CN114252593A - 一种信号放大的酶联免疫检测方法 - Google Patents

一种信号放大的酶联免疫检测方法 Download PDF

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Abstract

本申请涉及试剂盒技术领域，尤其涉及一种信号放大的酶联免疫检测方法，包括以下步骤：得到含捕获抗体的固相载体；将待测样本、FITC‑单克隆抗体记物溶液、生物素‑单克隆抗体标记物溶液与所述固相载体接触并进行第一反应，得到FITC‑生物素‑抗原抗体复合物；得到过氧化物酶溶液，所述过氧化物酶溶液包含亲和素；将所述过氧化物酶溶液与所述FITC‑生物素‑抗原抗体复合物接触并进行第二反应，后加入底物，得到有色产物；将所述有色产物进行含量检测，以实现对所述待测样本的检测。通过FITC‑anti‑FITC处理过的固相载体，使结合位点充分暴露，增加吸附的抗体量，提高包被吸附效率；用长臂活化生物素酯，减少空间位阻，增强反应信号，提高检测的敏感性和精密度。

Description

一种信号放大的酶联免疫检测方法
技术领域
本申请涉及试剂盒技术领域，尤其涉及一种信号放大的酶联免疫检测方法。
背景技术
酶联免疫检测(ELISA)是为一种常用的检测方法，服务于生物工作，广泛应用于生物科学研究的各大细分领域。为了加速检测进度和效率，已搭建了ELISA检测技术平台。基于成熟的抗原-抗体制备平台制备的关键原料，采用竞争法和夹心法两大主流方法学支撑的酶联免疫检测技术，已成功开发出涉及肿瘤、激素、自身免疫、心血管、代谢等十多个领域，人类、小鼠、大鼠、牛等二十多个种属的4000余种ELISA试剂盒。
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。
发明内容
本申请提供了一种信号放大的酶联免疫检测方法，以解决现有酶联免疫检测方法精密度低的技术问题。
第一方面，本申请提供了一种信号放大的酶联免疫检测方法，所述方法包括以下步骤：
得到含捕获抗体的固相载体；
将待测样本、FITC-单克隆抗体记物溶液、生物素-单克隆抗体标记物溶液与所述固相载体接触并进行第一反应，得到FITC-生物素-抗原抗体复合物；
得到过氧化物酶溶液，所述过氧化物酶溶液包含亲和素；
将所述过氧化物酶溶液与所述FITC-生物素-抗原抗体复合物接触并进行第二反应，后加入底物，以使所述第二反应得到的双抗体-抗原复合物被所述底物催化，得到有色产物；
将所述有色产物进行含量检测，以实现对所述待测样本的检测。
可选的，所述FITC-单克隆抗体标记物溶液的制备方法包括：
将第一特定单克隆抗体用缓冲液稀释，以使所述第一特定单克隆抗体稳定，并加入含异硫氰酸荧光素的第一溶液，得到第二溶液；
将第二溶液进行第一搅拌、离心、第一透析和第一纯化，得到FITC-单克隆抗体标记物溶液。
可选的，所述生物素-单克隆抗体标记物溶液的制备方法包括：
得到用抗体保护液保护并活化的第三溶液，其中，所述第三溶液包含所述第二特定单克隆抗体；
将含生物素酰-N-羟基丁二酰亚胺酯的第四溶液与所述第三溶液混合，并进行第二透析和第二纯化，得到生物素-单克隆抗体标记物溶液。
可选的，所述第一特定单克隆抗体和所述第二特定单克隆抗体分别来源于鼠抗人单克隆抗体、兔抗人单克隆抗体和羊多抗人单克隆抗体中任意一种。
可选的，所述第一特定单克隆抗体包括促甲状腺激素单克隆抗体、三碘甲腺原氨酸单克隆抗体和甲状腺素单克隆抗体中任意一种。
可选的，所述过氧化物酶溶液的制备方法包括：将过氧化物酶溶液与氧化剂混合，以使所述过氧化物酶溶液中酶的糖基生成醛基，得到第五溶液；
将所述第五溶液中加入链霉亲和素并反应，得到第六溶液；
将所述第六溶液进行第三透析和第三纯化，得到过氧化物酶溶液。
可选的，所述固相载体的制备方法包括：
将捕获抗体用包被缓冲液稀释至特定浓度，置于第一载体中，得到第二载体；
将所述第二载体中的液体去除，并封闭，得到第三载体；
将所述第三载体中的液体去除，并烘干，得到固相载体。
可选的，所述捕获抗体包括RabbitAnti-FITC多抗或GoatAnti-FITC多抗。
可选的，所述第一反应和所述第二反应的温度分别为30-40℃。
第二方面，本申请提供了使用第一方面所述方法的试剂盒，所述试剂盒包括：FITC-单克隆抗体标记物、生物素-单克隆抗体标记物、过氧化物酶溶液和固相载体。
本申请实施例提供的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：
本申请实施例提供的该方法，采用双信号放大系统技术，间接包被反应体系，在固相上先预包被捕获抗体，添加FITC-单克隆抗体标记物、生物素-单克隆抗体标记物，形成的FITC-抗体复合物，通过FITC-anti-FITC系统处理过的固相载体，使固相载体中单克隆抗体的结合位点充分暴露，增加吸附的抗体量，提高包被吸附效率，从而增强反应信号。另外，采用亲和素-生物素信号放大系统，利用亲和素与生物素之间极强的亲和力，结合也极为稳定，不会在孵育和各种洗涤过程中脱落；同时，利用亲和素与生物素之间多价放大结合特性，每个亲和素分子能结合4个生物素，因此能耦合更多地联结生物素的酶分子，使生物素对抗体的标记率高，可以减少空间位阻，保持了大分子物质的原有生物活性，可以增强终反应信号，从而提高检测的敏感性和精密度。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本申请实施例提供的一种信号放大的酶联免疫检测方法的流程示意图；
图2为本申请实施例提供的用于检测促甲状腺激素(TSH)抗原的ELISA试剂盒和常规ELISA试剂盒OD值与浓度的曲线图；
图3为本申请实施例提供的用于检测促甲状腺激素(TSH)抗原的ELISA试剂盒、常规ELISA试剂盒和第三方检测试剂盒的线性回归分析图；
图4为本申请实施例提供的用于检测三碘甲腺原氨酸(T3)抗原的ELISA试剂盒和常规ELISA试剂盒OD值与浓度的曲线图；
图5为本申请实施例提供的用于检测三碘甲腺原氨酸(T3)抗原的ELISA试剂盒、常规ELISA试剂盒和第三方检测试剂盒的线性回归分析图；
图6为本申请实施例提供的用于检测甲状腺素(T4)抗原的ELISA试剂盒和常规ELISA试剂盒OD值与浓度的曲线图；
图7为本申请实施例提供的用于检测甲状腺素(T4)抗原的ELISA试剂盒、常规ELISA试剂盒和第三方检测试剂盒的线性回归分析图。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
第一方面，本申请提供了一种信号放大的酶联免疫检测方法，如图1所示，所述方法包括以下步骤：
S1.得到含捕获抗体的固相载体；
本申请实施例中，固相载体可以是酶标板，优选的，为氨基化酶标板，经表面改性处理后拥有带正电荷的氨基，其疏水键由杀水键取代。该类酶标板适合作为小分子蛋白的固相载体。使用合适的缓冲液和pH值，其表面可通过离子键与带负电荷的小分子结合。由于其表面的亲水特性和可通过其他交联剂共价结合的能力，可用于固定溶于Triton-100、Tween20等去污剂的蛋白分子。
S2.将待测样本、FITC-单克隆抗体记物溶液、生物素-单克隆抗体标记物溶液与所述固相载体接触并进行第一反应，得到FITC-生物素-抗原抗体复合物；
本申请实施例中，所述FITC-生物素-抗原抗体复合物被固定于所述固相载体；固相载体中的捕获抗体与待测样本中的抗原、FITC-单克隆抗体记物溶液、生物素-单克隆抗体标记物溶液发生第一反应。
S3.得到过氧化物酶溶液，所述过氧化物酶溶液包含亲和素；
