DE19630557C2 - Verfahren zum Nachweis von Antikörpern aus Körperflüssigkeiten durch eine Immunreaktion mit Gewebe-Transglutaminase (tTG) sowie die Verwendung von tTG in Diagnose und Therapie - Google Patents
Verfahren zum Nachweis von Antikörpern aus Körperflüssigkeiten durch eine Immunreaktion mit Gewebe-Transglutaminase (tTG) sowie die Verwendung von tTG in Diagnose und TherapieInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern aus Körperflüssigkeiten
durch eine Immunreaktion mit Gewebe-Transglutaminase (tTG), deren immunreaktiven
Sequenzen oder Analoga.
Das Verfahren kann zur Diagnose oder Therapiekontrolle von Erkrankungen dienen, die mit
einer Immunreaktion gegen diese Substanzen einhergehen. Gegenstand der Erfindung ist
deshalb insbesondere die Verwendung von tTG, deren immunreaktiven Sequenzen oder
Analoga zur Diagnose oder Therapiekontrolle von chronisch entzündlichen oder
Autoimmunerkrankungen, insbesondere der Sprue oder Zöliakie.
Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, daß die Gewebe-Transgluaminase (tTG,
EC 2. 3. 2. 13) das Autoantigen der Sprue bzw. der Zöliakie ist.
Die Zöliakie ist eine Erkrankung der Dünndarmschleimhaut mit Erstmanifestation vorwiegend
im späten Säuglings- und Kleinkindalter. Tritt das entsprechende Krankheitsbild erst beim Er
wachsenen auf, so wird sie als einheimische Sprue bezeichnet. Die Sprue geht mit einer ent
zündlichen Veränderung der Mukosa und einer dadurch verursachten generalisierten Malab
sorption einher. Sie reagiert meist morphologisch und klinisch auf eine Behandlung mit gluten
freier Diät (vgl. Literaturstellen 1, 2).
Bei der als latente Sprue, bzw. Gluten-Sensitivität bezeichneten symptomfreien Ausprägung
sollte zwischen einer mukosalen und einer klinischen Latenz unterschieden werden. Während
bei der mukosalen Latenz von einer milden Schädigung der Mukosa ausgegangen wird, die
durch Zugabe von Gluten verstärkt werden kann, können Personen mit einer klinischen Latenz
alle Phasen der Mukosa-Schädigung entwickeln und dennoch symptomfrei bleiben.
Zwischen der Sprue und bestimmten Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC)-Antigenen
besteht eine enge Assoziation. Die Gene, die für die MHC-Antigene kodieren, sind auf dem
kurzen Arm des Chromosoms 6 lokalisiert. Sie werden als humane Lymphozyten (HLA)-Anti
gene A, -B, -C und -D bezeichnet. Die HLA-DQ und HLA-DR Allele (MHC II) scheinen eine
besondere Rolle bei der Entwicklung der Sprue zu spielen (vgl. Literaturstellen 1, 2).
Als krankheitsauslösende Faktoren sind die Klebereiweiße (Glutene) von Weizen, Gerste,
Roggen und z. T. Hafer bekannt, während die von phylogenetisch weniger verwandten Pflan
zenarten wie Mais, Reis und Soja nicht pathogen sind. Unter den Glutenen wird den alkohol
löslichen Prolaminen, speziell dem α-Gliadin, die Rolle des krankheitsauslösenden Agens zu
geschrieben (vgl. Literaturstellen 1, 2). M. Szaboles et al. beschreiben in Acta Paediatrica
Hungaria 28 (3-4), S. 215-227 (1984), daß die Glutene aufgrund ihres hohen Glutamingehaltes
geeignete Substrate für Transglutaminasen sind.
Die Sprue tritt bevorzugt in Ländern aufs in denen Weizen als wichtige Nahrungsquelle dient
(Europa, USA, Australien) und besitzt z. B. eine Inzidenzrate von 0,14/1000 Neugeborener in
Dänemark, 0,7/1000 in Spanien, 1/1000 in Italien, 0,45/1000 in Deutschland und 2,42/1000 in
Schweden (vgl. Literaturstellen 1, 2, 3).
Neuere Untersuchungen belegen jedoch, daß eine subklinische Ausprägung, d. h. eine morpho
logische Veränderung der Mukosa ohne schwerwiegende Symptome, weit häufiger als bislang
vermutet auftritt. So zeigte eine 1994 in Italien durchgeführte Studie eine Inzidenz von
3,28/1000 bei Schulkindern (vgl. Literaturstelle 4). Das Risiko einer latenten Sprue bei
Verwandten 1. Grades von Sprue-Patienten liegt bei bis zu 50% (vgl. Literaturstelle 5).
Unter mehreren Hypothesen wird eine Interaktion zwischen genetischen Faktoren, Umweltfak
toren und dem Immunsystem favorisiert.
In den Seren der Sprue-Patienten kommen Antikörpern der IgA- und der IgG-Klasse vor, die
zum einen gegen Gliadin gerichtet sind, zum anderen gegen ein Autoantigen des Endomysiums,
einem speziellen Bindegewebe, das u. a. die Kollagene I, III und V, elastische Fasern, nicht
kollagene Proteine wie z. B. Fibronektin und Proteoglykane enthält.
Eine Dünndarm-Biopsie weist bei Sprue-Patienten charakteristische Schleimhautläsionen auf.
Beginnend mit der Einwanderung intraepithelialer Lymphozyten (IEL) kommt es bei fort
schreitender Sprue-Entwicklung zur Hyperplasie der Krypten sowie einer Atrophie der Villi,
was zum typischen Erscheinungsbild einer flachen Mukosa führt. Der proximal gelegene Teil
des Dünndarms ist dabei stärker betroffen als der distale Bereich (vgl. Literaturstelle 2).
Während bei allen symptomatischen Patienten eine flache Mukosa diagnostiziert wird, können
bei der asymptomatisch verlaufenden, Patenten Sprue alle Phasen der Mukosa-Veränderung,
vom Einwandern der IEL bis hin zur totalen Villus-Atrophie beobachtet werden (vgl.
Literaturstelle 5).
Mit einer vorwiegend latenten Sprue einhergehend tritt gehäuft eine polymorphe Dermatose,
die Dermatitis herpetiformis auf, wobei charakteristische subepiderrnale Blaschen mit granulä
ren IgA-Ablagerungen in den dermalen Papillenspitzen zu beobachten sind. Dünndarmbiopsien
zeigen eine unregelmäßige, mehr oder weniger stark geschädigte Mukosa.
Eine weitere gesicherte Assoziation ist zwischen der Sprue und dem Insulin-abhängigen Dia
betes meffitus, Schilddrüsenerkrankungen, sowie einer selektiven IgA-Defizienz zu beobachten.
Eine Sprue wurde auch in einigen Patienten mit Sjögrens Syndrom, seltener bei systemischem
Lupus erythematosus, Enzephalopathien, Polymyositis und distaler Axonopathie beschrieben.
Neben zahlreichen klinischen Begleiterscheinungen der Sprue, wie z. B. einer Anämie, die u. a.
einer Vitamin B12-Malabsorption zugeschrieben wird und einem Vitamin K-Mangel, auf den
eine erhöhte Blutungsneigung zurückzuführen ist, spielt das stark erhöhte Risiko gastrointesti
naler Malignome eine besondere Rolle. Bis zu 15% der Sprue-Patienten entwickeln, meist im
Alter über 50 Jahren, neoplastische Erkrankungen, von denen etwa 50% auf intestinale T-Zell-
Lymphome und weitere 25% auf Ösophagus-, Oropharynx- und Dünndarm-Tumore entfallen
(vgl. Literaturstelle 1).
