JPS5839950A - ビリルビン測定用試験キツト及びそれを用いた測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ζこに開示され九発明は、試験試料中のビリルビンの分
析に関する。更に詳しくは、ビリルビン測定に用いる試
薬マツ）（ｍａｔ）／試檗メタブレット　ｔａｂｌ＠ｔ
）構成の改良された試験キット（ｋｉ　ｔ）Ｋ関する。

胆汁色素の化学及び生物学は非常に複雑であり、代謝経
路におけるいくつかの段階性未だ神秘のベールに包まれ
ている。このことく関する古い文献の多くは、今や、陳
腐なものとなっておｐ、臨床医ＩＩｋとってあｔｐ重要
なものではない。しかしながら、ビリルビンはへムの代
ｌＩにおいて幾分早期に表われる胆汁色素の１つであり
、しかも、重要な分析に関する文献を入手すゐことがで
きる。

ビリルビンは、主として、細網内皮系によシ、老衰赤血
球中ヘモグロビンのへム部分の分解から生ずる。これは
、主として、牌Ｓ、肝臓及び骨髄の中で起る。

ヘモグロビンの分解によって生成するビリルビンは、ア
ルフイン又は、少量ではあるが、α−グロブリン類及び
他の血清蛋白類のような担体に結合されて、血漿中に移
送される。サリチル酸塩及びサルファ剤のような険イオ
ン性薬剤又は遊離脂肪酸のような他の陰イオンは、これ
らの結合点を競いあい、血漿のビリルビン運搬能力を事
実上減少させる仁とができる。ビリルビンは、肝臓細胞
膜内で七の担体蛋白から解離し、非結合の伏線もしくは
親和力が高くかつ特異な受容系罠結合した状Ｉで、何ら
かの作用あるいは過程によって、細胞内を移送されると
いう仮設が立てられている。

ダルクロン酸並びに程度としてはよ〕少ないが、硫酸及
び訃そらくは、他の酸類と、ビリルビンの複合体化性、
肝臓で起る。複合体化されたビリルビンは、肝臓細胞か
ら胆汁細管に＃泄される。腸管の甲で、胆汁に排泄され
た複合体化ビリルビンの小部分は加水分解されて、複合
体化されていなかビリルビンが再吸収される。従って、
実際忙は全ての排泄されたビリルビンは複合体の形轢で
存在する。

尿中ビリルビン測定の診断上の価値は、長い間認められ
てきた６正常な尿中ビリルビンのＩＩ度は、デシリット
ル蟲ル約ｏ、ｏ　ｓ　ｔリダツム以下である（ｑ−）。

したがって、尿中の上昇したビリ、ルピンｌＩｉ度は、
患者が病１１にある可能性を暗示する。

例えば、高談度ピリルＣンは、胆汁障害並びに血液及び
肝臓病から起夛得る。一般に、上に述べたｏ、ｏｓｑ＊
を趨える一度での尿中ビリルビンの存在は、尿中Ｏ高ビ
リルビン濃度の原因となっている具体的な病状を決定す
るより包括的ＳＷｔ行なうことがｍ宜しい仁とを示して
いることが、認められている。

上に述べたように、病轢尿又は他の体外排泄物中に現わ
れるほとんど全てＯビリルビンは、ダルクロン酸塩と複
合した形で存在する。従来から、ビリルビンのこの形体
を測定するための多くの分析系が存在する。− ビリルビン試験具や製造及び使用については米国特許１
１Ｅ３，５８５．００１に詳細に述べられている。

先行文献に述べられている試験具は、尿中ビリルビン検
知用の非常に迅速かつ便利な手段を提供しているが、他
方、入手できる試験具紘正常外濃度からほんの少し上昇
したビリルビンの濃度、すなわち、　０．１−０．４Ｎ
Ｉ％のビリルビンを検知するには、充分に感度が良好で
はないということが知られている。

ジアゾニウム化合物と尿中ビリルビンとの間の反応の感
度を高める九めに二、三の試みが報告されているが：し
かじ、得られた試験系はあるいくつかの不利な点を有す
る。米国特許第３，８８０．５８８号は、アゾビリルビ
ン複合体（コンプレックス）の呈色応答性を高めかつ、
構造的にも化学的にもビリルビンと非常ＫＩＩＩ似する
ウロビリノーｒンとの妨害呈色反応管器めるように意図
してつくられた一許のＶアｙ＝ウム類を記載している。

