HU228479B1 - Immunological process for detecting antibodies directed towards tissue transglutaminase (ttg), use of ttg for diagnostic purposes and therapy control, and oral pharmaceutical agent containing ttg - Google Patents

Description

Képviselő:

Danubi a

Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.

S u d a © e s t

Immunológiai eljárás szöveti feranszglutamináz. CfcTG} elleni antitestek kimutatására, tTG alkalmazása diagnosztikai célokra ás terápiás ellenőrzésre, valamint tTG-t tartalmazó orális gyógyászati hatóanyag

A találmány tárgyát eljárások képezik ellenanyagok testfölyadékokban történő kimutatására, szöveti transzglutamínázzai („tissue fcransglutaminase; tTG;, annak antigén sajátságú struktúráival, iwwtreaktiv szekvenciáival vagy analógjaival, valamint tTG-tartabmú vegyületekkel, azok antigén sajátságú struktúráival, imm.unrea.ktlv szekvenciáival vagy analógjaival adott imaunreakció alapjánUgyancsak a találmány tárgyát képezi tTG és a fent említett vegyületek alkalmazása betegségek diagnózisára és a terápia hatásosságának ellenőrzésére; előnyösen, krónikus gyulladásos betegségek vagy autoimmun betegségek diagnózisára és terápiájuk hatásosságának ellenőrzésére; előnyösebben, „sprue'^z vagy „eoeiiakia diagnózisára és terápiája hatásosságának ellenőrzésére. A találmány tárgyát képezik továbbá, szájon át adagolható gyógyászati hatóanyagok, amelyek aktív hatóanyagként tTG-t, t?G-tartalmú vegyűleteket, azok antigén sajátságú struktúráit, immunreakt.lv szekvenciáit vagy analógjait tartalmaznak, és alkalmazhatók a fenti

Akt a számunk: 8 9213-5S'7 /PÁ

vegyületskkel szemben irányuló immunr©akcióval járó betegségek kezelésére, ezáltal, hogy a fent esti 1 tett vegyüietek szájon át történő adagolásával ismumtoleranciát váltunk ki.

Az eljárások alkalmazhatók tiG-vei, tTG-tartainú vegyüietekkel azok antigén sajátságú struktúráival, immunreaktív szekvenciáival vagy analógjaival szentben irányuló immunreakciőval kapcsolatos betegségek diagnózisára és/vagy terápiájuk hatásosságának ellenőrzésére.

A találmány alapját az a felismerés képezi, hogy a szöveti transzglutamináz (tTG; EC 2.3.2.13) tölti be az autoantigén szerepét sprue vagy coeii&kía betegségekben.

A fenti felismerés alapján fejlesztettük ki a találmány szerinti immunológiai eljárást, amely alkalmas tTG-vel és tTG-tartalmú vegyüietekkel szembeni ellenanyagok kimutatá,Sá.X£t „

A coeliakia a vékonybél nyálkahártyájának betegsége, amelynek első tünetei főként a késői csecsemőkorban és a tipegő korban jelentkeznek, Amennyiben a megfelelő klinikai kép nem jelentkezik a felnőtt kort megelőzően, a betegséget „nem-trópusi sorúénak nevezzük. Mindkét kifejezés tehát ugyanarra a betegségre vonatkozik. A. spruet a nyálkahártya iásos elváltozása kiséri., aminek következménye általános maiabszorbció (felszívódási zavar), Az esetek többségében, gluténmentes diéta alkalmazásán alapuló kezelésre a morfológiai és klinikai tünetek javulnak.

Jól ismert kóroki faktorok a búza, árpa, rozs - és bizonyos mértékben a zab -glutánjei; míg alacsonyabb fokú filogenetikai rokonságban levő növényfajták, például a kuko« X » rica, rizs és szója glu térijei nea váltanak ki betegséget. .Az említett giutének kézül/ a kóroki szerepet az alkoholban oldódó prolamlnoknak, közelebbről, &z a-gliadinnak tulajdonitják.

A fenti okokból/ a sprue elsősorban olyan országokban fordul elő, ahol a búza fő élelmiszer-alapanyagként szerepel {például Európa/ U..S.A., Ausztrália) , a betegség előfordulási aránya az újszülöttek között például Dániában 0/14/1 000/ Spanyolországban 0/7/1 000/ Olaszországban 1/1 000, Németországban 0,45/1 000, és Svédországban

Újabb vizsgálatok azonban azt mutatták, hogy a betegség nyilvánvaló klinikai tünetekkel nem járó formája - azaz, a nyálkahártya morfológiai elváltozása, súlyosabb tünetek jelentkezése nélkül - sokkal gyakoribb, mint korábban, azt hittük. Sgy 1994-ben Olaszországban végzett vizsgálat szerint, iskolás gyermekek közt a betegség előfordulási aránya 3,20/1 Oööt A latens sprue kockázata a sprusban szenvedő betegek legközelebbi rokonaiban eléri az '50 §-ot.

Az elsősorban latens formában jelentkező spruet gyakran polimorf dermatózis azaz, Dermutitis neoy:e ti formás kiséri, amelynek jellemző tünete a bor papiliacsúcsaiban található, granuláris IgA-lerakódást tartalmazó kis méretű, bőr alatti hólyagok jelenléte. A vékonybél bíopsziája szabálytalan, többé-kevésbé súlyosan károsodott nyálkahártyát mutat.

/ x fi - .

Jói megalapozott kapcsolat mutatható ki továbbá a sprue és az inzulinfüggő üiabefes méláitas, a pajzsmirigy betegségei és a szelektív IgA-hiány közt.

A spruet kisérő számos klinikai tüneten, például, anémián (vérszegénységen; felül, amely - többek között - .a B12~vitamin felszívódási zavarára, valamint a fokozott vérzékenység! hajlamot eredményező E~vitsmi.n hiányra vezethető vissza, fontos megemlíteni a betegséggel kapcsolatosat kimutatható jelentősen megnövekedett kockázatot gasztrointesztinális (gyomor-bélrendszerií malignus tumorok kialakulására ,

A sorúéban szenvedő betegek akár 15 %-ánái, többnyire 50 éves kor felett, tumoros betegség alakul ki; ezek 50 %--& bél ϊ-sejtes limfóma, további 25 % pedig a nyelőcsövet, száj-garat üreget és vékonybelet érintő tumor.

A sprua kezelése életre szőlő gluténmentes diéta szigorú betartásán alapul, amelyben nem csak a búzából készült glutántartalmú termékektől kell tartózkodni, hanem a rozsból, árpából és zabból készült termékeket is el kell kerülni. A beteg számára ez szigorú megszorításokat jelent mind az étkezési szokások, mind a társadalmi érintkezés tekintetében.