Die Dünndarm-Biopsie ist der Goldstandard für die Diagnose der Sprue und der Verlaufskon
trolle unter glutenfreier Diät. Zunehmend gewinnen aber auch nicht-invasive Methoden der
Diagnostik an Bedeutung, die auf immunologischen Markern beruhen. Seren können dabei im
ELISA auf IgG- und IgA-Antikörper gegen Gliadin, sowie durch indirekte Immunfluoreszenz
auf IgG- und IgA-Antikörper gegen Endomysium getestet werden. Während Antikörper gegen
Gliadin nicht spezifisch genug für die Sprue sind, wird für die IgA-AK gegen Endomysium eine
hohe Sensitivität und Spezifität (97-100%) berichtet. Für den Immunfluoreszenz-Nachweis
werden Ösophagusschnitte von Primaten benötigt (vgl. Literaturstelle 6). Zur Zeit laufen
Untersuchungen, die Endomysium-Antikörper auch auf Nabelschnurmaterial nachzuweisen
(vgl. Literaturstelle 7). EP 0321988A1 beschreibt den Nachweis von IgA-
Endomysiuraautikörpern auf Fasern der glatten Muskulatur.
Die Therapie besteht in der strikten Einhaltung einer lebenslangen glutenfreien Diät, wobei
nicht nur Gluten enthaltende Produkte aus Weizen, sondern auch aus Roggen, Gerste und Ha
fer ausgeschlossen werden müssen. Dies bedeutet für die Patienten gravierende Einschrän
kungen sowohl der Essensgewohnheiten als auch der sozialen Interaktionen.
Sofern die Sprue rechtzeitig diagnostiziert und therapiert wird, besitzt sie eine gute Prognose.
Jedoch sind aufgetretene Komplikationen häufig nicht gänzlich reversibel. Wird die Krankheit
dagegen nicht erkannt und behandelt, so kann es durch Malabsorption zu schwerwiegenden
Krankheitserscheinungen kommen. Letztendlich besteht das erhöhte Risiko einer Entwicklung
eines intestinalen Lymphoms, sowie anderer gastrointestinaler Neoplasien.
Bei rechtzeitiger Diagnose und konsequenter Einhaltung einer glutenfreien Diät kann die Er
krankung in Remission gehalten und damit auch das erhöhte Malignom-Risiko der Patienten
auf den Normalwert gesenkt werden (vgl. Literaturstellen 8, 9). Es ist folglich von großem
Interesse, einen geeigneten Nachweistest für die Sprue zu entwickeln. Da der Personenkreis
mit einer latenten Sprue ebenfalls zur Risikogruppe gehört, sollten alle in Betracht kommenden
Personen (vor allem Verwandte 1. Grades), letztendlich alle Schulkinder, wie dies in Italien zur
Zeit erwogen wird, mit einem sensitiven, spezifischen, leicht durchführbaren und preiswerten
Test untersucht werden.
Große Screening-Programme scheiterten an folgenden Problemen:
- - Die invasiven Duodenal-Biopsien symptomfreier Personen sind unzumutbar und viel zu aufwendig.
- - Ein auf Antikörpern gegen Gliadin beruhender ELISA-Nachweis ist aufgrund seiner gerin gen Spezifität kaum brauchbar.
- - Der auf Primaten-Ösophagus basierende Immunfluoreszenz-Nachweis von Endomysium- Antikörpern der IgA-Klasse ist als generelle Screeningmethode zu aufwendig. Ferner ist die Beurteilung subjektiv und erlaubt nicht die Erfassung von Sprue-Patienten mit einer IgA-Defizienz (2% der Patienten).
Es existiert bisher kein nicht-invasiver, spezifischer, quantitativer, schnell, leicht und kosten
günstig durchzuführender Nachweistest für die Sprue/Zöliakie und deren Therapie-Kontrolle.
Dieses Problem wird durch die Charakterisierung der tTG als Autoantigen der Sprue und die
Verwendung von tTG in der Diagnostik und Therapiekontrolle der Sprue gemäß der
vorliegenden Erfindung gelöst.
Des weiteren können durch die in den Patentansprüchen aufgeführten immunologischen
Verfahren andere Erkrankungen/Symptome diagnostiziert und kontrolliert werden, welche mit
einer Immunreaktion gegen tTG einhergehen. Der auf der tTG basierende erfindungsgemäß
entwickelte ELISA-Nachweis von IgA-Antikörpern im Serum von Sprue-Patienten eignet sich
aufgrund seiner hohen Sensitivität und Spezifität hervorragend zur Diagnostik und Therapie-
Kontrolle der Sprue. Dies wird auch bei der Verlaufs-Kontrolle der behandelten Patienten
deutlich (Titer-Abfall unter Therapie). Ein Vergleich der vorliegenden ELISA-Daten mit den
Immunfluoreszenz-Auswertungen Dritter (Nachweis von IgA anti-Endomysium) zeigt eine
gute Übereinstimmung. Unstimmigkeiten treten vor allem bei niedrigen Antikörper-Titern auf,
was jedoch eher zu Lasten der bisher als Goldstandard geltenden indirekten Immunfluoreszenz
geht. Dies ist u. a. bedingt durch die subjektive Auswertung und die unspezifischen Begleit
reaktionen dieser Methode des Standes der Technik.
Der entsprechende, auf Antikörpern anderer Klassen beruhende Nachweis, aufgezeigt am Bei
spiel der IgG-Antikörper, eignet sich zum Auffinden von Sprue-Patienten mit einer IgA-Defizi
enz sowie zur Untersuchung anderer Erkrankungen, die mit einer Immunreaktion gegen die
tTG einhergehen.
Eine weitere Verbesserung wird durch den Einsatz der aufgereinigten tTG aus Meer
schweinchen, der humanen tTG, proteolytisch oder gentechnisch erhaltener immunreaktiver
Sequenzen oder Analoga sowie synthetischer immunogener tTG-Peptide und Testsystem
erwartet.
Die TGn (EC 2.3.2. 13) sind Enzyme, die Ca2+-abhängig einen Acyltransfer katalysieren, wobei
die γ-Carboxamldgruppen von Peptid-gebundenen Glutaminresten als Acyl-Donoren agieren.
Als Acyl-Akzeptoren dienen primär proteingebundene Lysinreste, so daß der Transfer in einer
ε-(γ-Glutamyl-) Lysin-Bindung resultiert. Die Substratspezifität der TGn bezüglich der Acyl-
Donoren ist sehr hoch (Abhängigkeit von der Aminosäure-Sequenz), wohingegen ein außer
gewöhnlich breites Spektrum an Akzeptoren zur Verfügung steht (vgl. Literaturstelle 18). Die
entstandenen kovalenten Peptidbindungen sind sehr stabil und proteaseresistent, wodurch sich
eine erhöhte Beständigkeit der vernetzten Proteine gegenüber chemischen, enzymatischen oder
physikalischen Einflüsse ergibt.
Mit dem weitverbreiteten Vorkommen verschiedener TGn in diversen Organen, Geweben, im
Plasma und in interstitiellen Körperflüssigkeiten korreliert auch das Vorkommen von durch
Transglutaminase modifizierten Proteinen im Blutgerinnsel, auf Zellmembranen, in der Horn
schicht der Epidermis, in Haaren, Nägeln und in der extrazellulären Matrix (vgl. Literaturstelle
19). S.E. Bruce et al. beschreiben in Clinical Science (1985) 68, 573-579 den erstmaligen
Nachweis von Transglutaminaseaktivität in humaner jejunaler Mucosa. G. Sharp et al.
berichten in Cell Biochemistry and Function, 1988 (6), Heft 2, S. 137-141 über die
Lokalisierung von Transglutaminase im Dünndarm von Ratten mittels Immunfluoreszenz.
Die beschriebenen Transglutaminasen lassen sich durch ihre physikalischen Eigenschaften, ihre
Lokalisation im Körper und ihre Primärstruktur unterscheiden.