ここに述べられたジアゾニウム化合物は、従来の化合物
とは違って、ホモピンチシン酸及び５−ヒドロキシイン
ドール−３−酢酸のような尿中成分と干渉性（妨害性）
の発色生成物を形成する。後者は、尿の正規の成分であ
）、そして尿中のその成分が１１１１Ｆ１１はどで、こ
の特許に述べられているジアゾニウム化合物を用いたと
きに＠りた正の結果をもたらす。

試験具に包含されたジアゾニウム試薬の感度を高めゐ他
の試みは、ジアゾニウム化合物とビリルビンとの間の反
応のために増感又は増強剤としてのある種のリン酸ジエ
ステル類の使用を開示する米ｆｆｌ特許第３，８５３，
４７６号の中に述べられている。しかしながら、リン酸
ジエステル類と水性媒体間が摺入れないために、この特
許によｐｊｌ造される試験具紘、二回含一工程でつくら
れなければならない。

各種のいわゆる「促進側」が、ジアゾカップリング反応
による血清中ビリルビンの検知に関する先行文献中に述
べられていることを述べておく。

このような荊には、カフェイン、〆イフイリン、酢酸ナ
トリウム、安息誉駿ナトリウム、アラビアジム、及び各
種の他の化学的に無関係な化合物が含まれて＾ゐ。

尿中ビリルビンの定性分析用１ｃ７０以上の試験法が提
案されている。一般に、これらは、用いられていＪｂ原
ｓＫよって４つの軸層Ｋｔとめることができる：葎）尿
試料の色の観察；（ｂ）染料の色がビリルビンの色和う
ち勝つ壇で染料（例えばメチレンツルー）を用いた尿試
料の滴定；（Ｃ）特徴ある色へのビリルビンの酸化；及
び（ｄ）　Ｓ’アゾカップリング。これらの試験法のう
ち臨床上実行可能なもののほとんどはＶアゾ二カップリ
ンダに基づく。

ある榎のジアゾニウム化合物の存在下で、ビリルビンは
その中央のメチレン基でわかれて、アゾピリルＣンとし
て知られている顔料の２つの分子を形成する。これらの
分子は、酸と塩基のｐＨで青から紫、そして中性ｐＨで
赤くなる。この反応は、以下のように構造的ＫＡ象化す
る仁とができる： ＣＨＩＣωＲ ＋ ＣＢａＣｏｏｌ （ここでＭｕメチルそしてＶはｆ＝ルである。）１９８
３年に、：フリーｗ（Ｆｒ＾）−とｉｌＪ＋＝Ｑ’ｒｅ
＊）は、驚くはど便利な形で、Ｖアゾーカｌツリング技
術を利用したタブレット試験具を紹介した。この試験具
は、ザエイムス・デイビｙＩｌン・オプ・マイルス・う
がラドリーズ・インコーーレーテツド（ｔｈｅ　Ａｍｅ
ａＤｌｖｉｍｌｏｎ　ｏｆ　Ｍｉｌｅｓ　Ｌａｂｏｒａ
ｔｏｒｉｅｓ＋、　Ｉｎｃ、　）よりイクトテス）　　
（ＩＣＴＯＴＩＳＴ■）として商業的に入■ 手できる〔フリー（Ｆｒ・・〕等、胃腸病学（Ｇａ５ｔ
ｒｏ−＊ｎｔ＠ｒｏｌｏｇｙ）　ｅ　２４　＊　４１４
　（１９５３）　：及び１９５８年９Ａ３０日に７り−
等に発行された米国特許第２，８５４，３１７号を参照
）。

