CN219574123U - 一种甲乙流病毒抗原检测试纸条 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及一种甲乙流病毒抗原检测试纸条，具体地，包括：底板、检测膜、样品垫、结合垫及吸水垫，其中，所述检测膜上设有相互平行的检测线和质控线；其中，所述检测线的数量至少为2，并且所述检测线与结合垫固定有联合检测甲乙流病毒抗原的蛋白，其中，所述蛋白由纳米酶标记。本实用新型的抗原检测试纸条直观的显示了人体样本中是否含有甲乙流病毒抗原以及含有的抗原种类，可方便分析不同的甲乙流病毒感染情况。

Description

一种甲乙流病毒抗原检测试纸条

技术领域

本实用新型涉及一种甲乙流病毒的抗原检测试纸条，更具体地，涉及一种甲乙流病毒的纳米酶抗原检测试纸条，属于甲乙流病毒检测技术领域。

背景技术

流感病毒是一种能够引起急性呼吸道感染的病毒，具有高度的传染性和感染性。病毒属正粘病毒科，可分为甲型、乙型和丙型，其中，甲型病毒经常发生抗原变异，传染性大，至今仍是大型性流感爆发的主要病原；乙型病毒一般不引起世界范围内的大流行，但是它能够引起地区性、季节性的流行。

目前，检测流感病毒感染的方法主要有病毒培养法、RT-PCR法和免疫层析法。病毒培养是病毒检测的金标准，但该方法操作复杂、耗时、灵敏度不高；RT-PCR是一种依赖于对特定核酸片段的扩增放大技术，从而实现核酸检测的方法，该方法灵敏度高且特异性强，但需要特定的场地、专业的检测人员，并不适用于机场、车站等人流量大的地方的即时检测。免疫层析法具有方便快捷、特异敏感、稳定性强、不需要特殊设备、结果判断直观等优点,特别适合于广大基层检验人员以及大批量检测和大面积普查等,具有广阔的应用前景。传统的免疫层析试纸条主要是利用金纳米颗粒颜色性质来实现对分析物的定性或半定量检测，然而金纳米颗粒在检测过程中容易受到环境影响，如在强酸、强碱和高浓度盐的环境中容易聚集死金，影响检测结果。

本领域需求一种免疫层析试纸，其解决现有检测技术中存在的流感病毒检测昂贵、检测耗时、纳米金标记灵敏度低等缺陷。

实用新型内容

本实用新型提供了一种甲乙流病毒抗原检测试纸条，包括：底板、检测膜、样品垫、结合垫及吸水垫，其中，所述检测膜上设有相互平行的检测线和质控线；其中，所述检测线的数量至少为2条，并且所述检测线与所述结合垫固定有联合检测甲乙流病毒抗原的蛋白，其中，所述蛋白由纳米酶标记。

纳米酶是一类具有类似天然酶催化活性的纳米材料，由于其原料资源丰富、催化活性高、对极端环境的耐受力强，而且纳米酶具有类过氧化物酶、类漆酶等类酶活性，可催化相应底物氧化并产生颜色，为疾病诊断提供了新的方向。纳米酶种类繁多，其中单金属、双金属纳米酶不仅具有类酶活性，同时具有自身的颜色特性，可代替胶体金应用到免疫层析检测中。

在一个具体的实施方案中，所述纳米酶是单金属纳米酶或双金属纳米酶。

在一个具体的实施方案中，所述纳米酶是双金属纳米酶。

在一个具体的实施方案中，所述双金属纳米酶是金和其余金属的纳米酶。

在一个具体的实施方案中，所述双金属纳米酶是金和铂的纳米酶。

在一个具体的实施方案中，所述底板为聚氯乙烯(PVC)板。

在一个具体的实施方案中，所述检测膜为硝酸纤维素膜、或羧化纤维素膜、或聚偏二氟乙烯纤维素膜。

在一个具体的实施方案中，检测线分别为检测甲型流感病毒抗原和乙型流感病毒抗原。

进一步地，甲乙流病毒的抗体包括：针对甲乙流病毒的NP蛋白产生的抗体。

进一步地，所述检测线固定有蛋白，所述蛋白为甲乙流病毒的抗体。在一些具体的实施方案中，所述抗体可以为靶标NP蛋白的抗体。

进一步地，结合垫上具有纳米酶标记的蛋白，所述蛋白为甲乙流病毒的抗体或者抗人抗体的二抗。在一些具体的实施方案中，所述抗体可以为靶标不同NP蛋白表位的抗体。

本实用新型中任意所述蛋白可以是该蛋白天然或重组的蛋白片段，可以是天然或重组的全长蛋白，可以是天然或重组的蛋白片段与全长蛋白的组合。

在一些具体的实施方案中，所述检测线的数量为2条、3条、4条、5条，或者大于5条。每条检测线固定有不同甲乙流病毒抗体。固定不同甲乙流病毒抗体的检测线的顺序可以任意进行排列。

