JPS60249057A - １段階へテロジニアスアツセイ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の背景］ （発明の分野） ハブテン、抗原およびレセプダーのようなアナライト（
ａｎａｌｙｓｅ、分析質）の迅速かつ正確な定量法とし
て、幾つかの方法が開発された。一群のアッセイには、
吸収性支持体と酵素コンジュゲートが含まれ、支持体−
Ｌにおける色素の存否がアッセイ媒質中のアナライト量
の指標となる。このようなアッセイの開発に際しては、
プロトコルを単純化することが望ましい。多数の独立し
た手操作を含むプロトコルは、通常多数の誤差をもたら
す。また、技術者が異なると結果に大きな相違が生まれ
得る。さらに、多段階プロトコルは、プロトコルを自動
化し得るのでない限り通常退屈である。自動化アッセイ
は普通精巧な機械を必要とし、そのため大形臨床実験室
以外におけるアッセイの遂行を排除する。

したがって、プ【１トコルを単純化することによって既
存のアッセイを単純化し、そこで用いる試薬は予じめ定
めた量を供給し、使用者による計量を回避し得ることに
は関心がもたれる。

（従来の技術） 米国特許第４１６８１４６号は、テストストリップ・イ
ムノアッセイを記載している。米国特許第４２９９９１
６号は、吸収性支持体およびアッセイ媒質中のアナライ
ト量に関係して支持体に結合する酵素を用いる酵素アッ
セイを記載している。

また、上記第４２９９９１６号の一部継続出願に係る米
国特許第４３９１９０４号も参照されたい。

米国特許第４３６６２４１号は、イムノアッセイ実施用
の別の装置を記載している。米国特許第４４３５５０４
号（１９８２年７月１５日出願、第３９８５０５号）は
、２種の酵素を含む酵素的クロマトグラフィー・イムノ
アッセイを記載している。

［発明の要約コ この発明によると、酵素イムノアッセイ実施のための改
良法か提供される。この酵素イノ１ノアツセイは、吸収
性支持体に結合している特異的結合対の一員を含み、支
持体に結合するに至る酵素量は試料中のアナライト量と
関係づ（〕られる。支持体に対する酵素結合の存在は、
基質から着色生産物への酵素触媒反応の結果として支持
体」二に呈色をもたらす、プロトコルは、支持体の少な
くとも・一部に酵素基質を含浸させることにより著しく
単純化され、基質は試料溶液と接触したとき酵素に利用
される。

［実施態様］ 特異的結合対の相同（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）成分間の
反応が仲介する、吸収性支持体に対する酵素の結合が関
係した酵素イムノアッセイは、吸収性支持体に酵素基質
を含浸させることにより単純化され改善される。アッセ
イの結果は、基質から酵素触媒により生産物が形成され
る結果として起る呈色変化により測定される。含浸した
基質の存在に加えて、特異的結合対の一員が吸収性支持
体に非拡散結合される。

吸収性支持体を含めて種々の装置（仕掛け）を使用する
ことができ、そこではアッセイ媒質が移動性フロント（
前面）を構成する。装置は、非拡散結合した特異的結合
対の一員をもっことができ、これは溶媒フロントが通る
全領域中の一小部分にのみ位置するかまたは溶媒が通過
する装置の主要部もしくは全部にわたって拡がり得る。

また、基質も溶媒が通過する領域の一部または全部に含
浸させることができるが、通常は一部のみに含浸させる
。特異的結合対の一員の結合領域および基質の含浸領域
は、装置の性質によって定まる。

特に興味がもたれる一装置は、米国特許第４１６８１４
６号に記載されている。この装置は、修正の対象であり
、吸収性ストリップの主要部にわたって非拡散的に均一
結合した特異的結合対の一員を有する。装置の端部ある
いは先を試料溶液に浸漬し、試料は装置の他端へ向かっ
て」１昇する。

洗浄後、装置を酵素に結合した特異的結合対の−員を有
する試料に浸漬し、これは装置の結合可能な部位に結合
するが、これらの部位はアナライトの存在または不存在
の結果として結合可能になっている。装置の洗浄後、酵
素に対する基質を含む現像用溶液に装置を浸漬し、それ
により装置上の酵素存在領域に検出可能な呈色をもたら
す。

装置に関して、プロトコルの単純化をもたらす数々の改
善がなされている。特に関心がもたれるのは、酵素の組
合わせの使用であり、この場合、特異的結合対の一員に
加えて、酵素も装置の主要部にわたって結合される。第
２の酵素が特異的結合対の一員に結合され、２種の酵素
は一方の基質が他方の生産物に当るという関係を有する
。この酵素の組合わせは「チャンネリング」とも称する
が、これを用いると、アナライト・酵素コンジュゲート
（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、結合体または抱合体）並びに第
１および第２酵素に対する基質を組合わせることにより
、プロトコルを単純化することができる。アッセイの結
果は、呈色の最遠端によって決定され、これは多くの場
合線であるか、またはアナライト酵素コンノユゲ−１・
が結合した全領域にわたって拡がっている。このアッセ
イのさらに詳細な記述については、米国特許第４４３５
５０４号（出願第３９８５０５号）があるので、ここに
引用して記載の一部とする。