本申请实施例中，过氧化物酶溶液可以包含辣根过氧化物酶，辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)，是临床检验试剂中的常用酶，辣根过氧化物酶广泛用于多个生化检测项目，也广泛运用于免疫类(ELISA)试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。
辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。HRP广泛分布于植物界，辣根中含量高，也可以来源于其他植物，它是由无色的酶蛋白和棕色的铁卟啉结合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多个同工酶组成，分子量为40,000，等电点为pH3～9，酶催化的最适pH因供氢体不同而稍有差异，但pH为5左右。
本申请实施例中，S1得到含捕获抗体的固相载体；和，S3得到过氧化物酶溶液，所述过氧化物酶溶液包含亲和素；这两个步骤的顺序不作限定，只需要在使用时，已经制备得到了固相载体和过氧化物酶溶液即可。
S4.将所述过氧化物酶溶液与所述FITC-生物素-抗原抗体复合物接触并进行第二反应，后加入底物，以使所述第二反应得到的双抗体-抗原复合物被所述底物催化，得到有色产物；
本申请实施例中，底物包括但不限于：显色液A(过氧化氢溶液)和显色液B(TMB)，可以达到显色，生产有色产物的效果。
S5.将所述有色产物进行含量检测，以实现对所述待测样本的检测。
本申请实施例中，FITC，一般指异硫氰酸荧光素，可以是异硫氰酸荧光橙红，异硫氰酸荧光黄，异硫氰酸荧光红，异硫氰酸荧光素异构体I，5-异硫氰酸荧光素。
本申请实施例中，将上述FITC-单克隆抗体标记物、生物素-单克隆抗体标记物、亲和素-过氧化物酶配制成工作液进行使用，搭配酶标板使用，大大缩短反应所需的时间，达到快速检测的目的。此外，与常规工艺的酶联试剂盒进行性能比对，可以用于评价试剂的空白限、检出限和精密度，空白限和检出限可以反映出试剂对低浓度样本的检测能力，本申请方法的空白限和检出限越低，说明试剂的检测灵敏度越好；精密度可以反映出试剂对同一样本检测结果的一致性，本申请方法的变异系数CV值低，说明试剂的精密度好。
本申请实施例中，空白限(LOB)，一定概率下，测量空白样本时可能得到的最高测量结果；检出限(LoD)，检测方法可以检测出的最低被测物的浓度，也称检测低限或最小检出浓度。
在一些实施方式中，所述FITC-单克隆抗体标记物溶液的制备方法包括：
将第一特定单克隆抗体用缓冲液稀释，以使所述第一特定单克隆抗体稳定，并加入含异硫氰酸荧光素的第一溶液，得到第二溶液；
将第二溶液进行第一搅拌、离心、第一透析和第一纯化，得到FITC-单克隆抗体标记物溶液。
本申请实施例中，第一透析的目的是去除溶液中未结合的抗体，达到初步纯化的作用；进行第一纯化，纯化作用是通过分子筛纯化柱去除游离异硫氰酸荧光素，防止对检测结果造成干扰。
在一些实施方式中，所述生物素-单克隆抗体标记物溶液的制备方法包括：
得到用抗体保护液保护并活化的第三溶液，其中，所述第三溶液包含所述第二特定单克隆抗体；
将含生物素酰-N-羟基丁二酰亚胺酯的第四溶液与所述第三溶液混合，并进行第二透析和第二纯化，得到生物素-单克隆抗体标记物溶液。
本申请实施例中，采用生物素酰-N-羟基丁二酰亚胺酯，可以减少空间位阻，从而增强终反应信号；第二透析的目的是去除溶液中未结合的抗体，达到初步纯化的作用；第二纯化是通过分子筛纯化柱去除游离生物素，防止对检测结果造成干扰。
在一些实施方式中，所述第一特定单克隆抗体和所述第二特定单克隆抗体分别来源于鼠抗人单克隆抗体、兔抗人单克隆抗体和羊多抗人单克隆抗体中任意一种。
优选的，所述第一特定单克隆抗体和所述第二特定单克隆抗体分别来源于鼠抗人单克隆抗体。
在一些实施方式中，所述第一特定单克隆抗体包括促甲状腺激素单克隆抗体、三碘甲腺原氨酸单克隆抗体和甲状腺素单克隆抗体中任意一种。
本申请实施例中，所述第二特定单克隆抗体与所述第一特定单克隆抗体的种类一致，来源于不同克隆号，具有不同的结合位点，避免形成竞争关系，从而降低试剂盒检测的精度和准确度。
在一些实施方式中，所述过氧化物酶溶液的制备方法包括：将过氧化物酶溶液与氧化剂混合，以使所述过氧化物酶溶液中酶的糖基生成醛基，得到第五溶液；
将所述第五溶液中加入链霉亲和素并反应，得到第六溶液；
将所述第六溶液进行第三透析和第三纯化，得到过氧化物酶溶液。
本申请实施例中，第三透析的目的是去除溶液中未结合的抗体，达到初步纯化的作用；第三纯化是通过分子筛纯化柱去除游离酶，防止对检测结果造成干扰。
在一些实施方式中，所述固相载体的制备方法包括：
将捕获抗体用包被缓冲液稀释至特定浓度，置于第一载体中，得到第二载体；
将所述第二载体中的液体去除，并封闭，得到第三载体；
将所述第三载体中的液体去除，并烘干，得到固相载体。
本申请实施例中，固相载体的制备方法包括配置包被缓冲液，配置封闭液；包被缓冲液的浓度可以为0.05M碳酸盐缓冲液，pH可以为9.6，组分包括NaCO3、NaHCO3和水，具体地，组分可以为NaCO3：0.318g和NaHCO3：0.586g，加超纯水定容至200mL。封闭液的组分包括蔗糖和BSA和水，具体的，组分可以为：蔗糖：10g、BSA：5g，后加超纯水定容至200mL。酶标板制备包括：用包被缓冲液将捕获抗体稀释至100μg/mL，加入酶标板中，每孔200μL，置于2-8℃过夜，甩去酶标板中液体，加入封闭液，每孔200μL，置于37℃封闭2h，甩去酶标板中液体，将酶标板倒扣在吸水纸上吸干多余液体，放入37℃烘箱，烘干2h，装入铝箔袋密封备用。
本年申请实施例中，固相载体表面需有效地封闭，由于亲水和共价的表面特性，使用的封闭液可以与非反应性氨基基团和所选择的交联剂中任何功能基团发生作用，进行烘干使捕获抗体固定于固相载体上，同时不失去活性。
在一些实施方式中，所述捕获抗体包括Rabbit Anti-FITC多抗或Goat Anti-FITC多抗，所述捕获抗体包括但不限于兔来源tAnti-FITC多抗和羊来源Anti-FITC多抗。
本年申请实施例中，Anti-FITC抗体是一类可以特异性结合FITC的多克隆抗体，主要用于检测FITC的Western Blot、IHC-P、IF、ELISA、Co-IP等多种免疫学实验。检测原理：双抗体夹心法测定标本中FITC水平。用纯化的FITC抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入FITC，再与HRP标记的FITC抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物显色。
在一些实施方式中，所述第一反应和所述第二反应的温度分别为30-40℃。
本年申请实施例中，FITC-单克隆抗体标记物、生物素-单克隆抗体标记物、亲和素-过氧化物酶配制成工作液进行使用，与固相载体反应的温度控制为30-40℃的积极效果是促进抗原与抗体、生物素与亲和素间的免疫结合反应，优选的为37℃。
第二方面，本申请提供了使用第一方面所述方法的试剂盒，所述试剂盒包括：FITC-单克隆抗体标记物、生物素-单克隆抗体标记物、过氧化物酶溶液和固相载体。
下面将结合实施例、对比例及实验数据对本发明的方法进行详细说明。
实施例1
本申请提供了一种信号放大的促甲状腺激素(TSH)抗原酶联免疫检测方法，所述方法包括以下步骤：
S1.得到含捕获抗体的固相载体；
S2.将待测样本、FITC-单克隆抗体记物溶液、生物素-单克隆抗体标记物溶液与所述固相载体接触并进行第一反应，得到FITC-生物素-抗原抗体复合物；
