CN1194036A - 胶体金免疫检测法 - Google Patents

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Abstract

在此公开了一种用于通过胶体金免疫检测法测定靶物质的方法,它包括在免疫反应系统中溶入一种选自如下种类的金属盐:钠、钾和锂的氟化物,钠、钾、锂和镁的碘化物,钠、钾、锂和镁的溴化物,锂和镁的氯化物,钠、钾、锂和镁的硝酸盐,钠、钾、锂和镁的硫酸盐,钠、钾、锂和镁的甲酸盐,钠、钾、锂和镁的乙酸盐,以及这些金属盐中至少二种的混合物,借此,使该金属盐能够存在于反应混合物中。按照这种检测方法,由于金属盐的功能,胶体金显示的颜色变得非常清晰。特别是当用肉眼观察具有测定范围附近浓度的样品时,阴性和阳性之间的差异更加明显,因此,使之有可能容易地作出判断。

Description

胶体金免疫检测法
技术领域
本发明是关于对用于测定样品中靶物质是否存在或含量的胶体金免疫检测法的改进，特别是对用于体外诊断方面的胶体金免疫检测法的改进。
背景技术
借助胶体金免疫检测法测定抗原或抗体，是多年来就知道的方法。这种检测法的原理可简述如下。也就是，例如当靶物质是抗原时，将以能够识别这种抗原的抗体致敏的胶体金，即抗体致敏性胶体金，用于通常以紧密混合状态包含有抗原和杂质等的反应混合物，从而，该抗体致敏性胶体金能与此抗原发生特异性结合。由于这种结合反应形成了一种复合物，使含有此复合物的反应混合物，通过一种反应混合物可渗透性材料而经受类似层析展开的渗透作用，或者利用反应混合物的扩散渗虑现象，使含有复合物的反应混合物通过一种反应混合物可渗透性材料而经受过滤渗透作用，这样，可使含有抗体致敏性胶体金的反应混合物，其未与复合物反应，以及杂质等发生渗透性运动。
在运动路径的特定位置，将捕捉抗体予先固相化在反应混合物可渗透性材料上，进而，借助于捕捉抗体与抗原的特异性结合，并且其抗原识别位点不同于抗体致敏性胶体金的抗原识别位点，因此，只有该复合物被捕获在特定的位置，其余的成分将随同反应混合物被移去。根据在特定位置上复合物中胶体金的显色，可单独对抗原进行识别或测定。
另一方面，当靶物质是抗体时，能够识别该抗体的抗原所致敏的胶体金(抗原致敏性胶体金)，在含有该抗体的反应混合物中，也通过特异性结合与该抗体反应。在反应混合物中生成了复合物，随后，利用如上述检测中的穿透性渗透现象，使含有此复合物的反应混合物运动通过一种反应混合物可渗透性材料。借助在反应混合物可渗透性材料特定位置上予先固相化的捕捉抗体或捕捉抗原，以及通过它与复合物中抗原或抗体的特异性结合，只有来自含有复合物反应混合物的复合物能在特定的位置被捕获。根据在特定位置复合物中胶体金的显色，靶抗体可被单独识别或测定。
在这种胶体金免疫检测法中，一般是通过抗原-抗体反应进行特异性结合，并且可使用的胶体金通常是红色型或紫红色型。
作为介质，反应混合物通常含有水，缓冲液等，水中又含有生物成份。其中的水可部分地用惰性的水溶性有机溶剂如二甲基亚砜或二噁烷代替，目的在于促进靶物质在这样一种不干扰特异性结合反应的液态介质中的溶解。另外，还可加入惰性高分子物质，用于保护抗体或其它类似的成分，或者用于降低含胶体金反应混合物的介电常数。而且，为了促进反应混合物的扩散性渗透现象，还可以加入表面活性物质或其它类似物。
作为反应混合物可渗透性材料，可以使用对反应混合物具有渗透性的片状或层状材料。借助于扩散渗透作用，靶物质随同反应混合物一道运动，透过该材料中的间隙和微孔。这种材料构成至少是一片滤纸、棉花状、海绵状或多孔薄膜等的形式。在片状材料中通常使靶物质在同一平面(coplanar)方向运动，或者在层状材料中使之在厚度方向运动。
