CN1300584C - 盐酸克伦特罗检测试剂条及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了盐酸克伦特罗检测试剂条及其制造方法，目的是提供一种能够快速半定量检测盐酸克伦特罗是否存在的试剂条及其制造方法。检测盐酸克伦特罗的试剂条，包括设有凹槽的吸附板，在所述吸附板的凹槽内吸附有带固化相抗盐酸克伦特罗的抗体的载体膜，所述载体膜上放置有带有盐酸克伦特罗与过氧化物酶偶联物的释放垫；所述试剂条还包括一个装有底物和显色剂的遮光容器。本发明的产品为一次性用检测工具，属于快速微量检测，CBL的检测限为1ng/ml，对于控制瘦肉精等违禁药物的非法使用具有重要的价值。

Description

盐酸克伦特罗检测试剂条及其制造方法

技术领域

本发明涉及一种检测试剂条及其制造方法，特别是涉及一种检测盐酸克伦特罗的试剂条及其制造方法。

背景技术

盐酸克伦特罗(CBL)俗称“瘦肉精”，是一种β-兴奋剂类药物，具有促进动物生长，提高畜禽瘦肉比的作用。盐酸克伦特罗进入猪体后，代谢时间长，性质稳定，易在动物组织中形成残留，主要残存在肝脏、肺、眼球等部位。当人们食用含“瘦肉精”超标的动物性食品一定量后，会出现不同程度的震颤、心慌、头痛、恶心、呕吐、代谢紊乱等中毒症状。盐酸克伦特罗本身及其代谢物残留的特殊毒性及其致癌、致畸胎、致突变作用，已被大量的试验研究和追踪调查所证明，引起了世界各国的高度警惕。我国饲料中非法使用这些激素类药物的问题也很严重。我国政府已明令禁止用盐酸克伦特罗作为饲料添加剂。我国在2001年制定了“饲料中盐酸克伦特罗的测定气相色谱-质谱法”、“动物组织中盐酸克伦特罗的测定气相色谱-质谱法”等农业部行业标准，在分析技术上为我国对盐酸克伦特罗的管理提供了技术保证。但是，这些检测方法需要大型精密仪器，而且分析程序需要30个小时左右。即使是快速的检测方法如酶联免疫吸附试验法(ELISA)，也需要在实验室内进行分析，完成一次检测需要2小时，无法做到现场检测，成本也高。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够快速半定量检测盐酸克伦特罗是否存在的试剂条。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种检测盐酸克伦特罗的试剂条，它包括设有凹槽的吸附板，在所述吸附板的凹槽内吸附有带固化相抗盐酸克伦特罗的抗体的载体膜，所述载体膜上放置有带有盐酸克伦特罗与过氧化物酶偶联物的释放垫；所述试剂条还包括一个装有底物和显色剂的遮光容器。

为了方便比色，所述试剂条还包括比色卡。

所述载体膜优选为偏二氟乙烯膜；所述过氧化物酶优选为辣根过氧化物酶；所述释放垫优选为玻璃纤维膜。所述遮光容器优选为棕色毛细管。

所述底物优选为过氧化氢；所述显色剂优选为四甲基联苯胺。

本发明的第二个目的是提供一种生产检测盐酸克伦特罗的试剂条的方法。

一种生产检测盐酸克伦特罗的试剂条的方法，包括以下步骤：

1)获得抗盐酸克伦特罗的抗体；

2)制备带有固化相抗盐酸克伦特罗的抗体的载体膜；

3)制备带有盐酸克伦特罗与过氧化物酶偶联物的释放垫；

4)将载体膜贴附在用常规方法生产的吸附板上；

5)吸附板、释放垫及装有底物和显色剂的遮光容器共同包装。

在上述生产过程中，所述获得抗盐酸克伦特罗的抗体的步骤为：将盐酸克伦特罗重氮化后与BSA偶联，偶联的比例为12∶1；用该偶联物免疫动物，并自动物的血清中获得抗体。

所述制备带有固化相抗盐酸克伦特罗的抗体的载体膜的步骤是：

1)以100％甲醇浸润偏二氟乙烯膜10-30秒，50∶50甲醇/PBS混合液浸润5-10分钟，0.2mol的PBS缓冲液(pH为7.4)平衡30分钟；

2)盐酸克伦特罗抗体的贮备液加蔗糖和PVP保护液后稀释至2ng/ul；

3)将抗体液点加到偏二氟乙烯膜上；

4)待膜彻底干后放入含4％戊二醛的固定液中，38℃浸泡10-20分钟；

5)在含3％脱脂乳的PBS缓冲液中浸泡10分钟，取出后用PBS冲洗2次，置于室温下晾干。

所述制备带有盐酸克伦特罗与过氧化物酶偶联物的释放垫的步骤是：

1)盐酸克伦特罗重氮化后与辣根过氧化物酶偶联，偶联的比例为7∶1；

2)用0.2％土温20、0.2％PVA等释放促进剂喷涂、或浸润10-20分钟表面经聚丙乙烯处理的玻璃纤维膜载体；

3)盐酸克伦特罗辣根过氧化物酶偶联物的贮备液加4％蔗糖和5％PVP保护液后稀释至3ng/ul，点加到玻璃纤维膜上，室温下晾干得到释放垫。

本发明巧妙地利用ELISA的原理，并创造性地将抗体和竞争物均固相化，使半定量检测盐酸克伦特罗的过程大大简化，检测过程只需17分钟，而且在检测过程中不需要任何仪器设备，使盐酸克伦特罗的现场快速检测成为了可能。

