纯水溶解sulfo-SMCC，ASP1抗体与Sulfo-SMCC＝1∶100的比率，在搅拌下把sulfo-SMCC溶液逐滴缓慢加入ASP1抗体溶液中，室温搅拌30min以上。

3)用平衡缓冲液平衡Sephadex G25柱30min，把反应好的sulfo-smcc/ASP1抗体混合液体过柱，用紫外检测仪器收集蛋白偶联物最高峰，以去除游离的sulfo-smcc。

4)取与ASP1抗体等量的HRP用PBS溶解，然后在搅拌的情况下，缓慢加入到ASP1+Sulfo-SMCC复合物中，室温反应2小时以上。

5)通过分子筛层析去掉，未偶联的HRP和ASP1+Sulfo-SMCC，最终得到彻底偶联在一起的HRP-Sulfo-SMCC-ASP1复合物。

6)将标记的抗体添加20％-50％甘油于-20℃保存。

2.2.ST与BSA的偶联

由于ST分子量较小，不能有效的包被在目前市场常见的酶标板上，所以需要将ST与BSA偶联，具体方法如下：

ST与稀硫酸在热水浴中回流衍生成ST半缩醛衍生物，ST半缩醛衍生物经过硅胶G层析柱纯化后在中性磷酸盐缓冲液中(PBS)与牛血清白蛋白(BSA)反应5小时，低温下加入NaBH4还原，再用稀盐酸除掉过量的NaBH4，然后兑水透析，备用。由此得到复合抗原BSA-ST，分装冻干，免疫动物。用紫外吸收光谱确定BSA与ST的偶联率。

2.3.检测杂色曲霉素的ELISA试剂盒组装

检测杂色曲霉素的ELISA试剂盒包括：HRP标记的抗杂色曲霉素ASP1抗体(HRP-Sulfo-SMCC-ASP1)、辣根过氧化物酶底物缓冲液、蛋白标准品ST(100ug/ml，0.1ml)、包被原BSA-ST、阴性对照样品BSA。其中辣根过氧化物酶底物缓冲液：称取10mg3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)溶于5ml无水乙醇中制备成TMB贮存液。待使用时取0.5ml TMB贮存液加到10ml磷酸柠檬酸底物缓冲液(0.2MNa₂HPO₄，0.1M柠檬酸)中，再加入32μl0.75％H₂O₂混匀，配置成辣根过氧化物酶底物缓冲液。

2.4检测杂色曲霉素的ELISA试剂盒的使用方法：

a)用包被液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液)稀释BSA-ST至浓度为2μg/ml，取稀释后的BSA-ST加入酶标板中，每孔100μl，4℃过夜；

b)洗涤液(PH7.4PBS)清洗酶标板3次，每次在摇床上摇5-8min；

c)将待测样品和100μl按1∶3000-1∶5000稀释的HRP-Sulfo-SMCC-ASP1稀释液，同时加入到包被的酶标板中，37℃孵育2h，每个样品包被2个孔，同时将标准品进行梯度稀释依次为5ng/ml、10ng/ml、40ng/ml、160ng/ml、640ng/ml、2560ng/ml，每孔100μl；

d)再用洗涤液清洗3次，加辣根过氧化物酶底物缓冲液100μl，显色5min后，加入终止液100μl，终止显色；

e)用酶标仪检测OD450的值，依据标准品的吸光值制备标准曲线，从而根据吸光值判断所测样品中ST的浓度。

实施例5一种检测杂色曲霉素的ELISA试剂盒的灵敏性检测

通过标准品检测实施例4所制备的ELISA试剂盒的灵敏度，标准品ST的稀释度如下：0ng/ml、1.25ng/ml、2.5ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、40ng/ml、160ng/ml、640ng/ml、2560ng/mml，ELISA步骤如实施例4所述，结果见表2，

表2不同浓度ST检测吸光值

以上结果显示，本发明所述的试剂盒能检测的最低量为1ng，在0.5～256ng之间具有显著的线性关系，由上述标准品制备的标准曲线如图6所示。

实施例6一种检测杂色曲霉素的ELISA试剂盒的特异性分析

1、材料

黄曲霉毒素M1(Aflatoxins M1，AFM1)、玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)、