当在胶体金免疫检测法中的靶物质是抗原时，通常需使用针对此抗原的二种类型抗体，用于胶体金致敏而形成抗体致敏性胶体金的一种抗体，通常是单克隆抗体，而用另一种抗体(单克隆抗体或多克隆抗体)作为捕捉抗体，其抗原识别位点与抗体致敏性胶体金的不同。
下面将以用于人尿中人绒毛膜促性腺激素(hCG)检测的实例为基础，对胶体金免疫检测法作进一步的详述。例如，以一片滤纸用作反应混合物可渗透性材料。将用抗-hCG抗体致敏的胶体金(以胶体金颗粒标记的抗-hCG单克隆抗体)，以可再溶解(可再洗脱)的形式吸附在靠近滤纸的一端，而将抗原表位不同于上述单克隆抗体的抗-hCG多克隆抗体或单克隆抗体，以不可再溶解的形式固相化在靠近滤纸的另一端，作为捕捉抗体。
为了确定展开终点，如果有必要也可将针对上述抗-hCG单克隆抗体的某种抗体(例如，如果单克隆抗体是小鼠IgG，则可用抗小鼠IgG抗体)，固相化在从展开方向观察，比展开终点更远的位置。
检测是通过将含有靶物质的人尿施加于该滤纸片的一端来进行，然后借助于尿液的扩散性渗透现象，按照与纸层析相似的方式，使尿中所含的抗原如杂质随同尿液一道被展开至另一端。
通过展开，以抗-hCG单克隆抗体致敏并被吸附在靠近纸片一端的胶体金首先被洗脱进入尿液中。胶体金和尿中所含有的hCG形成hCG-抗hCG单克隆抗体致敏的胶体金复合物，它继续向另一端扩散。通过与固相化的捕捉抗体发生抗原-抗体反应，此复合物被捕获，这样，在捕捉抗体被固相化的位置，胶体金按照其固相化的式样(以斑点，符号，字母或其它类似的形式)显示出色调，从而指示尿中存在作为抗原的hCG。
另一方面，仅仅被洗脱进入尿中，并没有与hCG发生反应的以抗-hCG单克隆抗体致敏的胶体金，也随同尿液扩散至另一端。由于未结合hCG而不能与捕捉抗体发生抗原-抗体反应，因此可通过捕捉抗体的位置。但是它可以被固相化在末端附近的抗-小鼠IgG抗体捕获，这样，胶体金也按照其固相化的式样(以斑点，符号，字母或其它类似的形式)显示色调，从而指示借助尿的展开过程已确实完成了。
胶体金免疫检测法就是根据如上所述的这样一种原理进行检测，已被用作体内物质的简易检测法。但是，这种检测法存在一个问题，就是胶体金展开形成的色调常常不清晰，而这种色调正是对靶物质检测特异性反应结果的指示。因此，长时间以来就一直希望发展一种方法，使之能简便和清晰地识别胶体金的显色位置，不会由于非特异性反应的背景色调而造成模糊。
本发明的公开内容
鉴于上述情况，为了发展一种能确保胶体金色调清晰显示的方法，本发明者进行了各种探索。结果发现，采取一种简单的措施，即将一种适当的盐混合于样品溶液或用于溶解样品的溶液中，就能使胶体金的色调显得非常清晰，与没有加入这种盐的样品溶液或用于溶解样品的溶液，即通常的反应混合物(用于特异性结合反应的液体介质)形成鲜明的对照，因而导致实现了本发明。
因此，本发明提供了一种借助胶体金免疫检测试验测定靶物质的方法，它包括在免疫反应系统中溶入一种选自如下种类的金属盐：氟化钠，氟化钾，氟化锂，碘化钠，碘化钾，碘化锂，碘化镁，溴化钠，溴化钾，溴化锂，溴化镁，氯化锂，氯化镁，硝酸钠，硝酸钾，硝酸锂，硝酸镁，硫酸钠，硫酸钾，硫酸锂，硫酸镁，甲酸钠，甲酸钾，甲酸锂，甲酸镁，乙酸钠，乙酸钾，乙酸锂，和乙酸镁，以及这些金属盐中至少二种的混合物，借此，使所述金属盐能够存在于反应混合物中。实施本发明的最佳模式
本发明中的上述金属盐是碱金属或碱土金属的中性盐。为了实现本发明的目的，还可能存在用于缓冲，或者作为杂质或类似物的其它一些盐。