用本发明的方法制造的试剂条，固相化的CBL抗体活性可保存4个月，酶标记CBL在50秒内释放率达于85％，干燥情况下，酶标记CBL的活性保存期达到3个月，既确保了反应的灵敏快速，又方便了使用者，可以做到一次购买，较长时间地使用，节约开支降低成本，符合市场竞争的需要。

本发明的产品为一次性用检测工具，属于快速微量检测，CBL的检测限为1ng/ml，对于控制瘦肉精等违禁药物的非法使用具有重要的价值。

下面结合附图对本发明的产品及制造方法做进一步说明。

附图说明

图1为本发明试剂条的结构示意图。

图2为本发明试剂条载体膜在不同样品作用下的反应。

具体实施方式

实施例1、检测盐酸克伦特罗试剂条的结构

如图1所示，本发明检测盐酸克伦特罗的试剂条包括设有凹槽2的塑料吸附板1，在吸附板1的凹槽2内吸附固定有带固化相抗盐酸克伦特罗的抗体的偏二氟乙烯载体膜3，载体膜3上放置有带有盐酸克伦特罗与辣根过氧化物酶偶联物的玻璃纤维膜释放垫4；一个装有过氧化氢底物和显色剂四甲基联苯胺的棕色毛细管6；在塑料吸附板1上粘贴有比色卡5。

在本实施例中，吸附板1也可以是其它材料制成的，如树脂、玻璃等。

本发明试剂条的工作原理是，样品滴加在释放垫4上，释放垫中的盐酸克伦特罗与辣根过氧化物酶偶联物及样品中的标的物与抗体发生竞争反应，样品中含CBL越多，与抗体结合的盐酸克伦特罗—辣根过氧化物酶偶联物越少，反之亦然。洗膜后，与抗体复合的辣根过氧化物酶促使过氧化氢底物还原，并与显色剂发生显色反应。观察载体膜的颜色变化，便可知样品中是否含有CBL。如图2所示，C的样品不含CBL，呈现蓝色，为阴性；B的样品中含有少于1ng/ml的CBL，呈现蓝色，但颜色稍淡，也为阴性；A的样品中含有多于1ng/ml的CBL，不显色，为阳性。

实施例2、检测盐酸克伦特罗试剂条的制备

一、CBL抗体的获得和纯化

1、CBL重氮化后与BSA偶联，偶联的比例为12∶1；

2、偶联产物经过透析去除游离的小分子CBL、经过亲和柱分离出没有结合CBL的游离BSA，获得纯化的CBL-BSA产物，该产物中的CBL浓度为原浓度的10倍；

3、用该偶联产物，经免疫程序(一次全免疫、三次强化)从兔中获得抗血清，该抗血清经CBL的ELISA试剂盒(CBL浓度为1ng/ml)检验，效价为1∶10000；

4、抗血清经亲和净化后，获得纯化抗体备用。

二、CBL抗体固相化的构建

1、选择用强疏水的偏二氟乙烯膜(简称为PVDF，孔径为0.45um)为载体，使用前分别以100％甲醇浸润10-30秒、50∶50甲醇/PBS混合液浸润5-10分钟、0.2mol的PBS缓冲液(pH为7.4)平衡30分钟；

2、CBL抗体的贮备液加3-5％的蔗糖和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)保护液后稀释至2ng/ul，用移液枪将2ul该抗体液分次点加到直径为3-4mm的PVDF膜上；

3、待膜彻底干后放入含4％戊二醛的固定液，38℃浸泡10-20分钟，后在含3％脱脂乳的PBS缓冲液中浸泡10分钟，取出后移PBS冲洗2次，置于室温下晾干待用。

三、辣根过氧化物酶偶联CBL的获得和纯化

1、CBL重氮化后与辣根过氧化物酶偶联，偶联的比例为7∶1；

2、偶联产物经过透析去除游离的小分子CBL、经过亲和柱分离出没有结合CBL的游离辣根过氧化物酶，获得纯化的CBL-辣根过氧化物酶产物，该产物中的CBL浓度经ELISA试剂盒检测，为原浓度的5倍。

四、辣根过氧化物酶偶联CBL固相载体的构建

1、选择用表面经聚乙烯醇(PVA)处理的玻璃纤维膜为载体。该载体在使用前分别用0.2％土温20、0.2％PVA等释放促进剂喷涂、或浸润10-20分钟；

2、CBL辣根过氧化物酶的贮备液加4％蔗糖和5％PVP等的保护液后稀释至3ng/ul，用移液枪将3ul该抗体液分次点加到直径为3-4mm的玻璃纤维膜上，置于室温下晾干即为CBL与辣根过氧化酶偶联物的释放垫，待用。