Amennyiben a spruet időben diagnosztizálják ás annak kezelését Időben megkezdik, a betegség jő prognózisé. Az egyszer már jelentkezett komplikációk azonban gyakran nem fordíthatók vissza teljes mértekben. A fentiekkel szemben, ha a betegséget nem ismerik fel, és az kezeletlen marad, a felszívódási zavar következtében súlyos tünetek léphetnek fel.. Végül, számolnunk kall bél eredetű limfómák és más gyomor-bél rendszeri daganatos elváltozások kialakulásának fokozott kockázatával.

Jelenleg, a vékonybél biopsziás vizsgálata képezi a sprue diagnózisának és - a gluténmentes diéta betartása mellett - a betegség atánkövefcésének legmagasabb színtű elismert módszerét, bár egyre nagyobb jelentőséget kapnak immunológiai .markerek kimutatásán alapuló nem-invazív diagnosztikai eljárások is. Mivel sorúéban szenvedő betegek szérumában olyan, IgA- és IgG-osztáiyba tartozó ellenanyagok mutathatók ki.,, amelyek egyrészt, glíadinnal szemben irányulnak, másrészt, az endomizium („endomysium; kollagén és elasztikus elemeket, is tartalmazó kötőszövet! sövényrendszer) valamely autoantigénjével reagálnak, amely utóbbi speciális kötőszövet, amely többek között, I., 111. és V. kollagéneket, elasztikus rostokat, nem-kollagén természetű proteineket, például fibronekfint és protsoglíkánokat tartalmaz -, a beteg szérumát ELISA-el járással glíadinnal szemben irányuló IgG- és IgA-ellenanyagok jelenlétére, indirekt immunfiuoreszenciás eljárással pedig endomiziummal szemben irányuló IgG- és IgA-ellenanyagok jelenlétére tesztelhetjük. Míg a glíadinnal szemben irányuló ellenanyagok nem elég specifikusak sprue betegségre, az endomiziummal szemben irányuló IgA-ellenanyagok. kimutatását nagy fokú érzékenység és specifitás (97-100 %; jellemzi. Az immunfluoreszcens vizsgálathoz azonban főemlőstől nyert nyelőcsőmetszetre van szükség. Jelenleg, kísérletek folynak «φ» endomi ziummai szembeni ellenanyagok köldökzeinör-szövatsn történő kimutatáséra is,

As korai diagnózissal és a diéta szigorú betartásával a betegség tünetmentes állapotban tartható, és a betegeknél fennálló fokozott kockázat malignus tumorok kialakulására ugyancsak a normális szintre csökkenthető. Nagy az érdeklődés tehát sprue kimutatására alkalmas eljárások kifejlesztésére. Mivel a sprue latens formájában szenvedő betegek is a magas kockázati csoportba tartozónak tekintendők, valamennyi érintett egyént (különösen a betegek legközelebbi hozzátartozóit), és végső soron - amint azt Olaszországban mérlegelik - valamennyi iskolás korú gyermeket vizsgálnunk kellene egy érzékeny, specifikus, könnyen kivitelezhető és alacsony költséggel járó vizsgálati eljárással.

Eddig azonban, a nagy populációk vizsgálatára kiterjedő szűrési programok kudarcot vallottak, a következő problémák következtébeni

Az invazív duódénális biopszia tünetmentes egyéneknél ésszerűtlen beavatkozás, és különösen költséges.

A gliadinnal szemben Irányuló ellenanyagok kimutatására szolgáló E.LISA-eijárások alkalmazhatósága megkérdőjelezhető, azok nem kielégítő speclfitása miatt.

Az IgA-osztályú ellenanyagok kimutatására alkalmas immunfiuoreszcens eljárások, amelyek főemlős nyelőcsőszdvet alkalmazását teszik szükségessé, általános szűrővizsgálat céljára túlságosan költségesek. Ezen felül, értékelésük szubjektív, és nem. teszik lehetővé az IgA-híányos spruebetegek (azaz, a betegek 2 %~ának: azonosítását.

_χ φν ♦♦ ♦ ** **:* ϊ, **** « · * ♦ * ' . * «.«. «« ·* *♦ *»*

Eddig tehát sprue/co-eliakia. betegség kimutatására és megfelelő terápia hatásosságának ellenőrzésére slkaIáé nem-invazív, specifikus, kvantitatív, gyors, könnyen és ol csőn kivitelezhető kimutatási eliárás nem állt 3 z o -r .o ·<

Est a problémát kívántuk megoldani, Azon meglepő eredmény alapján, hogy a szöveti transzglutasdnáz ítTG;

né

3,2.13} tölti he az autóantigén szerepét sorúé betegségben, a csatolt 1--6. igénypontok szerinti immunológiai eljárásokat fejlesztettünk ki, melyek alkalmasak t'TG és tTG-tartalmű vegyületekkei szemben irányuló ellenanyagok kimutatására testfolyadékokban, különösen szérumban, amely eljárás nem csupán sprue vagy coelíakia diagnózisát teszi lehetővé, hanem valamennyi, tlG-vel vagy tTG-tartalmú vegyúlettei, azok antigén, sajátságé, struktúráival, immunreak.trv szekvenciáival vagy analógjaival szemben irányuló immunreakcióval járó betegségét is,

A szöveti transzgiutamináz a transzgiutaminázok {TG} családjába tartozik, A TG-k ·{£€ 2.3.2.13} Ca^-függo, aciltranszfert katalizáló enzimek; az általuk katalizált reakciókban peptidköcésöen lévő giutaminok γ-karboxamídcsoportja.í szolgálnak acil-donorokként. Acii-akceptorokként, elsősorban proteinkötésben, lévő Iizinek szarepeinek, igy a transzfer e- íy-giutamil} lizln-kötést eredményez. A TG-k szuhsztrátspecifitása acildonorok vonatkozásában igán szigorú (függ az aminosav-szekvenczátői} , míg a lehetséges akceptorok köre kivételesen tág. A képződő kovalens pept lekötések nagy mértékben stabilak és proteáz-rezisztensek, és φ < φ ♦.**♦ * φ a keresztköté-st tartalmazó proteinek vegyszerekkel, onzimatikus vagy fizikai behatásokkal szembeni megnövekedett el1 en á 11 ó k ép e s s é g é h e z- ve -se t ne k,

Továbbá, a különböző TG-k széles körű előfordulása különböző szervekben, szövetekben, plazmában és szövet közti folyadékokban, összefüggést mutat a transzglutamináz által módosított proteinek előfordulásával varaivadékokban, sejtmembránokon, a hám szarurétegében, hajban, körmökben és az extracelluláris mátrixban*

Az ismert transzgiutamlnázck megkülönböztethetők fizikai sajátságaik, a test különböző helyein történő kimutathatóságuk és elsődleges- struktúrájuk alapján.

