CN111781353A - 检测SARS-CoV-2抗体的胶体金试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

检测SARS-CoV-2抗体的胶体金试纸条及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及免疫层析检测领域，具体而言，提供了一种检测SARS‑CoV‑2抗体的胶体金试纸条及其制备方法和应用。胶体金试纸条，包括底板和设置其上的样品垫、结合垫、含有检测线和质控线的检测垫、以及吸水垫。该胶体金试纸条将SARS‑CoV‑2抗体的检测时间缩短到5min，同时可以保证检测准确性。

Description

检测SARS-CoV-2抗体的胶体金试纸条及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及免疫层析检测领域，具体而言，涉及一种检测SARS-CoV-2抗体的胶体金试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
新型冠状病毒，即“SARS-CoV-2”，2020年1月12日被世界卫生组织命名，其与2002年的SARS冠状病毒以及2012年的中东呼吸综合症冠状病毒(MERS)同属于冠状病毒科β属。新型冠状病毒呈球形、上有突起、直径75-160nm，病毒基因组为连续线型单链RNA。病毒基因组依次编码棘突蛋白(S蛋白)、包膜蛋白、膜蛋白和核蛋白(NP蛋白)，S蛋白位于病毒表面形成棒状结构，作为病毒的主要抗原蛋白之一，是用于分型的主要基因。NP蛋白包裹病毒基因组，可用作诊断抗原。
现如今，市面上出现的SARS-CoV-2抗体检测试剂盒越来越多，其中，胶体金免疫检测试纸的检测时间大都在10-15min内，其检测时间还有待进一步的缩短。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种检测SARS-CoV-2抗体的胶体金试纸条。
本发明的第二目的在于提供上述胶体金试纸条的制备方法。
本发明的第三目的在于提供上述胶体金试纸条的应用。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种检测SARS-CoV-2抗体的胶体金试纸条，包括底板和设置其上的样品垫、结合垫、检测垫、以及吸水垫；
其中，结合垫上包被有胶体金标记的SARS-CoV-2病毒的抗原，胶体金粒径为80nm-120nm，检测垫采用的是90s层析膜。
进一步地，所述胶体金标记的SARS-CoV-2病毒的抗原是NP抗原和/或S抗原。
进一步地，所述胶体金粒径为100nm-120nm。
进一步地，所述结合垫上还包被有胶体金标记的质控抗体，胶体金的粒径为20nm-120nm。
进一步地，所述检测垫上沿样品流动方向设有检测线T1、检测线T2和质控线C；
所述检测线T1和检测线T2均独立地包被抗人IgM抗体或抗人IgG抗体，所述质控线C线上包被的是能够捕捉结合垫上胶体金标记的质控抗体的抗体。
进一步地，所述检测垫采用的是90s NC膜。
进一步地，胶体金标记的NP蛋白和胶体金标记的S蛋白的浓度均独立地为0.4mg/ml-0.6mg/ml。
上述胶体金试纸条的制备方法，将所述样品垫、结合垫、含有检测线和质控线的检测垫、以及吸水垫组装到底板上，得到所述胶体金试纸条；
所述结合垫上包被有胶体金标记的SARS-CoV-2病毒的抗原。
进一步地，所述胶体金标记的SARS-CoV-2病毒的抗原是NP抗原和/或S抗原；
优选地，胶体金标记的NP蛋白和胶体金标记的S蛋白的浓度均独立地为0.4mg/ml-0.6mg/ml。