对于本发明，有必要使上述的金属盐存在于反应混合物中，在此反应混合物中，按照胶体金免疫检测法将发生抗原-抗体反应，换句话说，是在一种液态介质中，即含有靶物质的液态介质中。可以将这种金属盐加到样品溶液中，或者还可以掺入到溶解样品的溶液中或样品稀释液中。
对于使胶体金的显色更清晰而言，对反应混合物中该金属盐的浓度并没有任何特别的限制。但如果浓度太低则色调显示不清晰，从而不能达到预想的优越效果。另一方面如果浓度太高，则会促进非特异性反应，导致出现许多问题，使计划的检测不能实行，并使固相化的抗体或其它类似物被释放出。因此对这方面必须给予重视。
至于在抗原-抗体反应时该金属盐在反应混合物中的浓度，通常可含有的总浓度范围是0.05～2克分子/升，优选的是0.05～1.5克分子/升，更优选的是0.1～1克分子/升。如果是一种低溶解度的盐，其本身不能达到预定的浓度，则可以是二个或几个盐组合使用。
下面将以本发明的实施例对本发明作更具体的描述。但是应该记住，本发明完全不受这些实施例的限制。实施例1
尿中hCG的测定(1).试剂盒：
使用了一种可作为商品买到的妊娠检测试剂盒(Heart Sign hCG“新型”，由SS Pharmaceutical Co、Ltd销售)，它是通过胶体金免疫检测法测定尿中hCG。
此试剂盒由反应卡盒，吸滴管和尿加样杯组成。反应卡盒内，中心孔的多孔材料中吸附了16mg以小鼠抗-hCG单克隆抗体致敏的胶体金试剂，并且还在卡盒内中心孔的多孔材料下面，衬有鉴定片，其上面有以心形式样固相化的20g小鼠抗-hCG抗体。此试剂盒的设计使尿样品能连贯地通过多孔材料和鉴定片。(2).检测原理和测定灵敏度：
小鼠抗-hCG单克隆抗体致敏的胶体金，借助hCG与固相化在鉴定片上的小鼠抗-hCG抗体相结合。这样，使鉴定片显示出微红紫色至紫红色的颜色。这种显色可用肉眼观察，从而对尿中hCG进行测定。测定灵敏度是50IU/升。(3).待测样品：
将hCG(UCB-Bioproduct产品)加入到250ml正常男性受试者的尿液中，形成500IU/升的浓度。(4).加入金属盐
将上述尿样品以5ml的等分量注入28个尿加样杯中，其中分别加入以下化合物，并作为金属盐溶解在尿液中，形成0.24克分子/升尿液的浓度。(金属盐)
氟化钠，氟化钾，碘化钠，碘化钾，碘化锂，碘化镁，溴化钠，溴化钾，溴化锂，溴化镁，氯化锂，氯化镁，硝酸钠，硝酸钾，硝酸锂，硝酸镁，硫酸钠，硫酸钾，硫酸锂，硫酸镁，甲酸钠，甲酸钾，甲酸锂，甲酸镁，乙酸钠，乙酸钾，乙酸锂，和乙酸镁。
另将上述尿样品以5ml等分量注入5个尿加样杯中。其中一个尿样杯不加任何金属盐，用作对照样品(用常规法测定)。对其余的尿加样杯分别加入氯化钠，氯化钾，氯化铵和乙酸铵，以代替上述的金属盐，溶解片浓度为0.24克分子/升，以如此制备的样品用作比较样品(比较样品1～4)。(5).检测
按照试剂盒所附的说明书，将尿样品收集在尿加样杯中，用吸滴管吸取尿样至刻度(标记)(0.5ml)然后将吸滴管中的尿样全部滴加至反应卡盒的中心孔内。等候约1分钟，将尿样完全被吸收之后，打开反应卡盒的封盖，取出鉴定片进行鉴定。仅根据心形色斑是否存在进行鉴定，而不是根据色调的深浅当反应完成之后，在鉴定片的中央观察到微紫红色的心形色斑时，则可作出阳性判断。当没有观察到心形色斑时，则应作出阴性判断。
在此实施例中，按照说明书，将按程序(4)制备的各个样品，取0.5ml等分量滴加至不同的反应卡盒内。吸收1分钟之后，取出鉴定片，用肉眼对各鉴定片表面中心显示的心形微红紫色斑点进行判别和评分，根据如下评定系统进行评分。(评定系统)