PBS、杂色曲霉素阳性样品、BSA-ST、ELISA包被液、PBST、TMB、H₂SO₄。

2、方法和结果

用包被液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液)稀释BSA-ST至浓度为2μg/ml，取稀释后的BSA-ST加入酶标板中，每孔100μl，4℃过夜；洗涤液(PH7.4PBS)清洗酶标板3次；

取100μl黄曲霉毒素M1(1ng/μl)、玉米赤霉烯酮(1ng/μl)，100μl阳性样品：杂色曲霉素阳性样品(P)、100μl阴性样品：PBS(N)，100μl BSA(阴性对照样品1ng/μl)，100μl杂色曲霉素标准品(阳性对照1ng/μl)；将上述各样品和100μl按1∶3000-1∶5000稀释的HRP-Sulfo-SMCC-ASP1稀释液混匀后，同时加入到包被的酶标板中，37℃孵育2h，每个样品包被2个孔。其它步骤同上述的ELISA实验步骤。

实验结果显示，本发明的ELISA试剂盒能特异性的与杂色曲霉素结合，实验结果吸光值如表3和图7。

表3ELISA试剂盒的特异性测定结果

由于本发明采用的是间接竞争ELISA的方法检测样品中杂色曲霉素的含量，包被抗原(BSA-ST)与目标抗原(样品中游离的ST)竞争抗体，当游离的目标抗原ST越多，其与HRP标记的抗杂色曲霉素ASP1抗体(HRP-Sulfo-SMCC-ASP1)结合的就越多，导致标记的抗体与包被的抗原结合就越少，导致吸光值就越少，反之样品中游离目的抗原ST越少，标记的抗体越多的与包被的抗原结合就越多，导致吸光值就越少，所以吸光值越大代表样品中ST越少。以上实验结果显示：本发明所述的试剂盒只能特异性的与ST结合，与黄曲霉毒素M1(AFM1)和玉米赤霉烯酮(ZEN)无交叉反应。

Claims (8)

1.一种抗杂色曲霉素的抗体，其特征在于，所述的抗体包括轻链和重链，其中所述轻链的氨基酸的序列如序列表SEQ ID NO：1所示，所述重链的氨基酸的序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

2.编码权利要求1所述抗体的核苷酸序列。

3.权利要求1所述的抗体在制备检测杂色曲霉素试剂、药剂或试剂盒中的应用。

4.一种检测杂色曲霉素的ELISA试剂盒，包括权利要求1所述的抗体。

5.权利要求4所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的抗体带有生物标记或化学标记，所述生物标记或化学标记为荧光标记、放射性标记或酶标记。

6.权利要求5所述的ELISA试剂盒，其特征在于，所述的酶标记为辣根过氧化酶标记。

7.权利要求5所述的ELISA试剂盒，还包括：辣根过氧化物酶底物缓冲液、杂色曲霉素标准品、偶联BSA的杂色曲霉素、阴性对照样品BSA。

8.一种检测杂色曲霉素的方法，包括以下步骤：

a)用包被液(PH9.60.05M碳酸盐缓冲液)稀释BSA-ST至浓度为2μg/ml，取稀释后的BSA-ST加入酶标板中，每孔100μl，4℃过夜；

b)洗涤液(PH7.4PBS)清洗酶标板3次，每次在摇床上摇5-8min；

c)将待测样品和100μl按1∶3000-1∶5000稀释的HRP-Sulfo-SMCC-ASP1稀释液，同时加入到包被的酶标板中，37℃孵育2h，每个样品包被2个孔，同时将标准品进行梯度稀释依次为5ng/ml、10ng/ml、40ng/ml、160ng/ml、640ng/ml、2560ng/ml，每孔100μl；

d)再用洗涤液清洗3次，加辣根过氧化物酶底物缓冲液100μl，显色5min后，加入终止液100μl，终止显色；

e)用酶标仪检测OD450的值，依据标准品的吸光值制备标准曲线，从而根据吸光值判断所测样品中ST的浓度。

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