CN110618274B - 同时定量检测食用油中黄曲霉毒素总量、玉米赤霉烯酮的嵌合elisa试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明实施例公开了一种同时定量检测食用油中黄曲霉毒素总量、玉米赤霉烯酮的嵌合ELISA试剂盒，所述嵌合ELISA试剂盒包括偶联黄曲霉毒素总量全抗原和偶联玉米赤霉烯酮全抗原、黄曲霉毒素总量单克隆抗体、玉米赤霉烯酮单克隆抗体、基准液、同时包被所述黄曲霉毒素总量全抗原和玉米赤霉烯酮全抗原的酶标板以及用于ELISA实验的显色液、终止液和稀释液；所述基准液用于作为空白对照组的溶液；测定待测样品时，同时检测加入基准液的空白对照组和加入待测样品组的OD值，通过所述OD值计算得到所述待测样品的浓度。本发明实施例提供一种同时定量检测食用油中黄曲霉毒素总量、玉米赤霉烯酮残留检测试剂盒，其操作简便、检测快速、准确、成本低、稳定性好。

Description

同时定量检测食用油中黄曲霉毒素总量、玉米赤霉烯酮的嵌 合ELISA试剂盒

技术领域

本发明实施例涉及生物检测技术领域，具体涉及一种同时定量检测食用油中黄曲霉毒素总量、玉米赤霉烯酮的嵌合ELISA试剂盒。

背景技术

黄曲霉素(Aflatoxin,AFT)，是一类真菌毒素，主要是由黄曲霉 (Aspergillusflaw)、寄生曲霉(Aspergillus parasitwus)和集峰曲霉(Aspergillusnomius)产生的次生代谢产物。目前已分离鉴定出18种属于该类的毒素，黄曲霉毒素B1最常见，以下简称AFB1，它具有极强的致癌性，广泛存在于食品中，对其进行及时、快速、高效地检测和有效的分离，控制含量在允许的范围内至关重要。黄曲霉素是目前发现的化学致癌物中公认致癌性最强的物质之一，能使灵长类、禽类、鱼类及猴等实验动物诱发实验性肝癌，主要病变表现为肝出血、坏死、胆管增生和肝硬化等。

玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN)是广泛存在于饲料和谷物中的一种毒素，它是由真菌产生的次级代谢产物，对玉米、小麦、大麦、燕麦、稻谷等具有很强的污染性，它具有类雌激素作用，会对人和动物产生很大的危害。最近研究表明，ZEN除了对繁殖机能造成影响外，还具有免疫毒性、肝毒性和细胞毒性，且对肿瘤的发生也有一定影响。

目前，检测黄曲霉素和玉米赤霉烯酮的都是单独分开检测，需要测定的样本量多，检测过程麻烦，对操作的要求高，检测结果不准确，亟待进一步改进。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种同时定量检测食用油中黄曲霉毒素总量、玉米赤霉烯酮的嵌合ELISA试剂盒及其制备方法，以解决现有技术中检测试剂盒检测过程复杂，检测结果不准确的问题。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

一种同时定量检测食用油中黄曲霉毒素总量、玉米赤霉烯酮的嵌合ELISA 试剂盒，所述嵌合ELISA试剂盒包括偶联黄曲霉毒素总量全抗原和偶联玉米赤霉烯酮全抗原、黄曲霉毒素总量单克隆抗体、玉米赤霉烯酮单克隆抗体、基准液、同时包被所述黄曲霉毒素总量全抗原和玉米赤霉烯酮全抗原的酶标板以及用于ELISA实验的显色液、终止液和稀释液；所述基准液用于作为空白对照组的溶液；

测定待测样品时，同时检测加入基准液的空白对照组和加入待测样品组的 OD值，通过所述OD值计算得到所述待测样品的浓度。

优选的，所述基准液为硼酸、氢氧化钠、色氨酸和乙二胺四乙酸的水溶液。

优选的，所述黄曲霉毒素总量单克隆抗体是通过黄曲霉毒素总量AFT细胞株4E9株制备得到的，所述黄曲霉毒素总量AFT细胞株4E9株已于2019 年4月28日保藏于位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201991；

所述玉米赤霉烯酮单克隆抗体是通过ZEN 6G1细胞株制备得到的，所述 ZEN 6G1细胞株已于2019年7月4日保藏于位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2019153。