A szöveti TG-t (tTG-t)· celiuláris, erítrocita, endotheliálís, -citoplazmáris, máj vagy 11. típusú TG-nek is nevezik, és az '“5-8 5 kSa molekula tömegű monomer.

A protein 587 amino savból, álló teljes amino sav-szekvenciáját cBMS alapján határozták meg, A proteínsze.kvencia vonatkozásában, 84 %-os homológia mutatható ki a humán enzim és az egér makrofágakból nyert megfelelő enzim, közt; és 81 %-os homolögia mutatható ki a humán enzim és a megfelelő tangerimalac enzim közt, A fenti fajokban előforduló nukleo-tídszubsztitűciők gyakran nem befolyásolják az aminosavsze'kvenciát. Az aktív centrum nagy mértékben konzervált, é-s jelentős proteinszskvaneis-homolagiát mutat a három említett. faj esetében (azaz, az 51 amínosavből 43 azonos), továbbá, nagy fokú homológiát mutat (75 %; a XIII. faktor aalegységév-el.

► X * ♦x$ **♦ * * nem mu- 9 A proteinben sziynálpeptld 'vagy glíkozílezödés tathato ki, és annak ellenére, hogy abban több -cisztein aminosav található, diszulíid-hidakak nincsenek jelen. Fluoreszcens hibridizációs' eljárás szerint, a humán. szöveti transzglutamináz gén a 2€-gi2-k.romossómarégióban található. Bár az enzímfelszabadulás mechanizmusa nem világos, egyértelmű. bizonyítékok támasztják, alá, hogy a tTG,· általános intracelluláris elterjedtsége, ellenére, fontos szerepet tölt be az extraceiluláris mátrixban (SCM-ben). Ezen felül> az intracelluláris Ga·²’-koncentráció fiziológiás körülmények mellett valószerűtlen, hogy elérje a tTG aktivitásához szükséges szintet, míg az extraceiluláris térben elegendően magas Ca²’ -koncentráció mutatható ki.

Több vizsgálat kapcsolatot mutatott ki a tTG és a fibronektln ECM-protein közt. A fibronektínen felül, a nidogén, az N~terminális prokollagén ITT., peptid, az V. és XI. kollagének, az oazteonektln - amely egy mi.krofibriilnmasszociált glikoprotein magas molekuiatömegű dermatánszulfát proteogllkán és a galektin-3 lektin ECM-molekulák is a tTG specifikus szubsztrátjálként azonosíthatók.

Továbbá, a tTG sefogyőgyulásban betöltött lényeges szerepére utalnak azok az iiamunfluo-reszcens vizsgálatok, amelyeket tenyésztett WlSS-sejteken (tüdő embrionális íihroblasztokon) végeztek, amely sejtek esetében, normális körülmények mellett nem mutatható ki extraceiluláris tTGaktivitás, de mesterségesen előidézett sérülés esetében az enzim extraceliulárisan is kimutathatővá válik. Az enzim feltehetően passzív felszabadulását a sérült sejtekből, ν *» * »:♦ Φ Φ X , φφ·» « φ φ * « * ν* *··

Φ '«· X » * > ·*·$ φφ kezdetben nem-kovalens, kötés kialakulása követi az enzim é.s az ECM, közelebbről, az azt alkotó .fibronektin és fibr.iiláris kollagének közt, miáltal az enzim néhány órára katalitikusán. aktívvá válik. ?atkánymodeiiben - hasonlóképp, sérülés mesterséges úton történő létrehozását követően 5 napon át fokozott tlG-aktivitás volt kimutatható. Továbbá, amennyiben humán eritrocita lizátúmokat plazmával inkubáltünk, azt találtuk, hogy a felszabaduló tTG erős affinitást mutat fibronektinhez, Valamennyi adat arra utal, hogy tTG ECM-hez történő kötődése központi szerepet játszik a sebgyógyulás korai fázisában, közelebbről, az a XIII. faktorral együtt hozzájárul a fibrin stabilizálásához, ügy, hogy keresztkötéseket képez az extraceiluláris proteinek közt, miáltal védőréteg és stabil adheziv szubsztrát képződik a sérült sejtek körül. Eddig, nem sikerült gerincesekben kimutatni olyan enzimet, amely képes lenne a proteinek tTG •által katalizált, különlegesen stabil keresztkötéseit hasítani .

Azon felismerés alapján, hogy a tTG szerepei autó-antigénként sprue betegségben, a találmány tárgyát képezi tTG, tTG-tartaimű vegyüietek, azok antigén sajátságé. struktúráinak, immunreaktív szekvenciáinak vagy analógjainak alkalmazása a fenti vegyületekkel szemben irányuló immunr«akcióval járó betegségek diagnózisára és terápiájuk hatásosságának ellenőrzésére. Közelebbről, a találmány szerinti eljárásokkal diagnosztizálhatók például a felsorolt betegségek; akut gyulladásos betegségek, például tüdőgyulladás, giomerulonephrifcis, virushepatitiso krónikus gyulladásos betegségek, «

például Crobn-betegség, Coihtis uicerosa; autoimmun betegségek, például autoimmun hepatitis, Sjoegren-szindrőma, Wegener-granulomatbzis, reumatold artritisz, idiopátiás szerviibrózisok, például tüdőtibrósis. A találmány szerinti kimutatási eljárás különösen előnyösen alkalmazható sprue diagnózisára és terápiája hatásosságának ellenőrzésére. Mivel. az eljárás gyorsan és költségkímélő módon kivitelezhető, lehetővé teszi a populáció hatékony szűrését tTGellenenyagok j e1enlétére,

A találmány szerinti eljárásban tTG-ként alkalmazhatunk állati, szintetikus vagy rekombináns eredetű tTG-t; ugyanez érvényes tTG-tartaimú vegyüietekrs, amelyek ezen felül, lehetnek vegyes eredetűek (például tartalmazhatnak állati tTG-t szintetikus pepiiddel összekapcsolva'· - A leírásban t^:TG~ tartalmú vegyületeken tTG proteinekkel alkotott kémiai vegyüieteit vagy azok analógjait értjük. A leírásban. tTG-analőgoknak vagy a tTG-tartaimű vegyületek anionjainak nevezünk valamennyi olyan antigén sajátságú struktúrát, amely tTG-vel vagy tTG-tartaimú vegyülettel szembeni ellenanyagokkal ímmunreakcióba lép, ilyenek lehetnek például szintetikus peptidek, Immunreaktív szekvenciákon tTG vagy tTG-tartaimú vegyületek proteolizis, szintézis vagy géntechnológiai beavatkozás révén létrejött fragmentumait, valamint azok aminosav-szabszfcítűciővai létrehozott variánsait értjük,

A találmány szerinti immunológiai kimutatási eljárást jói ismert módszerek szerint végezzük, A betegben jelen lévő ellenanyagok kimutatására tehát bármely direkt (például * *

X * Φ « φ > * Φ* szenzor „chip alkalmazásán, alapuló) vagy indirekt módszer alkalmazható.