[得分]                        [描述]
+4         与常规方法相比较，观察到非常强的颜色显示。
+3         与常规方法相比较，观察到强的颜色显示。
+2         与常规方法相比较，观察到稍强的颜色显示。
+1         观察到与常规方法类似强度的颜色显示。
±         由于显色很弱，不能作出阳性判断。(6).结果：
结果显示在下面的表1中。结果表明，按本发明加入金属盐，将导致与常规方法相比较更强，更清晰的颜色显示，因此更容易判断。
表1
    金属盐        评分
    氟化钠        +4氟化钾        +4碘化钠        +2碘化钾        +3碘化锂        +3碘化镁        +3溴化钠        +2溴化钾        +2溴化锂        +2溴化镁        +2氯化锂        +3氯化镁        +3硝酸钠        +2硝酸钾        +2硝酸锂        +2硝酸镁        +3硫酸钠        +2硫酸钾        +3硫酸锂        +2
表1(续)
    金属盐                    评分硫酸镁                     +4甲酸钠                     +3甲酸钾                     +3甲酸锂                     +3甲酸镁                     +3乙酸钠                     +3乙酸钾                     +3乙酸锂                     +3乙酸镁                     +3氯化钠(比较样品1)          +1氯化钾(比较样品2)          +1氯化铵(比较样品3)          ±乙酸铵(比较样品4)           ±未加金属盐(常规法，对照)     +
实施例2
人粪便中血红蛋白的测定(1)试剂盒：
使用一种检测大便潜血的商品试剂盒[ME-ICHECKHEMOPLATE(GS)，MEIJI SEIKA KAISHA，LTD.产品]，它是通过胶体金免疫检测法测定粪便中的血红蛋白(此后缩写为“Hb”)。
此试剂盒由鉴定片，胶体金试剂，胶体金溶解液和粪便溶解缓冲液组成，并备有反应容器，滤纸，标准照片，粪便取样杯和粪便取样小棒。其中鉴定片含有2.5ml免抗体抗-Hb。并且，胶体金试剂含有以胶体金标记的小鼠抗-Hb单克隆抗体，此试剂溶解于胶体金溶解液中而配制成检测反应液。在每个粪便取样杯中含有2ml等分量粪便溶解缓冲液。(2)检测原理和测定灵敏度：
以胶体金标记的小鼠抗-Hb单克隆抗体，借助Hb与固相化在鉴定片为膜上的免抗体抗-Hb结合，这样，薄膜将显示微红-红紫色或紫红色。用肉眼观察这种显色而测定粪便中的Hb。测定灵敏度为40μg/g粪便。(3)待测样品：
以400μg/g-粪便的含量将Hb(Sigma Chemical Company产品)加到正常受试人的1克粪便中。(4)加入金属盐：
将10mg等分量的上述样品分别置于28个粪便取样杯中，其中备有粪便溶解缓冲液。在这些取样杯中，分别加入下列化合物，溶解片金属盐的浓度为0.24克分子/升，粪便溶解缓冲液，由此制备成检测样品。(金属盐)
氟化钠，氟化钾，碘化钠，碘化钾，碘化锂，碘化镁，溴化钠，溴化钾，溴化锂，溴化镁，氯化锂，氯化镁，硝酸钠，硝酸钾，硝酸锂，硝酸镁，硫酸钠，硫酸钾，硫酸锂，硫酸镁，甲酸钠，甲酸钾，甲酸锂，甲酸镁，乙酸钠，乙酸钾，乙酸锂，和乙酸镁。