ＩＣＴＯＴＥ８Ｔ（イクトテスト）は、存在するビリル
ビンを吸着しながら水性の試験試料を吸収でき、そのむ
とによって分析対象物を淡縮できる試験マットを利用す
る。試験試料の数滴を試験マットの１点に落した後、つ
づけて、安定化され緩衝化された試＊ａｉ成物を含む試
薬タブレットが、試験マットの湿潤され大部分に置かれ
る。このタブレットは、つづいて、数滴の水で「洪水（
ｆｌｏｏｄ）Ｊ状ｌＩＫされ、そのことＫよって、試薬
を部分的に溶解し吸着されているいか麦るビリルビンも
ジアゾニウム塩を含む溶ＩＩＫ接触せしめられる。もし
も、試験試料がビリルビンを含有するならば、試験マッ
トには紫色が発色する。この試験は０．０５〜０．１０
１１Ｆ１１と同程度の低いビリルビン濃度で感応するこ
とが見出されている。

本殆−が関係するの社、正に、このイクトテストの改良
であり、とくに試験マットの改良である。

ｙ　Ｉ）　−□’ｒ・・）等は、試験ｉット用の好ｔし
い組成物としてセルロース含有のアスベストの使用を教
示している。アスベストは、水性の試験試薬を吸収する
間、％にビリルビン含有着するに適していゐという性質
を備えている。しかしながら、「チーメルク・インデッ
クｘ　（Ｔｈｅ　Ｍｅｒｃｋ　Ｉｎｄ＠ｘ）Ｊ。

９Ｊ［、ｌｌｏ頁、メルク・アンド・カン／ヤニ−・イ
ン３−　／レージ冒ン（Ｍｓｒｅｋ　＆　Ｃｏ、、　Ｉ
ｎｃ）　ｓｌ　９７６＄を参照すると、アスベストにけ
、潜在的に深刻な健康障害が伴うことが判る。更に、７
リー勢によって示唆され九アスベス、）Ｋ代わるものと
して、セライト（Ｃｅ１ｉｔｅ　、二酸化ケイ素）及び
粘土が挙げられるが、これらにも・、それ自身に起因す
る潜在的な健康障害が伴う一方、ビリルビン吸着性及び
充分な水吸収性を有しない。

したがって、本発明は、ビリルビンを高い８度に吸着で
きる一方、イクトテスト試験マットの要請を満たすこと
ができ、それにもかかわらず、障害という欠点が伴うア
スベスト及び二酸化ケイ素を含まない試験マットのＲｊ
ｌｌＩ／ｃ用いるための材料を見出す試みを完成したも
のである。水性の試験試料に対するＳ度の高ｉ吸収性を
有し、それＫよシ、ｉット出の１つの点で比較的大量の
試料接種をもたらすこと；及びビリルビンを吸着する傾
向が高く、そのことくより、接種点でビリルビンが濃縮
されること−この２重の要請こそが本発明を特異なもの
にしている。

簡単にいえば、本発明は、試験試料中ビリルビンの存在
を測定するための試験用キットである。

このキットは、ビリルビンの存在に対し検知可能な応答
を与えることのできる試薬並びに試験試料及び試薬が逐
次適用される試験マットから構成される。試験マットは
、微粉末のシリカダルから成る。更に、本発明は、試験
試料中のビリルビンをこの試験キットを用いて測定する
ための方法にある。

本発明の重Ｉ！な点は改良された試験マット、又はむし
ろ、その改良された組成にある。微粉末シリカダルは、
従来技術は全く逆のことを教えているが、　　ビリルビ
ン含有の水性の試験試料を適用した個所で、試料の残）
を散逸せしめる一方、ピリルビシを湊細できることが見
出され友。

化学的には、シリカダルは、近似実験式ＨｓＳｉＯｍを
有する沈降ケイ酸塩である（「メルク・インデックＸ　
（Ｍｅｒｃｋ　Ｉｎｄ＠ｘ）　Ｊ　、　９版、１０９９
頁、メルク・アンド・カンパニー・インコーポレーショ
ン（Ｍ＠ｒｏｋ　＆　Ｃｏ、、　Ｉｎｓ、　）　、　ａ
−ウェイ（Ｒａｈｗａｙ）　。