优选的，储存有预先建立的用于计算待测样本中黄曲霉毒素总量和玉米赤霉烯酮含量的标准曲线的数据处理装置。

优选的，所述标准曲线建立包括：利用标准品稀释液配成不同质量浓度的黄曲霉毒素总量溶液，用缓冲液稀释的黄曲霉毒素总量单克隆抗体，用缓冲液稀释的所述酶标物，进行间接ELISA测定，计算各浓度黄曲霉毒素总量的吸光度值，并以各浓度黄曲霉毒素总量的吸光度值的结合率为纵坐标、黄曲霉毒素总量标准物质浓度为横坐标，建立IC₅₀最低的黄曲霉毒素总量抑制标准曲线；

和/或者所述标准曲线建立包括：利用标准品稀释液配成不同质量浓度的玉米赤霉烯酮溶液，用缓冲液稀释的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，用缓冲液稀释的所述酶标物，进行间接ELISA测定，计算各浓度玉米赤霉烯酮的吸光度值，并以各浓度玉米赤霉烯酮的吸光度值的结合率为纵坐标、玉米赤霉烯酮的浓度为横坐标，建立IC₅₀最低的玉米赤霉烯酮抑制标准曲线。

优选的，所述酶标液为羊抗鼠IgG-HRP溶液。

本发明实施例还提供一种制备所述的同时定量检测食用油中黄曲霉毒素总量、玉米赤霉烯酮的嵌合ELISA试剂盒的方法，其包括制备基准液、黄曲霉毒素总量单克隆抗体、玉米赤霉烯酮单克隆抗体，配制用于ELISA实验的显色液、终止液和稀释液以及将偶联黄曲霉毒素总量全抗原和偶联玉米赤霉烯酮包被于同一酶标板上的过程。

优选的，所述基准液为硼酸、氢氧化钠、色氨酸和乙二胺四乙酸的水溶液。

优选的，所述黄曲霉毒素总量单克隆抗体是通过黄曲霉毒素总量AFT细胞株4E9株制备得到的，所述黄曲霉毒素总量AFT细胞株4E9株已于2019 年4月28日保藏于位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201991；

所述玉米赤霉烯酮单克隆抗体是通过ZEN 6G1细胞株制备得到的，所述 ZEN 6G1细胞株已于2019年7月4日保藏于位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2019153。

优选的，预先建立用于计算待测样本中黄曲霉毒素总量或玉米赤霉烯酮含量的标准曲线，

所述黄曲霉毒素总量标准曲线建立包括：利用标准品稀释液配成不同质量浓度的黄曲霉毒素总量溶液，用缓冲液稀释的黄曲霉毒素总量单克隆抗体，用缓冲液稀释的所述酶标物，进行间接ELISA测定，计算各浓度黄曲霉毒素总量的吸光度值，并以各浓度黄曲霉毒素总量的吸光度值的结合率为纵坐标、黄曲霉毒素总量标准物质浓度为横坐标，建立IC₅₀最低的黄曲霉毒素总量抑制标准曲线；

和/或者所述标准曲线建立包括：利用标准品稀释液配成不同质量浓度的玉米赤霉烯酮溶液，用缓冲液稀释的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，用缓冲液稀释的所述酶标物，进行间接ELISA测定，计算各浓度玉米赤霉烯酮的吸光度值，并以各浓度玉米赤霉烯酮的吸光度值的结合率为纵坐标、玉米赤霉烯酮的浓度为横坐标，建立IC₅₀最低的玉米赤霉烯酮抑制标准曲线。

本发明实施例具有如下优点：

本发明实施例提供一种同时定量检测食用油中黄曲霉毒素总量、玉米赤霉烯酮残留检测试剂盒，其操作简便、检测快速、准确、成本低、稳定性好，避免了以往试剂盒需要一套系列标准品的缺陷。本发明实施例的ELISA 嵌合试剂盒，操作人员无需接触标准品，避免了标准品对操作人员的伤害，一盒96T规格的试剂盒实际测试样本的数量远远大于90个，且能够同时定量检测黄曲霉毒素总量、玉米赤霉烯酮含量，减少了检验样本所需要的时间。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为本发明实施例提供的SPG抗体纯化纯度鉴定图；