Faktor XIII (FXIII), ein im Blut zirkulierendes Plasmaprotein, stellt die am besten charakteri
sierte TG dar. Im Plasma liegt FXIII als Tetramer von 320 kDa vor, bestehend aus zwei kata
lytischen a-Untereinheiten (je 75 kDa, mit 39% Homologie zur tTG) und zwei vermutlich sta
bilisierenden b-Untereinheiten (je 80 kDa). Eine lediglich aus zwei a-Untereinheiten bestehende
Variante findet sich u. a. in Plättchen, Makrophagen, Plazenta, Uterus und Prostata. Im Gegen
satz zu den anderen TGn wird der als Proenzym vorliegende FXIII durch Thrombin aktiviert,
indem ein 4 kDa Peptid am Aminoende der a-Untereinheit abgespalten wird. In Gegenwart von
Ca2+ dissoziiert das Tetramer in das aktive a-Dimer und die zwei b-Untereinheiten. Die Kal
ziumionen binden an die a-Untereinheiten und aktivieren das Enzym zu FXIIIa.
FxIIIa katalysiert die Quervernetzung zahlreicher Plasmaproteine, insbes. der Fibrinmono
mere, ein entscheidender Schritt in der Blutgerinnung. Bei der Regulation der Fibrinolyse spielt
FXIIIa durch das Vernetzen von α2-Plasmin-Inhibitor mit der α-Kette des Fibrins eine wichtige
Rolle. Ferner kann FXIIIa Fibronektin mit der α-Kette des Fibrins bzw. Kollagenen querver
netzen (vgl. Literaturstelle 20).
Aus Epidermis-Zellen konnte die epidermale TG isoliert werden, die als Protransglutaminase
mit 72 kDa durch chaotrope Agenzien oder Proteolyse in das aktive 50 kDa-Fragment über
führt wird. Ihr wird Bedeutung bei der Quervernetzung von zytoplasmatischen oder Membran
proteinen in der Epidermis zugeschrieben. In welchem Verhältnis die epidermale TG zur
Haarfollikel-TG steht, die als Dimer aus zwei identischen Untereinheiten von je 27 kDa be
steht, bleibt noch zu klären (vgl. Literaturstellen 19, 20).
Eine ebenfalls auf die Haut beschränkte TG konnte aus Keratinozyten gewonnen werden und
liegt primär membrangebunden voL Die Membran-Verankerung der TGK erfolgt über eine
posttranslationale (thio-) Veresterung mit Palmitin-/oder Myristinsäure. Milder Trypsinabbau
bewirkt eine Entfernung der Peptid-gebundenen Fettsäure, eine Reduktion des Molekularge
wichts von 90 auf 80 kDa und die Solubilisierung des Enzyms (vgl. Literaturstelle 19).
Die Gewebe-TG (tTG), das der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Molekül, auch
zelluläre, Erythrozyten-, endotheliale, zytoplasmatische, Leber- oder Typ II-TG genannt, ist
ein Monomer mit einem Molekulargewicht von 75-85 kDa.
Die komplette Aminosäuresequenz mit 687 Resten wurde von der cDNA abgeleitet. Auf Pro
tein-Ebene besteht eine 84%ige Homologie zwischen dem menschlichen Enzym und dem
Enzym aus Mausmakrophagen, sowie eine 81%ige Homologie zwischen dem menschlichen
und dem Meerschweinchen-Enzym Nukleotidaustausche zwischen den Spezies sind oftmals
ohne Auswirkung auf die Aminosäuresequenz. Stark konserviert ist das aktive Zentrum mit
einer ausgeprägten Protein-Homologie zwischen den drei Spezies (49 von 51 Resten sind
identisch) und einem hohen Grad an Protein-Homologie (75%) zur a-Untereinheit des Faktor
XIII (vgl. Literaturstellen 16, 19).
Es liegen weder ein Signalpeptid noch eine Glykosylierung vor, und trotz mehrerer Cystein
reste existieren offenbar keine Disulfidbrücken (vgl. Literaturstelle 20). Fluoreszenz-
Hybridisierungen lokalisierten das Gen für die humane Gewebe-Transglutaminase auf dem
Chromosom 20q12 (vgl. Literaturstelle 21).
Obwohl der Mechanismus der Enzym-Ausschleusung noch unklar ist, gibt es eindeutige Be
lege, daß die intrazellulär ubiquitär vorkommende tTG in der extrazellulären Matrix (EZM)
wichtige Aufgaben übernimmt. Zudem wird die für die Aktivität der tTG erforderliche Ca2+
Konzentration unter physiologischen Bedingungen intrazellulär kaum erreicht, während im
Extrazellulärraum dagegen ausreichend hohe Ca2+-Konzentrationen vorliegen (vgl.
Literaturstelle 22).
Mehrere Untersuchungen belegen eine Assoziation von tTG mit dem EZM-Protein Fibronek
tin. Neben Fibronektin (vgl. Literaturstellen 23, 24, 26) konnten auch die EZM-Moleküle
Nidogen (vgl. Literaturstelle 27), das N-terminale Prokollagen in-Peptid (vgl. Literarurstelle
28), die Kollagene V und XI (vgl. Literaturstelle 29), Csteonectin (vgl. Literaturstelle 30), ein
Mikrofibrillen-assoziiertes Glykoprotein (vgl. Literaturstelle 31), hochmolekulares Dermatan
Sulfat-Proteoglykan (vgl. Literaturstelle 32) und das Lektin Galectin 3 (vgl. Literaturstelle 33)
als spezifische Substrate für die tTG identifiziert werden.
Hinweise für eine wichtige Rolle der tTG an der Wundheilung kamen u. a. von Immunfluores
zenz-Studien an kultivierten WI38-Zellen (embryonalen Lungenfibroblasten), die unter Nor
malbediugungen keine extrazelluläre tTG-Aktivität aufiveisen, das Enzym jedoch nach künst
licher Wundsetzung extrazellular ablagern. Dem möglicherweise passiven Austritt des Enzyms
aus geschädigten Zellen schließt sich eine zunächst nicht-kovalente Bindung an die EZM, ins
besondere an Fibronektin und fibrilläre Kollagene an. Dort ist das Enzym einige Stunden
katalytisch aktiv (vgl. Literaturstelle 23). Am Rattenmodell wurde, ebenfalls nach künstlicher
Wundsetzung, 5 Tage lang eine erhöhte tTG-Aktivität nachgewiesen (vgl. Literaturstelle 34).
Auch bei der Inkubation von humanen Erythrozytenlysaten mit Plasma konnte eine starke
Affinität der freigesetzten tTG an Fibronektin demonstriert werden (vgl. Literaturstelle 35).
Alle Befunde deuten daraufhin, daß die an die EZM gebundene tTG eine zentrale Rolle in der
frühren Phase der Wundheilung übernimmt, insbes. zusammen mit Faktor XIIIa bei der Fibrin-
Stabilisierung mitwirkt und durch ein Quervernetzen von extrazellulären Proteinen eine
Schutzschicht und ein stabiles adhäsives Substrat um die geschädigten Zellen bildet (vgl.
Literaturstelle 23). Eine interessante Hypothese sieht in der Bindung der tTG an extrazelluläres
Fibronektin bei pathologischen Situationen, in denen es zum Austritt von tTG aus dem Gewebe
kommt, eine Schutzreaktion der Zelle, um gefährliche Effekte von Fremdproteinen
abzuwehren (vgl. Literaturstelle 35).
Bisher konnten in Vertebraten keine Enzyme nachgewiesen werden, die in der Lage sind, die
von der tTG katalysierten, überaus stabilen Quervernetzungen der Proteine zu spalten. In die
sem Zusammenhang konnte zunehmend eine Bedeutung der tTG bei der Apoptose, d. h. dem
programmierten Zelltod, aufgezeigt werden. Im Gegensatz zur Nekrose (ungeregelte Zellyse)
durchlaufen die Zellen bei der Apoptose ein physiologisches Suizid-Programm, das einen akti
ven Metabolismus und eine gezielte Proteinsynthese benötigt und immunologisch unauffällig
verläuft. Apoptose erfolgt während der Embryonalentwicklung, der Metamorphose, bei Hor
mon-induzierten Atrophien, beim Tumorwachstum und der geregelten Immunantwort
(Immuntoleranz). Sie reguliert die Zellzahl durch Eliminierung geschädigter oder potentiell
schädlicher Zellen. Apoptotische Zellen zeichnen sich durch intakte Crganellen und Plasma
membranen, eine sigiurikante Volumenverminderung, typische Chromatinkondensation und
letztendlich eine Fragmentierung in die sogenannten Apoptosekörper aus (vgl. Literaturstelle
36). Bei Beginn der Apoptose findet eine Induktion und Aktivierung der tTG mit vermehrter
Ausbildung einer unlöslichen Proteinhülle statt. Dieses Phänomen geht auch mit einer
Fixierung des Zytoskeletts durch tTG einher und verhindert so das Austreten intrazellulärer
Bestandteile in den Extrazellulärraum mit einer konsekutiven Immunantwort (vgl.