第２の装置では、吸収性部材がアッセイ試料中に導入さ
れる。吸収性部材は支持体上にマウントされた小形素子
であってよく、この素子はアツセ　−イ媒質中に完全に
浸漬される。素子に結合しているのは特異的結合対の一
員、および適当な場合には酵素であり、これは上記の作
用を果す。アナライト・酵素コンジコゲートは、アッセ
イ媒質中のアナライト量に比例して素子に結合する。素
子をアッセイ媒質から取り出し、洗浄し、次いで酵素に
対する基質を含有する現像液に浸漬すると着色不溶性生
産物が生成し、この着色生産物は素子に結合したアナラ
イト・酵素コンジュゲートの量に比例して素子上に堆積
する。この装置のさらに詳細な記述については、米国特
許第４３９１９０４号（１９８１年４月１７日出願、第
２５５０２２号）があるので、ここに引用して記載の一
部とする。

この発明によると、このような装置または同様な装置が
、アナライト・酵素コンジュゲートに対する基質を吸収
性素子に含浸させて呈色をもたらせることにより、改変
される。アッセイ条件下において、基質は酵素：÷利用
され、酵素の触媒作用により急速に着色生産物に変換さ
れ、これは吸収性素子に結合して検出可能なシグナルを
発生し、シグナルはアッセイ媒質中の、アナライト量に
関係づけることができる。吸収性素子に呈色性基質を含
浸させることにより、アッセイ媒質製造用試薬混合物を
単純化し、基底値を減少することができ、精度のよい定
量を行なうことができる。

この発明を説明するために用いる用語の定義は次の通り
である。

［定義］ アナライト　測定される化合物または組成物であって、
リガンドであってもよく、これはモノまたはボリエビト
ビソク（単または多決定基）、抗原性またはハプテン性
であり、単一化合物または少なくとも１つの共通エビト
ビツク部位あるいはレセプターを共有する化合物群であ
る。

特異的結合対（ｒｍｉｐＪ）　：　１種または２種の異
なる分子であって、分子の一方は、他の分子の特定の空
間性および極性構成（ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）に対
して特異的に結合する領域を表面上またはキャビティ内
に有する。特異的結合対の構成員は、リガンドおよびレ
セプター（「アンチリガンド」）と称される。

多くの場合、レセプターは抗体であり、リガンドは抗原
またはハプテンの役目をし、その意味で免疫対の構成員
である。したがって、各構成員はｍｉｐと称することが
でき、ｒｍｉｐＪはあらゆるリガンドおよびあらゆるレ
セプターを包含するものとする。

リガンド、対応するレセプターが天然に存在するか、ま
たはレセプターを製造し得る化合物。

レセプタ＝（「アンチリガンド」）２分子の特定の空間
性または極性構成すなわちエビトピヅク部位あるいは決
定部位を認識できる化合物または組成物。

レセプターの例には、天然レセプター−類、例えばチロ
キソン結合グロブリン、抗体、酵素、ＦＡＢフラクメン
ト類、レクチン類等が含まれる。

標識　標識は、他の分子または支持体にコンジュゲート
した任意の分子であってよく、２種の分子が関係する場
合には、何れの分子を標識にするかは随意に選択される
。この発明では、標識は支持体およびｍｉｐにコンノコ
ゲートした酵素であり得る。

シグナル発生系　シグナル発生系は、３つまたはそれ以
」二の成分を有し、少なくとも＋７分はｍｉｐにコンジ
ュゲートしている。シグナル発生系は、外部的手段、通
常電磁放射の測定、好ましくは視覚的検査により検出で
きる、測定可能なシグナルを発生する。シグナル発生系
は、酵素基質および発色団を含み、発色団は紫外領域ま
たは可視領域の光線を吸収する色素、燐光剤、蛍光剤お
よび化学発光剤を含む。

免疫クロマトグラフ・免疫クロマトグラフは、リガンド
またはレセプターのような複数個のｍｌｐを含み、これ
らは吸収性支持体の領域に結合し、支持体はアナライト
を移送しながら領域を通過する液体の移動を許すもので
あり、また適当な場合にはシグナル発生系の任意構成員
を含む。ｍｉｐ類は共有結合または非共有結合により非
拡散的に支持体に結合している。ｍｉｐが均一に結合す
る領域は「免疫吸収帯」と称する。さらに、シグナル発
生系の１つまたはそれ以上の構成員が、共有結合または
非共有結合により非拡散的に吸収性支持体に結合してい
る。

（材料） 使用する酵素は、多くの場合可視領域に吸収をもたない
物質、例えばロイコ色素から着色生産物をもたらずもの
である。基質は一般に加水分解または酸化還元反応によ
り変形される。生成する生産物は水に比較的難溶性であ
り、吸収性支持体に適当に強く結合して、生成部位また
はその近傍で゛検出可能なシグナルを発生をする。使用
できる種々の酵素には、β−ガラクトシダーゼ、β−グ
ルコシダーゼ、ホスファターゼ、コリンエステラーゼ等
のグリコツダーゼ、その他のヒドラーゼのようなヒドラ
ーゼ類が含まれる。オキシドレダクターゼ類には、ペル
オキシダーゼ類、オキシダーゼ類、例えばウリカーゼ、
モノアミンオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、デ
ヒドロゲナーゼ類、例えばグルコース−６＝燐酸デヒド
ロゲナーゼ、または他のペルオキシダーゼ類、オキシダ
ーゼ類、またはデヒドロゲナーゼ類が含まれる。