五、制备试剂条

1、将载体膜贴附在用常规方法生产的塑料吸附板上，为了方便比色，在塑料吸附板上还应粘贴上阴性及阳性对照比色卡；

2、释放垫放置在载体膜上，过氧化氢底物及显色剂四甲基联苯胺封装在棕色毛细管内。

3、吸附板、释放垫及毛细管共同包装得到试剂条产品。

实施例3、用本发明的试剂条检测尿样中是否含有CBL

1、试剂条撕去封口膜待用。

2、取尿液30ul，缓慢滴加在释放垫上，轻轻晃动后用镊子将释放垫去掉，反应10分钟。

3、用100ul水分别洗载体膜3次，每次1分钟。

4、打开毛细管，加底物和显色剂10ul，4分钟后判断出现的色斑。

5、结果判定：蓝色为阴性(即低于1ppb)，浅蓝色或无色为阳性(即高于1ppb)。

Claims (9)

1、一种检测盐酸克伦特罗的试剂条，它包括设有凹槽的吸附板，其特征在于：在所述吸附板的凹槽内吸附有带固化相抗盐酸克伦特罗的抗体的偏二氟乙烯载体膜，所述载体膜上放置有带有盐酸克伦特罗与过氧化物酶偶联物的释放垫；所述试剂条还包括一个装有底物和显色剂的遮光容器；所述制备带有固化相抗盐酸克伦特罗的抗体的偏二氟乙烯载体膜的步骤是：

1)以100％甲醇浸润偏二氟乙烯膜10-30秒，50∶50甲醇/PBS混合液浸润5-10分钟，0.2mol，pH为7.4的PBS缓冲液平衡30分钟；

2)盐酸克伦特罗抗体的贮备液加蔗糖和PVP保护液后稀释至2ng/ul；

3)将抗体液点加到偏二氟乙烯膜上；

4)待膜彻底干后放入含4％戊二醛的固定液中，38℃浸泡10-20分钟；

5)在含3％脱脂乳的PBS缓冲液中浸泡10分钟，取出后用PBS冲洗2次，置于室温下晾干。

2、根据权利要求1所述的试剂条，其特征在于：所述试剂条还包括比色卡。

3、根据权利要求1或2所述的试剂条，其特征在于：所述过氧化物酶为辣根过氧化物酶；所述释放垫为玻璃纤维膜。

4、根据权利要求1或2所述的试剂条，其特征在于：所述遮光容器为棕色毛细管。

5、根据权利要求1或2所述的试剂条，其特征在于：所述底物为过氧化氢；所述显色剂为四甲基联苯胺。

6、一种生产检测盐酸克伦特罗的试剂条的方法，包括以下步骤：

1)获得抗盐酸克伦特罗的抗体；

2)制备带有固化相抗盐酸克伦特罗的抗体的偏二氟乙烯载体膜，包括：(1)以100％甲醇浸润偏二氟乙烯膜10-30秒，50∶50甲醇/PBS混合液浸润5-10分钟，0.2molpH为7.4的PBS缓冲液平衡30分钟；

(2)盐酸克伦特罗抗体的贮备液加蔗糖和PVP保护液后稀释至2ng/ul；

(3)将抗体液点加到偏二氟乙烯膜上；

(4)待膜彻底干后放入含4％戊二醛的固定液中，38℃浸泡10-20分钟；

(5)在含3％脱脂乳的PBS缓冲液中浸泡10分钟，取出后用PBS冲洗2次，置于室温下晾干；

3)制备带有盐酸克伦特罗与过氧化物酶偶联物的释放垫；

4)将载体膜贴附在用常规方法生产的吸附板上；

5)吸附板、释放垫及装有底物和显色剂的遮光容器共同包装。

7、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述获得抗盐酸克伦特罗的抗体的步骤为：将盐酸克伦特罗重氮化后与BSA偶联，偶联的比例为12∶1；用该偶联物免疫动物，并自动物的血清中获得抗体。

8、根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述过氧化物酶为辣根过氧化物酶；所述制备带有盐酸克伦特罗与过氧化物酶偶联物的释放垫的步骤是：

1)盐酸克伦特罗重氮化后与辣根过氧化物酶偶联，偶联的比例为7∶1；

2)用0.2％土温20或0.2％PVA喷涂或浸润10-20分钟表面经聚丙乙烯处理的玻璃纤维膜载体；

3)盐酸克伦特罗辣根过氧化物酶偶联物的贮备液加4％蔗糖和5％PVP保护液后稀释至3ng/ul，点加到玻璃纤维膜上，室温下晾干得到释放垫。

9、根据权利要求6或7或8所述的方法，其特征在于：所述底物为过氧化氢；所述显色剂为四甲基联苯胺。

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