Literaturstelle 37).
Eine Stimulation der tTG-Transkription und -Expression durch den transformierenden Wachs
tumsfaktor β1 (TGF-β1) wurde an Ratten-Hepatomzellen nachgewiesen. Die Induktion der
tTG mit einer darauffolgenden gesteigerten Quervernetzung zellulärer Proteine könnte u. a. der
durch TGF-β1 verursachten Wachstumssuppression und Apoptose-Induktion zugrunde liegen
(vgl. Literaturstelle 38). Interessanterweise spielt TGF-β1 eine zentrale Rolle bei der
Wundheilung und Fibrosierung. Eine ebenfalls steigernde Wirkung auf die tTG-RNA und
Proteinexpression mit anschließender Apoptose, konnte durch Inkubation von Ratten-
Tracheobronchialzellen mit Retinolsäure erreicht werden (vgl. Literaturstelle 39). Humane
Leukämiezellen zeigten jedoch zellspezifische Unterschiede in der tTG-Induktion durch
Retinolsäure (vgl. Literaturstelle 40).
Ferner war die Expression der zytosolischen tTG umgekehrt mit dem Metastasierungspotential
von Hamster-Fibrosarkom und Maus-Melanomzellen korreliert (vgl. Literaturstelle 41). In den
metastasierenden Hamster-Fibrosarkomzellen, nicht jedoch im Normalgewebe, wurde eine
inaktive Form der tTG nachgewiesen. Die inaktive Variante (ca. 120 kDa) war deutlich größer
als die aktive tTG und konnte durch Behandlung mit Trypsin oder Thrombin in die aktive Form
überführt werden. Ob es sich hier um eine transkriptionell oder post-transkriptionell
fehlgeleitete Expression handeln, ist noch unklar (vgl. Literaturstelle 42). Da aber auch eine
positive Korrelation zwischen tTG-Aktivität und Metastasierungs-Potential von humanen
Melanom- (vgl. Literaturstelle 43), und Ratten-Kolonkarzinom-Zellen beschrieben wurde,
müssen weitere Studien zeigen, ob die Vernetzung der den Tumor umgebenden EZM durch
tTG, diesen eventuell auch vor dem Angriff des Immunsystems schützen kann (vgl.
Literaturstelle 44).
Interessant ist auch die Aktivitätssteigerung der Pankreas-Phospholipase A2 (PLA2) des
Schweins durch posttranslationale, tTG-vermittelte kovalente Vernetzung von PLA2 mit
Polyaminen, welche intrazellulär in hohen Konzentrationen vorliegen, vor allem in sich schnell
teilenden Zellen. Die durch tTG aktivierte PLA2 könnte den Membran-Stoffwechsel rasch pro
liferierender Zellen und die Arachidonsäure-Kaskade Stimulieren (vgl. Literaturstelle 45).
Desweiteren konnte die tTG als ein neues Mitglied der GTP bindenden Proteine identifiziert
werden, wobei jedoch keine Homologien zu den bisherigen bekannten G-Proteinen bestehen.
Eine Aktivierung durch den α1-adrenergen Rezeptor stimuliert die Bindung von GTP an tTG
(vgl. Literaturstelle 46).
Ferner werden erfindungsgemäß Wege aufgezeigt, auf denen von tTG abgeleitete
Therapieformen eingesetzt werden können. So ist es möglich, tTG, dessen immunreaktive
Sequenzen oder Analoge bzw. von tTG abgeleitete immunogene Peptide zur Erzeugung einer
oralen Toleranz bei der einheimischen Sprue/Zöliakie oder anderer Erkrankungen/Symtome
einzusetzen, die mit einer Immunreaktion gegen tTG einhergehen.
Dies erfolgt durch Stimulation spezifischer Suppressorzellen oder durch Induktion einer
klinischen Anergie autoreaktiver Immunzellen.
Die orale Toleranz wird wesentlich durch das Immunsystem des Darmes bestimmt, das eine
systernische Immunantwort gegen resorbiertes Antigen verhindert, welches der enzymatischen
Verdauung im Darm entging. Neben einer Stimulation der IgA-Sekretion, die eine weitere
Aufnahme der Antigene durch die Mukosa verhindern soll, werden insbes. Suppressor-T-Zel
len aktiviert, die zur systemischen Toleranz beitragen (vgl. Literaturstelle 47). Orale Toleranz
wird zum einen durch die orale Zufuhr des Autoantigens erreicht, zum anderen existiert ein
sog. "Bystander-Effekt": sofern das die Krankheit auslösende Autoantigen nicht bekannt ist,
kann in einigen Fällen ein anderes Antigen, das im Zielorgan mit dem Immunsystem in Kontakt
kommt, zur oralen Therapie verwendet werden. Dieses Antigen ist dann in der Lage, lokal die
Anügen-spezifischen Suppressor-T-Zellen zu stimulieren und dadurch eine systemische
Immunantwort zu unterdrücken (vgl. Literaturstelle 47). Erst bei höherer Antigen-Dosis wird
eine Anergie autoreaktiver T-Zellen ausgelöst (vgl. Literaturstelle 48).
Die orale Toleranz wird in letzter Zeit als praktische Behandlungsmethode von diversen Auto
immunerkrankungen gesehen. So sind im Tiermodell bei der experimentellen autoimmunen
Thyroiditis (vgl. Literaturstelle 49), der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (vgl.
Literaturstelle 50), der Kollagen-induzierten Arthritis (vgl. Literaturstelle 51) und der
experimentellen Autoimmun-Uveoretinitis (vgl. Literaturstelle 52) durch orale Zufuhr der
entsprechenden Antigene (z. T. aus unterschiedlichen Spezies) Erfolge erzielt worden (vgl.
Literaturstelle 53). Es konnte gezeigt werden, daß die einmalige orale Zufuhr einer hohen
Antigen-Dosis eine Anergie (funktionelle Inaktivität) autoreaktiver CD4⁺ T-Zellen bewirkt,
während die mehrmalige Gabe kleinerer Dosen die erwünschte aktive Suppression
autoreaktiver T-Zellen zur Folge hat (vgl. Literaturstelle 48).
An Patienten mit rheumatoider Arthritis konnte durch dreimonatige orale Gabe von Kollagen II
aus Huhn (0,1 mg im ersten Monat, 0,5 mg in den folgenden 2 Monaten) nach Aussetzen der
oralen Antigen-Zufuhr eine zweimonatige nach Absetzen der Therapie anhaftende Antigen
spezifische Immunsuppression und damit eine Unterdrückung der Autoimmunerkrankung
erreicht werden, was durch eine deutliche Besserung, z. T. sogar ein Abheilen der Erkrankung
belegt wurde (vgl. Literaturstelle 54).
Da die tTG das Autoantigen der Sprue darstellt, besteht die Möglichkeit, dieses in seiner
Gesamtheit bzw. dessen immunreaktive Epitope (proteolytisch oder gentechnisch hergestellte
Sequenzen, Analoga oder synthetische Peptide) zur oralen Therapie einzusetzen. Aufgrund des
hohen Homologiegrades zur tTG aus anderen Organismen (z. B. Maus, Meerschweinchen) und
der Kreuzreaktivität autoantigener Epitope ist auch eine orale Therapie mit tTG bzw. dessen
immunreaktiver Epitope anderer Spezies denkbar.