所望の着色生産物をもたらす広範な色素（染料）類が用
いられる。特に、多数のフェノール性化合物は、キャッ
プして、イオン化不可能な無色のキャップ生産物にする
ことができる。キャップ′４Ａ利を除くと、生産物は着
色する。このような色素（染料）の例は、フルオレスセ
イン類、ヒドロキシクマリン類、例えばウンベリフェロ
ン等である。過酸化水素と酸素触媒または他の化合物を
介して反応する種々の化合物には、ナフトール類、例え
ば４−タロロナフトール、へＢＴＳ等、すなわち肉眼ま
たは機器分析により検出しうる任意の化合物Ｊ、Ｊ惑十
Ｊ−＋　２　１　ｋ−ＡＩ−フ　々＝　非／　）Ｊｔ　
幻’ｌ　Ｍ　Ｎ五Ｉ）牝景から区別できる転回で検出可
能な化合物を意味する。通常、検出は肉眼による。化合
物は一般に約３’５５０−６５０ｎの領域の光を吸収す
るか、または一般に約６００ｎｍ以下の光を吸収して約
３５０ｎｍ以上（通常約４００ｎｍ以上）の光を発生ず
る蛍光化合物である。

吸収性支持体に結合した特異的結合対の構成員は、アナ
ライト、その相同性または逆性結合具、またはそれらの
類縁体である。したがって、結合オろ物質はハプテン性
リガンドもしくは抗原性リガンドのようなりガント、ま
ノこは天然もしくは合成レセプターである。

この発明にお（３るリガント・アナライトは、モノエビ
トビツクまたはポリエピトビツクであることを特徴とし
、レセプター・アナライトは、単一または複数の結合部
位を有ずろ。ボリエピトピソク・アナライトは通常ポリ
（アミノ酸）すなわちポリベブヂドおよび蛋白質、多糖
類、核酸並びにこれらの組合わせである。このような組
合わＵまたは集合体ｌこは　鋪肯　Ｉ″１１ノ！　７７
　ｒ−１工・ＩＪ遺伝子、ミトコンドリア、核、細胞膜
等が含まれる。

多くの場合、この発明で用いるポリエピトビツク・リガ
ンド・アナライトは、少なくとし約５０００、通常少な
くとも約１００００の分子量を有する。ポリ（アミノ酸
）の範囲では、関心の対象であるポリ（アミノ酸）は一
般に分子量約５０００−５００００００、通常的２０（
ｊＯＯ−１００００００であり、関心の対象であるホル
モンでは分子量約５０００−６０００（ｌである。

有用なりガントのさらに詳細なリストについては、米国
特許第４２７５１４９号の１２−１７欄に列記されてい
るので、ここに引用して記載の一部とする。

モノエピトピソク・リガント・アナライトは、一般に分
子量約１０ｎ−２０００、通常的１２５−１０００であ
る。関心の対象であるアナライトには、医薬、代謝産物
、農薬、汚染物質等が含まれる。

関心の対象である多数のアナライトが、米国特許第４２
７５１．１９号の１７’−１８１１１１で列記されてい
るので、ここに引用して記載の一部上セる。

レセプター・アナライトでは、分子量は一般に、約１０
”−２ｘ　ｌ　Ｏ１＋、通常的３ＸｌＯ’　−２ｘ１０
６、さらに詩通には約３ＸＩ　Ｏ”−２ＸＩＯ６の範囲
内にある。免疫グロブリン類、ＩｇΔ、ＩｇＤ、ＩｇＥ
Ｓ　ＩｇＧ　およびＩｇＭでは、分子量は一般に約１６
００００−約１０６である。酵素は一般に約１００００
−６０００００ドルトンである。

天然レセプタ〜は広範に変るが、一般に少なくとし分子
量約２５０００であり、１０°またはそれ以上でもよく
、アビノン、チロギソン結合グロブリン、チロキシン結
合プレアルブミン、トランスコルヂノ、膜表面蛋白等を
含む。

リガンドが他の分子または支持体にコンジュゲートシて
いる場合、しばしば特定の部位に特定の官能基をらたら
すようにリガントを修飾する。修飾により、リガンド類
縁体と称する生産物か得られる。リガンド類縁体につい
ては米国特許第４２７５１４９号の１８−１９１１１１
に詳述されているのて、ここに引用して記載の一部とず
ろ。

使用する装置は、免疫クロマトグラフもしくはディツブ
ステインクまたは他の同様な装置である。

まず、免疫クロマトグラフについて述へる。

（免疫クロマトグラフ） 免疫クロマトグラフは、毛管内に液体を通ず吸収性支持
体、非拡散結合したｍｉｐを含み、また、シグナル発生
系の１つまたはそれ以−］二の構成員、すなわち少なく
とも１つの基質を含む。

広範囲の支持体であって、ディメンジョン（寸法）、特
に厚みが異なるもの、材質が異なるらのおよび形状が異
なるものを用いることができる。

多くの場合、形状は長く、直角四辺形（矩形）のストリ
ップが好適である。少なくともストリップの一部には、
ストリップに均一に結合したｍｉｐが存在する。ストリ
ップの寸法は、取扱いの便宜にある程度支配される。ま
た、免疫吸収帯は、関心のある濃度範囲で存在し得るア
ナライト全部に適応できるに充分な寸法でなければなら
ない。プロト免疫吸収帯はアナライトと標識ｍｉｐの山
背に対する８爪を含む必要がある。