S3.得到过氧化物酶溶液，所述过氧化物酶溶液包含亲和素；
S4.将所述过氧化物酶溶液与所述FITC-生物素-抗原抗体复合物接触并进行第二反应，后加入底物，以使所述第二反应得到的双抗体-抗原复合物被所述底物催化，得到有色产物；
S5.将所述有色产物进行含量检测，以实现对所述待测样本的检测。
本申请的检测方法用于检测促甲状腺激素(TSH)抗原，主要实验材料包括：聚苯乙烯酶标板、硫氰酸荧光素(FITC)、Anti-FITC多抗、鼠抗人TSH单克隆抗体-1、鼠抗人TSH单克隆抗体-2、链霉亲和素(SA)、生物素酰-N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、过碘酸钠(NaIO4)、乙二醇、硫酸铵、辣根过氧化物酶(HRP)、NaCO3、NaHCO3、蔗糖、BSA、NaH2PO4·2H2O、NaHPO4·12H2O、NaCl、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸。
1、固相载体为酶标板，其制备方法包括：
(1)溶液配制：
A.包被缓冲液(pH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液)：
NaCO3 0.318g
NaHCO3 0.586g
加超纯水定容至200mL
B.封闭液
蔗糖 10g
BSA 5g
加超纯水定容至200mL
(2)酶标板包被：用包被缓冲液将Anti-FITC多抗稀释至100μg/mL，加入酶标板中，每孔200μL，置于2-8℃过夜，甩去酶标板中液体，加入封闭液，每孔200μL，置于37℃封闭2h，甩去酶标板中液体，将酶标板倒扣在吸水纸上吸干多余液体，放入37℃烘箱，烘干2h，装入铝箔袋密封备用。
2、FITC-鼠抗人单克隆抗体标记物制备方法包括：
(1)标记缓冲液配制：(0.1M pH7.2PBS)
NaH2PO4·2H2O 0.5g
NaHPO4·12H2O 6.46g
NaCl 1.754g
加超纯水定容至200mL
(2)标记：用pH7.2的磷酸盐缓冲液将鼠抗人TSH单克隆抗体-1稀释至20mg/mL，按照每毫克抗体加入0.01mg的FITC计算，称取所需FITC，用3％碳酸钠溶液溶解，将上述抗体溶液与FITC溶液等比例混合，放置2-8℃条件下磁力搅拌器持续搅拌18-24h。将标记的抗体溶液3000r/min离心20min，除去其中少量沉淀物，装入透析袋中，放入装有pH7.2的磷酸盐缓冲液的烧杯中在2-8℃过夜透析，将上述标记物用蛋白纯化仪及分子筛纯化柱，分离游离FITC，收集标记的FITC-鼠抗人TSH单克隆抗体，用标记缓冲液调整浓度至0.5mg/mL，2-8℃密闭保存。
3、生物素-鼠抗人单克隆抗体标记物溶液，及其制备方法包括：
(1)溶液配制：
抗体保护液：
Figure BDA0003451594020000081
Figure BDA0003451594020000091
加超纯水定容至200mL
(2)标记：标记前用截留分子量为50kDa的超滤管对抗体进行纯化处理，以除去抗体中可能含有氨基基团的添加物：向超滤管中加入200μL的抗体保护液和0.5mg鼠抗人单克隆抗体-2，高速冷冻离心机设置4℃，6000rpm离心5分钟，弃废液，再向超滤管中加入100μL的标记反应溶液，高速冷冻离心机设置4℃，12000rpm离心5分钟，重复上述步骤5次，得到纯化抗体溶液，用抗体保护液将抗体浓度调整到2mg/mL。
将已经纯化好的抗TSH单克隆抗体-2用0.1mol/L的碳酸氢钠(NaHCO3)溶液配制成1mg/mL的抗体溶液，将抗体溶液中加入溶于二甲基甲酰胺浓度为20g/L的生物素酰-N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)溶液10μL，匀混，置于室温反应2h，装入透析袋中，放入装有pH7.2的磷酸盐缓冲液的烧杯中在2-8℃过夜透析，将上述标记物用蛋白纯化仪及分子筛纯化柱，分离游离生物素，收集标记的生物素-抗TSH单克隆抗体，用抗体保护液将浓度调整至0.5mg/mL，2-8℃密闭保存。
4、亲和素-辣根过氧化物酶溶液，及其制备方法包括：
(1)溶液配制：
50mMTris-HCl缓冲液(pH7.4)
0.1mol/LTris 50mL
0.1mol/LHCl 42mL
加超纯水定容至100mL
(2)标记：在EP管中加入1mg的辣根过氧化物酶(HRP)和0.1mL60mM的过碘酸钠(NaIO4)，置于2-8℃反应30分钟，加入1mg的链霉亲和素(SA)，加入0.1mL0.16mol/L的乙二醇，置于2-8℃反应18-24h，反应结束后透析过夜，加入等体积的饱和硫酸铵溶液，6000rpm离心5分钟，去除上清，将沉淀物溶解于0.1M pH7.2PBS缓冲液，将上述标记物用蛋白纯化仪及分子筛纯化柱，去除游离酶，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)洗脱，在UV280、流速1mL/min条件下按0.5mL/管收集纯化后的标记物，2-8℃密封保存。
本申请的ELISA试剂盒使用时，将20-50ul待测样本、50ulFITC-鼠抗人单克隆抗体标记物溶液、50ul生物素-鼠抗人单克隆抗体标记物溶液滴加于酶标板，在37度环境中，培养0.5h-1h后；滴加50ul亲和素-辣根过氧化物酶溶液，在37度环境中，培养0.5h-1h；用清洗液进行洗板，添加50ul底物，在，在37度环境中，培养15min，添加终止液终止反应，将有色产物置于酶标仪中进行检测，得到OD值。
实验检测
空白限：用本申请方法得到ELISA试剂盒和常规ELISA试剂盒分别检测：空白样本(5％BSA)，各重复测定20次，得出20次测定结果的OD值，计算20次检测结果的平均值(X)、标准差(SD)，用零浓度校准品(校准品S1)和相邻校准品(校准品S2)之间的浓度-OD值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将(X+2SD)所对应的OD值带入上述回归方程，求出对应的浓度值，即为空白限。常规ELISA试剂盒来源于武汉生之源生物科技股份有限公司研发的促甲状腺激素(TSH)酶联免疫试剂盒，常规ELISA未采用FITC包被体系处理酶标板，未采用亲和素和生物素体系，只采用双抗体抗原反应机制制得，并基于ELISA技术进行检测。得到20次OD值检测结果如表1，两个试剂盒校准品的OD值如表2，两个ELISA试剂盒OD值与浓度的曲线图，如图2。
表1本申请的ELISA试剂盒和常规ELISA试剂盒的检测OD值。
Figure BDA0003451594020000101
表2本申请的ELISA试剂盒和常规ELISA试剂盒校准品的OD值和试剂盒的标准曲线方程。
Figure BDA0003451594020000111
由表1和表2可知，本发明ELISA试剂盒：平均值X＝0.0335，标准差SD＝0.007，X+2SD＝0.048，代入标准曲线方程得到空白限为0.022mIU/L。常规ELISA试剂盒：平均值X＝0.0315，标准差SD＝0.009，X+2SD＝0.0490，代入标准曲线方程得到空白限为0.106mIU/L。本申请的试剂盒的空白限比常规的试剂盒更低，说明了本申请的试剂盒的检测灵敏度更好。