上述胶体金试纸条在制备检测或辅助检测SARS-CoV-2产品中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供一种检测SARS-CoV-2抗体的胶体金试纸条，包括底板和设置其上的样品垫、结合垫、检测垫、以及吸水垫，其中，结合垫上包被有胶体金标记的SARS-CoV-2病毒的抗原，胶体金粒径为80nm-120nm，检测垫采用的是90s层析膜。该胶体金试纸条用于检测SARS-CoV-2抗体，为了保证胶体金试纸条的灵敏度和特异性，在本发明中，采用爬速快的90s层析膜可以促进液体的流动性，大大缩短层析时间，实现快速检测的效果，同时为了保证胶体金试纸条的灵敏度和特异性，对胶体金粒径进行了优化，采用80nm-120nm的胶体金有利于灵敏度的提高，确保检出率的要求，满足阳性不漏检和阴性无假阳。该胶体金试纸条将SARS-CoV-2抗体的检测时间缩短到5min，同时可以保证检测准确性。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。
本发明首先提供检测SARS-CoV-2抗体的胶体金试纸条，包括底板和设置其上的样品垫、结合垫、检测垫、以及吸水垫，其中，结合垫上包被有胶体金标记的SARS-CoV-2病毒的抗原，胶体金粒径为80nm-120nm，检测垫采用的是90s层析膜。该胶体金试纸条用于检测SARS-CoV-2抗体，为了保证胶体金试纸条的灵敏度和特异性，在本发明中，采用爬速较快的90s层析膜可以促进液体的流动性，大大缩短层析时间，实现快速检测的效果，同时为了保证胶体金试纸条的灵敏度和特异性，对胶体金粒径进行了优化，采用80nm-120nm的胶体金有利于灵敏度的提高，确保检出率的要求，满足阳性不漏检和阴性无假阳。该胶体金试纸条将SARS-CoV-2抗体的检测时间缩短到5min，同时可以保证检测准确性。
需要说明的是，90s层析膜是指层析速度是90s/4cm的层析膜。在胶体金免疫层析试纸条中，检测垫用作检测线和质控线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。本发明对多种不同种类的检测垫进行了优化考察，结果发现，采用90s层析膜作为检测垫，无背景显色、检测线显色深、无非特异性显色，同时可以促进液体的流动性，大大缩短层析时间，实现快速检测的效果，且爬速适中，可以大大提高检测的灵敏度。优选地，检测垫采用的是90sNC膜。
标记抗原的胶体金粒径可以但不限于为80nm、90nm、100nm、110nm或120nm。为了进一步调整检测时间，优选为100nm-120nm。
在一些实施方式中，胶体金标记的SARS-CoV-2病毒的抗原是NP抗原和/或S抗原。可以理解的是，对于不同的抗原选择，胶体金试纸条可以实现IgM抗体和/或IgG抗体的检测。
在优选地实施方式中，胶体金标记的NP蛋白和胶体金标记的S蛋白的浓度均独立地为0.4mg/ml-0.6mg/ml，质量比优选为1:(0.8-1.2)。NP蛋白和S蛋白的质量比可以但不限于为1:0.8、1:0.9、1:1、1:1.1或1:1.2，NP蛋白和S蛋白浓度均独立地可以为0.4mg/ml、0.45mg/ml、0.5mg/ml、0.55mg/ml或0.6mg/ml。
在一些实施方式中，结合垫上还包被有胶体金标记的质控抗体，胶体金的粒径为20nm-120nm。质控抗体指的是抗体的来源不是人，通常使用的是兔抗体、鼠抗体、羊抗体等。
标记质控抗体的胶体金粒径可以跟标记抗原的胶体金粒径不同，可以但不限于为20nm、30nm、40nm、50nm、60nm、70nm、80nm、90nm、100nm、110nm或120nm。
在一些实施方式中，对于检测垫，沿样品流动方向依次设有检测线T1、检测线T2和质控线C；检测线T1和检测线T2均独立地包被抗人IgM抗体或抗人IgG抗体，且二者并不相同；C线上包被的是能够捕捉结合垫上胶体金标记的质控抗体的抗体。可以理解的是，检测线T1包被抗人IgM抗体时，检测线T2包被抗人IgG抗体；检测线T1包被抗人IgG抗体时，检测线T2包被抗人IgM抗体。
在短时间内完成层析过程的同时，为了进一步满足灵敏度的要求，发明人对检测垫上检测线和质控线的包被条件进行了优化，抗人IgM抗体的包被浓度优选为0.3mg/ml-0.8mg/mL；抗人IgG抗体的包被浓度优选为0.3mg/mL-0.8mg/mL。质控线包被抗兔抗抗体，包被浓度优选为0.2mg/mL-1.0mg/mL。