在一具体的实施方案中，所述检测线的数量为2条，其中一条检测线固定有甲流病毒抗体，另一条检测线固定有乙流病毒抗体。

在一些具体的实施方案中，质控线固定有针对二抗的抗体或者包括人源或非人源的其他确定免疫反应组合。

在一个具体的实施方案中，质控线固定有羊抗鸡多克隆抗体。

在一个具体的实施方案中，本实用新型所述检测试纸条的作用原理为：样本中的甲乙流病毒抗原加入到样品垫后，由于毛细作用进入到结合垫，不同的抗原会与结合垫上纳米酶标记的对应抗体或二抗反应结合，同时由于毛细作用继续进入NC膜(硝酸纤维素膜)，在NC膜上开始层析。当结合后的复合分子经过对应的检测线时，会与该检测线上的抗体发生免疫反应实现捕获，而非对应的抗体则不会发生免疫反应，复合分子则继续在NC膜上层析。当检测线上捕获的对应复合分子数量累积到一定数量时，则会显示纳米酶颜色。试纸条上的C线，则通过捕获未反应的纳米酶颗粒，或者捕获其专门标记的纳米酶颗粒显色。

本实用新型所述检测试纸条针对不同抗原的检测线，直观的显示了人体样本中是否含有甲乙流病毒抗原以及含有的抗原种类，可方便分析不同的甲乙流病毒感染情况。一体化的试纸条结构，使得检测所需组分简单、便捷。一次性的免疫层析反应，降低了非特异性反应的风险，显色更稳定。成熟的侧向层析技术，需要的检测时间更短。同时，纳米酶成本更低，且不易受环境影响，可提高灵敏度；双金属纳米酶更易修饰，比表面积更大，具有一定的抗体富集作用，进而提高标记效率，提高灵敏度；利用纳米酶本身的颜色特性，简化工艺。

附图说明

图1为本实用新型的甲乙流病毒抗原检测试纸条的一个实施方案的结构。

具体实施方式

实施例1：制备Au@Pt纳米酶溶液

1.1取250μL的H₂PtCl₆·6H₂O乙醇溶液(1％,w/v)和250μL的HAuCl₄·4H₂O乙醇溶液(1％,w/v)，混匀超声1h。

1.2加入1mLNaBH₄乙醇溶液(1.2mM)，冰浴超声1h。

1.3超声完成后，将获得的产物8000rpm下离心15min，除去多余的上清液，并加入去离子水进行反复洗涤，洗涤4次，最后加入双蒸水并超声分散，获得Au@Pt纳米酶溶液。

实施例2：抗原检测试条的制备

2.1.制备Au@Pt标记单克隆抗体(Au@Pt-mAb)

1)取三个离心管，分别加入1mL步骤1.3中制备的Au@Pt纳米酶溶液，分别取10ug甲型、10ug乙型流感病毒抗体以及10ug鸡IgY抗体和纳米酶溶液混合，混匀仪混匀30min，使抗体标记在纳米酶上。

2)然后向离心管中各加入100μL 10％牛血清白蛋白溶液(0.01mol/L Tris缓冲液，pH 9.0)，封闭30min；在4℃下以8000r/min离心30min后，去除上清液。

3)将沉淀液重溶于600μL Tris缓冲液(50mmol/L，含3％蔗糖、3％牛血清白蛋白和0.05％磺胺嘧啶作为稳定剂)中，4℃下保存；分别得到稳定的Au@Pt标记的甲型流感病毒抗体(Au@Pt-Flu A-mAb)、乙型流感病毒抗体(Au@Pt-Flu B-mAb)和鸡IgY抗体(Au@Pt-IgY-mAb)。