A dire.kt eljárások szerint, az ellenanyagok antigénhez ••történő kötődését megváltozott kémiai vagy fizikai sajátságok alapján mutatjuk ki, úgy, hogy jelölt kötődő vegyület kimutatását magában foglaló további lépésekre nincs szükség .

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a tTG-ellenanyagokat immunvizsgálati eljárással, előnyösen, szilárd fázisú immunvizsgálatí eljárással mutatjuk ki, úgy, hogy a reagáló-anyagot, közvetlen vagy közvetett mődon, könnyen, kimutatható·· jelölő vegyülettel kapcsoljuk össze. Előnyösebben, a kimutatást ELISA, RXA vagy immunfiuoreszcens módszerrel mutatjuk ki. Ilyen kimutatási eljárásokban alkalmazott módszerek szakember számára jói ismertek.

SbISA-el járásban például,· az antigént - esetünkben tTG-t - közvetlenül vagy közvetett módon hordozóhoz, például polisztírénhez kötjük. A kimutatandó ellenanyaggal történő ínkübáiást követően, az antigénhez kötődött ellenanyagokat - például beteg szérumában található ellenanyagokat közvetlen vagy közvetett módszerrel mutatjuk ki, enzimhez kötött anyagok alkalmasásával. Ilyen anyagokként alkalmazhatunk ellenanyagokat, ellenanyag-fragmentumokat vagy nagy affinitású ligandumokat, például biotin jelölőanyaghoz kötődő avidint. Enzimekként alkalmazhatunk például peroxidázt, .al kai ikus 'foszfátért,· β-galáktozidást, ureázt vagy glükóz oxidázt. A kötődött enzimek, ezáltal a kötődött t?Gφφ ♦ * * * ♦ Φ * φ * *

Α Φ Φ φ » ellenanyagok mennyiségét például kromogén szubsztrát hozzáadásával határozhatjuk meg.

Radioimmunvizsgálatí eljárásokban, az antigént - például cTG-t - az előbbiekhez hasonló módon, közvetlenül vagy közvetett módon hordozóhoz, például polisztIrénhez kötjük, A kimutatandó ellenanyaggal történő inkufeálást követően, az antigénhez kötődött ellenanyagokat - például beteg szérumában található ellenanyagokat radioaktív jelölést, például ’l-izotópot hordozó anyagok alkalmazásával mutatjuk ki. Ilyen anyagokként alkalmazhatunk, ellenanyagokat, al lenanyag-fragmentumokat, nagy affinitású ligandumokat, például biotin jsiölőanyaghoz kötődő avidint, A kötődött radioaktivitás mértékét megfelelő mérőkészülékkel határozhatjuk meg<

Immunfluoreszcens vizsgálati eljárások alkalmazásakor, az antigénhez kötődött ellenanyagok mennyiségét a. fentiekkel azonos elv alapján határozzuk meg, fluoreszcens jelőlclőanyagot, például fInoreszcein-izotiocianátot ÍEXTGj hordozó anyagok alkalmazásával. Ilyen anyagokként alkalmazhatunk ellenanyagokat, ellenanyag-fragmentumokat, nagy affinitásé ligandumokat, például biotin jelölőanyaghoz kötődő avidint. A kötődött fluoreszcens festék mennyiségét ezután megfelelő mérőkészülékkel határozzuk, meg,

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a betegben található- ellenanyagokat agglutinációs eljárással vagy géldiffúziós eljárással mutatjuk ki. Ezek az módszerek, szakember számára jól ismertek., Géldif fúziós eljárás szerint, az antigént vagy ellenanyagot tartalmazó oldatot például agar vagy agsrőzlemez egymáshoz közei eső mélyüléseibe ♦ ♦ ♦ mérjük. Esetünkben, antigén oldatként alkalmazhatunk például tTG-oldatot; -ellenanyag oldatként pedig például vésszérumot. Amint az anyagok kidiffundáinak a mélyületékből, koncentráci-őgradiens jön létre, -amelynek centrumát a megfelelő mérvűiét képezi. Amennyiben a gélben az átfedő antigén és ellenanyag koncentrációk aránya meghatározott értéket ér el, ás as ellenanyag oldat az antigénnel szemben irányúié ellenanyagokat tartalmaz, precipit-átum képződik a gélben.

Az agglutinációs eljárások szerint, valamely antigsn(példáu.l t?G~) hordozó részecskék, például latén vagy poiisztirén részecskék közt keresztkötéseket hozunk létre ellenanyagok, például szérumból származó ellenanyagok alkalmazásával. A képződő aggregátumokat például turbídimetriával mutathatjuk ki.

A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint, a sprueban szenvedő betegek szérumában található ellenanyagokat IgA-specifikus vagy IgG-speciflkus ELISA alkalmazásával mutatjuk ki. Azt találtuk, hogy a sorúéban szenvedő betegek szérumában, található IgA-ellenanyagok kimutatására alkalmas, t.TG alapú, újonnan kifejlesztett SLI-SA-el j ár ás nagy érzékenységének és magas specifi kásának köszönhetőén, kitünően alkalmazható sprue diagnózisára és a betegség kezelése hatásosságának ellenőrzésére. Ez a kezelt betegek utánköve-tése alapján is nyilvánvaló { a kezelés során a ti tér csökkenése figyelhető meg) . A találmány .szerinti eljárással kapott ELISA-eredmények és egy harmadik személy által végzett immunfluoreszcens értékelés (antiendomizium IgA-ellenanyagok. kimutatása) adatainak összehaφφ

Φ * Λ « Λ « * ♦ Φ < Φ *χχ »*« > φφ» χ « Φ X φ ♦ φ Φ* ♦* >χ* sonlítása szerint/ a két vizsgálat jó egyezést sutát. Eltérések elsősorban alacsony eílenanyagfcitereknéi fordultak elő, amelyek azonban az indirekt immunfluoreszcenciás módszer alkalmazásából következnek, amelyet jelenleg az első számú választandó eljárásnak tartanak. Az eltérések többek között - a szubjektív értékelésből, és a korábbi módszerrel kapcsolatosan, előforduló nem-specifikus reakciókból adódnak.