图2为本发明实施例提供的嵌合ELISA数据分析软件主界面；

图3为本发明实施例提供的嵌合ELISA试剂盒中黄曲霉毒素总量标准曲线图；

图4为本发明实施例提供的嵌合ELISA试剂盒中玉米赤霉烯酮标准曲线图。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1、抗黄曲霉毒素总量、玉米赤霉烯酮单克隆抗体的制备

1、细胞复苏：

将黄曲霉毒素总量AFT细胞株4E9株，该黄曲霉毒素总量AFT细胞株 4E9株已于2019年4月28日保藏于位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:C201991；与玉米赤霉烯酮的杂交瘤细胞株 ZEN 6G1细胞株，该ZEN 6G1细胞株已于2019年7月4日保藏于位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2019153。从液氮罐内快速取出一管后迅速放至37℃水中融化，完全融化后1000转离心3min，酒精擦拭消毒放置无菌工作台操作，弃上清，用600ul HT培养基悬浮管内细胞，转至24孔培养板中，放至37℃CO₂培养箱中培养。

2、腹水制备

抗黄曲霉毒素总量、玉米赤霉烯酮单克隆抗体单克隆抗体的生产采用动物体内腹水诱生法，按照0.5ml矿物油/只小鼠的用量制敏，制敏后7至10天将至80％满时的细胞打入小小鼠腹腔，按照100万/只的数量注入，稀释液为无菌生理盐水，7至10天取腹水。

3、抗黄曲霉毒素总量、玉米赤霉烯酮单克隆抗体单克隆抗体的纯化

采用SPG柱法对腹水进行纯化，按常规操作，抗体纯度鉴定如图1所示，其中，泳道1为纯化后的黄曲霉毒素总量单克隆抗体，泳道2为纯化后的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，SDS-PAGE电泳观察到25KD和55KD的清晰条带，分别是抗体的轻链和重连，并无杂带，表明抗体纯度达到95％以上。

实施例2、嵌合ELISA试剂盒的制备

1.酶标板的制备

1.1包被：将包被偶联抗原(AFT-BSA，货号LD-003；ZEN-BSA，货号 LD-006；山东绿都生物科技有限公司)用包被缓冲液稀释，AFT-BSA按照 1：10000稀释，ZEN-BSA按照1:20000稀释，每孔取100μL加入酶标板包被，盖好盖板膜，置4℃静置20h。

1.2洗板：包被后要进行两次洗涤，用蒸馏水，250微升/孔，洗涤完毕后，应在毛巾上拍干残余液体，并及时进行下一步封闭。

1.3封闭：封闭液应提前一小时取出初步回温，用前摇匀，每孔取180 μL加入酶标板，盖好盖板膜，37℃封闭1.5h，酶标板之间的间距应保持一致，较佳的距离一般为5cm。

1.4烘干装袋：封闭完后，摔倒孔内液体，并在毛巾上拍干接下来采取烘方式彻底干燥酶标板，37℃倒置，不加盖板膜或用自封袋，烘干30min。酶标板干燥后，应及时装入自封袋，按照每块酶标板1袋干燥剂的量装入，放入冷藏环境中，保存备用。

2.嵌合ELISA试剂盒各溶液的配制

2.1多因素正交试验确定抗原抗体稀释度

首先采用多因素正交试验对抗原的最佳包被浓度以及抗体的工作浓度予以选择，从而达到抗原抗体二者之间的最佳反应条件。选择OD值在2.0左右所对应的抗原、抗体稀释倍数，由表1可知，AFT抗原抗体稀释度排列示意表，AFT抗原抗体不同稀释度的OD值在2.0左右的组合有三组，分别是：抗原稀释倍数1：10000和抗体稀释倍数1：80000；抗原稀释倍数1：80000和抗体稀释倍数1：40000；抗原稀释倍数1：160000和抗体稀释倍数1： 20000。然后，根据此条件下建立的IC₅₀值等条件，进一步确定最佳包被抗原的浓度为1：10000，最佳抗体的工作浓度为1:80000。