需要说明的是，抗人IgM抗体和抗人IgG抗体的浓度均独立地可以但不限于为0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL、0.6mg/mL、0.7mg/mL或0.8mg/mL；抗兔抗抗体的浓度可以但不限于为0.2mg/mL、0.4mg/mL、0.6mg/mL、0.8mg/mL或1mg/mL。
在一些实施方式中，对于样品垫，是经过样品垫处理液浸渍处理的玻璃纤维膜或无纺布或滤纸，所述样品垫处理液含有如下组分：Tween 20、Triton x-405、Casein、BSA、PEG-20000和NaCl。
本发明提供的胶体金试纸条检测原理如下：当待测样本中含有SARS-CoV-2抗体时，待测样本加到样本垫后，在侧向毛细管的作用下，经过结合垫，与上面包被的NP蛋白-胶体金和/或S蛋白-胶体金发生特异的免疫结合，形成胶体金-新型冠状病毒抗原-IgM复合物和/或胶体金-新型冠状病毒抗原-IgG复合物；复合物再分别与检测垫上的抗人IgM抗体和抗人IgG抗体特异性结合，从而显色。
本发明同时保护上述胶体金试纸条的制备方法，将样品垫、结合垫、含有检测线和质控线的检测垫、以及吸水垫组装到底板上，得到胶体金试纸条。
在一些实施方式中，将80nm-120nm胶体金溶液和蛋白(NP蛋白、S蛋白和质控抗体)混匀，反应，得到金标蛋白；再将金标蛋白包被到玻璃纤维素膜上，得到包被有金标蛋白的结合垫。
上述胶体金试纸可用于制备检测或辅助检测SARS-CoV-2产品中，亦可用于制备检测或辅助检测待测样本或待测动物或待测人是否感染SARS-CoV-2产品，具体地，产品可以为试剂盒。
下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1胶体金的制备
柠檬酸三钠还原法
(1)取约100ml双蒸水，放入带搅拌棒的洁净锥瓶内，煮沸后弃去(目的为最后一次清洁)。
(2)取247.5ml新鲜制备的双蒸水，加热至沸腾。
(3)加入2.5ml 1％HAuCl4，加速搅拌。
(4)取7.5ml1％柠檬酸三钠，迅速加入沸腾的金溶液中，继续搅拌煮沸，30min即可。
(5)电镜检测金颗粒直径。按此法所制金颗粒直径约15nm，置灭菌容器中4下可贮存半年。
应用柠檬酸三钠还原法的优点是通过改变柠檬酸三钠的加入量，可制备不同直径(15～150nm)的胶体金颗粒。基本规律为：柠檬酸三钠用量越少，胶体金颗粒直径越大。
实施例2胶体金试纸条的制备
胶体金与新冠状病毒NP蛋白连接抗原标记
取胶体金10ml，在200mM NaHCO3 pH8.0的缓冲液中，加100μg新冠状病毒N蛋白连接抗原，混匀，放置20min，加入5％BSA 1ml混匀，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，将沉淀用TBS缓冲液溶解至10ml，4℃、10000r/min离心1h，弃上清，沉淀用TBS缓冲液溶解至1ml，得胶体金标记的新冠状病毒NP蛋白连接抗原。
同样步骤制备胶体金标记兔IgG和胶体金标记的新冠S蛋白。
胶体金试纸条的制备
将样品垫和金标结合垫通过处理液进行水化和封闭处理：样品垫和结合垫经剪裁后通过浸蘸前处理液进行水化和封闭处理，浸泡30min后于温度37℃下烘干2小时，结合垫处理液为：含有终质量浓度为0.3％吐温-20、2％海藻糖、10％蔗糖及pH值为7.2、浓度为0.01mol/L的PBS溶液；将胶体金标记物溶液喷涂在结合垫上：喷涂机将胶体金标记物在结合垫上均匀喷涂，喷样量在30μL/cm2，37℃真空干燥；检测点抗体和控制点二抗的包被：分别将包被抗体均稀释到0.8mg/mL，二抗稀释到0.2mg/mL，点样在NC膜上分别为检测点和质控点，于温度37℃下干燥；试纸条的组装：将2.4cm×0.8cmNC膜、1.8cm×0.8cm吸水纸、0.6cm×0.8cm胶体金结合垫、1.5cm×0.8cm样品垫依次粘贴在PVC胶板上，即成胶体金试纸条大板。
实施例3