Egyéb ellenanyag osztályba tartozó ellenanyagok, például IgG-ellenanyagok kimutatásán alapuló megfelelő eljárások alkalmasak IgA-def.íciens sprue betegek azonosítására, valamint tTG-vel. szeriben irányuló immunreakciőval járó egyéb betegségek vizsgálatára.

A találmány szerinti kimutatási eljárás további előnye származik abból, ha a tesztrendszerben tisztított tengerimalac tTG-t, humán tTG-t, proteollzissel vagy géntechnológiai eljárásokkal, nyert szekvenciákat vagy analógokat, vagy szintetikus úton előállított immunogén tTG-peptideket alkalmazunk. tTG-vei szemben, irányuló immunreakcióval járó egyéb betegségek diagnózisára és u.tánkővetésére alkalmas ELI SA-el jár ást ismertetünk a 3.3 példában.

A. találmány tárgyát képezi továbbá, a 9. igénypont szerinti, szájon át adagolható gyógyászati hatóanyag fcTGvei, fcTG-tartalmú vegyületekkel, azok antigén sajátságé .struktúráival, imunraaktív szekvenciáival vagy analógjaival szemben irányuló immunre&kelővai járó betegségek kezelésére.. A szájon, át történő adagolásra alkalmas hatóanyagokat előnyösen, tabletta vagy kapszula formájában állítjuk

slő, és .azok alkalmazásával orális toleranciát váltunk ki, tTG, tTG-tartalmű vegyüietek, azok antigén sajátságú struktúrái, immunreaktiv szekvenciái vagy analógjai adagolásán, keresztül. Egyrészt, az autoantigén szájon át történd adagolásával orális· toleranciát érünk el; másrészt, ágy nevezett „hystandör^?/ hatást váltunk ki, azaz, .amennyiben a betegséget okozó autoantigén nem ismert, egyes esetekben terápiás hatású lehet a célszervben az immunrendszerrel érintkező egyéb antigén szájon át történő adagolása. Ez az antigén képes helyben, az antigén-specifikus szupresszor Tsejtek stimulálására, ezáltal, a szisztémás immunválasz elnyomására. Kizárólag' magasabb antigén dózisok alkalmazása esetén, az autoreaktiv T-sejtek energiája váltható ki.

Orális tolerancia kiváltása a megfelelő módszer különböző autoimmun betegségek kezelésére.

A találmány szerinti gyógyászati hatóanyagokat előnyösen, sprue kezelésére, alkalmazzuk, de azok alkalmazhatók más krónikus gyulladásos bélbetegségek és autoimmun hepatitis· kezelésére is.

A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a tTG-t, t'TG-tartalmú vegyületeket, azok antigén sajátságú struktúráit, immunreaktiv szekvenciáit vagy analógjait 0,01-100 mg/testtőmeg-kg dózisban adagoljuk.

A találmány szerinti gyógyászati hatóanyagok - adott esetben tartalmazhatnak gyógyászatllag elfogadható adjavánsokat, például a gyógyszergyártásban szokásosan alkalmazott töltőanyagokat, sikosítő anyagokat, a készítmény szétesését elősegítő anyagokat, kötőanyagokat vagy a hatóanyag

7 felszabadulását elősegítő anyagokat. A gyógyászatilag -elfogadható adjuváns aránya a választott aktív hatóanyagtól függően széles határok kört változhat, és az általában 0,1--20 tömeg-á közt var,

Közelebbről, a találmány előnyösen, sorté diagnózisára és terápiája hatásosságának ellenőrzésére szolgáló kimutatási eljárásra vonatkozik, amely eljárás nem-invazív., nagy fokban, specifikus, és közvetlenül a betegséggel kapcsolatos vegyület kimutatására irányul. Az általunk kifejlesztett eljárás előnye, hogy az gyorsan, könnyen és költségkímélő módon kivitelezhető, valamint különböző laboratóriumokban standardizálható. A vizsgálati eljárás tehát lehetővé teszi a populáció hatékony szűrését, tTG-vsi szemben irányuló ellenanyagok jelenlétére.

A vizsgálati eredmények objektív voltának köszönhetően, az eredmények mennyiségi, meghat árazásának lehetősége as eljárást fölébe helyezi ez immunfluoreszcens értékelésnek, amely szubjektív elemeket hordoz magában. Ezen felül, az immunfluoreszcens értékelést, különösen alacsony titerek esetén, gátolja a vizsgálattal kapcsolatban megfigyelhető nem-specifikus reakciók jelentkezése. Amennyiben a tesztrendszerben a specifikus autoantigént alkalmazzuk, a főemlősök nyslőesőmetszetsín vagy köldökzsinór-metszeteken immunfluoreszcens eljárással megfigyelhető nem-specifikus reakciók a lehető legnagyobb mértékben kiküszöbölhetők.

Mivel a vizsgálati eljárás xgA-osztályú ellenanyagok vagy egyéb osztályba tartozó ellenanyagok esetében egyaránt alkalmazható, azzal az IcA-deficíens sprue betegek is azoο ·*'-»

IS nosithatok, A tTG-vel 52exsb-en irányuló ellenanyagokon alapuló kimutatási eljárás ugyancsak alkalmas tTG-vsl szemben irányuló ímmunrea ke lóval járó egyéb betegségek azonosítási-xa, vizsgálatára, és terápiájuk hatásosságának ellenőrzéséMiután a tTG-t a sprueban szereplő autoantigénként azonosítottuk/ azt alkalmazhatjuk teljes egész formájában; vagy alkalmazhatjuk annak immunreaktív epitöpjaic (annak proteol.izi.ssel vagy géntechnológiai eljárásokkal nyert szekvenciáit, analógjait vagy szintetikus peptidjélt) sprue szájon át történő (orális; terápiájára; vagy tTG-vei szemben irányuló immunreakciőval járó egyéb betegségek terápiájára ,

A találmány szerinti megoldást az alábbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk, .2.. példa

Az autoantigén izolálása és jellemzése

1.1, immuntluoreszoens eljárás, ArAAr-festés (AffAAű: alkallkus foszfatáz antl- a.1 kall'kus foszfatáz)

A festést különböző sejtvonsiakon végeztük el, amelyeket előzőleg 2 percig, -20 C-on, 100 % metanolban fixáltunk.