检出限：用本发明ELISA试剂盒检测TSH浓度在0.03mIU/L附近的低浓度样本，重复测定60次，结果如表3；用常规ELISA试剂盒检测TSH浓度在0.12mIU/L附近的低浓度样本，重复测定60次，结果如表4。计算测定结果低于空白限的数量百分比，比较该百分比与发生Ⅱ类错误的概率(通常β＝0.05)，若百分比小于β(即测定结果低于空白限的数量小于5％)，则检出限LoD为该试剂测定结果的中位数；若百分比大于等于β(即测定结果低于空白限的数量大于等于5％)，则用一组更高浓度的低浓度样本重新进行测试，重新进行的测试不需要再重复计算空白限的部分。直到每批试剂测定结果中低于空白限的百分比低于Ⅱ类错误的概率为止。分析物的浓度即为测量程序的检出限。
表3本申请的ELISA试剂盒检测结果。
Figure BDA0003451594020000112
Figure BDA0003451594020000121
表4常规ELISA试剂盒检测结果。
序号 浓度 序号 浓度 序号 浓度 序号 浓度 序号 浓度
1 0.127 13 0.126 25 0.113 37 0.124 49 0.129
2 0.130 14 0.119 26 0.123 38 0.116 50 0.115
3 0.116 15 0.115 27 0.112 39 0.114 51 0.123
4 0.119 16 0.117 28 0.129 40 0.129 52 0.125
5 0.119 17 0.112 29 0.113 41 0.116 53 0.122
6 0.111 18 0.126 30 0.112 42 0.124 54 0.115
7 0.110 19 0.122 31 0.112 43 0.120 55 0.127
8 0.116 20 0.128 32 0.123 44 0.121 56 0.122
9 0.109 21 0.122 33 0.119 45 0.116 57 0.112
10 0.130 22 0.117 34 0.124 46 0.114 58 0.112
11 0.113 23 0.127 35 0.114 47 0.125 59 0.110
12 0.117 24 0.125 36 0.121 48 0.129 60 0.121
表3和表4中，浓度的单位为mIU/L，由表3和表4可知，本申请的试剂盒的测定结果低于空白限的数量为2个，百分比为3.33％，低于Ⅱ类错误的概率(β＝0.05)，则检出限LoD为测定结果的中位数，即本发明ELISA试剂盒的检出限为0.032mIU/L。常规的试剂盒的测定结果低于空白限的数量为1个，百分比为1.67％，低于Ⅱ类错误的概率(β＝0.05)，则检出限LoD为测定结果的中位数，即常规ELISA试剂盒的检出限为0.119mIU/L。本申请的试剂盒的检出限比常规的试剂盒低，说明试剂的检测灵敏度更好。
精密度：用本申请的ELISA试剂盒和常规ELISA试剂盒分别检测浓度为2.0mIU/L和7.5mIU/L的临床样本，各重复测定10次，计算测定结果的平均值(X)、标准差(SD)和变异系数(CV)，得到检测结果如表5。
表5临床样本的检测OD值与检测浓度。
Figure BDA0003451594020000122
Figure BDA0003451594020000131
表5中浓度的单位为mIU/L，由表5可知，本申请的试剂盒的变异系数CV值分别为8.92％和4.97％，常规试剂盒的变异系数CV值分别为9.51％和8.04％，本申请的试剂盒的变异系数低，说明本申请的试剂的精密度更好。X为浓度的平均值，SD为浓度的标准差，变异系数CV的计算方法为：CV＝SD/X*100％
临床比对
用本申请的ELISA试剂盒、常规ELISA试剂盒和第三方ELISA试剂盒分别检测由医院收集的健康体检样本、甲亢样本、甲减样本共20例，对比本申请的试剂盒和常规试剂盒检测结果与第三方试剂盒检测结果的相关性，计算相关系数r，对r系数进行t检验，满足r＞0.975表明试剂检测结果具有显著性正线性相关关系。第三方ELISA试剂盒来源于武汉华美生物工程有限公司的人促甲状腺素(TSH)ELISAKit，货号：CSB-E05114h，规格：96T，基于ELISA原理进行检测。线性回归分析图如图3。
表6试剂盒和常规试剂盒检测结果与第三方试剂盒检测结果。
Figure BDA0003451594020000132
Figure BDA0003451594020000141
由表6可知，ELISA试剂盒与第三方试剂盒检测结果相关系数r＝0.9895，常规ELISA试剂盒与第三方试剂盒检测结果相关系数r＝0.9838，本发明ELISA试剂盒与常规ELISA试剂盒检测结果相关系数r＝0.9952，表明三种ELISA试剂盒的结果均具有显著性正线性相关关系，可满足样本检测需求。
实施例2
本申请提供了一种信号放大的三碘甲腺原氨酸(T3)抗原酶联免疫检测方法，如图1所示，所述方法包括以下步骤：
S1.得到含捕获抗体的固相载体；
S2.将待测样本、FITC-单克隆抗体记物溶液、生物素-单克隆抗体标记物溶液与所述固相载体接触并进行第一反应，得到FITC-生物素-抗原抗体复合物；
S3.得到过氧化物酶溶液，所述过氧化物酶溶液包含亲和素；
S4.将所述过氧化物酶溶液与所述FITC-生物素-抗原抗体复合物接触并进行第二反应，后加入底物，以使所述第二反应得到的双抗体-抗原复合物被所述底物催化，得到有色产物；
S5.将所述有色产物进行含量检测，以实现对所述待测样本的检测。
本申请的检测方法用于检测三碘甲腺原氨酸(T3)抗原，主要实验材料包括：聚苯乙烯酶标板、硫氰酸荧光素(FITC)、Anti-FITC多抗、鼠抗人T3单克隆抗体-1、鼠抗人T3单克隆抗体-2、链霉亲和素(SA)、生物素酰-N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、过碘酸钠(NaIO4)、乙二醇、硫酸铵、辣根过氧化物酶(HRP)、NaCO3、NaHCO3、蔗糖、BSA、NaH2PO4·2H2O、NaHPO4·12H2O、NaCl、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸。
1、固相载体为酶标板，其制备方法包括：
(1)溶液配制：
A.包被缓冲液(pH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液)：
NaCO3 0.318g
NaHCO3 0.586g
加超纯水定容至200mL
B.封闭液
蔗糖 10g
BSA 5g
加超纯水定容至200mL
(2)酶标板包被：用包被缓冲液将Anti-FITC多抗稀释至100μg/mL，加入酶标板中，每孔200μL，置于2-8℃过夜，甩去酶标板中液体，加入封闭液，每孔200μL，置于37℃封闭2h，甩去酶标板中液体，将酶标板倒扣在吸水纸上吸干多余液体，放入37℃烘箱，烘干2h，装入铝箔袋密封备用。
2、FITC-鼠抗人单克隆抗体标记物制备方法包括：
(3)标记缓冲液配制：(0.1M pH7.2PBS)
NaH2PO4·2H2O 0.5g
NaHPO4·12H2O 6.46g
NaCl 1.754g
加超纯水定容至200mL
(4)标记：用pH7.2的磷酸盐缓冲液将鼠抗人T3单克隆抗体-1稀释至20mg/mL，按照每毫克抗体加入0.01mg的FITC计算，称取所需FITC，用3％碳酸钠溶液溶解，将上述抗体溶液与FITC溶液等比例混合，放置2-8℃条件下磁力搅拌器持续搅拌18-24h。将标记的抗体溶液3000r/min离心20min，除去其中少量沉淀物，装入透析袋中，放入装有pH7.2的磷酸盐缓冲液的烧杯中在2-8℃过夜透析，将上述标记物用蛋白纯化仪及分子筛纯化柱，分离游离FITC，收集标记的FITC-鼠抗人T3单克隆抗体，用标记缓冲液调整浓度至0.5mg/mL，2-8℃密闭保存。
3、生物素-鼠抗人单克隆抗体标记物溶液，及其制备方法包括：
