DE102012007510A1

DE102012007510A1 - Verfahren zur Präsymptomatischen Diagnostik von Zöliakie und Glutensensitivität

Info

Publication number: DE102012007510A1
Application number: DE201210007510
Authority: DE
Inventors: Torsten Matthias; Sascha Pfeiffer; Kai Prager; Christian Meesters; Patricia Jeremias
Original assignee: Aesku Diagnostics & Co KG GmbH; Aeskudiagnostics & Co KG GmbH
Current assignee: Aeneas GmbH and Co KG
Priority date: 2012-04-17
Filing date: 2012-04-17
Publication date: 2013-10-17

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf die Verwendung einer immunologisch reaktiven mikrobiellen Transglutaminase oder deren immunologisch reaktive Teile oder Analoga, die in einem Komplex mit Gliadin oder dessen immunologisch reaktiven Teilen oder Analoga vorliegt, zur Diagnose und/oder Therapiekontrolle der Zöliakie oder Sprue, sowie einem Kit zur Bestimmung von Diagnose und/oder Therapiekontrolle der Zöliakie oder Sprue mittels des zuvor genannten Komplexes.

Description

Die Zöliakie, auch glutensensitive Enteropathie oder Sprue genannt, ist eine chronische Entzündung des Dünndarms mit oft ausgedehnter Zerstörung der Darmepithelzellen, was zu einem Malabsorptions-Syndrom und/oder immunologischen Begleiterkrankungen führen kann.
Die Entzündung wird hierbei, bei entsprechender genetischer Disposition, aufgrund einer Überempfindlichkeit gegen Gluten, ein Sammelbegriff für die in vielen Getreidearten vorhandenen sog. „Klebeeiweiße” aktiviert. Im Weizen wird das immunogene Prolamin (die alkohollösliche Fraktion) Gliadin genannt, homologe Prolamine sind auch in Roggen (Secaline), Gerste (Nordeine) und Hafer (Avenine) bekannt. Bei Menschen mit entsprechender Prädisposition können diese Peptidfragmente zu einer komplexen Reaktion der Darmschleimhaut und des Immunsystems führen.
Unter Gluten sind ebenso insbesondere Glutenderivate, Gliadin oder Gliadinhomologe Extrakte, nicht synthetisch erzeugte oder synthetisch Erzeugte Gliadinpeptide und chemische Derivate derselben unter ”Gliadinpeptid” zu versehen.
Bestimmte Gliadinpeptide oder homologe Prolaminpeptidfragmente werden von antigenpräsentierenden Zellen aufgenommen, prozessiert und auf HLA-Moleküle geladen oder binden direkt an HLA-Moleküle, hauptsächlich an HLA-DQ2 oder HLA-DQ8. Verstärkt wird diese Bindung dadurch, dass die in der häufig im Peptid vorhandene Aminosäure Glutamin desamidiert wird. Diese Desamidierung wird hauptsächlich durch das Enzym Gewebs-Transglutaminase (tTg), insbesondere durch die Gewebs-Transglutaminase 2 (tTg2) katalysiert. Daneben katalysiert das Enzym auch eine Transamidierung, durch die ein Vernetzen der Umgebungspeptide und Proteine induziert wird. Durch die Desamidierung von Gliadinpeptiden wird eine hochaffine Bindung zwischen dem Gliadinpeptid und zum Beispiel HLA-DQ2 garantiert.
Dieser Peptid-HLA-Komplex wiederum bindet nun an CD4+-T-Helferzellen, was wiederum zur Aktivierung der inflammatorischen Zytokin-Kaskade führt. Dadurch wird vermehrt die Produktion von verschiedenen entzündungsauslösenden Botenstoffen hervorgerufen, wie beispielsweise Interferon-gamma, TNF-alpha, Interleukin-6 und Interleukin-2.
Im Verlauf der Entzündung werden verschiedene Antikörper gebildet, welche zum Beispiel gegen Gliadin selbst (Gliadin-Antikörper) oder auch gegen die Gewebs-Transglutaminase (tTg-Antiköper) gerichtet sind. Letztlich endet der Entzündungsprozess in der Apoptose der Enterozyten (Saumzellen des Dünndarmepithels), was zu einem mehr oder weniger ausgeprägten Verlust von Dünndarmzotten (Zottenatrophie) führt. Dadurch ist die Dünndarmschleimhaut nicht mehr in der Lage genügend Nährstoffe vom Darm in die Blutbahn zu transferieren, wodurch es im Endeffekt zu einem Malabsorptions-Syndrom kommt.
Die Prävalenz (Anzahl der zum Untersuchungszeitpunkt Kranken/Anzahl der „betrachteten” Individuen) der Zöliakie oder einheimischen Sprue beträgt 1:100, neuere Studien gehen aber von einer Prävalenz von ca. 1:50 aus. Alles in allem tritt die Zöliakie oder einheimische Sprue mit einer Häufigkeit von 1% bis 3 innerhalb der kaukasischen Bevölkerungsgruppe auf.