Az immunfluoreszcens kimutatási eljárás szerint, a készítményeket sorúéban szenvedő betegből származó szérummal vagy kontroli szérummal Inkubáltuk, mostuk, majd TRITG1.9 » * * V * « * * «.

χ* W* V** jelölt, nyálban termelt anti~humán-IgA ellenanyag alkalmazásával kimutatást végeztünk [S-chuppan és mtsai-: J. Bioi. Chem. 265 8823 (1990)j .

Az APAAF--· jelölést azután végeztük, hogy a sejteket a sprue-szérumokkal inkubáltuk, ezután, azokat mostuk, végül az APAAP-komplexeket kimutattuk {Cordell J.L, és mtsai.: J. Histochem. Cytochem. 32, 219 (1984)].

A fenti vizsgálatban, ullöSO-sejtek (humán fibroszarköma sejtek), WT3S-sajtek (humán tüdő embrionális fibroblasztok), Hep-1- és BspG2-sajtek (hepatokarcinóma sejtek) esetében, betegszérum alkalmazása mellett egyértelműen pozitív citoplazmafestődés volt megfigyelhető, mig normál szérumok alkalmazása, vagy humán IgA-val. történő előkezelés esetén nem volt jelölőués kimutatható. Humán fityma fibroblasztok, humán rabdomlo szar kóma (PD), Xto és Morris patkány hepatőma, és kutya MPCK-sejtek alkalmazásakor csupán igen gyenge vagy negatív reakciót tapasztaltunk.

1.2. Metábolikus sejt jelölés, és az antigén immunprecipitációja

Az autó-antigén jellemzését és izolálását HTlOSO-sejtek alkalmazásával végeztük.

A sejteket L-alanil-L-glutamint, 10 % fötális borjúszérumot („fetal caif serua, FCS, Gibco), 100 eg'ység/mi penicillint és 100 pg/ml streptomycint (Sézomed) tartalmazó Dulbecco-féle módosított Eagie-tápfolyadékban CDMEM, Gibco) tenyésztettük, 37 °C-on, 3 % CO₂~ atmoszférában. A metábolikus jelöléshez a sejteket S cm átmérőjű tenyésztő edényekbe vittük át, majd azután, hogy **« *

.mintegy 90 %-ban összefüggő tenyészet alakult ki, a sejteket metionin- és FCS-msntas tápfoiyadékban tartottuk, majd ezt a tápfolyadékot 3 mi, 'S-metionint (0,2 mCi; •£xprs⁵'^aS”'⁵S, HSN-Dupont) tartalmazó FCS-me.ntes tápfolvadékkal helyettesítettük. Miután a sejteket 16-20 órán át a •fenti tápfolyadékban inkubáltuk, a felülúszókat e 1 távol 1tottak. A sej tokét foszfát-pufferes fiziológiás sóoldattal (PS.S? Se.romed) mostuk, majd 3 ml. iizispufferben Xizáltattuk (50 mmöl/l Tris-HCl; ISO mmól/l NaCl; 0, S % Tr.icon-X~löQ; 0,5 % IGSFAL CA-630 nem-ionos detergens (Sígma); Compiete® proteázinhibítor (So.ehri.nger; (pH-7,5)]. Ezután, CNSr-aktivált „Sepharose~4S (Fh.arm.acia) alkalmazásával ímmunoprecipitációt végeztünk, mind a. tápfolyadék, mind a sejtlizátum.

esetében..

Az aktiválást és a „Sepharose·-hoz történő kötést a gyártó utasításai szerint végeztük. Miután a „Sepharo-se-t duzzadni hagytuk, és '1 mmól/i H.C 1-ben, ρΗ-2,5 mellett mostuk, a CHSt-aktivált „.Sepharose-1 egy éjszakán át, 4 °Con, nyűlban termelt, humán IgA-val. szemben irányuló- ellenanyaggal inkubáltuk (üianova; 2,4 mg ellenanyag / 1 mi Sepharose) , a következő· összetételű pufferben: 0,1 mői/i NaHCOd, 0,5 mól/1 MaCI, (pH~8,3)> A nem-kötődött ellenanyagokat az összekapcsoló pufferrel történő mosással távolítottul el, a szabad kötőhelyeket 1 mól/1 etanolamin (pH~9,0) hozzáadásával, majd 2 órán át, szobahőmérsékleten történő inkubáiással telítettük. Szt követően, a Sepharose--! 3-szor mostuk (az. egyes mosásokat lö-10-sz.eres térfogatú pufferrel végezve), az alábbi összetételű puffé* ·*

rek váltakozva történő alkalmazásával: 0,1 m.ól/1 nátriumacetát; 0,5 mől/1 NaCI (pH~4, 0) ; és 0,1 mől/i Tris-HCl; 0,5 mől/'l NaCl (pN~8,0), majd a „Sepahrose^w-t guruéban szenvedd betegek és egészséges egyének szérumaival inkubáltuk (0,5 al szérum / 1 ml Sepharose), agy éjszakán át, 4 °C~on, összekapcsoló puffezben (50 mmdl/i ?ris~H€l; 150 mmői/1 NaCl; 1 sasői/i CaCX₂,' 1 mmól/l MgCl? (pH-3,0)]. A feleslegben lévő szérumellenanyagokat összekapcsoló puff.erre.1. történő háromszori mosással, távoli tót.tűk. el.

Minden alkalommal, 1 ml HT1080-tápfolyadékot vagy a metabollkusan jelölt sejtek sej tliz.átumát (mintegy 5x10* sejt Tiz át urnát) 50 al „C14B~Sepharose-val (Pharmacia) 30 percig, szobahőmérsékleten élőin kukái tünk, hogy a ssaspecifikusan kötődd proteineket eltávolítsuk. Centrífugálást (10 OOQxg, 5 perc, 4 C) követően, a felülúszókat keverés mellett, á ^öC-on, 50 pl olyan „Sepharosa~val inkubáltuk, amelyhez előzőleg a betegekből vagy kontroll, egyénekből származó IgA-t kötöttünk. Ezután, a „Sepharosepelleteket 3x1 ml mosóp-ufferrel [10 mmól/l Tris-HCl; 1 % IGEPAL CA-630 (Sígma) ; 0,5 % nátrium-dezoxikólát; 0,1 % nátrium lauriiszulfát; Complete® (Boehringeri (pH~8,0), majd 1 ml, 10 mmól/l Trís-HCl-puf f-errel (pH»8,Ö} mostuk. Ezt követően, a pe.lleteket. SDS vizsgálati pufrerben szuszpendaltuk, 5 percig, redukáld vagy nem-redukálő körülmények mellett, 95 ⁹C~on inkubáltuk; 10-12,5 % SDS-poiiakrilamídgélen szétválasztottuk (Lámmli, öiK. : Natúré 227, 68Ό (1970) j ; majd a precipitál-ődo-tt proteineket autoradiográriával kimutattuk (1. ábra).