(3)溶液配制：
抗体保护液：
Figure BDA0003451594020000161
加超纯水定容至200mL
(4)标记：标记前用截留分子量为50kDa的超滤管对抗体进行纯化处理，以除去抗体中可能含有氨基基团的添加物：向超滤管中加入200μL的抗体保护液和0.5mg鼠抗人单克隆抗体-2，高速冷冻离心机设置4℃，6000rpm离心5分钟，弃废液，再向超滤管中加入100μL的标记反应溶液，高速冷冻离心机设置4℃，12000rpm离心5分钟，重复上述步骤5次，得到纯化抗体溶液，用抗体保护液将抗体浓度调整到2mg/mL。
将已经纯化好的抗T3单克隆抗体-2用0.1mol/L的碳酸氢钠(NaHCO3)溶液配制成1mg/mL的抗体溶液，将抗体溶液中加入溶于二甲基甲酰胺浓度为20g/L的生物素酰-N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)溶液10μL，匀混，置于室温反应2h，装入透析袋中，放入装有pH7.2的磷酸盐缓冲液的烧杯中在2-8℃过夜透析，将上述标记物用蛋白纯化仪及分子筛纯化柱，分离游离生物素，收集标记的生物素-抗T3单克隆抗体，用抗体保护液将浓度调整至0.5mg/mL，2-8℃密闭保存。
4、亲和素-辣根过氧化物酶溶液，及其制备方法包括：
(3)溶液配制：
50mMTris-HCl缓冲液(pH7.4)
0.1mol/LTris 50mL
0.1mol/LHCl 42mL
加超纯水定容至100mL
(4)标记：在EP管中加入1mg的辣根过氧化物酶(HRP)和0.1mL60mM的过碘酸钠(NaIO4)，置于2-8℃反应30分钟，加入1mg的链霉亲和素(SA)，加入0.1mL0.16mol/L的乙二醇，置于2-8℃反应18-24h，反应结束后透析过夜，加入等体积的饱和硫酸铵溶液，6000rpm离心5分钟，去除上清，将沉淀物溶解于0.1M pH7.2PBS缓冲液，将上述标记物用蛋白纯化仪及分子筛纯化柱，去除游离酶，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)洗脱，在UV280、流速1mL/min条件下按0.5mL/管收集纯化后的标记物，2-8℃密封保存。
本申请的ELISA试剂盒使用时，将20-50ul待测样本、50ulFITC-鼠抗人单克隆抗体标记物溶液、50ul生物素-鼠抗人单克隆抗体标记物溶液滴加于酶标板，在37度环境中，培养0.5h-1h后；滴加50ul亲和素-辣根过氧化物酶溶液，在37度环境中，培养0.5h-1h；用清洗液进行洗板，添加50ul底物，在37度环境中，培养15min，添加终止液终止反应，将有色产物置于酶标仪中进行检测，得到OD值。
实验检测
空白限：用本申请方法得到ELISA试剂盒和常规ELISA试剂盒分别检测：空白样本(5％BSA)，各重复测定20次，得出20次测定结果的OD值，计算20次检测结果的平均值(X)、标准差(SD)，用零浓度校准品(校准品S1)和相邻校准品(校准品S2)之间的浓度-OD值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将(X+2SD)所对应的OD值带入上述回归方程，求出对应的浓度值，即为空白限。常规ELISA试剂盒来源于武汉生之源生物科技股份有限公司研发的三碘甲腺原氨酸(T3)酶联免疫试剂盒，常规ELISA未采用FITC包被体系处理酶标板，未采用亲和素和生物素体系，只采用双抗体抗原反应机制制得，基于ELISA技术进行检测。得到20次OD值检测结果如表7，两个试剂盒校准品的OD值如表8，两个ELISA试剂盒OD值与浓度的曲线图，如图4。
表7本申请的ELISA试剂盒和常规ELISA试剂盒的检测OD值。
Figure BDA0003451594020000171
Figure BDA0003451594020000181
表8本申请的ELISA试剂盒和常规ELISA试剂盒校准品的OD值和试剂盒的标准曲线方程。
Figure BDA0003451594020000182
由表7和表8可知，本发明ELISA试剂盒：平均值X＝0.048，标准差SD＝0.0094，X+2SD＝0.0639，代入标准曲线方程得到空白限为0.147ng/mL。常规ELISA试剂盒：平均值X＝0.045，标准差SD＝0.0099，X+2SD＝0.062，代入标准曲线方程得到空白限为0.198ng/mL。本申请的试剂盒的空白限比常规的试剂盒更低，说明了本申请的试剂盒的检测灵敏度更好。
检出限：用本发明ELISA试剂盒检测T3浓度在0.15ng/mL附近的低浓度样本，重复测定60次，结果如表9；用常规ELISA试剂盒检测T3浓度在0.2ng/mL附近的低浓度样本，重复测定60次，结果如表10。计算测定结果低于空白限的数量百分比，比较该百分比与发生Ⅱ类错误的概率(通常β＝0.05)，若百分比小于β(即测定结果低于空白限的数量小于5％)，则检出限LoD为该试剂测定结果的中位数；若百分比大于等于β(即测定结果低于空白限的数量大于等于5％)，则用一组更高浓度的低浓度样本重新进行测试，重新进行的测试不需要再重复计算空白限的部分。直到每批试剂测定结果中低于空白限的百分比低于Ⅱ类错误的概率为止。分析物的浓度即为测量程序的检出限。
表9本申请的ELISA试剂盒检测结果。
序号 浓度 序号 浓度 序号 浓度 序号 浓度 序号 浓度
1 0.245 13 0.223 25 0.184 37 0.218 49 0.280
2 0.239 14 0.256 26 0.220 38 0.211 50 0.262
3 0.293 15 0.145 27 0.299 39 0.199 51 0.275
4 0.164 16 0.272 28 0.274 40 0.237 52 0.244
5 0.242 17 0.263 29 0.261 41 0.216 53 0.269
6 0.247 18 0.174 30 0.286 42 0.255 54 0.269
7 0.289 19 0.243 31 0.176 43 0.163 55 0.164
8 0.160 20 0.191 32 0.236 44 0.291 56 0.289
9 0.289 21 0.203 33 0.244 45 0.266 57 0.227
10 0.278 22 0.159 34 0.166 46 0.276 58 0.148
11 0.171 23 0.250 35 0.172 47 0.238 59 0.243
12 0.251 24 0.262 36 0.149 48 0.227 60 0.215
表10常规ELISA试剂盒检测结果。
序号 浓度 序号 浓度 序号 浓度 序号 浓度 序号 浓度
1 0.479 13 0.409 25 0.485 37 0.264 49 0.281
2 0.303 14 0.344 26 0.244 38 0.326 50 0.269
3 0.297 15 0.390 27 0.481 39 0.430 51 0.379
4 0.260 16 0.497 28 0.294 40 0.233 52 0.362
5 0.331 17 0.383 29 0.245 41 0.313 53 0.427
6 0.305 18 0.231 30 0.294 42 0.452 54 0.277
7 0.286 19 0.291 31 0.330 43 0.266 55 0.469
8 0.360 20 0.246 32 0.372 44 0.310 56 0.428
9 0.353 21 0.300 33 0.207 45 0.209 57 0.407