Die Zöliakie hat zwei Manifestationsgipfel, einen im Säuglingsalter mit ca. 6 bis 18 Monaten, ein bis drei Monate nachdem Cerealien in die Ernährung mit aufgenommen wurden und einen zweiten Gipfel im Alter von ca. 30 bis 40 Jahren.
Die häufigsten Symptome der Zöliakie oder Sprue sind durch die Verdauungsstörung bedingte chronische Diarrhö, Eisenmangel mit oder ohne Anämie und Osteopenie. Bei betroffenen Kindern ist oft eine Gedeihstörung zu beobachten. Seltenere Symptome sind zum Beispiel chronische Müdigkeit, Nervosität, Osteoporose, Osteomalazie, Angststörungen, Depressionen, Muskelkrämpfe und sekundäre Laktose-Intoleranz. Des Weiteren können auch verschiedene Begleiterkrankungen auftreten, wie zum Beispiel ein selektiver IgA-Mangel, Dermatitis herpetiformis, Diabetes Typ I, und gastrointestinale Malignome.
Die Diagnose der Zöliakie oder Sprue wird bevorzugt oder üblicherweise mittels einer serologische Diagnostik und/oder mittels Histologie von Dünndarmbiopsien durchgeführt. Die serologische Diagnostik der Zöliakie oder Sprue wird üblicherweise auf das Vorhandensein von Antikörpern gegen ein Fremdantigen, wie beispielsweise Gliadin (anti-Gliadin-Antikörper) oder deamidiertes Gliadinpeptid (anti-DGP-Antikörper) und gegen Autoantigene des Endomysiums (anti-EMA-Antikörper), insbesondere jedoch gegen Gewebstransglutaminase 2 (anti-tTg2-Antikörper) oder einem Komplex aus Gewebstransglutaminase und Gliadin (anti-tTg/Gliadinpeptid-Komplex-Antikörper) getestet.
Autoantikörper gegen Endomysial-Antigene sind hochspezifisch und lassen sich bei über 90% der Patienten mit einer Zöliakie bzw. einheimischen Sprue nachweisen. Hierbei handelt es sich um einen indirekten Immunofluoreszenztest an Gewebsschnitten aus Affenösophagus. Die Anti-Endomysium-Konzentrationen spiegeln das histologische Erscheinungsbild wider: je höher die Antikörpertiter sind, desto ausgeprägter ist auch die Zottenatrophie. Jedoch ist der Anti-Endomysium-Nachweis mittels der Immunofluoreszenz-Technik nicht ohne erheblichen Aufwand durchführbar, da dieser Test besondere technische Fähigkeiten des Anwenders fordert, einen hohen Zeitbedarf benötigt und relativ rare biologische Material (Affenösophagusgewebe) beansprucht wird.
Der Nachweis von Antikörpern gegen Gliadin war historisch gesehen die erste Möglichkeit, um eine Zöliakie bzw. einheimische Sprue mithilfe eines Antikörper-Testverfahrens zu erkennen. Jedoch sind anti-Gliadin-Antikörper nicht spezifisch genug, um die einheimische Sprue in einem befriedigenden Maße zu detektieren. Die Detektionssensitivität konnte durch Auffinden der anti-deamidierten-Gliadinpeptid(DGP)-Antikörper verbessert werden. Nochmals konnte die Spezifität und Sensitivität der Detektion der einheimischen Sprue durch Auffinden der anti-Gewebs-Transglutaminase-Antikörper erhöht werden.
Bei serologischen Diagnostik der Zöliakie werden üblicherweise Anti-Endomysialen Antikörpern nachgewiesen.
Ein zentrales Element der Zöliakie-Diagnostik war und ist zum Teil heute immer noch eine histologische Untersuchung einer Dünndarmbiopsie, wobei das histopathologische Spektrum dabei von einer minimalen Vermehrung intraepithelialer Lymphozyten bis zur vollständigen Zottenatrophie reichen kann. Dabei sind charakteristische histopathologische Elemente: Vermehrung intraepithelialer Lymphozyten sowie Vermehrung der Lymphozyten und Plasmazellen in der Lamina propria, häufig vermischt mit Eosinophilen; verminderte Zottenlänge, Vertiefung der Krypten; verminderte Zotten: Krypten-Relation (Normal > 4–5:1); erhöhte Mitosenzahl; abnorme Enterocyten (kuboide anstatt zylindrische Zellen, Verlust der basalen Kern-Polarität, Verlust des Bürstensaums).
Das histologische Grading wird üblicherweise nach der von Marsh vorgeschlagenen Klassifikation vorgenommen. Tabelle : Einteilung der Marsh Kriterien [A. Vècsei et al. 2011, p. 6]