<. * ·*'.% **»« « V ί * X « ««X #** <* * ♦ X « X ♦ « Μ ♦ « ♦ » χ χ * ♦* »* χ χ

További vizsgálatok során, a tápfoiyadék esetében kötődött nagy molekuiatömegű proteinről kimutattuk, hogy ar fíbronektin, amely - más proteinek mellett - nem-specifikus módon kötődött ,,Sepharose^?'~hoz.

Egy sejt-asszooiáit SS kDa protein preolpitáiódott azonban, mind a 30 tesztelt sprue betegből származó szérumból; mig a 15 iontrollszérum - ezen beiül, normál szérumok, Colitis ulcerosában vagy Sjoegran-szindrömában szenvedő betegek széruma - esetében, ilyen protein nem volt megfigyelhető. A fentiek alapján, arra a következtetésre jutottunk, hogy sz a protein a sprue kialakulása szempontjából alapvetően fontos autoantigén.

A gélek ezüst-nitráttal történő proteinfestésével íHankeshoven J. és mtsai.; Slectrophoresis 6, 103 (13S5)] egy éles proteíncslk volt hozzárendelhető az autoradiográfiával kimutatott 8 5 kDa csíkhoz.

1.3. A 35,kPa autoantigén Izolálása és tisztítása

Hogy az autoantígénből nagyobb mennyiséget izolálhassunk, összesen 65 (175 cm² alapterületű) tenyésztőedényben HTlOSO-sejteket (míntegylö² sejtet) tenyésztettünk. Röviddel azelőtt, hogy összefüggő tenyészet alakult volna ki, a tápfolyadékot FCS-mentes tápfolyadékra cseréltük, majd a sejteket további 16-20 órán át, CCl-termosztátban inkubáltuk. A sejtek lizálását és az irsmunprecípl táciöt a fent leírtak szerint végeztük. A „Sepharose-pelletet összesen 4,5 ml, 2% Dű-ditiotreltolt {Sigma) tartalmazó SDS-reakciőpufferben inkubáltuk, 5 percig, 95 °C~on, hogy a kötődött proteineket felszabadítsuk, majd azokat analitikus SDSpoliakrilajmídgélen analizáltuk.

Az autó-antigén további tisztítására, az immunprecipítátumot elúciós eiektroforézissel, „Prep Cell (Modell 491, Bio-Rad) alkalmazásával szétválasztottak, a következők szerint eljárva; 4,5 ml pro te inalegyet 6,5 cm szeparáló- gélből (8 % poliakrilamíd; pH-8,8) és 1,5 cm gyűjtőgélből (4 % poliakrilamíd; pK^:-6,3j álló kerek gélre vittünk fel (külső átmérő: 3 cm), majd eiektroforézissel szétválasztottunk. Az egyes proteineket az elúciós pufférben gyűjtöttük [25 mmől/1 Tris-HCl; 0,1 möl/l giicin; 0,01 % SDS (pH-8,3)I, 1,2 ml frakciókban (0,3 ml/perc siúciős sebesség mellett). Az eluált frakciókat SDS-PAGB-gélen analizáltuk, a kívánt proteint tartalmazó frakciókat (mintegy 15 ml) elegyítettük, és ult.r.afiltráció-s eljárással („Amicon Centriprep-50 alkalmazásával; lOOOxg mellett) mintegy 1 ml térfogatúra koncentráltuk.

- - ^Az autoantigén proteáz emésztése

Több vizsgált proteáz közül az endoproteínáz-Asp-N bizonyult megfelelőnek a protein fragmentálására, mivel az nagy mértékben reprodukálható hasítási mintát eredményezett, viszonylag jöl elkülöníthető fragmentumokkal> 1:100 arányú enzim:ssubsztrát koncentrációt alkalmaztunk, és az emésztést 30 percig, 37 °C~on. végeztük,

1.5 A proteinek transzferé PDVF-mambránra

Miután a tisztított autoantigént emésztettük, a peptld fragmentumokat preparatív, 10 %-os Tricíngélen szétválasztottuk [Scháogar H. és mtsai.: Anal Sic chem. 156, 353 •ί Γ' » Λ * « Jr* {1937)1 [2. ábra), és 4. ^eC-on, PVDE-mebránra {poiivinilidén-difiuorid; „Immobilon®*', Millipore) vittük át, félsz.áráz gyorsbiot eljárással, grafit-tartalmú elektrödlemezek alkalmazásával („Fastbiot B32/33; Siometra). Ebből a célból, a következő rétegeket helyeztük az· ano-dlemezre::' 1.1 1. anódpufferrel [300 mmól/I Tri.s~HC.l; 20 % metanol (pH~l. 0,4)} átitatott szűrőpapírt; 2.) 2. anődpufferrel (30 mmől/1 Trís-HCl; 20 % metanol CpH=10,4)I átitatott szűrőpapírt;

3.) a metanolban aktivált és anődpufferrel skvíiibrált PVDF-membránt; 4.) a Tricingélt; 5.) két réteg, katódpufferrel átitatott szűrőpapírt [25 mmől/i Tris-HCi; 40 mmől/1 s-amino-n-kapronsav; 20 % metanol ipH~9,4)]; β.) katódleme2. A transzfert 3 5 percen, át, 180 mA mellet végeztük.

Ezután, a PVDF-membránt 0,1 1 „Coomassie Slue Serva R250 festéket és 50 % metanolt, tartalmazó elegyben 5 percig festettük, 50 metanolt, 10 % ecetsavat tartalmazó oldatban színtelen! tettük, geszti Hált vízzel alaposan mostuk, majd levegőn szárítottuk.. As emésztett autoantígén 10 kDa, 14 kDa, lő kDa és 25 kDa molekulatömegü jellemző cslkja.it óvatosan kivágtuk, és annak N-terminusát egy előzetes szekvariálással meghatároztuk.

1·Sdman-degradáció [Az eljárást Edman. és Henschen leírása szerint végeztük: lásd Neddleman S.B..: „Protein Sequence Determinálion, Springer Verlag, Seriin, 232-279. oldal 11975)).