！］　−Ｎ：ｒ−イ（ＮＪ）ｌ　１９７６４）６現在で
は、高重合度のケイ素、すなわち、ケイ酸の縮合生成物
から成ると信じられている〔カーク・オスＹ　−（Ｋｉ
ｒｋ　−Ｏｔｈｍ＠ｒ　）　、エンサイクロペディア・
オ／・ケンカルψテクノａ　Ｖ　−（Ｅｎｅｙｃｌ＊ｐ
＊ｄｌａ　ｏｆＣｈｅｍｉｅａｌ　Ｔｅｅｈｎｏｌｏｇ
Ｆ　）　ｅ　１　ｓ　、　ｓ　ｌ＝　７０　、　ｌ／Ｎ
ン＊ｆ；１イリー・アンド・サンｙｅ　（Ｊｏｈｎ　Ｗ
ｉｌ＠ｙ＆８ｏｎｓ　）、１９６９年〕。それは、酸性
化、つづいて電解質除去のための洗浄、そして種々の程
度の脱水状ｍＫ−＊での乾燥によって、水性のケイ酸塩
溶液から調製される（同上）。得られた固体は、一般に
、三次元架橋された水利性ケイ素ミセルであると考えら
れている（同上）。それは水を容易に吸着し、高炉ガス
、空気及び炭化水素をはじめとする他のガスを乾燥すゐ
ために使われる〔）・ツクーズ・ケンカル・ディクショ
ナリー（Ｈａａｋｋ　ａＣｈｅｍｌｃａｌ　Ｄｌｏｔｌ
ｏｎａｒｙ　）　ｓ　４版、６１０頁、マツクダロウ・
ヒル・インコーポレーション（ＭｃＧｒｏｗＨｌｌｌ、
　Ｉｎｅ、　）　、　１９７２年）。「シリカダルは、
炭化水素に対してよ〕も水に対して、よシ大きな親和性
を有するので、（炭化水累流）から吸着されゐ水はしだ
いに全ての炭化水ｊｌ！ｉＩ／Ｃとってかわるであろう
」（カーク・オスマー（Ｋｉｒｋ−Ｏｔｈｍ・ｒ、上の
引例）。

シリカダルが、炭化水素よ多も水に対してよシ強く結合
し、水を吸着するという後者の性質を考えるならば、全
く驚くべきことに１本発明においては、シリカグルは、
ビリルビンと着合するが、水を力かクーオネ！−の教示
を考えに入れると、轟業者は、一旦シリカｒｋの試験マ
ットが吸着され良木分子で飽和されると、試験試料中に
存在するどのビリルビンも過剰の水で這ばれて試料適用
の位置から単に流れ去ると考え為であろう。驚くべきこ
とには、ｔさに正反対の現象が起るのである。

本発明の試験マットは、最適に実施されるためには微細
Ｋｌ）砕されたシリカグルを含有すべきことが見出され
た。すなわち、それは５μ又はそれ以下から約２００声
の範囲の粒径であるべきである。約５μ〜約２０μの範
囲の粒径を有するシリカグルを用いることが本発明では
％に好ましい。

試験マットに存在するシリカグルの量ＫＦｉ制限はない
。それは、２閣のシリカダル層を有する薄層クロマトグ
ラフィー（ＴＬＣ’）板の場合のように約１０９−から
・比較的少量０−粉末″′−”２“ｒ含有するＩり塩化
ビニル黴細孔膜のようＫよｐ少量Ｋｉで変えることがで
きる。試験マットに用いて最適のシリカグルの量は、例
の中で以下に提供されるような定常の実験によって容易
に決めることができる。それは、利用できる試験試料の
体積及び分析に必要とされる感度のような変動因子によ
って影響される。

試験マット中のシリカグルの量及び粒径は広く変化せし
める仁とができるのみならず、存在してもよい他の成分
の性質は同様に異なったものであってもよい。例えば、
試験マットがＴＬＣ板であるならば、それは、シリカグ
ル粒子を支持部材、この場合ガラス板、に固着せしめる
ために少量の不活性な粘着剤を含んでいてもよい。つづ
いては、例えば？リスチレン、ナイロン又はポリプロピ
レンシートのような他の材料が、ガラスに代って支持部
材を構成することができる。

更に１シリカｒルを支持層と一体的に組合せるか又は支
持層Ｋｌｌ設することができる。例えば、それを軟化又
は溶融され九ポリ塩化ビニルと混合しその後均−系フイ
ルムとじて押出すことができる。その他に、セルロース
又は紙のような繊維質材料と組合わせて試験マットを形
成することができる。