10 0.259 22 0.284 34 0.486 46 0.205 58 0.499
11 0.327 23 0.462 35 0.396 47 0.416 59 0.447
12 0.494 24 0.289 36 0.206 48 0.416 60 0.413
表9和表10中，浓度的单位为ng/mL，由表9和表10可知，本申请的试剂盒的测定结果低于空白限的数量为1个，百分比为1.67％，低于Ⅱ类错误的概率(β＝0.05)，则检出限LoD为测定结果的中位数，即本发明ELISA试剂盒的检出限为0.243ng/mL。常规的试剂盒的测定结果低于空白限的数量为0个，百分比为0％，低于Ⅱ类错误的概率(β＝0.05)，则检出限LoD为测定结果的中位数，即常规ELISA试剂盒的检出限为0.329ng/mL。本申请的试剂盒的检出限比常规的试剂盒低，说明试剂的检测灵敏度更好。
精密度：用本申请的ELISA试剂盒和常规ELISA试剂盒分别检测浓度为1.8ng/mL和4.1ng/mL的临床样本，各重复测定10次，计算测定结果的平均值(X)、标准差(SD)和变异系数(CV)，得到检测结果如表11。
表11临床样本的检测OD值与检测浓度。
Figure BDA0003451594020000201
表11中浓度的单位为ng/mL，由表11可知，本申请的试剂盒的变异系数CV值分别为6.45％和4.91％，常规试剂盒的变异系数CV值分别为9.24％和7.50％，本申请的试剂盒的变异系数低，说明本申请的试剂的精密度更好。X为浓度的平均值，SD为浓度的标准差，变异系数CV的计算方法为：CV＝SD/X*100％
临床比对
用本申请的ELISA试剂盒、常规ELISA试剂盒和第三方ELISA试剂盒分别检测由医院收集的健康体检样本、甲亢样本、甲减样本共20例，对比本申请的试剂盒和常规试剂盒检测结果与第三方试剂盒检测结果的相关性，计算相关系数r，对r系数进行t检验，满足r＞0.975表明试剂检测结果具有显著性正线性相关关系。第三方ELISA试剂盒来源于武汉华美生物工程有限公司的人三碘甲状腺原氨酸(T3)ELISAKit，货号：CSB-E05084h，规格：96T，基于ELISA原理进行检测。线性回归分析图如图5。
表12试剂盒和常规试剂盒检测结果与第三方试剂盒检测结果。
序号 第三方试剂盒 本申请的试剂盒 常规试剂盒
1 6.743 6.408 6.327
2 2.736 3.223 3.519
3 4.761 5.502 5.462
4 2.693 2.647 2.940
5 2.789 3.013 2.470
6 4.536 5.310 5.980
7 1.950 1.980 1.971
8 1.892 1.980 1.590
9 0.711 0.602 0.500
10 0.718 0.677 0.615
11 2.530 2.731 2.689
12 5.812 5.816 6.134
13 0.942 0.858 0.713
14 0.570 0.582 0.552
15 0.680 0.770 0.876
16 0.629 0.707 0.699
17 1.861 1.669 1.418
18 1.443 1.368 1.164
19 1.199 1.049 0.941
20 7.005 6.894 8.208
由表12可知，ELISA试剂盒与第三方试剂盒检测结果相关系数r＝0.9910，常规ELISA试剂盒与第三方试剂盒检测结果相关系数r＝0.9815，本发明ELISA试剂盒与常规ELISA试剂盒检测结果相关系数r＝0.9906，表明三种ELISA试剂盒的结果均具有显著性正线性相关关系，可满足样本检测需求。
实施例3
本申请提供了一种信号放大的甲状腺素(T4)抗原酶联免疫检测方法，所述方法包括以下步骤：
S1.得到含捕获抗体的固相载体；
S2.将待测样本、FITC-单克隆抗体记物溶液、生物素-单克隆抗体标记物溶液与所述固相载体接触并进行第一反应，得到FITC-生物素-抗原抗体复合物；
S3.得到过氧化物酶溶液，所述过氧化物酶溶液包含亲和素；
S4.将所述过氧化物酶溶液与所述FITC-生物素-抗原抗体复合物接触并进行第二反应，后加入底物，以使所述第二反应得到的双抗体-抗原复合物被所述底物催化，得到有色产物；
S5.将所述有色产物进行含量检测，以实现对所述待测样本的检测。
本申请的检测方法用于检测甲状腺素(T4)抗原，主要实验材料包括：聚苯乙烯酶标板、硫氰酸荧光素(FITC)、Anti-FITC多抗、鼠抗人T4单克隆抗体-1、鼠抗人T4单克隆抗体-2、链霉亲和素(SA)、生物素酰-N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)、二甲基甲酰胺(DMF)、过碘酸钠(NaIO4)、乙二醇、硫酸铵、辣根过氧化物酶(HRP)、NaCO3、NaHCO3、蔗糖、BSA、NaH2PO4·2H2O、NaHPO4·12H2O、NaCl、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、盐酸。
1、固相载体为酶标板，其制备方法包括：
(1)溶液配制：
A.包被缓冲液(pH9.6 0.05M碳酸盐缓冲液)：
NaCO3 0.318g
NaHCO3 0.586g
加超纯水定容至200mL
B.封闭液
蔗糖 10g
BSA 5g
加超纯水定容至200mL
(2)酶标板包被：用包被缓冲液将Anti-FITC多抗稀释至100μg/mL，加入酶标板中，每孔200μL，置于2-8℃过夜，甩去酶标板中液体，加入封闭液，每孔200μL，置于37℃封闭2h，甩去酶标板中液体，将酶标板倒扣在吸水纸上吸干多余液体，放入37℃烘箱，烘干2h，装入铝箔袋密封备用。
2、FITC-鼠抗人单克隆抗体标记物制备方法包括：
(5)标记缓冲液配制：(0.1M pH7.2PBS)
NaH2PO4·2H2O 0.5g
NaHPO4·12H2O 6.46g
NaCl 1.754g
加超纯水定容至200mL
(6)标记：用pH7.2的磷酸盐缓冲液将鼠抗人T4单克隆抗体-1稀释至20mg/mL，按照每毫克抗体加入0.01mg的FITC计算，称取所需FITC，用3％碳酸钠溶液溶解，将上述抗体溶液与FITC溶液等比例混合，放置2-8℃条件下磁力搅拌器持续搅拌18-24h。将标记的抗体溶液3000r/min离心20min，除去其中少量沉淀物，装入透析袋中，放入装有pH7.2的磷酸盐缓冲液的烧杯中在2-8℃过夜透析，将上述标记物用蛋白纯化仪及分子筛纯化柱，分离游离FITC，收集标记的FITC-鼠抗人T4单克隆抗体，用标记缓冲液调整浓度至0.5mg/mL，2-8℃密闭保存。
3、生物素-鼠抗人单克隆抗体标记物溶液，及其制备方法包括：
(5)溶液配制：
抗体保护液：
Figure BDA0003451594020000231
加超纯水定容至200mL
(6)标记：标记前用截留分子量为50kDa的超滤管对抗体进行纯化处理，以除去抗体中可能含有氨基基团的添加物：向超滤管中加入200μL的抗体保护液和0.5mg鼠抗人单克隆抗体-2，高速冷冻离心机设置4℃，6000rpm离心5分钟，弃废液，再向超滤管中加入100μL的标记反应溶液，高速冷冻离心机设置4℃，12000rpm离心5分钟，重复上述步骤5次，得到纯化抗体溶液，用抗体保护液将抗体浓度调整到2mg/mL。