Aufgrund der erhöhten Immunreaktion anderer Erkrankungen mit der tTG (z. B. andere chro
nisch entzündliche Darmerkrankungen, autoimmune Hepatiden) ist auch bei diesen Krankhei
ten ein Einsatz der tTG bzw. deren immunreaktiver Epitope zur oralen Therapie erfolgverspre
chend.
Die mit der Erfindung erreichten Vorteile bestehen insbesondere in einem nicht-invasiven, hoch
spezifischen, gegen das direkt mit der Erkrankung assoziierte Agens gerichteten Nachweistest
für die Sprue und deren Therapie-Kontrolle. Darüberhinaus besteht der große Vorteil des ent
wickelten Tests in der schnellen, leicht und kostengünstigen Durchführbarkeit und der Stan
dardisierbarkeit zwischen verschiedenen Labors. Der Test ermöglicht dadurch ein effizientes
Screening der Bevölkerung auf Antikörper, gerichtet gegen die tTG.
Die Möglichkeit der quantitativen Auswertung der Test-Daten ist zudem durch deren Objekti
vität gegenüber der subjektiv geprägten Auswertung einer Immunfluoreszenz überlegen.
Immunfluoreszenz-Auswertungen werden außerdem, vor allem bei niedrigen Titern, durch
unspezifische Begleitreaktionen erschwert. Durch den Einsatz des spezifischen Autoantigens
im Testsystem können die bei der Immunfluoreszenz auf Ösophagusmaterial von Primaten
bzw. Nabelschnüren unspezifischen Reaktionen weitgehendst ausgeschaltet werden.
Da der Test sowohl auf Antikörper der IgA- als auch anderer Antikörper-Klassen anwendbar
ist, werden auch Sprue-Patienten mit einer IgA-Defizienz erfaßt. Der auf Antikörpern gegen
tTG beruhende Nachweis eignet sich ebenso zum Auffinden, zur Untersuchung und zur Thera
piekontrolle anderer Erkrankungen, die mit einer Immunantwort gegen die tTG einhergehen.
Desweiteren besteht durch die Identifizierung der tTG als Autoantigen der Sprue die Möglich
keit, dieses in seiner Gesamtheit bzw. dessen immunreaktive Epitope (proteolytisch oder gen
technisch hergestellte Sequenzen, Analoga oder synthetische Peptide) zur oralen Therapie der
Sprue, sowie anderer Erkrankungen, die durch eine Immunantwort gegen die tTG gekenn
zeichnet sind, einzusetzen.
Die Färbungen wurden auf verschiedenen, in 100% Methanol über 2 min bei -20°C fixierten
Zellinien, durchgeführt.
Beim Immunfluoreszenz-Nachweis wurden die Präparate mit Sprue- bzw. Kontrollseren inku
biert, gewaschen und mit einem TRITC-markierten anti-human-IgA aus Kaninchen detektiert
(vgl. Literaturstelle 10).
APAAP-Markierungen wurden nach Inkubation der Zellen mit den Sprue-Seren, Waschen und
der darauffolgenden Detektion mit dem APAAP-Komplex durchgeführt (11).
Dabei zeigten HT1080 (humane Fibrosarkom-Zellen), W138 (humane embryonale Lungen
fibroblasten), Hep1 und HepG2 (Hepatokarzinom-Zellen) mit den Patientenseren eindeutig
positive, zytoplasmatische Signale, wogegen Normalseren oder auch eine Vorbehandlung mit
humanem IgA keine Markierung zeigten. Humane Vorhautfibroblasten, humane Rhab
domyosarkom (RD)-/Ratten-Ito-/Ratten-Morris-Hepatom und Hund-MDCK-Zellen zeigten
nur sehr schwache bis negative Reaktionen.
Die Charakterisierung und Isolierung des Autoantigens wurde aus HT1080 Zellen durchge
führt.
Die Zellen wurden in Dulbecco's modifiziertem Eagle Medium (DMEM, Glbco) mit L-Alanyi-
L-Glutamine, 10% fötalem Kälberserum (FKS, Gibco), 100 U/ml Penizillin 100 µg/ml
Streptomyzin (Seromed) bei 37°C und 8% CO2 kultiviert. Zur metabolischen Markierung
wurden die Zellen in Kulturschalen mit 5 cm2 Durchmesser überführt und bei Erreichen einer
∼90%-igen Konfluenz 2 h in Methionin- und FKS-freiem Medium gehalten, bevor dieses
gegen 3 ml FKS-freies, 35S- Methionin (0,2 mCi, Expre35S35S, NEN-Dupont) enthaltendes
Medium ausgetauscht wurde. Nach 16-20-stündiger Inkubation wurde der Überstand abge
nommen. Die Zellen wurden mit Phosphatpuffer (PBS, Seromed) gespült und anschließend in
3 ml Lysepuffer (50 mM Tri-HCl, 150 mM NaCl, 0,5% Triton X-100, 0,5% nichtionisches
Detergenz IGEPAL CA-630 [Sigma], Proteaseinhibitor Complete®[Boehringer], pH 7,5)
lysiert. Im Anschluß wurde sowohl mit dem Medium als auch dem Zellysat eine Immunpräzi
pitation mit CNBr-aktivierter Sepharose 4B (Pharmacia) durchgeführt.
Die Aktivierung und Bindung an die Sepharose erfolgte nach Herstellerangaben. Nach dem
Quellen und Waschen in 1 mM HCl, pH 2,5 wurde die CNBr-aktivierte Sepharose in 0,1 M
NaHCO3, 0,5 M NaCl, pH 8,3 , mit einem gegen humanes IgA gerichteten Antikörper aus
Kaninchen (Dianova, 2,4 mg Antikörper/ml Sepharose) über Nacht bei 4°C inkubiert. Nicht
gebundene Antikörper wurden durch Waschen mit dem Bindungspuffer entfernt, nicht besetzte
Bindungsstellen durch Zugabe von 1 M Ethanolamin, pH 9,0, bei Raumtemperatur 2 h abge
sättigt. Danach wurde die Sepharose 3×alternierend (je 10×Vol.) mit 0,1 M Natriumacetat,
0,5 M NaCl, pH 4,0 , und 0,1 M Tris-HCl, 0,5 M NaCl, pH 8,0 , gespült. Es folgte eine Inku
bation der Sepharose mit Seren von Sprue-Patienten bzw. gesunden Personen (0,5 ml Se
rum/ml Sepharose) bei 4°C über Nacht in Bindungspuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1
mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 8,0). Überschüssige Serum-Antikörper wurden durch 3×Spülen
mit Bindungspuffer entfernt.
Je 1 ml HT1080-Medium oder Zellysat (ca 5×104 Zellen) der metabolisch markierten Zellen
wurden 30 min bei Raumtemperatur mit 50 µl C14B-Sepharose (Pharmacia) vorirkubiert, um
unspezifisch bindende Proteine zu entfernen. Nach Abzentrifugieren (10 000×g, 5 min, 4°C)
wurden die Überstände mit je 50 µl der Sepharose, an die zuvor IgA der Patienten bzw. Kon
trollpersonen gebunden wurde, über Nacht unter Schütteln bei 4°C inkubiert. Dann wurden
die Sepharose-Pellets je 3× mit 1 ml Waschpuffer (10 mM Tris-HCl, 1% IGEPAL CA-630
[Sigma], 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,1% Natriumlaurylsulfat, CompleteOR[Boehrnger], pH
8,0) gewaschen, gefolgt von 1 ml 10 mM Tris-HCl, pH 8,0. Danach wurden die Pellets in
SDS-Probenpuffer aufgenommen, bei 95°C 5 min unter reduzierenden oder nicht reduzieren
den Bedingungen inkubiert, im 10-12,5% SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt (vgl.
Literaturstelle 12) und in der Autoradiographie nachgewiesen (Abb. 1).
Das gebundene hochmolekulare Protein aus dem Medium erwies sich bei weiteren Untersu
chungen als Fibronektin, welches u. a. unspezifisch an die Scpharose gebunden wird.