本発明で権利請求される試験キットは、ビリルビンをａ
ｍする試験マットに加えて、濃縮され九ビリルビンを検
知で會る試薬を包含する。「試薬」は、ビリルビンと相
互作用して発色若しくは色の変化、紫外線の反射若しく
は吸収におけるｍ化、蛍光、又は他の物塩的に識別可能
な表われのような検知可能な応答を生ずる１つ又はそれ
以上の成分を意味する。試薬は、前述した７り−等の特
許第２．８５４，３１７号、それはここで引例として含
まれている臥、で述べられている安定化ジアゾニウム塩
／緩衝割の組合わせのような化学変化を生ずる−の；又
は、イクトテスト試験キットに現在では包ｔされている
タブレットであることができる。

それは、ビリルビンの存在下で応答を生ずる抗体及び抗
原−標識化複合体のような免疫原糸であることができる
；それはビリルビンの存在下で蛍光を発する系又鉱冷光
を発する系であることができる。本発明で試薬として好
ましいものは、ジアゾニウム塩／酸緩衝＠を組合わせた
ものである。特に好オしいものは、ｐ−ニトロベンゼン
ゾアゾニクムーｐ−ｈルエンスルホン酸塩、サリチル酸
、及び発泡性塩基を含有するイクトテストタブレットで
ある。

使用において、ビリルビンを含有すると思われる例えば
尿のような試験試料の一部を、区別しうル点でに験−ｖ
ットに適用される。ついで、試薬が試験マットの湿潤領
域和適用され、少なくとも一部が溶媒に溶解され、試験
マットを濡らし、その後、検知可能な応答の発ｆＡＫ関
し、肉眼で又は機器的にのいずれかによって観察される
。試薬がビリルビン／緩衝化されたノアゾニウム塩の相
互作用に基づく場合、陽性の応答は、普通券から紫への
発色である。

例 以下の例は、本発明をなすＫあたって行なわれた実験を
違べるものである。これらは好ましい態様及び本発−を
り〈９、用する最良のモードについての発明者の思想を
例示するもの士あるが、それらは、決して、その範囲を
制限するものと解釈されるべ自ではない。

例１．シリカｒル含浸ｐｖｃ 尿中ビリルビンの存在を一定する九めに試験キットを製
造した。それは、試薬タブレット及びシリカビル含浸Ｐ
ｖＣから形成され九試験マットから構成された。試薬は
、イクトテスト試験キット（エイムス・ディ、ヒジＩＩ
　Ｖ　＠”Ｔイル夙・うがラドリーズ・インコーＩレー
テッド）から得られたタブレットから成る。

試験マットを建りａｔｅ−ラス・メンブレン・ｒレード
ム−４０／す塩化ビ＝　ル（ＭｉｏｒｏｐｏｒｕｓＭ＠
ｍｂｒａｎ＠Ｇｒａｄｅム−４０）（アメレース・コー
Ｉレーション：　ＡＸｎｇｒａｃ＠Ｃｏｒｐ）から調製
しｆｔ。

この膜を、色が取９除かれるまで、１００−蒸留水轟ル
５ｔのスルホサリチル酸を含む溶液中で洗浄した。つい
で、膜を脱イオン水で洗い、空気乾燥器中で約１０分間
６０℃で乾燥し友。このように処理し九膜を切断し、−
辺が約２．５４ｍ（１インチ）の四角い試験マットを形
成した。５つのマットそれぞれの別々の点に、以下の量
のビリルビン：０（対照）　、　ｏ、ｏ　ｓ　、　ｏ、
ｌ、　０．２及び０．４１１Ｆｔｓを含む尿ｔ−２滴そ
れぞれ添加した。各四角片の上にイクトテストタブレッ
トを置いた。各タブレットの上に水ｔ−２滴滴下し、そ
れぞれのマットの上に落とさせた。２０〜３０秒後、発
色に関しマットを皺察した。０及び０．０５岬チビリル
ピンを含有するマット上には全く発色がなかったが、他
方では、他のマット上には、０．１１１Ｆ　１ｇで非常
に淡い紫から０．４１１１１−では淡い中間紫色に及ん
で発色した。