另将上述样品以10mg等分量分别置于其中备有粪便溶解缓冲液的5个粪便取样杯中。其中一个粪便取样杯不加任何金属盐，用作对照样品溶液(以常规法测定)。对其含的粪便取样杯分别加入氯化钠，氯化钾，氯化铵和乙酸铵浓度为0.24克分子/升，代替上述的金属盐，用作比较样品溶液(比较样品5～8)。(5)检测：
按照说明书，取50μl等分量按程序(4)制备的样品溶液，滴加至不同的反应容器内。再向各个反应器滴加40μl检测反应液，并将反应容器震摇几次，以便使各个样品容器与检测反应液混合均匀。将鉴定片复盖在各反应容器中，鉴定片吸附在其中，将此反应容器在室温下放置3分钟。然后将反应器倒转过来，通过透明的反应容器，可用肉眼观察鉴定片表面。
根据在每个鉴定片表面呈现的判符号(星形)显色的深浅，通过与标准照片阳性显色范围相比较进行判断。当在鉴定片表面观察到清晰的显色(微红-紫红或紫红色)，可判定粪便Hb为阳性。如果在鉴定片表面未显色，或者与标准照片阳性范围相比较仅观察到轻微的显色，则判定粪便Hb为阴性。通过与对照样品液相比较，可以对加入金属盐的效果进行判断，并可根据如下的评分系统给予评分。(评分系统)[得分]+4       与常规方法相比较，观察到非常强的颜色显示。+3       与常规方法相比较，观察到强的颜色显示。+2       与常规方法相比较，观察到稍强的颜色显示。+1       观察到与常规方法类似强度的颜色显示。+        由于显示很弱，不能作出阳性判断。(6).结果：
结果显示在下面的表2中。结果表明，按本发明加入金属盐，将导致与常规方法相比较更强，更清晰的颜色显示，因此更容易判断。
表2
    金属盐        评分氟化钠        +3氟化钾        +3碘化钠        +2碘化钾        +2碘化锂        +3碘化镁        +3溴化钠        +3溴化钾        +3溴化锂        +3溴化镁        +3氯化锂        +3氯化镁        +3硝酸钠        +2硝酸钾        +2硝酸锂        +2硝酸镁        +3硫酸钠        +2硫酸钾        +2硫酸锂        +2硫酸镁        +2
表2(续)
    金属盐                     评分
    甲酸钠                      +3甲酸钾                      +3甲酸锂                      +3甲酸镁                      +3乙酸钠                      +3乙酸钾                      +3乙酸锂                      +3乙酸镁                      +3氯化钠(比较样品1)           +1氯化钾(比较样品2)           +1氯化铵(比较样品3)           ±乙酸铵(比较样品4)            ±未加金属盐(常规法，对照)     ±
实施例3
在不同金属盐浓度下尿中hCG的检测(1)试剂盒：
如实施例1，使用了一种商品妊娠检测试剂盒(Heart Sign HCG“新型”)，它是通过胶体金免疫检测法测定尿中hCG。(2)检测样品：
使用按实施例1程序(3)所制备的检测样品。(3)加入金属盐：