表1

“-”表示数值无法读出

分别将黄曲霉毒素总量或玉米赤霉烯酮标准品用不同的标准品稀释液配成不同质量浓度，分别将黄曲霉毒素总量单克隆抗体、玉米赤霉烯酮单克隆抗体用不同的缓冲液稀释，将酶标二抗用不同的缓冲液，在选定的最佳工作浓度和最佳反应条件下进行间接ELISA测定，分别计算各浓度黄曲霉毒素总量或玉米赤霉烯酮的结合率(％)，并分别以结合率为纵坐标、黄曲霉毒素总量或玉米赤霉烯酮浓度为横坐标，绘制IC₅₀最低的FF抑制标准曲线，如图3和图 4所示，黄曲霉毒素总量回归方程线性R：0.993，曲线：y＝-2.4342x-2.5039，玉米赤霉烯酮回归方程线性R：0.9967，曲线：y＝-1.8543x-1.1880，将回归方程嵌合在数据分析软件中，即数据处理装置中，即通过输入B₀进行数据处理。结合率(％)＝B/B₀×100％，其中，B₀为不加标准物质的OD₄₅₀值，B为加标准物质的OD₄₅₀值。

本发明实施例中，将预先建立的标准曲线录入分析软件，通过基准液的校准使得数据分析软件分析不同OD值下的含量趋于准确和精确，计算时，只需要选择项目，输入OD值、输入基准液和稀释倍数，即可得到黄曲霉毒素总量或玉米赤霉烯酮含量。

2.2嵌合ELISA试剂盒溶液配制

①包被液0.01MPBS，0.5L：1.2g磷酸二氢钾；1g氯化钾；14.5g磷酸氢二钠.12水；4.5g氯化钠；0.5L蒸馏水。

②封闭液，0.5L：1.2g磷酸二氢钾；1g氯化钾；14.5g磷酸氢二钠.12水； 4.5g氯化钠；50ml小牛血清；0.5L蒸馏水；1.5g防腐剂。

③10X洗涤液，0.5L：1.2g磷酸二氢钾；1g氯化钾；14.5g磷酸氢二钠.12 水；0.5L蒸馏水；50μL吐温20。

④抗体工作液，0.5L：1.2g磷酸二氢钠；18g磷酸氢二钠.12水；4.5g氯化钠；2.5g懒氨酸；10g酪蛋白；0.5L蒸馏水；1.5g防腐剂；6.5μL AFT单克隆抗体；5μL ZEN单克隆抗体。

⑤酶标物工作液，0.5L：1.2g磷酸二氢钠；18g磷酸氢二钠.12水；4.5g 氯化钠；1.5g懒氨酸；30g酪蛋白；0.5L蒸馏水；1.5g防腐剂；100μL HRP- 羊抗鼠二抗。

⑥底物液A，0.5L：1.2g磷酸二氢钠；18g磷酸氢二钠.12水；20g过氧化物脲；0.5L蒸馏水。

⑥底物液B，0.5L：1.9g磷酸二氢钠；5g磷酸氢二钠.12水；5g 3,3',5,5'- 四甲基联苯胺；2.8g懒氨酸；0.5L蒸馏水。

⑦终止液，10ml浓硫酸缓慢加到500ml蒸馏水，切记添加顺序是硫酸加到水。

3.样本的前处理方法

食用油样本前处理方法：称取样品1.0g±0.05g至离心管中，加入4mL 样品提取液，震荡提取1min；4000r/min离心5min；小心移取下清液100 μL加到900μL样品稀释液中，混匀，取50μL用于分析。

3.1溶液配制

①样品提取液：将甲醇与去离子水按V甲：V水＝4：1体积比配制成 80％甲醇，即样品提取液。

②样品稀释液：0.5g磷酸二氢钠；18g磷酸氢二钠.12水；4.5g氯化钠；6 g懒氨酸；8.4g乙二胺四乙酸(EDTA)；0.5L蒸馏水。

②基准液：0.5g硼酸；2g氢氧化钠；6g色氨酸；2.0g乙二胺四乙酸 (EDTA)；0.5L蒸馏水。

4.添加回收测定

分别在玉米油和花生油中添加黄曲霉总量2μg/kg、5μg/kg、10μg/kg和玉米赤酶烯酮代30μg/kg、60μg/kg、150μg/kg，对同一试样进行3次平行试验测定。计算平均值、回收率及变异系数，变异系数＝标准差/平均值，由此验证试剂盒的准确度和精密度，如表2所示，添加回收测定，可知回收率均在80％～93％，变异系数均小于5％。