広範囲の吸収性支持体を用いることができ、これには天
然および合成ポリマー性月利、特に紙箱、含有紙、例え
ば濾紙、クロマトグラフィー用紙等のようなセルロース
性材料、ポリ塩化ビニル、架橋デキストラン、アクリレ
ート類、ナイロン、ポリビニルジフルオリド等のような
合成または改質天然ポリマーか含まれ、これらのみてま
たはンリカのようなセラミック材料と組合わりて用いら
れる。

免疫クロマトグラフ用吸収性支持体の厚みは、一般に約
０．Ｏ５ｍｍ−約２　ｍｍ、通常的０．ｌｍｍ−０，５
＋ｎｍであり、約０．２ｍｍ−約０．４ｍｍか好ましい
。紙の構造は広範に変化することかでき、微細、中微細
（ｍｅｄｉｕｍ　ｆｉｎｅ）　、中（ｍｅｄｉｕｍ）、
中粗（ｍｅｄｉｕｍ　ｃｏａｒｓｅ　）および粗のもの
を含む。表面も広範に変ることができ、平滑と粗荒およ
び硬質と軟質の種々の組合わけであって乙ｊ：ｌ＋。

リスヂレノ、ポリエチレン等の種々の不活性支持体によ
って支持されることができる。支持体は、免疫クロマト
グラフから離れた裏張り、縁取り、またはその他の免疫
クロマトグラフの機械的強度を増大する構造として用い
ることができる。

（ディツプスティック） ディツプスティックは１つまたは２つの素子を含み、そ
のうち１方の素子は試料素子であり、他方の素子は標準
である。２つの素子は吸収性固体支持体であり、「支持
体」または「固体支持体」と称する。

吸収性固体支持体は広範に変化し得る。通常、支持体は
シグナル発生系の構成員に対して強い吸着剤でないもの
を選択する。吸着はアッセイに有害な作用を及ぼし、シ
グナル発生系が発生するシグナルの測定を妨害する。ま
た支持体は、アッセイ中その物理的一体性を実質的に維
持するものを選択する。支持体は種々の形態をとること
ができ、種々の物理特性をもち、種々の化学的組成物で
あってよく、組成物の混合物またはラミネートまたはそ
の組合わせのような１つまノこは２つ以−１二の組成物
であってもよい。特別な支持体は、支持体」二で酵素生
産物を不溶化することによりシグナル発生化合物と相互
作用４゛る。

支持体は、使用法および測定法に応じて、種々の形状お
よび形態、並びに種々のディメンジョンをとることがで
きる。支持体は、棒、管もしくは毛管、繊維、ストリッ
プ、ディスク、板、キュベツト等のような基体上にマウ
ントすることができる。

支持体は、その性質、適用容易性、および所望の性質に
応じて、比較的厚みの小さい層、通常少なくともＯｌμ
、一般にｌθμ、またはそれ以」二の厚みの適用層のよ
うに、基体と一体または別体の部分とすることができる
。

支持体は、不透明、半透明または透明であってよい。支
持体はシグナル発生化合物が少なくとも０．１μ、好ま
しくは１μ、特に好適には１０μの深さまで浸透するの
が好ましい。

また支持体は、その機能に応じて考慮される。

支持体は、媒質から識別でき通常媒質から分離できるよ
うに、水性アッセイ媒質中で別個の存在を保つ材料の役
目をする。支持体は、それに結合したｍｉｐを支持し、
支持体から独立して溶液中に拡散しないようにする。さ
らに、支持体は酵素基質および生産物の支持物として作
用し、沈積層の基体として作用する。支持体は、非流動
性で独立しており、支持体が浸漬されている液体媒質か
ら区別でき、ｍｉｐ　、シグナル発生系の構成員または
適当な場合には共有もしくは非共有結合した他の化合物
を支持する独立した基体または基礎を提供する。支持体
は荷電形でも非荷電形でもよく、荷電の場合電荷はシグ
ナル発生系の操作に利点をもたらすことがある。

広範囲の材料を用いることができ、最初に考慮されるの
は支持体に対するシグナル発生系の結合、シグナル発生
に対する妨害の欠如、支持体に対するコンジュゲートの
容易性等である。

広範囲の天然および合成の有機または無機ポリマーを、
吸収性をもたらす吸収性支持体、例えば紙の材料として
用いることができる。

支持体の個々のディメンジョンは便宜的な乙のであり、
用いる試料の量、プロトコル、ソゲナル測定法等によっ
て異なる。

ｍｉｐおよび支持体、並びにコンジュゲートされるべき
他の化合物間で共有結合させるために、支持体としては
通常多官能性であるかまたは多官能化できるものを用い
る。支持体上に存在し結合に用いる官能基としては、カ
ルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアノ基、エチレン
性基、ヒドロキシ基、メルカプト基等を含み得る。広範
囲の化合物を種々の支持体」二に連結する方法は周知で
あり、文献に詳述されているっ例えば「イモビライズド
・エンザイムス」（１ｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ　Ｅｎｚｙ
ｍｅｓ”、ンバタイチロウ、ハルステッド・プレス、ニ
コーヨ−り、１９７８年）およびカトレヵザス、ジャー
ナル・オブ・バイオ［１ジカル・ケミストリー（Ｊ。

Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）　２４５巻３０５９頁（１
９７０年）参照。

連結基の長さは、連結する化合物の性質、連結化合物と
支持体間の距離が連結化合物の性質に及ぼす影響、連結
化合物の架橋能力等によって広範に変化する。

連結部は単結合であってもよく、また約１２個以下、通
常約１０個以下の原子を含む鎖であってもよい。連結基
は脂肪族、脂環式、芳香族、複素環式の基またはこれら
の組合わせであり得る。連結基の総原子数は約２０以下
、通常約１６以下（水素を除く）であり、炭素、酸素（
オキシまたはオキソカルボニルもしくは非オキソカルボ
ニルを含むオキソとして）、窒素（アミノまたはアミド
として）および硫黄（ヂオまたはヂオノとして）を含む
ことができる。このような基の例には、メチレンカルボ
ニル、スクシンイミジル、α−ハロアセチル、チオメチ
レン、グリンルもしくはポリグリシル、スクシンジオイ
ル、マレジオイル、ゲルタールジアルキリデン、メチレ
ンフェニルジアゾ、およびウレイドが含まれる。

両装置において、ｍｉｐは一般に共有結合または非共有
結合により支持体に結合される。プロトコルの性質に応
して、結合させるｍｉｐ量を制限しまたはアナライトの
結合部位に基づいて試料中に予期されるアナライトの最
高量より過剰にすることができる。さらに、シグナル発
生系も固体支持体に結合させることができる。しばしば
、コンジュゲートするシグナル発生系の一員の量は速度
制限因子であるので、大過剰が用いられる。

吸収性支持体の準備に際しては、吸収性支持体を反応性
官能基により活性化して支持体にコンジュゲートされる
べき有機材料の共有結合を可能にすることができる。こ
のような材料は、酵素基質以外のものである。種々の技
術を吸収性支持体の活性化に用いることができ、これに
はアンル基による官能化、例えばカルボニルジイミダゾ
ールによるもの、臭化シアンまたはゲルタールアルデヒ
ド、こはく酸等のような２官能性試剤による処理等が含
まれる。広範囲の材料を吸収性表面に結合する方法が、
文献に記載されている。例えば米国特許第４１６８１４
６号参照。

支持体に結合させるｍｉｐの量は、支持体の寸法、およ
びアナライト全部を結合するに要する量、並びに必要な
場合には標識側ｐにより異なる。一般に、ｍｉｐの量は
約１Ｏ−５−Ｉｎ−”モル／ｃｍ２の範囲、通常的１０
−′−Ｉｎ　”モル／ｃｍ２である。単位領域当りのモ
ル数は、アナライトが通過する範囲において関心の対象
である濃度範囲で充分な識別ができるように調節される
。

特異的結合対および酵素は、何れも、適切な場合には共
有結合ではなく吸着ににり種々の支持体に結合すること
ができる。これは、吸収性支持体と特異的結合対および
酵素を含有する溶液とを接触させ、溶液から吸収性支持
体を取出し、吸収性支持体を乾燥する操作が含まれる。

別法として、特異的結合対および酵素を含む溶液を、噴
霧、塗布または他の均一適用が可能な技術により適用し
てもよい。

通常、大形シートを使用し、次いで適当な寸法に切断す
る。

特異的結合対構成員および適切な場合には酵素を結合さ
せる吸収性支持体は、通常泉質を結合させる前に洗浄す
る。基質の結合には、通常吸収性部材を水性媒質中で基
質および他の添加剤と接触させろ操作か含まれる。別法
として、色素の種類によっては、特異的結合対構成員を
吸収性支持体に結合させろ際に、同時に吸収性支持体に
色素を含浸させることができる。また、別法として、酵
素が存在する場合、これを基質と合わせて、予しめ特異
的結合対の構成員を結合させた吸収性支持体に結合させ
るごとができる。このように、１工程または２工程で実
施されるが、通常２工程である。

吸収性支持体に適用される基質含有溶液は、例えば水、
アルカノール、アルカノン等の極性溶液、特にアセトン
のような低分子型の不活性な（炭素原子数１−４の）有
機極性溶媒溶液が好適である。

溶液に含ませ得る他の添加剤と１．では、ポリ（ビニル
アルコール）、ヒドロキシルアミン、緩衝剤、界面活性
剤等が含まれる。ヒドロキシルアミンは一般に約１０−
１００ｍＭの量で、またポリ（ビニルアルコール）は一
般に０．１−１重量％の圭で用いられる。色素の性質に
よって異なるか、媒質中の色素の量は一般に約０　、ｌ
　−２ｍｇ／ｍｆｌ、通常的０　、２−１　ｍｇ／ｍｌ
である。種ケの緩衝剤、例えば燐酸緩衝剤、トリス緩衝
剤、炭酸緩衝剤を用いることができる。Ｉ）Ｉ−１ｔよ
基質の性質によるか、一般に約６−９である。

吸収性素子が基質含有溶液を均一に吸収するに充分な時
間後、吸収性素子を種々の方法で処理する。吸収性素子
の溶液を吸い取り、室温または加−温、一般に約６５℃
以下で乾燥し、冷凍し、および凍結乾燥等を行なう。重
要なことは、何れの処理ら支持体に結合した種々の物質
の活性を妨げず、相対的分布に影響しないことである。

