ES2558309T3

ES2558309T3 - Dispositivo de inmunocromatografía para el diagnóstico de enfermedades en una muestra

Info

Publication number: ES2558309T3
Application number: ES07804639.8T
Authority: ES
Inventors: Cécile BESSON DUVANEL; Thierry Duvanel
Original assignee: Augurix S A; AUGURIX SA
Current assignee: Augurix S A; AUGURIX SA
Priority date: 2006-07-25
Filing date: 2007-07-25
Publication date: 2016-02-03
Anticipated expiration: 2027-07-25
Also published as: US20090305303A1; EP2049903B1; EP2463656A1; EP2049903A2; WO2008012650A2; WO2008012650A3

Abstract

Dispositivo de inmunocromatografía para determinar la presencia de un analito de unión en una muestra biológica de un sujeto para detectar simultáneamente la presencia de IgA total y anticuerpos contra TGasa2 en poblaciones con enfermedad celíaca en riesgo entre las que se encuentran las que tienen deficiencia de IgA, siendo dicho analito de unión una inmunoglobulina seleccionada del grupo que comprende una IgA, una sIgA e IgG, o una combinación de las mismas, que comprende un sitio de aplicación de muestra para recibir dicha muestra biológica, lechos de conjugado que permiten que dicho analito de unión presente en dicha muestra biológica se una a un agente marcado, y lechos de prueba que comprenden zonas de ensayo, en el que iii) se impregna un primer lecho de conjugado con un anticuerpo anti-IgA humana marcado y está en comunicación con un primer lecho de prueba, estando recubierto dicho primer lecho de prueba, en la zona de ensayo, con transglutaminasa tisular 2 (TGasa2) o una parte antigénica de la misma y con anticuerpo anti-IgA humana o una parte de unión del mismo, y iv) se impregna un segundo lecho de conjugado con un anticuerpo anti-IgG humana marcado y está en comunicación con un segundo lecho de prueba, estando recubierto dicho segundo lecho de prueba, en la zona de ensayo, con transglutaminasa tisular 2 (TGasa2) o una parte antigénica de la misma y con anticuerpo anti-IgG humana, una proteína ubicua o partes de unión de los mismos, y en el que el sitio de aplicación de muestra está adaptado para dirigir al menos parte de dicha muestra biológica de un sujeto a través de dichos lechos de conjugado a al menos tres zonas de ensayo de dichos lechos de prueba y al menos uno de dichos lechos de prueba comprende dos zonas de ensayo.

Description

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humana o bien anti-IgG humana de modo que se forman complejos con dicho anticuerpo anti-IgA humana o anti-IgG humana y en el que dichos complejos entran en contacto además con transglutaminasa tisular 2 (TGasa2) o una parte antigénica de la misma,

f) permitir el desarrollo de una respuesta y detectar la presencia del marcador presente sobre los complejos,

g) interpretar la respuesta para indicar la presencia de dicho analito de unión en dicha muestra biológica.

No hay ninguna limitación particular sobre los métodos para recoger una muestra biológica de un sujeto. Por ejemplo, se recoge una gota de sangre completa de la punta de un dedo usando un dispositivo de lanceta y se diluye en el tampón de pretratamiento descrito más adelante para una aplicación de prueba directa, o se almacena en tubos capilares recubiertos con heparina antes de las pruebas. Específicamente, se recoge saliva usando dispositivos de lecho de algodón tales como Omni SAL® (Saliva Diagnostic Systems Inc., Brooklyn, Nueva York, EE.UU.) [patente estadounidense n.º 5.260.031], dispositivo de muestra de líquidos orales para VIH-1 OraSure® y UpLink® (OraSure Technologies Inc., Betlehem, EE.UU.), Salivette® (Sarstedt, Newton, N.C., EE.UU.), mechas TRANSORB® (Filtrona Richmond Inc., Colonial Heights, Vancouver, EE.UU.). El lecho se coloca entonces en el tampón de pretratamiento tal como se describe en los ejemplos.

Preferiblemente, el método de la invención está diseñado para el diagnóstico de enfermedad celíaca, en particular en poblaciones con IgAD.

Las muestras biológicas tales como sangre completa, suero o saliva se diluyen en tampón de pretratamiento tal como se describe en los ejemplos. Puede añadirse un agente conservante al tampón de pretratamiento.