表2

5.嵌合ELISA试剂盒使用

1、从4℃冷藏环境中取出所需试剂，置室温20-25℃环境中，平衡30min 以上，每种试剂使用前均须摇匀。

2、取出酶标板，保存于2-8℃。

3、将待测样本微孔和空白对照标准品微孔按序编号，每个待测样本和空白对照标准品平行做2微孔，并标记对照标准品微孔和待测样本微孔所在的位置。

4、加基准液和待测样本各50μl/孔到对应的微孔中，加入酶标物50μl/ 孔，再加入单克隆抗体工作液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置，37℃避光环境中反应20min。

5、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250μl/孔，充分洗涤3次，每次间隔10秒，用吸水纸拍干。

6、加入底物液A液50μl/孔，再加B液50μl/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中避光反应10min。

7、加入终止液50μl/孔，设定酶标仪于450nm处，测定每个微孔的OD 值。

8、定量分析：嵌合试剂盒配套数据分析软件里面提前录入了黄曲霉毒素总量和玉米赤霉烯酮的标准曲线，所以在使用嵌合试剂盒配套数据分析软件进行计算时，如图2，只需要输入OD值、基准液和稀释倍数，即可得到结果，如图3所示。

实施例3、嵌合ELISA试剂盒的准确度与精密度

GB/T 36858-2018饲料中黄曲霉毒素B1的测定高效液相色谱法，GB 5009.209-2016食品安全国家标准食品中玉米赤霉烯酮的测定，按照以上国标方法与本发明嵌合ELISA检测试剂盒方法分别对20份盲样进行测定，平行测定3次，比较测定结果平均值，验证嵌合ELISA检测试剂盒的准确性和可靠性。

1-10号样本为玉米油，11-20号样本为花生油，按照GB/T 36858-2018测定样本2号、6号、11号、16号的黄曲霉总量为未检出，而嵌合ELISA检测均低于0.5μg/kg；GB5009.209-2016测定与嵌合ELISA检测加过进行T检验，

为本嵌合ELISA检测的平均质量分数，μ为GB 5009.209-2016酶联免疫法和GB/T 36858-2018液相色谱-串联质谱法对同一添加的质量分数，s为标准偏差，n为样本数。AFT的t＝0.849，t<t0.05 (1.725)，说明2种方法对样本的检测结果无显著性差异。ZEN的t＝0.569， t<t0.05(1.725)，说明2种方法对样品的检测结果无显著差异。表明该嵌合ELISA与GB/T 36858-2018和GB 5009.209-2016测定结果的符合率为95％以上。如表3所示，与国际(GB/T 36858-2018和GB 5009.209-2016)仪器测定方法比较(μg/kg)。

表3

注：“ND”表示未检出

实施例4、嵌合ELISA试剂盒的稳定性

将本发明实施例的嵌合ELISA试剂盒放置于37℃和4℃，观察嵌合 ELISA试剂盒的稳定性，37℃保存一天相当于4℃保存1个半月，一般认为 OD值低于1.0时试剂盒性能已经严重下降到不可应用的程度，37℃加速破坏性实验与4℃保存实验如表4所示，嵌合ELISA的稳定性试验，本发明实施例的嵌合ELISA试剂盒在4℃下的保质期为至少24个月。

表4

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.一种同时定量检测食用油中黄曲霉毒素总量、玉米赤霉烯酮的嵌合ELISA试剂盒，其特征在于，所述嵌合ELISA试剂盒包括偶联黄曲霉毒素总量全抗原和偶联玉米赤霉烯酮全抗原、黄曲霉毒素总量单克隆抗体、玉米赤霉烯酮单克隆抗体、基准液、同时包被所述黄曲霉毒素总量全抗原和玉米赤霉烯酮全抗原的酶标板以及用于ELISA实验的显色液、终止液和稀释液；所述基准液用于作为空白对照组的溶液；

测定待测样品时，同时检测加入基准液的空白对照组和加入待测样品组的OD值，通过所述OD值计算得到所述待测样品的浓度；

所述黄曲霉毒素总量单克隆抗体是通过黄曲霉毒素总量AFT细胞株4E9株制备得到的，所述黄曲霉毒素总量AFT细胞株4E9株已于2019年4月28日保藏于位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201991；