Eine zellassoziiertes Protein von 85 kDa konnte jedoch mit allen 30 bisher so eingesetzten
Sprue-Seren präzipitiert werden, während dies mit 15 Kontrollseren, darunter Normalseren,
Seren von Patienten mit Colitis Ulcerosa und Sjögren-Syndrom, nicht möglich war. Hieraus
wurde gefolgert, daß dieses Protein das wesentliche Autoantigen der Sprue repräsentiert.
Der autoradiographisch sichtbaren 85 kDa-Bande wurde in einer Proteinfärbung der Gele mit
Silbernitrat (vgl. Literaturstelle 13) eine scharfe Proteinbande zugewiesen.
Zur Isolierung größerer Mengen des Autoantigens wurden insgesamt 65 Kulturschalen (je 175
cm2) der HT1080 Zellen (etwa 109 Zellen) kultiviert. Kurz vor Erreichen der Konfluenz wurde
das Medium gegen FKS-freies Medium ausgetauscht, gefolgt von einer Inkubation über wei
tere 16-20 h im CO2-Inkubator. Die Lyse bzw. Immunpräzipitation erfolgten wie oben be
schrieben. Das Sepharosepellet wurde in insgesamt 4,5 ml SDS-Probenpuffer mit 2% DL-
Dithiothreitol (Sigma) 5 min bei 95°C inkubiert, um gebundene Proteine zu lösen und an
schließend im analytischen SDS-Polyacrylamidgel überprüft.
Zur weiteren Aufreinigung des Autoantigens wurde das Immunpräzipitat über eine Elutions
elektrophorese mit einer Prep Cell (Model 491 BIO-RAD) wie folgt aufgetrennt:
Auf ein Rundgel (Außen-Durchmesser 3 cm), bestehend aus 6,5 cm Trenngel (8% Polyacryl amid, pH 8,8) und 1,5 cm Sammelgel (4% Polyacrylamid, pH 6,8) wurden die 4,5 ml des Proteingemisches aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Die einzelnen Proteine wur den im Elutionspuffer (25 mM Tris-HCl, 0,1 M Glycin, 0,01% SDS, pH 8,3) in Fraktionen a 1,2 ml (0,8 ml/min) gesammelt. Die einierten Fraktionen wurden in der SDS-PAGE kon trolliert und die das gewünschte Protein enthaltenden Fraktionen (etwa 15 ml) vereinigt und mit Hilfe einer Ultrafiltration (Amicon Centriprep-50 bei 1000×g) auf circa 1 ml Gesamtvo lumen aufkonzentriert.
Auf ein Rundgel (Außen-Durchmesser 3 cm), bestehend aus 6,5 cm Trenngel (8% Polyacryl amid, pH 8,8) und 1,5 cm Sammelgel (4% Polyacrylamid, pH 6,8) wurden die 4,5 ml des Proteingemisches aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt. Die einzelnen Proteine wur den im Elutionspuffer (25 mM Tris-HCl, 0,1 M Glycin, 0,01% SDS, pH 8,3) in Fraktionen a 1,2 ml (0,8 ml/min) gesammelt. Die einierten Fraktionen wurden in der SDS-PAGE kon trolliert und die das gewünschte Protein enthaltenden Fraktionen (etwa 15 ml) vereinigt und mit Hilfe einer Ultrafiltration (Amicon Centriprep-50 bei 1000×g) auf circa 1 ml Gesamtvo lumen aufkonzentriert.
Unter mehreren getesteten Proteasen wurde die Endoproteinase Asp-N (sequencing grade,
Boehringer Mannheim) als zur Fragrnentierung geeignet ermittelt, da sie ein weitestgehend
reproduzierbares Spaltmuster mit relativ gut trennbaren Fragmenten ermöglichte. Die Enzym
zu-Substratkonzentration wurde auf 1 : 100 eingestellt und der Verdau über 30 min bei 37°C
durchgeführt.
Nach Verdau des aufgereinigten Antoantigens wurden die Peptidfragmente auf einem präpara
tiven 10% Tricine-Gel aufgetrennt (14) (Abb. 2) und bei 4°C im Semi-Dry-Fastblot-Verfahren
unter Verwendung graphithaltiger Elektrodenplatten (Fastblot B32/33, Biometra) auf eine
PVDF-Membran (Polyvlnylidendifluorid, ImmobilonTM, Millipore) transferiert. Dazu wurden
folgende Schichten auf die Anodenplatte gelegt 1.) ein Filterpapier, getränkt in Anodenpuffer
1 (300 mM Tris-HCl, 20% Methanol, pH 10,4), 2.) ein Filterpapier, getränkt in Anodenpuffer
2 (30 mM Tris-HCl, 20% Methanol, pH 10,4), 3.) die PVDF-Membran, akriviert in Methanol
und präequilibriert in Anodenpuffer 2, 4.) das Tricine-Gel, 5.) zwei Filterpapiere, getränkt in
Kathodenpuffer (25 mM Tris-HCl, 40 mM ε-Amino-n-Capronsäure, 20% Methanol, pH 9,4),
6.) die Kathodenplatte. Der Transfer wurde 35 min bei 180 mA durchgeführt.
Die PVDF-Membran wurde daraufhin in 0,1% Coomassie Blue Serva R-250, 50% Methanol
für 5 min gefärbt, mit 50% Methanol, 10% Essigsäure entfärbt, gründlich mit destilliertem
Wasser gewaschen und luftgetrocknet. Charakteristische Banden des verdauten Autoantigens
bei 10 kDa, 14 kDa, 16 kDa und 25 kDa wurden sorgfältig ausgeschnitten und N-termal an
sequenziert.
Die Sequenzierung in einem Applied Biosystems 4778-Sequenator ergab drei Aminosäure-
Sequenzen, welche mit der Swiss-Prot 31 Datenbank (von PC/GENE, IntelliGenetics) vergli
chen wurden. Daraus konnte bei minimaler Diskordanz, eine eindeutige Zuordnung der drei
Fragmente zur humanen Gewebe-Transglutaminase (tTG, EC 2.3.2. 13, Protein-Glutamin
Gamma-Glutamyltransferase) gemacht werden; die Angaben erfolgen im "one letter code", X
bedeutet keine Identifizierung:
t-Transglutaminase: 28' REKLVRRRGQPEW 10 kDa-Fragment: REKLVVRRGQPF(S)
t-Transglutaminase: 581' DLYLENPEIKIRILG 14 kDa-Fragment: DLYLENPEIXIXILG
t-Transglutammase: 438' DITHTVKYPE 16 KDa-Fragment: DITLTYQYP(V).
t-Transglutaminase: 28' REKLVRRRGQPEW 10 kDa-Fragment: REKLVVRRGQPF(S)
t-Transglutaminase: 581' DLYLENPEIKIRILG 14 kDa-Fragment: DLYLENPEIXIXILG
t-Transglutammase: 438' DITHTVKYPE 16 KDa-Fragment: DITLTYQYP(V).
Dem 25 kDa-Fragment konnte keine eindeutige Sequenz zugeordnet werden, da es sich dabei
um ein Peptidgemisch handelt.
Bei kommerzieller Verfügbarkeit und einer Sequenz-Homologie (< 80%) zur humanen tTG
wurde die tTG aus der Leber des Meerschweinchens (Sigma) zunächst gelelektrophoretisch
aufgetrennt, um dessen Reinheit zu überprüfen. Die tTG stellt dabei neben mehreren anderen
Proteinen mit ca 50% eine der Hauptbanden dar.
Obwohl sich die humane tTG mit 687 Aminosäuren nur geringfügig vom Meerschweinchen
protein mit 690 Aminosäuren unterscheidet, besitzen die beiden Proteine ein sehr unterschied
liches Laufverhaften im SDS-Polyacrylamidgel. Während das Protein tierischen Ursprungs er
wartungsgemäß bei 75-80 kDa erscheint, wandert das humane Protein deutlich weniger schnell
und täuscht, wie auch in der Literatur beschrieben, trotz offenbar fehlender N-Glykosylierung
ein apparentes Molekulargewicht von 85 kDa vor (vgl. Literaturstelle 16).