参照实施例2的制备方法，分别采用粒径为50nm、80nm、100nm和120nm的胶体金溶液制备试纸条，分别检测新型冠状病毒的阳性样本和阴性样本。结果如下表1所示(通过与胶体金标准色板对比，B表示不显色，为阴性结果；C1-C9为阳性结果，编号越大表示活性越低)：
表1
Figure BDA0002642285800000081
从上述检测结果可以看出，80nm～120nm粒径的胶体金溶液可以显著提高检测的灵敏度，无假阳检出，从而满足检出率的要求。
实施例4
参照实施例2的制备方法，分别采用90s NC膜、140s NC膜，分别检测新型冠状病毒的阳性样本和阴性样本。结果如下表2所示：
表2
Figure BDA0002642285800000091
从上述试验及其结果可知：90s NC膜在层析5min后背景白，140s NC膜在层析5min后背景红，需8-10min背景才合格；同时，90s NC膜5min灵敏度合格，无假阳，虽然140s NC膜8min灵敏度略高点，但也有假阳反应性。
实施例5
参照实施例2的制备方法，分别采用混合比例为0.35mg/ml～1.0mg/ml的NP蛋白和S蛋白制备试纸条，分别检测新型冠状病毒的阳性样本和阴性样本。结果如下表3所示：
表3
Figure BDA0002642285800000092
Figure BDA0002642285800000101
从上述结果可以看出：NP蛋白和S蛋白的胶体金标记浓度在0.4mg/ml-0.6mg/ml时，效果最优，5分钟快速检测结果灵敏度最好，无假阳反应性和漏检。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种检测SARS-CoV-2抗体的胶体金试纸条，其特征在于，包括底板和设置其上的样品垫、结合垫、检测垫、以及吸水垫；
其中，结合垫上包被有胶体金标记的SARS-CoV-2病毒的抗原，胶体金粒径为80nm-120nm，检测垫采用的是90s层析膜。
2.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金标记的SARS-CoV-2病毒的抗原是NP抗原和/或S抗原。
3.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述胶体金粒径为100nm-120nm。
4.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述结合垫上还包被有胶体金标记的质控抗体，胶体金的粒径为20nm-120nm。
5.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测垫上沿样品流动方向设有检测线T1、检测线T2和质控线C；
所述检测线T1和检测线T2均独立地包被抗人IgM抗体或抗人IgG抗体，所述质控线C线上包被的是能够捕捉结合垫上胶体金标记的质控抗体的抗体。
6.根据权利要求1所述的胶体金试纸条，其特征在于，所述检测垫采用的是90s NC膜。
7.根据权利要求2所述的胶体金试纸条，其特征在于，胶体金标记的NP蛋白和胶体金标记的S蛋白的浓度均独立地为0.4mg/ml-0.6mg/ml。
8.权利要求1-7任一项所述的胶体金试纸条的制备方法，其特征在于，将所述样品垫、结合垫、含有检测线和质控线的检测垫、以及吸水垫组装到底板上，得到所述胶体金试纸条；
所述结合垫上包被有胶体金标记的SARS-CoV-2病毒的抗原。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述胶体金标记的SARS-CoV-2病毒的抗原是NP抗原和/或S抗原；
优选地，胶体金标记的NP蛋白和胶体金标记的S蛋白的浓度均独立地为0.4mg/ml-0.6mg/ml。
10.权利要求1-7任一项所述的胶体金试纸条在制备检测或辅助检测SARS-CoV-2产品中的应用。
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