吸収性支持体は、広範囲の材料で被覆して性質を向上さ
Ｕｏろことかできる。被覆には、蛋白質被覆、多糖類被
覆、しょ糖等が用いられ、これらは特に支持体にコンジ
ュゲートした物質の安定性を向上させるために用いるも
のである。さらに、これらの化合物は支持体に結合した
物質の結合を向」二させる場合もある。

次に、２種の装置を用いたアッセイの実施法について述
べる。免疫クロマトグラフは、定常的な固相を提供オろ
吸収性支持体と、移動液相を提供するアッセイ媒質を包
含する。ｍｉｐが均一・かつ非拡散的に吸収性支持体に
結合する領域は、免疫吸収帯と称する。試料中のアナラ
イトは、この帯域をフロントが通過する溶媒に伴なわれ
て帯域を通過する。支持体に結合したｍｔｐの相当性ま
たは逆性ｍｉｐであるアナライトは、ｍｉｐ複合体形成
を介して支持体に結合される。シグナル発生系は、アナ
ライトが結合した免疫吸収帯中の領域とそれが存在しな
い領域を区別できる方法を提供するので、免疫クロマト
グラフ上における予じめ定められた点からの距離が、試
料中のアナライト量の尺度となる。

免疫吸収帯を通る試料の動きの増大は適当な溶媒に試料
を溶かすことによ−てもたらされ、免疫吸収帯を通る溶
液の移送は毛管現象によって起る。

溶媒は、通常水性媒質であり、これは、曲の極性溶媒、
特に炭素原子数１〜６、通常１−４の酸化物溶媒（これ
はアルコール類、エーテル類等を含む）を約４０重量％
以下の量で含むことができる。通常、共溶媒は約２０重
量％以下の量で存在する。

媒質の叶■は、通常４１１、さらに普通には５−ＩＯ１
好ましくは約６．５−９．５である。

ｐｉ（は、ｍｉｐ類の結合親和力をしかるべきレベルに
保つように選ばれる。所望のｌ）Ｈをもたらし、溶離中
そのｐ　Ｉ−１を保つために、種々の緩衝剤が用いられ
る。緩衝剤の例には、はう酸−１燐酸−１炭酸−、トリ
ス−、パルビタールー緩衝剤等が含まれる。この発明で
は、使用する緩衝剤は限定されるものではないが、個々
のアッセイでは、ある緩衝剤が他のものより好ましいこ
とがあり得る。

試料には、約０．０５−０．５重量％の非イオン性界面
活性剤を含ませることが望ましい。約２００−２０００
０ドルトンの種々のポリオキシアルキレン化合物を用い
ることができる。

このアッセイの実施には、通常、緩和な、かつ望ましく
は実質的に一定の温度を用いる。溶離および検出可能な
ノブナルの発生に用いる温度は、一般に約２−５０℃、
通常的１５−５０℃の範囲であり、しばしば室温ずなわ
ら約１５−２５℃である。

アッセイに（＝１されるアナライトの濃度は、一般に約
１０’〜約１０−　”モル、通常的１０−６〜１０”モ
ルである。アッセイを定性的に、平定性的または定量的
の何れにするか、個々の検出法、関心のあるアナライト
の濃度、およびプロトコルによって、通常他の試薬の濃
度が定まる。

アッセイの実施に際しては、プロトコルは通常試料を溶
離溶媒に溶かずことを含む。試料は、例えば血液、血清
、血漿、尿、水晶体液、髄液等の生理学的液体、化学操
作液、飲食品、農薬、汚染物等のような、広範囲の原料
から得られる。

クロマトグラフの一一端を、次に希釈試料含有溶媒に接
触さ且るか、これは通常緩衝水性媒質であり、１種また
はそれ以上のツクナル発生系構成員を含むことができる
。シグナル発生系の構成員を含む場合、少なくとも■構
成員がｍｉｐにコンシフゲートされて制ｐ＝−標識コン
ジュゲ−１・を生成す充分な時間を与えて溶媒フロント
が免疫吸収帯を完全に通過するようにする。この帯域は
、そこに結合したｍｌｐを全部消費することなくアナラ
イト総量が帯域に結合するに充分な量のｍｉｐを含んで
いる。

種々のプロトコルを用い得るが、多くの場合、アッセイ
媒質は、試料、アナライト、および特異的結合対構成員
コンジュゲート、並びに緩衝剤、界面活性剤、他の基質
と酵素等のような他の試薬を含有する。種々の非イオン
性界面活性剤を使用することができ、これらは一般に約
０．０１−５重量％の量でアッセイ媒質中に存在する。

池の基質が存在する場合、それか速度制限因子とならな
いように過剰量を存在させることができる。良好な結果
を得るための濃度は、経験的に定めることができる。

充分な時間を与えて、アッセイ媒質が免疫吸収帯を通過
し、溶媒フ（Ｊントが免疫吸収帯の全部または実質的に
全部を通過するようにする。得られる免疫クロマトグラ
フは充分時間放置して呈色させ、呈色の高さを読み取っ
てアッセイ媒質中のアナライト量の尺度とする。

ディノブスティソク法では、」二記と同様な成分を含有
し、少なくとも酵素コンジュゲートと試料を含むアッセ
イ媒質中に、ディツプスティックを浸漬する。酵素コン
ノコゲ−１・が吸収性素子に結合した逆の結合量と反応
するに充分な時間の経過後素子をアッセイ媒質から取り
出し、直接読み取るか、または観察可能なノブナルを増
強する生産物が生成するに充分な時間を経過さ■る。洗
浄は必要なことも不必要なこともある。