Typ Krypten Zotten

0 normal normal

1 normal normal

2 hyperplastisch normal

3a hyperplastisch leicht verkürzt

3b hyperplastisch stark verkürzt

3c hyperplastisch fehlen ganz
Aufgrund der Diagnose von Symptomen, histologischen Befunden und serologischen Befunden, sowie genetischen und klinischen Informationen lässt sich die Zöliakie oder einheimische Sprue in verschiedene klinische Untergruppen unterteilen. Diese reichen von der sogenannten „silent Sprue” über die „latente Sprue” bis hin zur manifesten oder klassischen Sprue
Eine frühzeitige Diagnose der Zöliakie oder einheimischen Sprue ist für den Krankheitsverlauf von entscheidender Bedeutung. Dadurch, dass mit einer gesicherten und rechtzeitigen Diagnose die Erkrankung durch konsequente Einhaltung einer Gluten freien Diät in Remission gehalten werden kann und die Risiken von Begleit- und/oder Folgekrankheiten, wie zum Beispiel das erhöhte Malignom-Risiko, verhindert werden kann.
Es ist deshalb von größtem Interesse, geeignete Nachweistests für die Zöliakie oder einheimische Sprue zu entwickeln. Für einen schnellen, leicht durchführbaren und preiswerten Test kommen vor allen Dingen serologische Diagnostik-Verfahren in Betracht.
Die EP 0 912 898 B1 lehrt zum Beispiel ein immunologisches Nachweisverfahren von Antikörpern, die gegen Gewebe-Transglutaminase (tTg) gerichtet sind. Bei diesem Diagnose-Verfahren werden Antikörper gegen Gewebe-Transglutaminase aus Körperflüssigkeiten durch eine Immunreaktion mit Gewebe-Transglutaminase nachgewiesen, wobei die Immunreaktion nicht mit einem Gewebeschnitt eines tierischen oder menschlichen Gewebes durchgeführt wird.
Außerdem sind Testverfahren bekannt, welche Antikörper detektieren können, die gegen einen Komplex aus Gewebetransglutaminase und Gliadinpeptiden gerichtet sind. Solche Testverfahren werden zum Beispiel von der Firma AESKU.Diagnostics angeboten. Es hat sich gezeigt, dass mit diesen Testverfahren eine Antikörperbildung, welche noch vor allen anderen Tests aus dem Stand der Technik auftritt, nachgewiesen werden kann.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Nachweis für Antikörper gegen körperfremde Stoffe im Sinne des erfindungsgemäß verwendeten Komplexes aus mikrobieller Transglutaminase (mTg) und Gliadin bereitzustellen, welcher in der Lage ist vor Entstehung von Autoantikörpern und somit, präsymptomatisch, vor Entwicklung der Zöliakie oder Sprue zur Diagnose oder Therapiekontrolle der Zöliakie bzw. Sprue oder allgemeinen Gluten Unverträglichkeiten zu ermöglichen.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass zur Diagnose und/oder Therapiekontrolle der Zöliakie oder Sprue mindestens ein funktioneller, immunologisch reaktiven Komplexe aus mikrobieller Transglutaminase oder deren immunologisch reaktiven Teile und Gliadin oder dessen immunologisch reaktiven Teilen verwendet wird.
Überraschenderweise wurde nämlich gefunden, dass bereits in einem frühen Stadium der Erkrankung Antikörper aufzufinden sind welche an einen Komplex gebildet aus mikrobieller Transglutaminase und Gliadin binden. Dies ist umso überraschender da die mikrobielle Transglutaminase eine völlig andere Sequenz aufweist als die humane Gewebstransglutaminase (tTg).
Analog zur Funktion der Gewebstransglutaminase wird auch bei der Generierung des erfindungsgemäß verwendeten Komplexes davon ausgegangen, dass das Verhältnis von De- zu Transamidierung 4:1 beträgt und der erfindungsgemäß verwendete Komplex nicht zwangsläufig eine mit der Transglutaminase kovalent komplexierte Molekülspezies aufweist.
Analog zum Komplex aus tTg2 und Gliadinpeptiden wird auch beim erfindungsgemäß verwendeten Komplex davon ausgegangen, dass die Verteilung der vernetzten Gliadinpeptide und dem Enzym stochastisch erfolgt, welches durch die Lichtstreu-Messungen belegt ist. Diese Komplexe beinhalten die mikrobielle Transglutaminase und zeigen immunologische Aktivität auf, die geeignet ist in Kompetitionstests die Epitope aus tTg2 mit Gliadinpeptiden abzufangen. Belegt wird dies durch Kompetitionstests, welcher mit verschiedener Patientenseren durchgeführt wurden (vgl. 5).
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf Antikörper, die an den erfindungsgemäß verwendeten Komplex aus mikrobieller Transglutaminase und Gliadinpeptiden oder an immunologisch aktive Teile dieses Komplexes binden. Antikörper im Sinne der Erfindung umfassen sowohl polyklonale und/oder monoklonale Antikörper und/oder Aptamere. Unter einem Antikörper wird dabei ein Protein verstanden welches eine oder mehrere spezifische Antigenbindungsstellen aufweist. Der Fachmann ist ohne unzumutbaren Aufwand in der Lage, einen Antikörper zu generieren, welcher spezifisch an den erfindungsgemäß verwendeten Komplex aus mikrobieller Transglutaminase und Gliadinpeptiden oder an immunologisch aktive Teile dieses Komplexes bindet. Die entsprechenden Techniken und Herangehensweisen sind dem Fachmann aus täglicher Laborpraxis bekannt. Die erfindungsgemäßen Antikörper können z. B. auch dadurch generiert werden, dass die im Serum von Zöliakie- oder Sprue Patienten vorhandenen Antikörper mittels eines erfindungsgemäß verwendeten Komplexes isoliert, gereinigt und damit zugänglich gemacht werden. Dazu kann z. B. der erfindungsgemäß verwendete Komplex an einen Träger gekoppelt vorliegen, der beladene Träger wird dann mit Zöliakie- oder Sprue Patientenserum in Kontakt gebracht. Unspezifisch gebundene Bestandteile des Serums werden entfernt und die spezifisch an den erfindungsgemäß verwendeten Komplex gebundenen Antikörper werden daraufhin eluiert.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine Verwendung des Komplexs aus mikrobieller Transglutaminase oder und Gliadin oder deren immunologisch aktive Teile zum in vitro Nachweis von Antikörpern welche an diesen Komplex binden. Die erfindungsgemäße Verwendung zeichnet sich dadurch aus, dass:

1. ein erfindungsgemäße verwendeter Komplex mit einer Probe in vitro in Kontakt gebracht wird; und
2. dass an den erfindungsgemäß verwendeten Komplex gebundene Antikörper nachgewiesen werden.

Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird unter dem Begriff ”in vitro” jede Umgebung verstanden, die nicht innerhalb eines ganzen Organismus, beispielsweise eines menschlichen oder tierischen Körpers liegt.
Unter einer Probe wird eine zu untersuchende Zusammensetzung verstanden. Bevorzugt handelt es sich bei der Probe um biologisches oder medizinisches Material, also Material, dass von einem Organismus, von Bestandteilen eines Organismus oder von Zellen gewonnen wird. Das Material kann, bevor es als Probe im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, weiteren Behandlungsschritten unterzogen werden, z. B. um das Material in einen Zustand zu versetzten, in dem es sich als Probe für das Verfahren besonders eignet. Besonders bevorzugt handelt es sich bei der Probe um Material, das aus einer Körperflüssigkeit gewonnen wurde oder aus einer Körperflüssigkeit besteht. Bevorzugte Körperflüssigkeiten sind Blut, Plasma, Serum, Lymphe, Synovialflüssigkeit, Urin, Stuhl, Interstitialflüssigkeit, Speichel, Schweiß, Spinalflüssigkeit, Muttermilch und/oder Tränenflüssigkeit Besonders bevorzugt sind solche Körperflüssigkeiten in denen Antikörper in hoher Konzentration zu finden sind.
Bei der erfindungsgemäßen Verwendung wird ein erfindungsgemäße verwendeter Komplex mit einer zu untersuchenden Probe in vitro in Kontakt gebracht. Der Schritt des Inkontaktbringens dient dazu, dass ggf. in der Probe enthaltene Antikörper die Möglichkeit haben an ein Epitop des erfindungsgemäß verwendeten Komplexs zu binden. Dazu wird dieser Schritt unter Bedingungen und in einer Umgebung durchgeführt, die eine spezifische Antigen-Antikörper-Bindung erlauben. Dem Fachmann sind geeignete Bedingungen bekannt. Bevorzugt umfassen diese Bedingungen eine flüssige Umgebung (optional auch feste Trägermaterialien) und/oder das Inkontaktbringen bei einer Temperatur von > 0°C bis < 60°C. Das Inkontaktbringen wird bevorzugt über einen Zeitraum durchgeführt, der eine Ausbildung einer spezifischen Antigen-Antikörper-Bindung zwischen dem erfindungsgemäß verwendeten Komplex und ggf. in der Probe enthaltenem für den Komplex aus mikrobieller Transglutaminase und Gliadin oder deren immunologisch aktiven Teilen spezifischen Antikörper erlaubt.
In einem nachfolgenden Schritt der erfindungsgemäßen Verwendung wird der Antikörper nachgewiesen, der an den Komplex aus mikrobieller Transglutaminase und Gliadinpeptiden oder deren immunologisch aktiven Teilen spezifisch gebunden ist. Der Nachweis des spezifisch an den erfindungsgemäß verwendeten Komplex gebundenen Antikörpers kann beispielsweise dadurch erfolgen, dass nach dem Inkontaktbringen, nicht an den Komplex aus mikrobieller Transglutaminase und Gliadin oder deren immunologisch aktiven Teilen dieses Komplexes gebundene Bestandteile der Probe entfernt werden, z. B. durch einen oder mehrere Wasch-, Reinigungs- oder Isolierungsschritte, und anschließend Mittel eingesetzt werden, die den spezifischen Nachweis von Antikörpern erlauben. Dabei kann der Nachweis in einem oder in mehreren Schritten erfolgen. Bei diesen Mitteln zum spezifischen Nachweis von Antikörpern kann es sich beispielsweise selbst um Antikörper handeln. Der Nachweis kann dann z. B. durch eine Farbreaktion erfolgen, die direkt oder indirekt durch die Mittel zum Nachweis von Antikörpern vermittelt oder ausgelöst wird. Beispielsweise können Antikörper zum Nachweis von spezifischen Antikörpern an funktionale Gruppen oder Moleküle gebunden sein (z. B. Enzyme), die in der Lage sind unter bestimmten Bedingungen eine Farbreaktion auszulösen oder zu vermitteln.
Bei einer erfindungsgemäßen Verwendung kann der Komplex aus mikrobieller Transglutaminase und Gliadin oder deren immunologisch aktiven Teilen während einem, mehrerer oder aller Schritte der Verwendung an einen Träger immobilisiert vorliegen. Unter Immobilisierung wird hierbei jede Kopplung, Bindung oder anderweitige Assoziierung zwischen Komplex und Träger verstanden, die dazu führt, dass Komplex und Träger nicht getrennt voneinander bewegt werden können. Als Träger können beispielsweise Moleküle und/oder Oberflächen eingesetzt werden, die derart ausgestaltet sind, dass sie mit dem Komplex reversibel oder irreversibel verbindbar sind. Dazu können Träger und/oder erfindungsgemäß verwendete Gliadine und/oder erfindungsgemäße verwendete Komplexe funktionale Gruppen aufweisen, die eine Verbindung zwischen Gliadinen und/oder erfindungsgemäß verwendetem Komplex und Träger unterstützen und/oder ermöglichen. Beispielhaft seien als Träger Moleküle erwähnt, wie BSA oder Oberflächen, wie sie von Mikropartikeln, Nanopartikeln oder magnetischen Beads angeboten werden oder Oberflächen von ausgewählten Membranen, Polymeren (z. B. Polystyren) oder solche Oberflächen umfassende Mikrotiterplatten oder Teststreifen. Dem Fachmann sind geeignete Träger und Möglichkeiten zur Verbindung von Proteinkomplexen und Trägern bekannt.
Insbesondere kann das erfindungsgemäße Verfahren als Immunassay-Verfahren durchgeführt werden, geeignete Immunassay-Verfahren sind beschrieben in „Labor und Diagnose", S. 756 ff. (ISBN 3980521567)
Bevorzugt kann das erfindungsgemäße Verfahren als ELISA-Verfahren (ELISA = enzyme-linked immunosorbent assay,) durchgeführt werden, geeignete ELISA-Techniken sind beispielsweise beschrieben in „Labor und Diagnose", S. 1470 ff. (ISBN 3980521567). Dazu kann eine Probe mit einem an einen Träger immobilisierten erfindungsgemäß verwendeten Komplex in Kontakt gebracht werden, ggf. werden ungebundene Bestandteile teilweise oder im Wesentlichen entfernt, anschließend wird zum Nachweis von an dem erfindungsgemäß verwendeten Komplex gebundenem Probenantikörper ein an eine funktionale Gruppe gekoppelter oder koppelbarer Antikörper verwendet. Der Nachweis erfolgt in der Regel über eine optisch nachweisbare Reaktion.