将上述尿样品以5ml的等分量注入13个尿加样杯中，然后分别加入如下盐；加入氟化钠，形成0.06，0.12，0.48，和0.96克分子/升尿液的浓度，加入氟化钾，形成0.06，0.12，0.48，和0.96克分子/升尿液的浓度，加入氟化锂，形成0.06克分子/升尿液的浓度，另外，加入等克分子比例的氟化钠和氟化钾，形成0.12，0.24，0.96和1.92克分子/升尿液的总浓度。另将5ml等分量的上述尿样品注入尿加样杯，不加任何金属盐，用作对照(常规方法)。(4)检测和判断：
类似于实施例1，按照试剂盒所附的说明书进行每步试验，并且以类似于实施例1的方法进行评分。(5)结果
结果被提供在下面的表3中。结果表明，按照本发明加入金属盐，将导致与常规方法相比较更强、更清晰的显色，因此更容易判断。
表3
金属盐            浓度          评分
氟化钠            0.06          +2氟化钠            0.12          +3氟化钠            0.48          +3氟化钠            0.96          +2氟化钾            0.06          +2氟化钾            0.12          +3氟化钾            0.48          +3氟化钾            0.96          +2氟化钠+氟化钾     0.12          +3氟化钠+氟化钾     0.24          +4氟化钠+氟化钾     0.96          +2氟化钠+氟化钾     1.92          +2氟化锂            0.06          +2
不加金属盐(常规法，对照)        +1
产业开发的可能性
在通过胶体金免疫检测法对抗原或抗体的测定中，按照本发明的方法对反应混合物加入金属盐时，与不加入这种盐的常规方法相比较，以及与加入另一些盐的样品相比较，胶体金的显色增强了，如通过上述实施例所证明。更具体地说，胶体金色调的显示，由于这种金属盐的功能变得非常清晰，特别是当用肉眼观察具有测定范围附近浓度的样品时，阴性和阳性之间的差异更加明显。因此，容易作出判断是本发明显示的明显优越性效能。

Claims (5)

1.一种用于通过胶体金免疫检测法测定靶物质的方法，它包括在免疫反应系统中溶入一种选自如下种类的金属盐：氟化钠，氟化钾，氟化锂，碘化钠，碘化钾，碘化锂，碘化镁，溴化钠，溴化钾，溴化锂，溴化镁，氯化锂，氯化镁，硝酸钠，硝酸钾，硝酸锂，硝酸镁，硫酸钠，硫酸钾，硫酸锂，硫酸镁，甲酸钠，甲酸钾，甲酸锂，甲酸镁，乙酸钠，乙酸钾，乙酸锂，和乙酸镁，以及这些金属盐中至少二种的混合物，借此，使该金属盐能够存在于反应混合物中。
2.据权利要求1的检测法，其中所述的金属盐是如下种类中的任何一种：氟化钠，氟化钾，碘化锂，碘化镁，氯化锂，氯化镁，硝酸镁，硫酸镁，甲酸钠，甲酸钾，甲酸锂，甲酸镁，乙酸钠，乙酸钾，乙酸锂，和乙酸镁，或者是这些金属盐中至少二种的混合物。
3.据权利要求1的检测法，其中所述的金属盐是氟化钠，氟化钾，或者它们的混合物。
4.据权利要求1-3中任何之一的检测方法，其中在反应混合物中，所述金属盐的总浓度为0.05～2克分子/升液体介质。
5.据权利要求1-3中任何之一的检测法，其中在反应混合物中，所述金属盐的总浓度为0.1～1克分子/升液体介质。
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