所述玉米赤霉烯酮单克隆抗体是通过ZEN 6G1细胞株制备得到的，所述ZEN 6G1细胞株已于2019年7月4日保藏于位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2019153；

所述基准液为硼酸、氢氧化钠、色氨酸和乙二胺四乙酸的水溶液。

2.如权利要求1所述的同时定量检测食用油中黄曲霉毒素总量、玉米赤霉烯酮的嵌合ELISA试剂盒，其特征在于，

储存有预先建立的用于计算待测样本中黄曲霉毒素总量和玉米赤霉烯酮含量的标准曲线的数据处理装置。

3.如权利要求2所述的同时定量检测食用油中黄曲霉毒素总量、玉米赤霉烯酮的嵌合ELISA试剂盒，其特征在于，

所述标准曲线建立包括：利用标准品稀释液配成不同质量浓度的黄曲霉毒素总量溶液，用缓冲液稀释的黄曲霉毒素总量单克隆抗体，用缓冲液稀释的酶标物，进行间接ELISA测定，计算各浓度黄曲霉毒素总量的吸光度值，并以各浓度黄曲霉毒素总量的吸光度值的结合率为纵坐标、黄曲霉毒素总量标准物质浓度为横坐标，建立IC₅₀最低的黄曲霉毒素总量抑制标准曲线；

和/或者所述标准曲线建立包括：利用标准品稀释液配成不同质量浓度的玉米赤霉烯酮溶液，用缓冲液稀释的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，用缓冲液稀释的酶标物，进行间接ELISA测定，计算各浓度玉米赤霉烯酮的吸光度值，并以各浓度玉米赤霉烯酮的吸光度值的结合率为纵坐标、玉米赤霉烯酮的浓度为横坐标，建立IC₅₀最低的玉米赤霉烯酮抑制标准曲线。

4.如权利要求1所述的同时定量检测食用油中黄曲霉毒素总量、玉米赤霉烯酮的嵌合ELISA试剂盒，其特征在于，

所述试剂盒还包括酶标液，所述酶标液为羊抗鼠IgG-HRP溶液。

5.一种制备权利要求1所述的同时定量检测食用油中黄曲霉毒素总量、玉米赤霉烯酮的嵌合ELISA试剂盒的方法，其特征在于包括制备基准液、黄曲霉毒素总量单克隆抗体、玉米赤霉烯酮单克隆抗体，配制用于ELISA实验的显色液、终止液和稀释液以及将偶联黄曲霉毒素总量全抗原和偶联玉米赤霉烯酮全抗原包被于同一酶标板上的过程；

所述黄曲霉毒素总量单克隆抗体是通过黄曲霉毒素总量AFT细胞株4E9株制备得到的，所述黄曲霉毒素总量AFT细胞株4E9株已于2019年4月28日保藏于位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C201991；

所述玉米赤霉烯酮单克隆抗体是通过ZEN 6G1细胞株制备得到的，所述ZEN 6G1细胞株已于2019年7月4日保藏于位于中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:C2019153。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，

所述基准液为硼酸、氢氧化钠、色氨酸和乙二胺四乙酸的水溶液。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于还包括：

预先建立用于计算待测样本中黄曲霉毒素总量或玉米赤霉烯酮含量的标准曲线，

所述黄曲霉毒素总量标准曲线建立包括：利用标准品稀释液配成不同质量浓度的黄曲霉毒素总量溶液，用缓冲液稀释的黄曲霉毒素总量单克隆抗体，用缓冲液稀释的酶标物，进行间接ELISA测定，计算各浓度黄曲霉毒素总量的吸光度值，并以各浓度黄曲霉毒素总量的吸光度值的结合率为纵坐标、黄曲霉毒素总量标准物质浓度为横坐标，建立IC₅₀最低的黄曲霉毒素总量抑制标准曲线；

和/或者所述标准曲线建立包括：利用标准品稀释液配成不同质量浓度的玉米赤霉烯酮溶液，用缓冲液稀释的玉米赤霉烯酮单克隆抗体，用缓冲液稀释的酶标物，进行间接ELISA测定，计算各浓度玉米赤霉烯酮的吸光度值，并以各浓度玉米赤霉烯酮的吸光度值的结合率为纵坐标、玉米赤霉烯酮的浓度为横坐标，建立IC₅₀最低的玉米赤霉烯酮抑制标准曲线。

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