En el caso de que la muestra biológica sea saliva, la disolución de pretratamiento también permite procesar muestras de saliva para potenciar la detección de, por ejemplo, IgA contra TGasa2. Las interacciones de mucinas e IgA favorecen una tinción no específica y resultados falsos positivos. Tal como se conoce en la técnica, pueden añadirse mucolíticos o agentes reductores a la disolución de pretratamiento para escindir los enlaces químicos entre mucinas e IgA [24].

El método de la invención comprende además la etapa de poner en contacto la muestra biológica pretratada con el lecho de muestra del dispositivo de inmunocromatografía de la invención, permitiendo de ese modo que dicha muestra biológica pretratada difunda lateralmente a al menos tres zonas de ensayo.

Normalmente, la muestra biológica pretratada fluye a través del lecho de muestra hacia los lechos de conjugado y luego hacia los lechos de prueba que comprenden las zonas de ensayo. Cuando el analito de unión está presente en dicha muestra biológica, entra en contacto en primer lugar con agentes marcados impregnados en cada lecho de conjugado de modo que se forman complejos con dichos agentes marcados impregnados sobre los lechos de conjugado.

Tal como se describió anteriormente, el analito de unión es una inmunoglobulina y se selecciona del grupo que comprende una IgA, o una IgG o una combinación de las mismas. Preferiblemente, cuando el dispositivo de inmunocromatografía se usa para el diagnóstico de una enfermedad celíaca, el analito de unión es una IgA y/o una IgG.

También habitualmente, el agente marcado, diseñado para reconocer, unirse a y formar un complejo con el analito de unión, se selecciona del grupo que comprende un anticuerpo anti-IgA humana, anti-IgG humana. En el caso de que el analito de unión sea IgA y/o una IgG, entonces el agente marcado es un anticuerpo anti-IgA humana o un anticuerpo anti-IgG humana producido, por ejemplo, en cabra.

Preferiblemente, el marcador que está asociado con el agente se selecciona del grupo que comprende, pero sin limitarse a, enzimas, colorantes y partículas visibles.

Una vez formados los complejos, entran en contacto adicionalmente con agentes de captura o partes antigénicas de los mismos que se recubren, en la zona de ensayo, sobre lechos de prueba. El agente de captura puede “capturar” los complejos cuando están presentes en la muestra biológica. Habitualmente, el agente de captura es cualquier partícula o molécula tal como una proteína que reconoce o se une al complejo con el agente de marcaje que se ha unido al analito biológico en la muestra. El agente de captura se inmoviliza en el material poroso de los lechos de prueba, más particularmente ubicado en la zona de ensayo. El agente de captura no se ve afectado por el flujo lateral de la muestra líquida debido a la inmovilización en el material poroso. El agente de captura puede ser natural,

o no natural, es decir, sintético. Una vez que el agente de captura se une al complejo de analito-agente marcado, impide que el complejo continúe con el flujo lateral de la muestra líquida.

El método de la invención comprende además las etapas de permitir el desarrollo de una respuesta y detectar la presencia del marcador presente en los complejos. Generalmente, la reacción se visualiza a través de la deposición de un complejo coloreado.

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En el caso de que el marcador sea una enzima, entonces la adición de, por ejemplo, un sustrato coloreado específico para la enzima permitirá la visualización del complejo.

5 Habitualmente, el método de la invención comprende la etapa de interpretar la respuesta para indicar la presencia de dicho analito de unión en dicha muestra biológica. Generalmente, un examen visual de la zona de ensayo tras 10-20 minutos es suficiente para interpretar los resultados de la prueba. En referencia en más detalle a la realización preferida (ejemplo 2, figura 2), el dispositivo de inmunocromatografía debe colocarse con la ventana correspondiente a la zona de ensayo (14), que corresponde al control interno, delante del usuario. La prueba se valida si aparece una

10 línea azul en esta ventana. Puede visualizarse un total de 5 combinaciones que conducen a 4 diagnósticos clínicos distintos tal como se describe en la figura 2 y la tabla 1.

Tabla 1

Zonas de ensayo: Interpretación

(14): (15) (16) (17)

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+: - - El control interno muestra que la prueba se valida, el sujeto ni es deficiente en IgA ni padece EC.