2.2纳米酶标记单克隆抗体溶液喷涂：

1)设定喷涂量为3μL/mm，移动速度为60mm/s，将纳米酶-甲/乙型流感病毒抗体以及纳米酶标记鸡IgY抗体溶液喷涂到结合垫上，喷涂一条7mm*300mm的结合垫，Au@Pt纳米酶-甲型流感病毒抗体复合物的用量为62.5μL，Au@Pt纳米酶-乙型流感病毒抗体复合物的用量为75μL，Au@Pt纳米酶-鸡IgY抗体复合物的用量为30μL；

2)喷涂完成后，将结合垫转移到37℃恒温箱烘干过夜；

3)将干燥好的结合垫收集到干燥箱中保存备用。

2.3喷膜液配制：

1)配制0.01M的PBS，备用。

2)使用0.1M的PBS，将甲型流感病毒抗体配制成0.50mg/mL、0.75mg/mL、1.00mg/mL、1.25mg/mL、1.50mg/mL、2.00mg/mL浓度，PBS终浓度为0.01M。

3)使用0.1M的PBS，将乙型流感病毒抗体配制成0.50mg/mL、0.75mg/mL、1.00mg/mL、1.25mg/mL、1.50mg/mL、2.00mg/mL浓度，PBS终浓度为0.01M。

2.4.抗体包被液喷膜浓度测试：

设定喷膜量为0.1μL/mm，移动速度为60mm/s，开始喷膜，每个浓度分别制备一种试条以供优化实验。

1)各浓度测试：

包被甲型流感病毒抗体和乙型流感病毒试剂条测试使用志愿者提供的甲型流感病毒阳性样本、乙型流感病毒样本以及健康志愿者阴性样本各3例。观察反应条带的显色程度，显色深度以“+”表示；“1+”代表有显色但显色较弱，“2+”代表显色明显但显色不深，“3+”代表有显色很深，“-”表示无显色。测试结果如下：

甲型流感病毒抗体包被浓度优化结果如下：

表1.甲型流感病毒抗体包被浓度优化测试结果

乙型流感病毒抗体包被浓度优化结果如下：

表2.乙型流感病毒抗体包被浓度优化测试结果

2)、结果分析：

根据测试结果，包被甲型流感病毒抗体的最优浓度应为

1.00mg/mL-1.25mg/mL，包被乙型流感病毒抗体的最优浓度应为1.00mg/mL-1.50mg/mL。

2.5喷膜：

1)配制喷膜液：配制0.1M的PBS。使用0.1M的PBS配制T1线，将甲型流感病毒抗体配制成1.00mg/mL浓度，PBS终浓度为0.01M；使用0.1M的PBS配制T2线，将乙型流感病毒抗体配制成1.25mg/mL浓度，PBS终浓度为0.01M；使用0.1M的PBS配制C线，C线系统采用羊抗鸡IgY抗体包被，将羊抗鸡IgY配制成1.50mg/mL浓度，PBS终浓度为0.01M。

2)喷涂：设定喷膜量为0.1μL/mm，移动速度为60mm/s，进行喷膜。

3)将喷涂完成的NC膜大板转移到37℃恒温箱烘干过夜，完成后收集到干燥箱中保存备用。

2.6样品垫处理：

配制0.01M的PBST溶液，将样品垫浸入溶液中，浸透之后将样品垫放入纱网架，置于37℃烘箱烘干过夜，完成后收集到干燥箱中保存备用。

2.7大板的组装：

将喷涂好NC膜的大板、样品垫、结合垫、吸水垫按照图1的顺序依次粘贴好。

2.8切条

使用切条机将大板切成宽度为2.9mm宽的试条。

2种抗检测试纸条的结构如图1所示，试纸条包括：样品垫10、结合垫20、检测膜50、吸水垫60和底板70。样品垫10、结合垫20、检测膜50和吸水垫60均放置在底板70的上方。其中，沿检测膜50的延伸方向，结合垫20和吸水垫60设置于检测膜50的两侧，且结合垫20的一部分和吸水垫60的一部分分别搭接于检测膜50的端部。样品垫10的一部分搭接在结合垫20的端部。

检测膜50设置有检测线30和质控线40，沿检测膜50的延伸方向，检测线30和质控线40间隔设置。其中，检测线30包括：第一检测子线31和第二检测子线32，沿检测膜50的延伸方向，第一检测子线31和第二检测子线32间隔设置。