Der Antikörper zum Nachweis kann beispielsweise spezifisch sein für Antikörper eines bestimmten Organismus oder eines bestimmten Ursprungs und/oder für eine bestimmte Form des Antikörpers, bevorzugt für einen bestimmten Isotyps z. B. Antikörper vom Typ IgA, IgM, IgE und/oder IgG, ganz besonders bevorzugt für humane IgA, IgM, IgE und/oder humane IgG.
Die erfindungsgemäße Verwendung kann aber auch in anderen Formaten durchgeführt werden, so z. B. als RIA (radio-immuno-assay) als Immunoassay (z. B. sog. Lineblots oder ELISAs) oder in flüssigkeitsbasierten Verfahren wie HTRF (homogenous time resolved fluorescence). Die erfindungsgemäße Verwendung kann auch in sogenannten Multiplexassays (Assays mit anderen Biomarkern) in den genannten technischen Verfahren kombiniert eingesetzt werden.
Die vorliegende Verwendung eignet sich zum Nachweis von Antikörpern gegen einen erfindungsgemäß verwendeten Komplex, insbesondere zum Nachweis von Antikörpern vom Typ IgA, IgG, IgM und/oder IgE bevorzugt zum Nachweis von Antikörpern humanen Ursprungs.
Die erfindungsgemäße Verwendung kann zur Diagnose, insbesondere zur serologischen Diagnose, bevorzugt zur Diagnose von Zöliakie und/oder einheimischer Sprue und/oder tropischer Sprue und/oder frühzeitigen Detektion von allgemeinen Gluten Unverträglichkeiten und/oder Dermatitis herpetiformis verwendet werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst auch einen Kit zur Bestimmung von Diagnose und/oder Therapiekontrolle der Zöliakie oder Sprue. Wobei der Kit eine mikrobielle Transglutaminase oder deren immunologisch reaktive Teile oder Analoga, welche in einem Komplex mit Gliadin oder dessen immunologisch reaktiven Teilen oder Analoga vorliegt umfasst. Zusätzlich kann der Kit eine Anweisung zur Verwendung des Kits und/oder zur Durchführung der mit dem Kit durchführbaren erfindungsgemäßen Verwendung enthalten.
Bevorzugt ist der Kit als ELISA oder insbesondere als Streifentest ausgeführt. Das heißt, der erfindungsgemäß verwendete Kit umfasst den erfindungsgemäße verwendeten Komplex und ggf. weitere Bestandteile zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verwendung in einer Form, die sich zur Durchführung im ELISA- und/oder Streifentestformat eignet. Insbesondere kann der Kit den erfindungsgemäß verwendeten Komplex gekoppelt an einen Teststreifen umfassen.
Der erfindungsgemäß verwendete Kit kann ggf. weitere Bestandteile zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verwendung enthalten. Solche Bestandteile können beispielsweise Reaktionsgefässe, Filter, Lösungen, proteinmodifizierende Enzyme und/oder andere Mittel umfassen. Insbesondere kann der erfindungsgemäße Kit Mittel zum Nachweis von Antikörpern enthalten, bevorzugt von humanen Antikörpern des IgA-, IgM-, IgE- und/oder des IgG-Typs.
Insbesondere eignet sich der erfindungsgemäß verwendete Kit zur Verwendung in der Diagnose, bevorzugt in der serologischen Diagnose, ganz besonders bevorzugt in der Diagnose von Zöliakie, Sprue, Dermatitis herpetiformis und/oder Glutensensitivität.
Der erfindungsgemäß verwendete Kit kann ggf. weitere Mittel zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verwendung und/oder zur Einteilung der Zöliakie oder Sprue in spezifische Untergruppen (s. o., z. B. Silent, latent oder etablierte Zöliakie) enthalten. Solche Mittel können beispielsweise tTg-Antikörper, tTg/Gliadinpeptid-Komplex-Antikörper, DGP-Antikörper, Gliadin-Antikörper usw. umfassen
Es zeigen
1 zeigt ein paarweises Alignment der Aminosäuresequenzen von mikrobieller Transglutamase (mTG) aus Streptomyces mobaraensis und von humaner Gewebs-Transglutamase 2 (TG2) unter Verwendung des „strecher”-Algorithmus. Der Sequenzvergleich wurde mittels des im Internet frei zugänglichen „pairwise alignment tool” EMBOSS (von EMBL-EBI) durchgeführt.
2 zeigt ein paarweises Alignment der Aminosäuresequenzen von mikrobieller Transglutamase (mTG) aus Streptomyces mobaraensis und von humaner Gewebstransglutamase 2 (TG2) unter Verwendung des „needle”-Algorithmus. Der Sequenzvergleich wurde mittels des im Internet frei zugänglichen „pairwise alignment tool” EMBOSS (von EMBL-EBI) durchgeführt.
3 zeigt in Form eines Diagramms die Ergebnisse eines Kompetitionstests von Serum 1011 (IgA), wobei die Absorption in Abhängigkeit der Konzentration der Kompetitoren dargestellt ist. Die einzelnen Kompetitoren sind der Legende des Diagrames zu entnehmen.
4 zeigt in Form eines Diagramms die Ergebnisse eines Kompetitionstests von Serum 1038 (IgA), wobei die Absorption in Abhängigkeit der Konzentration der Kompetitoren dargestellt ist. Die einzelnen Kompetitoren sind der Legende des Diagrames zu entnehmen.
5 zeigt in Form eines Diagramms die Ergebnisse eines Kompetitionstests von Serum 1011 (IgG), wobei die Absorption in Abhängigkeit der Konzentration der Kompetitoren dargestellt ist. Die einzelnen Kompetitoren sind der Legende des Diagrames zu entnehmen.
6 zeigt in Form eines Diagramms die Ergebnisse eines Kompetitionstests von Serum 1038 (IgG), wobei die Absorption in Abhängigkeit der Konzentration der Kompetitoren dargestellt ist. Die einzelnen Kompetitoren sind der Legende des Diagrames zu entnehmen.
7 zeigt in Form eines Diagramms die Ergebnisse einer Messsungen über AF4/SEC MALS zur Bildung von Komplexen aus Gliadin und mikrobieller Transglutaminase, wobei die sog. „rayleight”-Ratio in Abhängigkeit der Zeit dargestellt ist. Die einzelnen Komponenten der Messung sind der Legende des Diagrames zu entnehmen.
8 zeigt in Form eines Diagramms die Ergebnisse einer Messsungen über AF4/SEC MALS zur Bildung von Komplexen aus Gliadin und mikrobieller Transglutaminase, wobei die die molare Masse in g/mol in Abhängigkeit der Zeit dargestellt ist. Die einzelnen Komponenten der Messung sind der Legende des Diagrammes zu entnehmen.