便宜のために、装置にはアッセイに用いる他の試薬を含
ませることができる。他の試薬としては、少なくとも酵
素コンジュゲート、および適当な場合には緩衝剤、他の
基質、安定剤等が含まれ、種々の活性成分の量はアッセ
イの感度が適切なものになるように定められる。

［実施例］ 以下に示す実施例は、この発明を説明するものであって
、これを限定するものではない。

実施例Ｉ Δ１紙の活性化 ワットマン３＋ＥＴ（厚さ０．５３ｍｍ、水におＩＪる
流速２２５ｍｍ／３０分）クロマトグラフィー用紙（２
０”×２０°）のロールをナイロンスクリーン（３５メ
ツシユ）と共にカートリッツに巻き込み、筒状反応器に
挿入した。イースタン遠心ポンプ（３４００ｒｐｍ　、
４　、　５リットル／分）を用いて０２Ｍカルボ＝　Ｊ
ｌ、ジイミダゾール／　ＣＩ−１２Ｃ１，２４５リツト
ルを９０分間反応器に循環させるこ表により紙を活性化
した。次いで紙をＣＨ、Ｃ１１２４５リツトルで洗浄し
、反応器に乾燥窒素ガスを１５０分間導通して紙から溶
媒を除いた。

Ｂ　蛋白質の固定 次のようにして、ワットマン３１ＥＴり〔ｌマドグラフ
ィー用紙に蛋白質を固定した。グルコースオキソダーゼ
・アミン（米国特許第４／１３５５０４号実施例３にし
たがって製造月Ｏμｇ／ｍｌ、テオフィリンに対する抗
体（アンヂテオフィリン）２、Ｏｍｇ／ｍ、Ｍを含む０
．　１Ｍ（＋’ｌ＋−（７，０）燐酸緩衝液７５ｍ！に
活性化した紙（２３０ｍｍｘ１８０ｍｍ）浸漬し、室温
で３．５時間インキコベートした。次いて紙を０．１Ｍ
燐酸緩衝液８リツトルで４５分間洗浄し、蒸留水４リツ
トルで１５分間洗浄した。０　、　５　（ｗ／ｖ）％ポ
リビニルアルコール（２０／３０）および４−クロロナ
フトニール（，１−Ｃ，Ｍ−１−ナフト−ル）４００　
ｔｔｇ／ｍｌを含む溶液に紙を浸漬し、２０分間インキ
コヘートし、吸い取った。紙を６５℃で６．５時間吸引
トンネル中で乾燥した。

Ｃアッセイ用プロトコル 固定化した紙を９０Ｘ６ｍｍのストリップに切断した。

２％テオフィリン溶液（０−４０μｇ／ｍｌ、７５ｎｇ
／ｍｆｌ西洋わさびベルオキシダーゼ（］−１ＲＰ）テ
オフィリン・＝ｌｌジンゲー１−（米国特許第１Ｉ／１
３５５０号実施例２にしたがって製造）、２００１ｔｇ
／ｍｌ　４−ＣＪｌ　−１−ナフトール、５０ｍＭクル
コース、オヨびＩｍｇ／Ｊ　うし血ｌＷｆアルブミン（
ｒ３ＳＡ）を含有する０、Ｉ　Ｍ（ｐｌ！７．０）燐酸
緩衝液からなる吸い」−げ（ｗｉｃｋｉｎｇ）現像液０
．５ｍ、９にストリップを浸漬した。溶液の吸い」−げ
につれて呈色が起った。次いで、アッセイストリップを
取り出し、呈色のフロントを（ストリップの下端から）
測定した。総アッセイ時間は１０−１５分であった。

Ｄ、結果 上記プロトコルにしたがって行なった結果を下表に示す
。

、＊ テオフィリン　ストリップ下端からの ユｇ玉／Ｊ）　、−ｍ−距離（ｍｍ） ０　９．５ ２．５　１３．５ ５．０　１９．３ １０．０　２３．５ ２０．０　２９．５ ４０．０　１１８ ＊２％溶液 実施例２ 次のようにして、西洋わさびペルオキシダーゼとアンピ
ンリンのコンジュゲートを製造した。８゜２４ｍｇ／＋
ｎ４西洋わさびペルオキシダーゼ水溶液２ｍえに、０．
０１２４Ｍ過ｊ；う過酸；トリウム０．５Ｊを加え、混
合物を１時間撹拌した。セファディックス（商標）ＰＤ
−１０のカラムおよび溶離剤として５　ｍＭ酢酸緩衝液
（＋）Ｈ４，５）を用いて混合物をクロマトグラフィー
に付した。蛋白質フラクションを３．５Ｊづつ集めた。

集めた酸化型ＨＲＰフラクションに、アンピシリン３８
゜５ｍｇ含有２Ｍ燐酸緩衝液（ｐｌ−Ｉ７．０）０．　
５　ｍｆｌを加えた。反応物を室温で３０分間撹拌し、
次いてｒ　Ｏｍｇ／ｍｌ水素化シアノはう素ナトリウム
溶液０．６５Ｊを撹拌下に加えた。反応混合物を４℃で
一夜インキコヘートし、０．１Ｍ燐酸塩−０，２Ｍ塩化
ナトリウム（ｐＨ７，０）に対して充分透析しノこ。