实施例3：不同种类甲型乙型流感病毒重组蛋白以及其他呼吸道病毒重组蛋白的测试

3.1、测试对象：甲流病毒、乙流病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎支原体病毒和肺炎衣原体病毒等的重组蛋白，每种病毒重组蛋白测试平行测试3支试条。

3.2、测试步骤：

1)测试样本处理，使用pH7.4 0.01M PBS将各待测病毒稀释到0.1mg/mL(或等同于0.1mg/mL)浓度。

2)吸样，吸取各样本各80μL，将由实施例2制备的各试条平放，分别加入检测试条的样品垫区。

3)反应读数，反应10分钟后，肉眼读取试条上的显色结果。

3.3、结果判读规则：

观察反应条带的显色程度，显色深度以“+”表示；“1+”代表有显色但显色较弱，“2+”代表显色明显但显色不深，“3+”代表有显色很深，“-”表示无显色。3支平行试条，甲流病毒、乙流病毒以每条检测线中最弱的结果作为判定结果，呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎衣原体以每条检测线中最强的结果作为判定结果。

1)、各种病毒测试结果：

表3.病毒测试结果

2)、结果分析:

从测试结果来看，试条对甲型流感病毒、乙型流感病毒响应良好，而对其他种类的病毒并无交叉反应。

实施例4：样本测试

4.1、测试方法：

分别使用本实用新型所述试条、某品牌甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂(胶体金法)、圣湘六项呼吸道病原体核酸检测试剂盒进行检测。

4.2、测试样本：

分别使用10例甲型流感病毒阳性志愿者咽拭子样本，10例乙型流感病毒阳性志愿者咽拭子样本，以及10例健康志愿者咽拭子样本进行测试。

4.3、试条测试步骤：

本实用新型所述试条、某品牌甲型/乙型流感病毒抗原检测试剂(胶体金法)均使用如下步骤测试。

1)吸样，吸取各样本各80μL，将各试条平放，分别加入检测试条的样品垫区。

2)反应读数，反应10分钟后，肉眼读取试条上的显色结果。

圣湘六项呼吸道病原体核酸检测试剂盒说明书对样本进行检测。

3)、结果判读规则：

观察反应条带的显色程度，显色深度以“+”表示；“1+”代表有显色但显色较弱，“2+”代表显色明显但显色不深，“3+”代表有显色很深，“-”表示无显色。

4)、样本测试结果：

表4.甲型流感病毒阳性志愿者咽拭子样本测试结果

表5.乙型流感病毒阳性志愿者咽拭子样本测试结果

表6.健康志愿者测试结果

5)、结果分析:

从测试结果来看，试条对不同的病毒感染人群的区分度较好，且与核酸试剂盒结果对比，阳性检出率较好。

Claims (9)

1.一种甲乙流病毒抗原检测试纸条，其特征在于，包括：底板、检测膜、样品垫、结合垫及吸水垫，其中，所述检测膜上设有相互平行的检测线和质控线；其中，所述检测线的数量至少为2条，并且所述检测线与所述结合垫固定有联合检测甲乙流病毒抗原的蛋白，其中，所述蛋白由纳米酶标记。

2.根据权利要求1所述的甲乙流病毒抗原检测试纸条，其特征在于，所述纳米酶是双金属纳米酶。

3.根据权利要求1所述的甲乙流病毒抗原检测试纸条，其特征在于，所述底板为聚氯乙烯板。

4.根据权利要求1所述的甲乙流病毒抗原检测试纸条，其特征在于，所述检测膜为硝酸纤维素膜、或羧化纤维素膜，或聚偏二氟乙烯纤维素膜。

5.根据权利要求1所述的甲乙流病毒抗原检测试纸条，其特征在于，所述蛋白为抗NP的抗体。

6.根据权利要求5所述的甲乙流病毒抗原检测试纸条，其特征在于，所述蛋白为抗NP不同表位的抗体。

7.根据权利要求1所述的甲乙流病毒抗原检测试纸条，其特征在于，所述检测线的数量为2条，其中一条检测线固定有甲流病毒抗体，另一条检测线固定有乙流病毒抗体。

8.根据权利要求1所述的甲乙流病毒抗原检测试纸条，其特征在于，所述质控线固定人源或非人源的确定免疫反应组合。

9.根据权利要求8所述的甲乙流病毒抗原检测试纸条，其特征在于，所述质控线固定有羊抗鸡多克隆抗体。