将已经纯化好的抗T4单克隆抗体-2用0.1mol/L的碳酸氢钠(NaHCO3)溶液配制成1mg/mL的抗体溶液，将抗体溶液中加入溶于二甲基甲酰胺浓度为20g/L的生物素酰-N-羟基丁二酰亚胺酯(BNHS)溶液10μL，匀混，置于室温反应2h，装入透析袋中，放入装有pH7.2的磷酸盐缓冲液的烧杯中在2-8℃过夜透析，将上述标记物用蛋白纯化仪及分子筛纯化柱，分离游离生物素，收集标记的生物素-抗T4单克隆抗体，用抗体保护液将浓度调整至0.5mg/mL，2-8℃密闭保存。
4、亲和素-辣根过氧化物酶溶液，及其制备方法包括：
(5)溶液配制：
50mMTris-HCl缓冲液(pH7.4)
0.1mol/LTris 50mL
0.1mol/LHCl 42mL
加超纯水定容至100mL
(6)标记：在EP管中加入1mg的辣根过氧化物酶(HRP)和0.1mL60mM的过碘酸钠(NaIO4)，置于2-8℃反应30分钟，加入1mg的链霉亲和素(SA)，加入0.1mL0.16mol/L的乙二醇，置于2-8℃反应18-24h，反应结束后透析过夜，加入等体积的饱和硫酸铵溶液，6000rpm离心5分钟，去除上清，将沉淀物溶解于0.1M pH7.2PBS缓冲液，将上述标记物用蛋白纯化仪及分子筛纯化柱，去除游离酶，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.4)洗脱，在UV280、流速1mL/min条件下按0.5mL/管收集纯化后的标记物，2-8℃密封保存。
本申请的ELISA试剂盒使用时，将20-50ul待测样本、50ulFITC-鼠抗人单克隆抗体标记物溶液、50ul生物素-鼠抗人单克隆抗体标记物溶液滴加于酶标板，在37度环境中，培养0.5h-1h后；滴加50ul亲和素-辣根过氧化物酶溶液，在37度环境中，培养0.5h-1h；用清洗液进行洗板，添加50ul底物，在37度环境中，培养15min，添加终止液终止反应，将有色产物置于酶标仪中进行检测，得到OD值。
实验检测
空白限：用本申请方法得到ELISA试剂盒和常规ELISA试剂盒分别检测：空白样本(5％BSA)，各重复测定20次，得出20次测定结果的OD值，计算20次检测结果的平均值(X)、标准差(SD)，用零浓度校准品(校准品S1)和相邻校准品(校准品S2)之间的浓度-OD值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将(X+2SD)所对应的OD值带入上述回归方程，求出对应的浓度值，即为空白限。常规ELISA试剂盒来源于武汉生之源生物科技股份有限公司研发的甲状腺素(T4)酶联免疫试剂盒，常规ELISA未采用FITC包被体系处理酶标板，未采用亲和素和生物素体系，只采用双抗体抗原反应机制制得，基于ELISA技术进行检测。得到20次OD值检测结果如表13，两个试剂盒校准品的OD值如表14，两个ELISA试剂盒OD值与浓度的曲线图，如图6。
表13本申请的ELISA试剂盒和常规ELISA试剂盒的检测OD值。
Figure BDA0003451594020000251
表14本申请的ELISA试剂盒和常规ELISA试剂盒校准品的OD值和试剂盒的标准曲线方程。
Figure BDA0003451594020000252
由表13和表14可知，本发明ELISA试剂盒：平均值X＝0.054，标准差SD＝0.010，X+2SD＝0.073，代入标准曲线方程得到空白限为0.926ng/mL。常规ELISA试剂盒：平均值X＝0.051，标准差SD＝0.013，X+2SD＝0.076，代入标准曲线方程得到空白限为2.566ng/mL。本申请的试剂盒的空白限比常规的试剂盒更低，说明了本申请的试剂盒的检测灵敏度更好。
检出限：用本发明ELISA试剂盒检测T4浓度在1.0ng/mL附近的低浓度样本，重复测定60次，结果如表15；用常规ELISA试剂盒检测T4浓度在2.6ng/mL附近的低浓度样本，重复测定60次，结果如表16。计算测定结果低于空白限的数量百分比，比较该百分比与发生Ⅱ类错误的概率(通常β＝0.05)，若百分比小于β(即测定结果低于空白限的数量小于5％)，则检出限LoD为该试剂测定结果的中位数；若百分比大于等于β(即测定结果低于空白限的数量大于等于5％)，则用一组更高浓度的低浓度样本重新进行测试，重新进行的测试不需要再重复计算空白限的部分。直到每批试剂测定结果中低于空白限的百分比低于Ⅱ类错误的概率为止。分析物的浓度即为测量程序的检出限。
表15本申请的ELISA试剂盒检测结果。
序号 浓度 序号 浓度 序号 浓度 序号 浓度 序号 浓度
1 0.963 13 1.018 25 0.969 37 1.176 49 1.137
2 0.943 14 0.945 26 0.940 38 1.069 50 1.121
3 0.964 15 1.184 27 1.025 39 1.174 51 1.053
4 1.188 16 0.965 28 1.029 40 0.925 52 0.945
5 0.970 17 1.030 29 1.176 41 1.163 53 0.991
6 0.930 18 1.095 30 1.072 42 1.143 54 0.973
7 0.986 19 1.097 31 0.942 43 1.070 55 1.098
8 0.977 20 1.154 32 1.014 44 1.158 56 0.975
9 1.029 21 0.998 33 1.132 45 1.188 57 1.064
10 1.061 22 1.044 34 1.074 46 1.068 58 1.096
11 1.154 23 1.035 35 0.948 47 1.063 59 1.000
12 0.976 24 1.105 36 1.134 48 0.951 60 0.930
表16常规ELISA试剂盒检测结果。
Figure BDA0003451594020000261
Figure BDA0003451594020000271
表15和表16中，浓度的单位为ng/mL，由表15和表16可知，本申请的试剂盒的测定结果低于空白限的数量为1个，百分比为1.67％，低于Ⅱ类错误的概率(β＝0.05)，则检出限LoD为测定结果的中位数，即本发明ELISA试剂盒的检出限为1.04ng/mL。常规的试剂盒的测定结果低于空白限的数量为1个，百分比为1.67％，低于Ⅱ类错误的概率(β＝0.05)，则检出限LoD为测定结果的中位数，即常规ELISA试剂盒的检出限为2.796ng/mL。本申请的试剂盒的检出限比常规的试剂盒低，说明试剂的检测灵敏度更好。
精密度：用本申请的ELISA试剂盒和常规ELISA试剂盒分别检测浓度为51.3ng/mL和151.5ng/mL的临床样本，各重复测定10次，计算测定结果的平均值(X)、标准差(SD)和变异系数(CV)，得到检测结果如表17。
表17临床样本的检测OD值与检测浓度。
Figure BDA0003451594020000272
Figure BDA0003451594020000281
表17中浓度的单位为ng/mL，由表17可知，本申请的试剂盒的变异系数CV值分别为5.76％和4.45％，常规试剂盒的变异系数CV值分别为12.5％和8.72％，本申请的试剂盒的变异系数低，说明本申请的试剂的精密度更好。X为浓度的平均值，SD为浓度的标准差，变异系数CV的计算方法为：CV＝SD/X*100％
临床比对
用本申请的ELISA试剂盒、常规ELISA试剂盒和第三方ELISA试剂盒分别检测由医院收集的健康体检样本、甲亢样本、甲减样本共20例，对比本申请的试剂盒和常规试剂盒检测结果与第三方试剂盒检测结果的相关性，计算相关系数r，对r系数进行t检验，满足r＞0.975表明试剂检测结果具有显著性正线性相关关系。第三方ELISA试剂盒来源于武汉华美生物工程有限公司人甲状腺素(T4)ELISAKit，货号：CSB-E05081h，规格：96T基于ELISA原理进行检测。线性回归分析图如图7。