ワットマンＩＣ（厚さ０．１６ｍｍ、水の流速１３０ｍ
ｍ／３０分）クロマトグラフィー用紙を、実施例１と同
様にカルボニルノイミダ′へ−ルを用いて活性化した。

Ｉ　ＯＯｔｔ　ｇ／ｍｆｆ１西ａ゛わさびペルオキシダ
ーゼ抗体（ＩｇＧ）、Ｉｍｇ／ｍ！グルコースオギノダ
−ゼ・アミン、Ｏ，１Ｍ燐酸塩、０．２Ｍ　ＮａＣｆｌ
（ｐｌ−１７）の溶液に、活性化した紙を浸漬した。次
いで紙を乾燥し、種々の濃度（１，５，１０および５０
ｍｇ／Ｊ）の４−（４−１−ナフトール含有アセトン溶
液に充分湿潤する時間浸漬することにより含浸させた。

紙から液を吸い取り、風乾した。

上記紙から製造したストリップを、アッセイ溶液［５０
ｍＭグルコース、３００　ｎｇ／ｍＩｌ西洋わさびペル
オキシダーゼ・アンピンリン・コンジュゲート（アンピ
シリンはアッセイで何の役目も果さない）、２ｍｇ／ｍ
ＪｌＢＳΔ、０．１Ｍ燐酸塩、０．２Ｍ　ＮａＣ克（ｐ
Ｈ７）］に１ｏ分浸漬し、４−（４，−１−ナフトール
の酸化で生成するストリップの反射率を測定した。

結果を下表に示す。

４−（４−１す　反射率　対照に対する０（対照）”　
１６．２　− １’　８２　５０ ５　１７．７　１０９ １０　１８．３　１１２ １四−□−，−−−−−−−−−！　６　、３−一−−
１０四−一＊含浸溶液中４−（４−１−ナフトール濃度
＊＊４−（４−１−−ナフトール２００１ｔ　ｇ／ｍｊ
２゜含有 含浸溶液中のナフトール色素濃度５ｍｇ／ｍｊ２．Ｊ２
Ｊ」二では、４−Ｃ，１１−ナフトール含浸ストリップ
による結果は、公知アッセイの現像剤溶液で一般に使用
される濃度の４．−Ｃ，Ｊ−１−ナフト−ルで得られた
結果と同等またはそれ以１−であった。

−に記の結果から、酵素イムノアッセイに用いる吸収性
支持体に酵素糸質を含浸させろとプロ１コルを中線化で
きろことが明らかである。すなわち、吸収性支持体を試
料含ａアッセイ媒質から現像剤溶液へ移さずに直接結果
を得ることかできろ。このシステムは、酵素を１つでは
なく２つ使用する系で特に有利であり、液体媒質を移堂
させる場合にも定常液体媒質の場合にも用いることがで
きる。

以上、実施態様に基づいてこの発明を説明したが、この
発明の範囲内において変更および修正をなし得ることは
いうまでもない。

特許出願人　シンテックス（ニー・ニス・エイ）インコ
ーホレイテッド 代理人　弁理出前　山　葆　はが１名

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）吸収性支持体に結合した特異的結合対の−・員お
   にび酵素と特異的結合対の一員のコンジュゲートを含有
   し、上記酵素の基質が酵素触媒作用を受ｔＪて実質的に
   水不容性の検出可能な生産物を生成する酵素イムノアッ
   セイにおいて、」二記吸収性支持体に、関心の対象であ
   るアナライトの濃度範囲にわたって検出可能なノブナル
   を供給するに充分な量の」二記基質を含浸させることを
   改良点として含む方法。
2. （２）吸収性支持体が長いストリップであり、アッセイ
   媒質が上記ストリップを通過する移動性液相を特徴する
   特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）ストリップに結合した第２酵素を含有し、上記第
   ２酵素とコンジュゲートの酵素か、一方の基質が他方の
   生成物という関係にある、特許請求の範囲第２項記載の
   方法。
4. （４）吸収性支持体がアッセイ媒質中に完全に浸漬しろ
   る小形素子である、特許請求の範囲第１項記載の方法。
5. （５）第２酵素が吸収性支持体に結合し、第２酵素と酵
   素コンジュゲートが、−＝一方の生産物が他方の基質と
   いう関係にある、特許請求の範囲第４項記載の方法。
6. （６）支持体に非拡散結合した特異的結合対の一員、お
   よび酵素基質を有する、特許請求の範囲第１項記載の方
   法に使用する吸収性支持体。
7. （７）支持体が長いストリップである、特許請求の範囲
   第６項記載の吸収性支持体。
8. （８）吸収性支持体がアッセイ媒質中に完全に浸漬しう
   る小形素子である、特許請求の範囲第６項記載の吸収性
   支持体。
9. （９）特許請求の範囲第６項記載の吸収性支持体および
   酵素コンノコゲートをパソケ　ンされた組合わＵとして
   含ろ、」−記酵素＝１ンジ：ｊゲートが基質から着色生
   産物への変換を触媒４゛るらのてある、キット。
10. （１０）酵素コンジュゲートが緩衝剤および少なくとも
    １種の安定剤と組合わされてい′る、特許請求の範囲第
    ９項記載のキット。