9 zeigt in Form eines Diagramms die Ergebnisse einer Messsungen über AF4/SEC MALS zur Bildung von Komplexen aus Gliadin und Gewebe-Transglutaminase, wobei die sog. „rayleight”-Ratio in Abhängigkeit der Zeit dargestellt ist. Die einzelnen Komponenten der Messung sind der Legende des Diagrammes zu entnehmen.
10 zeigt in Form eines Diagramms die Ergebnisse einer Messsungen über AF4/SEC MALS zur Bildung von Komplexen aus Gliadin und Gewebe-Transglutaminase, wobei die die molare Masse in g/mol in Abhängigkeit der Zeit dargestellt ist. Die einzelnen Komponenten der Messung sind der Legende des Diagrammes zu entnehmen.
11 zeigt eine schematische Einteilung verschiedener Detektionsstadien der Zöliakie oder Spure. Grundlage ist hierbei das zeitlich verschiedene (erst)auftreten verschiedener Diagnose-Antikörper.
12 zeigt: -log(P-Werte) des Wilcoxon-Mann-Whitney-Tests zur Überprüfung der vermuteten Abfolge des Antikörperauftretens.
Beispiele
Aminosäurensequenzalignments
Es soll gezeigt werden, dass die die mikrobiellen Transglutaminase (mTG) von Streptomyces mobaraensis und der humanen Gewebstransglutaminase (TG2) nur geringe Ähnlichkeit auf der Sequenzebene haben.
Zu diesem Zweck wurden die in der Datenbank, Uniprot (http://www.uniprot.org), vorhandenen Sequenzen Q5UCB5 (mTG) und P21980 (TG2) verglichen. Es wurde ein Sequenzvergleich mittels des im Internet vorhandenen „pairwise alignment tool” EMBOSS (von EMBL-EBI; http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/) durchgeführt. Es wurden die Algorithmen „needle” bzw. „strecher” verwendet.
Wie aus 1 bzw. 2 ersichtlich ist, besteht nahezu keine Homologie zwischen den verwendeten Sequenzen, unabhängig davon welcher Algorithmus verwendet wird. Das paarweise Alignment zwischen mikrobieller Transglutaminase von Streptomyces mobaraensis und humaner Gewebe-Transglutaminase besitzt, bei Verwendung des „stretcher”-Algorithmus nur eine Ähnlichkeit von 23,6% und eine Identität von 14,3% und bei Verwendung des „needle”-Algorithmus lediglich eine Ähnlichkeit von 15,3% und eine Identität von 9,2%.
Kompetitionstests
In Kompetitionsversuchen wird getestet, ob ein Zusammenhang zwischen dem gebildeten Komplex der humanen Gewebe-Transglutaminase mit Gliadin und dem erfindungsgemäß verwendeten Komplex besteht. Hierzu werden Patientenseren, die Antikörper gegen den Komplex aus Gewebe-Transglutaminase und Gliadin enthalten mit den Einzelkomponenten, sowie dem gebildeten erfindungsgemäßen Komplex aus mikrobieller Transglutaminase und Gliadin vermischt und auf eine mit dem Komplex aus Gewebe-Transglutaminase und Gliadin beschichteten Mikrotiterplatte gegeben. Über die Intensität einer Farbreaktion lässt sich nun ermitteln, wie stark jede Komponente zum Testergebnis beiträgt, also welcher reaktive Anteil der Antikörper an die jeweiligen Komponenten bindet. Wenn die Antikörper nicht nur an den Komplex aus humaner Gewebe-Transglutaminase und Gliadin, sondern auch an die anderen Kompetitoren binden, werden diese Antikörper weggefangen (und können somit nicht mehr an die Mikrotiterplatte binden) und die Farbreaktion fällt im Vergleich zum Referenzwert niedriger aus. Um einen Referenzwert zu erhalten, wird das Patientenserum direkt auf die mit dem Komplex aus humaner Gewebe-Transglutaminase und Gliadin beschichtete Platte gegeben.
Zur Durchführung des Kompetitionstests wurde ein AESKUKLISA tTg New Generation Kit der Firma AESKU.Diagnostics verwendet, welcher für eine separate quantitative und qualitative Bestimmung von IgA und/oder IgG Antikörpern, gerichtet gegen einen Komplex aus Gewebe-Transglutaminase und Gliadin, in humanen Seren geeignet ist.
Konzentrationen der Einzelkomponenten:
Die Komponenten mTG, DGP, tTG sowie Gliadin wurden in den Konzentrationen 0; 0,125; 0,25; 0,5; 0,75 sowie 1,0 μg/ml eingesetzt (Doppelbestimmung der jeweiligen Konzentration wurde durchgeführt).
Das Serum wurde jeweils mit dem jeweiligen Kompetitor inkubiert und anschließend im Standard ELISA nach Angaben des Herstellers gemessen.
Verwendete Seren:
Es wurden die Zöliakieseren mit der Serumnummer 1011, 1020, 1038 sowie 1045 verwendet.
Die Seren 1011 sowie 1038 wurden 1:10 mit einem Blutspenderserum vorverdünnt und schließlich nochmal 1:100 mit Probenpuffer.
Das Maß der Kompetition wurde bei jedem Serum im Vergleich zum Referenzwert berechnet. Der Referenzwert wurde auf 100% gesetzt und Diagramme mit Hilfe von Microsoft Office Excel erstellt.
Ergebnisse des Kompetitionstests IgA bzw. IgG:
Es ist zu erkennen, dass Antikörper durch die einzelnen Komponenten abgefangen werden vgl. Seren 1011 sowie 1038 (3 bzw. 4 für IgA und 5 bzw. 6 für IgG). In allen vier Fällen hat die Zugabe der Komponenten DGP, Gliadin sowie mTg kaum Einfluss auf die Farbintensität der Reaktion, sodass davon ausgegangen werden kann, dass die Antikörper in den Patientenseren ausschließlich gegen den erfindungsgemäß verwendeten Komplex gerichtet sind.
Messsungen zur Bildung von Komplexen über AF4/SEC MALS
Die jeweiligen Komplexe wurde über eine Größenausschlußchromatographie(SEC)-Säule oder Assymmetrische Fluss Feld Fluss Fraktionierung aufgetrennt und über Vielwinkellichtstreuung (Multi Angle Light Scattering – MALS) analysiert.
Über die Messung mittel MALS ist ein Vergleich der in einer Probe enthaltenen Massenverteilung möglich. Mit Hilfe des Massenvergleiches der MALS soll der Umsatz der Einzelkomponenten Gliadin mit der jeweiligen Transglutaminase (mTg oder tTg) zu einem Komplex nachgewiesen werden.
Zugabe von mTg führt zu deutlich höhren Massen im Vergleih zu Gliadin ohne mTg
ELISA Analyse von Zöliakie-Patientenseren
Die verwendeten Zöliakie Seren (N=82) sowie 33 Kontrollseren (Blutspender) wurden auf die folgenden AESKU Kits sowie auf selbst beschichtete Platten getestet.
Die Seren wurden auf IgA sowie auf IgG Antikörper gegen die einzelnen Komponenten oder Komplexe getestet.
AESKU Kits:

• AESKULISA Glia
• AESKULISA DGP
• AESKULISA tTg
• AESKULISA tTg New Generation

Selbst beschichtete Platten:

• Mikrobielle Transgluatminase
• Gliadin in Wasser
• Gliadin mit mikrobieller Transglutaminase
• Aufgereinigter mTg – Gliadin Komplex

Die Ergebnisse der ELISA sind in der Tabelle 1 zusammengefasst. Die Konzentration der Proteinlösungen wurde mittels der OD bei 280 nm bestimmt (Annahme: 1 OD = 1 μg/ml).

Marker	AUC	Sensitivität	Spezifität
AESKULISA tTg-G New Generation	0.95 +/– 0.02	0.87 +/– 0.04	0.93 +/– 0.03
AESKULISA GliaG	0.671 +/– 0.042	0.65 +/– 0.06	0.89 +/– 0.04
mTg-GP-Komplex-IgG	0.89 +/– 0.03	0.91 +/– 0.03	1.00 +/– 0.00
tTg-IgG ELISA	0.81 +/– 0.04	0.6 +/– 0.06	0.94 +/– 0.03
mTg-IgG ELISA	nicht bestimmbar
AESKULISA DGP IgG	0.73 +/– 0.04	0.58 +/– 0.06	0.79 +/– 0.05
AESKULISA tTg-A New Generation	0.95 +/– 0.02	0.89 +/– 0.04	0.93 +/– 0.03
AESKULISA Glia A	0.77 +/– 0.04	0.67 +/– 0.06	0.81 +/– 0.04
mTg-Complex-IgA	0.90 +/– 0.03	0.69 +/– 0.054	1.00 +/– 0.00
tTg-IgA ELISA	0.87 +/– 0.03	0.62 +/– 0.06	1.00 +/– 0.00
mTg-IgA ELISA	nicht bestimmbar
AESKULISA DGP IgA	0.68 +/– 0.04	0.41 +/– 0.06	0.96 +/– 0.02

Tabelle 1: Auszüge der ROC-Analyse.