Die Reakrivität des menschlichen Auto-Antikörpers aus Sprue-Seren mit der Meerschwein
chen-tTG wurde in einer Immunpräzipitation getestet. Dazu wurden 4µg tTG (Sigma) in 500 µl
Lysispuffer, 0,5% Rinderserumalbumin mit an 4B-Sepharose gekoppeltem Sprue-IgA bei 4°C
über Nacht geschüttelt, gewaschen, in SDS-Probenpuffer unter reduzierenden Bedingungen
gekocht und im 10% Polyacrylamidgel aufgetrennt (s. 4.1.2.). Hier zeigte sich eine spezifische
Präzipitation der erwarteten Bande (Mr 80 kDa) nicht aber der Verunreinigung.
Nach Auftrennung von 2 µg der tTG aus Meerschweinchen im SDS-Gel und Transfer auf
Nitrozellulose wurde der Blot bei 4°C in PBS, 2% fettarmen Magermilchpulver, 0,3% Tween
20, pH 7,3 über Nacht blockiert. Es folgten eine einstündlge Inkubation mit Sprue-Serum
(1/200) in demselben Puffer, drei Waschschritte und eine einstündige Inkubation mit an
alkalischer Phosphatase gekoppelten Antikörpern aus Kaninchen gegen humanes IgA (1/500).
Die Blots wurden in PBS gewaschen und mit Nitro Blue Tetrazolium und 5-Brom-4-Chlor-3-
Indolylphosphat als Substrat entwickelt (vgl. Literaturstelle 17).
Die 75-80 kDa-Bande ergab ein eindeutiges positives Signal mit dem Sprue-Serumni, als weite
rer Beweis dafür, daß die Seren von Sprue-Patienten Antikörper der IgA-Klasse gegen die tTG
enthaften, während Kontrollseren kein Signal ergaben.
Ösophagus-Gewebeschnitte von Primaten (Euroimmun, Deutschland) wurden zum indirekten
Nachweis der IgA-Antikörper gegen Endomysium in Sprue-Seren, bzw. deren Inhibition durch
tTG verwendet. Nach Vorinkubation von 10 µl des 1/320 in PBS verdünnten Patientenserums
mit 0,5 oder 10 µg tTG aus Meerschweinchen (Sigma) bzw. 10 µg BSA (Sigma) über 1 h bei
Raumtemperatur, erfolgte dessen Inkubation mit den Ösophagus-Schnitten 1 h bei Raumtem
peratur in feuchter Atmosphäre. Zur Positiv- bzw. Negativ-Kontrolle dienten Sprue-Serum
(1/320) bzw. Seren von Gesunden (1/50). Nach dreimaligem Waschen der Schnitte in PBS/
0,2% BSA und Lufttrocknen wurde die Detektion des Autoantigens mit einem TRITC-
markierten, gegen humanes IgA gerichteten, Antikörper aus Kaninchen (Dianova), 1/50 in PBS
verdünnt, 1 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Überschüssige Antikörper wurden durch
sukzessives Waschen mit PBS/0,2% BSA, PBS und destilliertem Wasser entfernt.
Das Patientenserum zeigte eine deutliche Anfärbung der EZM durch die Antikörper der IgA-
Klasse, die durch Zugabe von steigenden Konzentrationen an tTG inhibiert wurden, nicht je
doch durch Vorinkubation mit BSA. Die Kontrolle mit Serum von Gesunden zeigte keinerlei
Anfärbung der Ösophagus-Schnitte.
In Polystyrol-Mikroplatten (Greiner Labortechnik, 96 Wells) wurde pro Vertiefung 1 µg Meer
schweinchen-Transglutaminase (Sigma T-5398) in 100 µl PBS pipettiert und 2 h bei 37°C unter
leicht rotierenden Bewegungen inkubiert. Nicht gebundene tTG wurde durch Spülen mit PBS
(3×200 µl) entfernt, freie Bindungsstellen der Vertiefungen wurden mit 1% Rinderserum
albumin (Sigma) in 250 µl PBS über Nacht bei 4°C blockiert. Nach Waschen mit PBS/0,1%
Tween-20 (3×200 µl) wurden die Vertiefungen mit sequentiellen Serum-Verdünnungen in
PBS/0,1% Tween-20 (100 µl) für 1 h bei Raumtemperatur unter leicht rotierenden Bewe
gungen inkubiert, mit PBS/0,1% Tween-20 (3×200 µl) gewaschen und daraufhin mit einem
Peroxidasekonjugierten, gegen humanes IgA gerichteten Antikörper aus Kaninchen (Dianova)
(1/400 in 100 µl PBS/0,1% Tween-20) 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach Waschen mit
PBS (3×) erfolgte eine 30 min Inkubation bei Raumtemperatur im Dunkeln mit je 200 µl 0,1M
Citratpuffer, 17,6 mM H202, 5,5 mM o-Phenylendiaminhydrochlorid (Sigma), pH 4,2 und die
anschließende Detektion des gebildeten Farbstoffs im ELISA-Reader (MRX, Dynatech
Laboratories) bei 450 nm.
Getestet wurden 20 Seren von Sprue-Patienten vor und nach Therapie mit Gluten-freier Diät,
d. h. in der aktiven und weniger aktiven Phase der Erkrankung. Das Testsystem erwies sich als
hoch sensitiv, mit einer guten Korrelation der Werte zur aktiven Phase der Sprue. Die Thera
pie-Erfolge durch Einhalten einer Diät spiegeln sich in einer Abnahme der IgA-Antikörper ge
gen die tTG wider. Die große Spezifität zeigt sich in der geringen Extinktion (Hintergrund-
Level) der Kontrollseren von Gesunden, Patienten mit Colitis ulcerosa, Leberzirrhose, diversen
Tumoren, Sjögrens Syndrom u.v.m (Abb. 3).
Da ca 2% der Sprue-Patienten eine IgA-Defizienz besitzen, wurden die Seren auf ihre Sensiti
vität und Spezifität von IgG-Antikörpern gegen tTG getestet. Die Durchführung des ELISA
erfolgte wie unter 3.1. Es wurde lediglich der Peroxidase gekoppelte anti-human IgA Anti
körper (Dianova), gegen einen anti-human IgG Antikörper (Dianova) ausgetauscht. Die Werte
der Sprue-Patienten entsprachen in ihrer Sensitivität, sowohl vor als auch nach Gluten-freier
Diät, in etwa den mit IgA Antikörpern erhaltenen Daten. Kleinere Unterschiede könnten auf
eine verzögerte/verlängerte Immunantwort zurückzuführen sein.
Einige Kontrollseren zeigten leicht erhöhte Werte, was früheren Befunden einer Verminderten
Spezifität der Endomysium-Antikörper in der indirekten Immunfluoreszenz der IgG-Klasse
entspricht (Abb. 4).
Die Durchführung des ELISA erfolgte wie unter 3.2. beschrieben.
Die Seren von Patienten mit chronisch entzündlichen oder autoimmunen Erkrankungen (Colitis
ulcerosa (C.U.), Morbus Crohn, akute Autoimmunhepatitis) zeigten leicht bis mittelgradig er
höhte Werte. Inwiefern die genetische Veranlagung (Autoimmunhepatiden sind häufig assozi
iert mit dem DQ-Allel, welches auch bei der Sprue von Bedeutung ist) zur spezifischen Aus
prägung von gegen die tTG gerichteten IgG-Antikörpern verantwortlich ist, muß weiter unter
sucht werden.
Hier ergibt sich jedoch durch Einsatz z. B. des IgG-spezifischen ELISAs für Autoantikörper
gegen die tTG ein neuer Ansatz zur Diagnose und Therapiekontrolle voll Patienten mit
Erkrankungen, welche mit einer Immunreaktion gegen die tTG einhergehen.