+
+
+: - El control interno muestra que la prueba se valida, el sujeto no es deficiente en IgA pero padece EC.

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+: - - - El control interno muestra que la prueba se valida, el sujeto es deficiente en IgA pero no padece EC.

+: - - + El control interno muestra que la prueba se valida, el sujeto es deficiente en IgA pero padece EC.

15 Preferiblemente, el tampón de pretratamiento se selecciona del grupo que comprende N-acetil-cisteína en tampón PBS o carbocisteína min en tampón PBS, opcionalmente con un agente reductor tal como DDT o SDS. También opcionalmente, puede añadirse un agente conservante tal como EDTA o azida sódica al tampón de pretratamiento. Encontrar el mejor tampón de pretratamiento según la muestra biológica está dentro de la capacidad del experto en

20 la técnica.

Habitualmente, el marcador se selecciona del grupo que comprende cromógenos, catalizadores, compuestos fluorescentes, partículas metálicas y no metálicas coloidales, partículas de colorante, enzimas o sustratos, polímeros orgánicos, partículas de látex, liposomas con sustancias que producen señales y similares.

25 El método de una etapa está dedicado a la detección de IgA total simultáneamente con la detección de anticuerpos contra TGasa2 (con una sensibilidad de anticuerpos de clase IgA contra TGasa2 y con una sensibilidad de anticuerpos de clase IgG contra TGasa2) en la muestra biológica.

30 Además, dentro del alcance de la presente invención se encuentra un kit para determinar la presencia de un analito de unión en una muestra biológica de un sujeto, comprendiendo dicho kit el dispositivo de inmunocromatografía tal como se describe en el presente documento, opcionalmente con reactivos y/o instrucciones de uso.

El kit de la presente invención puede comprender además un dispositivo colector de saliva.

35 Alternativa o adicionalmente, el kit puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo tampones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas, por ejemplo para recoger la muestra biológica.

40 El kit puede incluir también un sistema que permite la detección de la respuesta. La respuesta puede detectarse visual o instrumentalmente dependiendo del marcador presente en los complejos. Las posibles respuestas pueden incluir la producción de productos coloreados, fluorescentes o luminiscentes, la alteración de las características de absorción o emisión de radiación por un producto o componente de ensayo, y precipitación o aglutinación de un producto de componente. Dicho componente puede ser un marcador, por ejemplo un radioisótopo, un fluoróforo, una

45 enzima, una coenzima, un sustrato enzimático, un compuesto electrodenso o una partícula que puede aglutinarse.

La descripción anterior se entenderá más completamente con referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, tales ejemplos son a modo de ejemplo de métodos de puesta en práctica de la presente invención y no pretenden limitar el alcance de la invención.

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Ejemplos

Ejemplo 1:

55 Recogida de muestras

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Grade A7250) 10 g/l, 20 g/l y 50 g/l. Se añadieron 5 l de cada una de estas disoluciones a 100 l de muestra extraída variando las concentraciones finales de N-acetil-cisteína (NAC) desde 0,2 hasta 2,4 g/l de saliva. Entonces se incubaron las muestras a temperatura ambiente durante 20 minutos. Se usaron muestras de saliva o bien puras o bien diluidas 1:10 antes de las pruebas.

Detección de anticuerpos anti-TGasa2 e IgA total

Se realizaron ensayos ELISA para detectar anticuerpos anti-TGasa2 IgG e IgA. Se usó un kit comercial, IgA e IgG QUANTA Lite™ h-tTG de Inova Diagnostics Inc. (San Diego, CA, EE.UU.). Se realizaron estas pruebas tanto sobre muestras de suero como de saliva para todos los pacientes, según las instrucciones de uso del fabricante. Se midió la IgA total en suero usando tecnología de ELISA.

Resultados

La concentración de anticuerpos en suero es 10 veces superior (IgA en el intervalo de 75 a 300 g/ml) que en saliva (IgA en el intervalo de 30  15 g/ml). Sin embargo, un factor de dilución 1:10 tenía un impacto demasiado fuerte sobre la sensibilidad de la prueba produciendo medidas de absorbancia muy bajas. Todos los ensayos adicionales se realizaron usando saliva pura.