Da für mTg-ELISAs keine Transformation in andere Einheiten möglich ist (nicht etablierte Tests) basieren diese Analyse auf den optischen Dichten der Assays, wobei das Sensitivitäts-/Spezifitätsverhältnis so optimiert wurde, dass ihre Summe maximal ist (sog. Youden-Index).
Aufgrund des Auswahl-Bias werden diese Werte von denen einer klinischen Studie abweichen.
Wie die Tabelle 1 belegt, verhalten sich die mTg-Komplex-ELISAs anders als die anderen Parameter und auch anders als die tTG-Gliadin-Komplex-ELISAs. Anzumerken ist, dass eine Unterscheidung über die Antikörper gegen die reine mTg nicht möglich ist. Zu beachten ist, dass die tTG2-Gliadin-Komplex-ELISAs zwar signifikant besser abschneiden, als die mTg-Gliadin-Komplex-ELISAs, diese aber wiederrum besser als die übrigen ELISAs – obwohl die Patienten kaum auf die mTg direkt ansprechen. Wie bereits ausgeführt, ist daher von einer Epitopähnlichkeit zwischen tTG2-Gliadin-Komplexen und mTg-Gliadin-Komplexen auszugehen – jedoch nicht zwingend einer Epitopgleichheit.
Stellt der erfindungsgemäß verwendete Komplex das erste immunopotente Epitop für eine Zöliakieneuerkrankung, so kann molekulare Epitopmimikrie dazu führen, dass das Patientenimmunsystem in der Folge Antikörper gegen körpereigene Gewebs-Transglutaminase im Komplex mit Gliadin und in der weiteren Folge – als Konsequenz sekundärer molekularer Epitopmimikrie – gegen Epitope, die sich auch der Gewebs-Transglutaminase, Gliadin, Gliadinpeptiden oder deamidierten Derivaten (DGPs = Deamidierte Gliadinpeptide) rekrutieren. Zöliakiepatienten scheinen nicht zu jedem Zeitpunkt ihren Antikörpertiter gegen bestimmte Epitope zubilden, sondern es scheinen sich transiente Übergänge von einem der geschilderten Epitope zu bilden was durchaus unter Beibehaltung von ”Resttitern” den Krankheitsverlauf kennzeichnet, insbesondere auch, da eine glutenfreie Diät zu einem geringerem Titer der etablierten Antikörper führen kann.
Um diesen Sachverhalt nachzuweisen wurde an einem vorhandenen Serenpanel (75 unabhängige Zöliakiepatientenserumproben verschiedener Nationalitäten) ein multipler Wilcoxon-Mann-Whitney-Test (auch U-Test) als Rangsummentest durchgeführt und die erhaltenen P-Werte als Maß für die die Unterschiede der Rangverteilung gezeigt. Hierbei wird der P-Wert – analog zum sog. Manhattan Plot – logarithmiert und im Vorzeichen invertiert (je ausgeprägter der Rangsummenunterschied der Parameterpaare, desto höher der Balken), wobei der horizontale Balken dem Bonferronisignifikanzschwellenwert, als möglichst konservative Korrektur für multiples Testen, entspricht.
Gemäß dem oben beschriebenen Sachverhalt ist davon auszugehen, dass analoge Epitop-Paare (z. B. Anti-Gliadin-Antikörper vs. DGP-Antikörper oder Anti-mTgase-Gliadinpeptidkomplex-Antikörper vs. Anti-humane-Gewebstransglutaminase-Komplex-Antikörper) gleichförmigere Rangsummen (kleinere P-Wertbalken) aufweisen als Epitope, deren Titerhöhe mit dem Erkrankungsverlauf korrelieren werden (z. B. Anti-mTgase-Gliadinpeptidkomplex-Antikörper vs. Anti-Gliadin-Antikörper).
Durch Detektion dieser Antikörper könnten auch Zöliakie- oder Sprue Patienten identifiziert werden, die mit einem oder mehreren anderen serologischen Diagnosetests für Zöliakie oder Sprue nicht erkannt werden. Dadurch lassen sich mit der erfindungsgemäßen Verwendung auch solche Patienten identifizieren, welche zuvor als falsch-negativ eingestuft wurden. Dies betrifft in unserem Panel von 75 zöliakiepositiven Seren insgesamt 8 Seren beim Anti-tTg-Gliadinkomplex-Antikörpertest, 25 Seren beim Anti-Gliadin-Antikörpertest, 44 Seren beim Anti-DGP-Antikörpertest und 28 Seren beim Anti-tTg-Antikörpertest bzgl. der IgA-Antikörper. Die damit zu schließende diagnostische Lücke ist somit hoch signifikant (P-Wert von 7,4·10e–8 bei einem Cochran-Armitage-Trendtest auf den Trend des erfindungsgemäß verwendeten Komplexes). Mit Einführung des im Antrags angesprochenen Kits kann die geschlossene Lücke noch vergrößert werden, da das betrachtete Serenpanel einem Auswahlbias unterliegt, der zu ohnehin positiv befundeten Patienten neigt.
Das Auffinden des erfindungsgemäß verwendeten Komplexes ist umso überraschender, da zwischen mikrobieller Transglutaminase und Gewebstransglutaminase nahezu keine Homologie vorhanden ist.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

EP 0912898 B1 [0019]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

„Labor und Diagnose”, S. 756 ff. (ISBN 3980521567) [0033]
„Labor und Diagnose”, S. 1470 ff. (ISBN 3980521567) [0034]
http://www.uniprot.org [0058]
http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/ [0058]

Claims

Verwendung einer immunologisch reaktiven Transglutaminase zur Diagnose und/oder Therapiekontrolle der Zöliakie oder Sprue, dadurch gekennzeichnet, dass die Transglutaminase eine mikrobielle Transglutaminase oder deren immunologisch reaktive Teile oder Analoga ist, die in einem Komplex mit Gliadin oder dessen immunologisch reaktiven Teilen oder Analoga vorliegt.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der immunologisch reaktive Komplex eine Transglutaminase oder deren immunologisch reaktive Teile oder Analoga eine Aminosäuresequenz mit der SEQ. ID. Nr. 1 aufweist und/oder das Gliadin oder dessen immunologische reaktive Teile oder Analoga eine Aminosäuresequenz mit der SEQ. ID. Nr. 2 aufweist.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass in einer Körperflüssigkeit Antikörper zur Diagnose und/oder Therapiekontrolle der Zöliakie oder Sprue durch eine Immunreaktion nachgewiesen werden.
Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass humane IgA-, IgG-, IgM- oder IgE-Antikörper nachgewiesen werden.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis in einem an sich bekannten Immunoassay durchgeführt wird, vorzugsweise einem ELISA, RIA oder Fluoreszenzimmunoassay.
Verwendung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis an einer festen oder in einer flüssigen Phase durchgeführt wird.
Kit zur Bestimmung von Diagnose und/oder Therapiekontrolle der Zöliakie oder Sprue enthaltend eine mikrobielle Transglutaminase oder deren immunologisch reaktive Teile oder Analoga, welche in einem Komplex mit Gliadin oder dessen immunologisch reaktiven Teilen oder Analoga vorliegt.
Kit nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit zusätzliche Mittel zum Nachweis von Antikörpern des IgA- und/oder des IgG-Typs und/oder des IgM-Typs und/oder des IgE-Typs enthält.
Kit nach einem der Ansprüche 7 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit zusätzliche Mittel zur Einteilung der Zöliakie und/oder Sprue in verschiedene Untergruppen der Krankheit enthält.
Kit nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit zusätzlich isolierte monoglonale und/oder polyglonale und/oder rekombinante Antikörper, welche spezifisch an eine mikrobielle Transglutaminase oder deren immunologisch reaktiven Teile oder Analoga, welche in einem Komplex mit Gliadin oder dessen immunologisch reaktiven Teilen oder Analoga vorliegt, enthält.