Während der durch die tTG katalysierten Reaktion ein breites Spektrum an Acyl-Akzeptoren
zur Verfügung steht, sind nur wenige Moleküle in der Lage als Acyl-Donoren zu fungieren. In
einem in vitro Versuch konnte der durch die tTG vermittelte Einbau von radioaktiv markiertem
Putrescin in Gliadin und damit die Funktion von Gliadin als Donor-Substrat der tTG
nachgewiesen werden. In 160 µl Puffer (0,1 M Tris-HCl, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl2, pH 7,5)
wurden 1 µg Substrat (Gliadin bzw. Kotrollproteine wie Albumin), 2 µCi[3H]-Putrescin und 1
µg tTG (aus Meerschweinchen, Sigma) 2 h bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch
Zugabe von 100 µl 50%-ige Trichloressigsäure (TCA) gestoppt und die Proteine wurden bei
4°C über Nacht präzipitiert. Nach Zentrifugation wurden die Pellets mit 10%-iger TCA gewa
schen, in SDS-Probenpuffer gelöst und einerseits in der SDS-PAGE aufgetrennt, andererseits
zur Szintillationszählung verwendet. Während bei den Kontrollen kein Einbau an lutrescin fest
zustellen war, zeigte Ghadin sowohl durch die Daten der Szintillationszählung als auch in der
SDS-PAGE einen deutlichen Einbau von [3H]-Putrescin in Gliadin, was belegt, daß Gliadin ein
exzellentes Substrat für die tTG darstellt.
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Abb., Abbildung
AK, Antikörper
APAAP, alkalische Phosphatase-Anti- Alkalische Phosphatase
BSA, Rinderserumalbumin
cm, Zentimeter
DMEM, Bulbecco's modifiziertes Eagle
Medium
EC, Enzymkommission
ELISA, Enzym-linked immunosorbent assay
EZM, Extrazelluläre Matrix
FKS, fötales Kälberserum
h, Stunde(n)
H2
AK, Antikörper
APAAP, alkalische Phosphatase-Anti- Alkalische Phosphatase
BSA, Rinderserumalbumin
cm, Zentimeter
DMEM, Bulbecco's modifiziertes Eagle
Medium
EC, Enzymkommission
ELISA, Enzym-linked immunosorbent assay
EZM, Extrazelluläre Matrix
FKS, fötales Kälberserum
h, Stunde(n)
H2
O2
, Wasserstoffperoxid
HLA, humane Lymphozyten-Antigene
IEL, intraepitheliale Lymphozyten
Ig, Immunglobulin
kDa, Kilodalton
M, molar
mA, Milliampere
MHC, Haupthistokompatibilitätskomplex
min, Minute(n)
mM, millimolar
Mr, relative molelculare Masse
µg, Mikrogramm
µl, Mikroliter
PAGE, Polyacrylamidgelelektrophorese
PBS, Phosphatpuffer
PLA2, Phospliolipase A2
PVDF, Polyvinylidendifluorid
s., siehe
SDS, Natriumdodecylsulfat
TCA, Trichloressigsäure
TGF, transformierender Wachstumsfaktor
Tris, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
tTG, Gewebe-Transglutaminase
u. a., unter anderem
z. B., zum Beispiel
z. T., zum Teil.
HLA, humane Lymphozyten-Antigene
IEL, intraepitheliale Lymphozyten
Ig, Immunglobulin
kDa, Kilodalton
M, molar
mA, Milliampere
MHC, Haupthistokompatibilitätskomplex
min, Minute(n)
mM, millimolar
Mr, relative molelculare Masse
µg, Mikrogramm
µl, Mikroliter
PAGE, Polyacrylamidgelelektrophorese
PBS, Phosphatpuffer
PLA2, Phospliolipase A2
PVDF, Polyvinylidendifluorid
s., siehe
SDS, Natriumdodecylsulfat
TCA, Trichloressigsäure
TGF, transformierender Wachstumsfaktor
Tris, Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
tTG, Gewebe-Transglutaminase
u. a., unter anderem
z. B., zum Beispiel
z. T., zum Teil.
Claims (8)
1. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern aus Körperflüssigkeiten durch eine
Immunreaktion mit Gewebe-Transglutaminase (tTG), deren immunreaktiven
Sequenzen oder Analoga.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß humane IgA-
und/oder IgG-Antikörper nachgewiesen werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die tTG
humanen, tierischen, rekombinanten oder synthetischen Ursprungs ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der
Nachweis in einem an sich bekannten Immunoassay durchgeführt wird,
vorzugsweise in einem ELISA.
5. Verwendung von tTG, deren immunreaktiven Sequenzen oder Analoga zur
Diagnose oder Therapiekontrolle von Erkrankungen, die mit einer
Immunreaktion gegen diese Substanzen einhergehen.
6. Verwendung gemäß Anspruch 5 zur Diagnose oder Therapiekontrolle von
chronisch entzündlichen oder Autoimmunerkrankungen.
7. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6 zur Diagnose oder
Therapiekontrolle der Sprue oder Zöliakie.
8. Verwendung von tTG, deren immunreaktiven Sequenzen oder Analoga zur
oralen Therapie von Erkrankungen, die mit einer Immunreaktion gegen diese
Substanzen einhergehen.
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IL128042A IL128042A (en) | 1996-07-18 | 1997-07-14 | Immunological process for detecting antibodies directed towards tissue transglutaminase (ttg), use of ttg for diagnostic purposes and therapy control, and oral pharmaceutical agent containing ttg |
AT97939994T ATE210296T1 (de) | 1996-07-18 | 1997-07-14 | Immunologisches nachweisverfahren von antikörpern,die gegen gewebe-transglutaminase (ttg) gerichtet sind, verwendung von ttg zur diagnose und therapiekontrolle sowie orales pharmazeutisches mittel enthaltend ttg |
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PT97939994T PT912898E (pt) | 1996-07-18 | 1997-07-14 | Metodo imunologico de deteccao de anticorpos dirigidos contra a transglutaminase (ttg) utilizacao de ttg para o diagnostico e controlo de terapia assim como agente farmaceutico oral contendo ttg |
HU0202779A HU228479B1 (en) | 1996-07-18 | 1997-07-14 | Immunological process for detecting antibodies directed towards tissue transglutaminase (ttg), use of ttg for diagnostic purposes and therapy control, and oral pharmaceutical agent containing ttg |
PL97331203A PL189091B1 (pl) | 1996-07-18 | 1997-07-14 | Sposób diagnozowania lub kontroli leczenia sprue lub celiakii, zastosowanie tTG sekwencji immunoreaktywnych lub ich analogów i doustny środek farmaceutyczny |
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BRPI9710500-7A BR9710500B1 (pt) | 1996-07-18 | 1997-07-14 | processo de detecção imunológico de anticorpos, que são dirigidos contra transglutaminase de tecido (ttg) para a diagnose e controle de terapia, bem como agente farmacêutico oral contendo ttg. |
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GR990300020T GR990300020T1 (en) | 1996-07-18 | 1999-01-01 | Immunological process for detecting antibodies directed towards tissue transglutaminase (ttg), use of ttg for diagnostic purposes and therapy control, and oral pharmaceutical agent containing ttg |
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HK99106049A HK1021025A1 (en) | 1996-07-18 | 1999-12-22 | Process for in vitro detecting the presence or absence of antibodies to anti-tissue transglutinase from body fluids. |
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DE19630557A Revoked DE19630557C2 (de) | 1995-07-18 | 1996-07-18 | Verfahren zum Nachweis von Antikörpern aus Körperflüssigkeiten durch eine Immunreaktion mit Gewebe-Transglutaminase (tTG) sowie die Verwendung von tTG in Diagnose und Therapie |
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DE59705683T Expired - Lifetime DE59705683D1 (de) | 1996-07-18 | 1997-07-14 | IMMUNOLOGISCHES NACHWEISVERFAHREN VON ANTIKÖRPERN, DIE GEGEN GEWEBE-TRANSGLUTAMINASE (tTG) GERICHTET SIND, VERWENDUNG VON tTG ZUR DIAGNOSE UND THERAPIEKONTROLLE SOWIE ORALES PHARMAZEUTISCHES MITTEL ENTHALTEND tTG |
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