この実験は、試験試料中のビリルビンの存在を關足する
際のシリカグル含有の／　ＩＪ塩化ビニル微細孔膜の効
能を示している。

例２　シリカグルのＴＬＣ板 試験マットとして微粉砕されたシリカグルのＴＬＣ板を
用いたビリルビン分析用の試験キットを製造する実験を
行なり九。

ＴＬＣＩｊｌ’ルク・アンド拳カンノ母ニー（Ｍｅｒｃ
ｋ＆　Ｃｏ　）から入手した。これらは、−辺が２０備
でその一つのＷｉＫは粒径１０〜１！ｓμを有する黴扮
末シリカｒルが塗布され九四角いガラス板から構成され
てｖｈ九。このシリカグル層は厚みが約２簡ｆ＆つ九。

この板をスルホサリチル酸の５９１溶液で、例ＩＫおけ
ると同様にして、紫色が取）除かれる壜で洗浄し、つい
で脱イオン水で洗った。この洗浄された板を実験台の上
で一晩室温乾燥し良。

乾燥し丸板の１枚を、シリカｒル塗布部が２．５４ａｓ
（１インチ）の四角に分割されるように区−した。例Ｉ
Ｋおけるように、５枚の四角片には１個々に、連続的に
増加するビリルビンの量：０（対照）　、　０．０５　
、０．１　、０．２及び０．４ｑｌＩを含有する尿を別
々の点ＫＩ！種した。各四角片に、５滴のそれぞれＯＩ
Ｌをｍ１ｌｌた。も温潤四角片の上にイクトテストタブ
レットを置き、２滴の脱イオン水で処理し、それを四角
片の上に落下せしめた。２０〜３０秒後、その四角片を
発色に関し調べ九。対、照に関しては色の変化は全く観
察されず、しかし他方で、他の四角片の上には、ｏ、ｏ
　ｓ　ｑ％の尿中ビリルビンに関しては非常に淡い紫色
から０．４１１Ｆ襲試料Ｋａしては中間紫色に及んで色
があられれ良。

この実験は、本発明の試験マット用の微粉末シリカダル
塗布ＴＬＣ板の効能を示している。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ビリルビンの存在に検知可能な応答を発することが
   できる試薬及び試験試料の少なくとも一部を吸収できる
   試験マットから成る試験試料中ビリルビンの存在ｔ　Ｉ
   ｔ定するための試験キットにおいて、 該試験マットが微粉末シリカゲルから成ること′を特徴
   とする試験キット。 ２　試験マットが、微粉末シリカゲルを含有するｌり塩
   化ビニルの微細孔フィルムである特許請求の範囲第１項
   記載の試験キット。 ＆　試験マットが、支持部材に＠着され九微粉末シリカ
   ｒルの薄層である特許請求の範囲第１項記載の試験キッ
   ト。 ４、　微粉末シリカグルが、約５〜約２０ミクロンの粒
   径を有する特許請求の範１！Ｉ！Ｉ−第３項のいずれか
   に記載の試験マット。 ＆　微粉末シリカゲルから成る試験マットの別々の点を
   試験試料の一部で濡らし、マットの濡れた部分にビリル
   ビンの存在下で検知可能な応答を発することができる試
   薬を置き、その試ｌＩを溶媒に少なくとも一部溶解せし
   めて試験マットを濡らし、ついで、検知可能な応答のあ
   られれｔ−観察する工程から成ることを特徴とする試験
   試料中ビリルビンの存在を測定する方法。 ６、　　Ｅｌｌがタブレットの形である特許請求の範囲
   １１５項記載の方法。 ７　試験マットが、微粉末シリカグルを含有するぼり塩
   化ビニルの微細孔フィルムである特許請求の範囲第５項
   又は第６項記載の方法。 ａ　試験マットが、支持部材に固着された微粉末シリカ
   グルの薄層である特許請求の範囲第５項又は第６項記載
   の方法。 張　微粉末シリカグルが、約５〜約２０建クロンの粒径
   を有する特許請求の範囲第５〜第８項記載の方法。