La saliva es un medio heterogéneo con propiedades de viscosidad debido a la presencia de mucinas. Estas últimas están entre las proteínas glicosiladas más grandes (de 2 a 50 MDa) que se secretan sobre la superficies mucosas para proteger las células [4]. Tienen la particularidad de formar agregados y complejos con otros polímeros, y por tanto inducen una fuerte tinción de fondo no específica en inmunoensayos [5]. Además, los anticuerpos quedan atrapados dentro de estos filamentos de mucina induciendo una pérdida de señal para el inmunoensayo. La necesidad de un pretratamiento mucolítico y reductor (combinación de NAC y Tween 20) de las muestras de saliva tiene varias ventajas. Permite que la degradación de agregados de mucina haga que la muestra sea más fluida para la migración por flujo lateral. También induce la escisión de los enlaces químicos entre mucinas e inmunoglobulinas. Este efecto se ilustra en la figura 4A.

A una concentración de 0,4 g/l de NAC y Tween 20 al 0,2%, los controles negativos mostraron los valores de DO más bajos. En comparación, muestras de saliva de pacientes con EC tratadas usando las mismas concentraciones de tampón produjeron diferencias no significativas con valores de DO de muestras no tratadas. El efecto principal del tampón de pretratamiento era evitar la tinción de fondo no específica de las mucinas y por tanto aumentar la discriminación entre las poblaciones positivas y negativas.

Usando la concentración óptima de agentes mucolíticos y reductores que reducía la mayor parte de la señal para los controles negativos, se evaluaron los diferentes grupos de pacientes para detectar IgA e IgG anti-TGasa2. Los resultados se muestran en la figura 4B. Cuando se consideran todos los grupos de pacientes, es difícil discriminar las diferentes poblaciones. Hay solapamientos importantes entre el grupo I (EC no tratada), II (mal cumplimiento de la dieta) y III (buen cumplimiento de la dieta). Cuando se elimina el grupo II, se hace posible la discriminación entre las otras poblaciones, tal como se muestra en la figura 5. Estos resultados preliminares demuestran que es viable usar saliva para distinguir entre un paciente con EC no tratada y un individuo sano. Por tanto, la saliva podría ser un medio de examen no invasivo excelente. Sin embargo, cuando se considera el seguimiento de pacientes con EC a dieta, se hace muy difícil discriminar los cumplimientos bueno y malo de la dieta. Para esta aplicación particular, el uso de o bien sangre completa o bien suero parece más adecuado. Esto se resalta en la figura 5.

Se midieron los niveles de IgG anti-TGasa2 en muestras de saliva tratadas y no tratadas de pacientes de los 5 grupos. Con la excepción de un paciente con EC con IgAD del grupo IV, no se detectaron anticuerpos IgG anti-TGasa2. Estos resultados preliminares son prometedores y parecen confirmar la especificidad de IgG anti-TGasa2 en saliva para diagnosticar EC en pacientes con IgAD. Sin embargo, serán necesarias más muestras de pacientes para llegar a conclusiones positivas sobre el uso de saliva para diagnosticar estos pacientes.

Con respecto a inmunoglobulinas salivares para la enfermedad sistémica, siguen siendo un reto. En el caso de EC, se han considerado dos subclases de inmunoglobulinas, IgA e IgG, teniendo cada una un origen diferente en la saliva. La primera se sintetiza por plasmocitos en glándulas salivales, y se secreta en forma de dímeros (IgA secretora). La segunda se deriva de suero principalmente a través de hendiduras gingivales y de trasudado de mucosa oral [6]. Uno de los retos es optimizar el procedimiento de recogida de saliva con el fin de recoger tanto IgA como IgG. Recogiendo saliva de debajo de la lengua, se recogió IgA secretada de la glándula sublingual así como IgG del trasudado de mucosa oral. Esto se ha demostrado anteriormente en el contexto de pruebas de VIH orales [7]. Tiene la ventaja de capturar tanto sIgA que refleja la inmunidad del intestino con respecto al direccionamiento de células B activadas dentro de las glándulas salivales menores como IgG de suero.

Aunque la invención se ha ilustrado mediante referencia a realizaciones preferidas y específicas, los expertos en la técnica reconocerán que pueden realizarse variaciones y modificaciones a través de la experimentación y práctica de rutina de la invención. Por tanto, se pretende que la invención no se limite por la descripción anterior, sino que se defina por las reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.

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Claims

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