表18试剂盒和常规试剂盒检测结果与第三方试剂盒检测结果。
Figure BDA0003451594020000282
Figure BDA0003451594020000291
由表18可知，ELISA试剂盒与第三方试剂盒检测结果相关系数r＝0.9912，常规ELISA试剂盒与第三方试剂盒检测结果相关系数r＝0.9856，本发明ELISA试剂盒与常规ELISA试剂盒检测结果相关系数r＝0.9808，表明三种ELISA试剂盒的结果均具有显著性正线性相关关系，可满足样本检测需求。
本申请方法制得的试剂盒，能够有效地提高抗原抗体的反应性，空白限、检出限和精密度方面相比常规ELISA试剂盒有较大幅度的提升，并且在临床样本检测结果方面与常规ELISA试剂盒和第三方ELISA试剂盒的结果均具有显著性正线性相关关系，可满足样本检测需求，为提高ELISA试剂盒的灵敏度与精密度提供了一种新方案。
附图2-7的详细说明：
如图2所示，为实施例1的ELISA试剂盒OD值与浓度的曲线图，由图可知；在样本浓度值相同的情况下，本申请的试剂盒检测的OD值高于常规的ELISA试剂盒检测的OD值。
如图3所示，为本申请实施例1提供的ELISA试剂盒、常规ELISA试剂盒和第三方检测试剂盒的线性回归分析图，由图可知；左上图中，回归系数为：1.0327，截距为0.1043，相关稀释r＞0.975，说明本申请实施例ELISA试剂盒与第三方试剂检测结果具有显著性正线性相关关系；右上图中，回归系数为：1.0726，截距为0.1184，相关稀释r＞0.975，说明常规ELISA试剂盒与第三方试剂检测结果具有显著性正线性相关关系；左下图中，回归系数为：1.0397，截距为0.0069，相关稀释r＞0.975，说明本申请实施例ELISA试剂盒与第三方试剂检测结果具有显著性正线性相关关系。
如图4所示，为实施例2的ELISA试剂盒OD值与浓度的曲线图，由图可知；在样本浓度值相同的情况下，本申请的试剂盒检测的OD值高于常规的ELISA试剂盒检测的OD值。
如图5所示，为本申请实施例2提供的ELISA试剂盒、常规ELISA试剂盒和第三方检测试剂盒的线性回归分析图，由图可知；左上图中，回归系数为：1.0213，截距为0.0239，相关稀释r＞0.975，说明本申请实施例ELISA试剂盒与第三方试剂检测结果具有显著性正线性相关关系；右上图中，回归系数为：1.1305，截距为-0.212，相关稀释r＞0.975，说明常规ELISA试剂盒与第三方试剂检测结果具有显著性正线性相关关系；左下图中，回归系数为：1.1071，截距为-0.239，相关稀释r＞0.975，说明本申请实施例ELISA试剂盒与第三方试剂检测结果具有显著性正线性相关关系。
如图6所示，为实施例3中的ELISA试剂盒OD值与浓度的曲线图，由图可知；在样本浓度值相同的情况下，本申请的试剂盒检测的OD值高于常规的ELISA试剂盒检测的OD值。
如图7所示，为本申请实施例3提供的ELISA试剂盒、常规ELISA试剂盒和第三方检测试剂盒的线性回归分析图，由图可知；左上图中，回归系数为：0.9406，截距为4.1687，相关稀释r＞0.975，说明本申请实施例3ELISA试剂盒与第三方试剂检测结果具有显著性正线性相关关系；右上图中，回归系数为：0.925，截距为8.5566，相关稀释r＞0.975，说明常规ELISA试剂盒与第三方试剂检测结果具有显著性正线性相关关系；左下图中，回归系数为：0.9771，截距为5.0772，相关稀释r＞0.975，说明本申请实施例ELISA试剂盒与第三方试剂检测结果具有显著性正线性相关关系。
需要说明的是，在本文中，诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者任何其他变体意在涵盖非排他性地包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其他实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.一种信号放大的酶联免疫检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
得到含捕获抗体的固相载体；
将待测样本、FITC-单克隆抗体记物溶液、生物素-单克隆抗体标记物溶液与所述固相载体接触并进行第一反应，得到FITC-生物素-抗原抗体复合物；
得到过氧化物酶溶液，所述过氧化物酶溶液包含亲和素；
将所述过氧化物酶溶液与所述FITC-生物素-抗原抗体复合物接触并进行第二反应，后加入底物，以使所述第二反应得到的双抗体-抗原复合物被所述底物催化，得到有色产物；
将所述有色产物进行含量检测，以实现对所述待测样本的检测。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述FITC-单克隆抗体标记物溶液的制备方法包括：
将第一特定单克隆抗体用缓冲液稀释，以使所述第一特定单克隆抗体稳定，并加入含异硫氰酸荧光素的第一溶液，得到第二溶液；
将第二溶液进行第一搅拌、离心、第一透析和第一纯化，得到FITC-单克隆抗体标记物溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述生物素-单克隆抗体标记物溶液的制备方法包括：
得到用抗体保护液保护并活化的第三溶液，其中，所述第三溶液包含第二特定单克隆抗体；
将含生物素酰-N-羟基丁二酰亚胺酯的第四溶液与所述第三溶液混合，并进行第二透析和第二纯化，得到生物素-单克隆抗体标记物溶液。
4.根据权利要求3任意一项所述的方法，其特征在于，所述第一特定单克隆抗体和所述第二特定单克隆抗体分别来源于鼠抗人单克隆抗体、兔抗人单克隆抗体和羊多抗人单克隆抗体中任意一种。
5.根据权利要求2-3任意一项所述的方法，其特征在于，所述第一特定单克隆抗体包括促甲状腺激素单克隆抗体、三碘甲腺原氨酸单克隆抗体和甲状腺素单克隆抗体中任意一种。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过氧化物酶溶液的制备方法包括：
将过氧化物酶溶液与氧化剂混合，以使所述过氧化物酶溶液中酶的糖基生成醛基，得到第五溶液；
将所述第五溶液中加入链霉亲和素并反应，得到第六溶液；
将所述第六溶液进行第三透析和第三纯化，得到过氧化物酶溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相载体的制备方法包括：
将捕获抗体用包被缓冲液稀释至特定浓度，置于第一载体中，得到第二载体；
将所述第二载体中的液体去除，并封闭，得到第三载体；
将所述第三载体中的液体去除，并烘干，得到固相载体。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述捕获抗体包括RabbitAnti-FITC多抗或GoatAnti-FITC多抗。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一反应和所述第二反应的温度分别为30-40℃。
10.一种如权利要求1-9任意一项使用所述方法的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：FITC-单克隆抗体标记物、生物素-单克隆抗体标记物、过氧化物酶溶液和固相载体。
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