„Applied Biosystems 4778-Seguenator készülékkel végzett szekvenáiássa! bárom aminosav-szekvenciát kaptunk, amelyeket, a. „.S-wíss Drót 31 adatbázisban szereplő- szekven* .·.· X ♦ *

4t X *·**'♦' » χ* ·» dákkal vetettünk Össze {„BC/GSWS programcsomag aaxaimazásával; InteiliGenetics). A fenti összehasonlítás szerint, minimális eltérésektől eltekintve, a három fragmentum szekvenciája egyértelműen megfelelt a humán szöveti transzglutamináz (tTG; EC 213,2.13; protein gintamin γ-glutamil transzferár) szekvenciájának. A szekvenciákat az „egyhetes kóddal adtuk meg; X nem azonosított aminosavat jelent:

t-Transzglutamináz: 10 kDa fragmentum:

t-Transzglutamináz: 14 kDa fragmentum:

t-Transzgiutamináz: 16 kDa fragmentum:

28' REKLVYB.EGQPFW;

REKLYYPEGQDF(S) ;

581/ DLuLENPEIKIRíLG?

DLYLENPE1XIX1LG;

438' DITH7YXYFE;

DXTLTYQYP(V).

A 25 kDa fragmentumhoz nem volt egyértelműen fTGszekvencia hozzárendelhető, mivel es különböző peptidek elegyéből állt.

2, példa

A. szöveti, transzgletamináz (tTG) spru a-au t o ant igén kén t történő azonosítása

2.1, Teugerimalac tTG ímmnnpreeipitáoiója

Mivel az kereskedelemben hozzáférhető, és nagy fokú {>80 B) szekvenciahomológiát mutat humán tTG-vel, tengerimalac májból izolált tTG-t (Sígma) először gélelektorforézissel szétválasztottunk, hogy annak tisztaságát ellenőriz-

.-} /- _w zük. Több más protein jelenléte mellett, a tTG - amely az összes protein mintegy 58 %~át tette ki képviselte a legerősebb csíkok egyikét.

Sár a 687 amino savból álló humán tTG csak. kis mértékben különbözik a 690 aminosavból álló tengerimalac t'TGproteintől, a két protein SD-S-poliakriíamidgélen megfigyelhető migrációs sajátsága nagy mértékben eltér. Mig a2 állati eredetű protein a várakozásnak megfelelően,. 75-80 kDa molekulatömegnek megfelelően vándorol, a humán proteint, annak ellenére, hogy az N-giiközirezest látszólag nem tartalmaz, jelentősen kisebb migrációs sebesség jellemzi, és az - amint azt a szakirodalomban leírják (Gentile VI és atsai.: J.. Bioi. Chem.. 2 68, 478 (1991)1 -, 85 kDa látszólagos molekulatömegnek, megfelelően vándorol.

A sprue betegek szérumából származó humán ellenanyagok és tengerimala-c tTG közti, reaktivitást immunoprecipítációs eljárással teszteltük. Ebből a célból, 4 ug tTG-t (Sigma), 500 μί, 0,5 % szarvasmarha, szérumalbumínt tartalmazó lizispufferben, keverés mellett, „Sepharose-S^-hez kötött sprueIgA-val inkubáltunk, 4 °C~on, egy éjszakán át, majd a ,,Sepharose-t mostuk, redukáló körülmények mellett SDSreakciópufserben forraltuk, és a proteineket 10 %-os poiiakrilamidgélen szétválasztottuk (lásd 4.1,2). Itt, a várt esik (80 kDa molekulatömegü esik) specifikus precípitácíóját észleltük, a szennyeződések, nélkül.

* * «I

2♦² 1-TG autóantigénként történő azonosítása Westernblot eljárással

Miután 2 -ug tengerimalac tTG-t S.D'S-gélen szétválasztottunk és nitrocellulozra vittünk át, a biot tót 2 % alacsony zsírtartalmú fölözött tej port és 3 % Tween-20detergenst tartalmazó ?BS-.ben {pH«7_/3), 4 ^öC~on, egy éjszakán át blokkoltuk. Est kővetően# a membránt egy órán át# a fentivel megegyező Összetételű pufferben (1/200 arányban) hígított sprue szérumban inkübáltuk, háromszor mostuk, majd egy órán át, aikaiikus foszfatázzai jelölt, humán TgA-val. szemben irányuló fl/SOö arányban hígított) nyűi ellenanyaggal Inkübáltuk, A biottokat FSS-ben mostuk, majd „Nitro

Slue tetrazolium* és S-bróm-á-klór-G-lndoIíi-foszfát szubsztrátként történő alkalmazásával előhívtuk [Blake M.S. és mtsai.: An al. Bíochem. 136, 175 (1934;;.

A '7 3-30 kDa méretű, csík egyértelmű pozitív jelet adott a sprue szérummal, ami további bizonyítéka annak, hogy a sprue betegek széruma tTG-vel. szemben irányuló, IgAosztályba tartozó ellenanyagokat tartalmaz; míg a kontroll szérumok esetében nem volt jel megfigyelhető.

2.3. A tTG endomltlitm-au.toan.tigé.n.ként történő azonosítása, indirekt immunfluoreszcanoiás eljárássa!

Főemlősből származó nyelőcső szöveti metszeteket {Euroimmun, Németország) alkalmaztunk sprue szérumokban jelen lévő, endomiziummal szemben irányuló XgA-elienanyagck indirekt alj árassal történő kimutatására, valamint azok tTG-vel történő gátolhatőságának igazolására. Miután 10 ül, PBS-ben 1/320 arányban hígított betegszérumot 0,5 ug vagy μσ tengerimalao tTG-vel (Sigma), valamint 10 μσ BSA-val (Sigma) ϊ órán át, szobahőmérsékleten előinkubáltuhk, azokat a fenti nyelőcsőmet szerekkel in.kubáituk, I órán át, szobahőmérsékleten, . magas pá.ratartalmú légtérben. Pozitív kontroliként sprue szérumot alkalmaztunk (1/320 arányban hígítva), negatív kontroliként egészséges egyénektől származó szérumot alkalmaztunk (1/50 arányban hígítva). Miután a metszeteket 0,2 % BSA-t tartalmazó PBS-ben háromszor mostuk és levegőn szárítottuk, az autoantigéneket úgy mutattuk ki, hogy a metszeteket 1 órán. át, szobahőmérsékleten, TRITC-jelölt, humán IgA-val szemben irányuló (PSS-ben 1/50 arányban hígított) nyűi ellenanyagokkal (Dianova) inkubáituk. A feleslegben lévő· ellenanyagokat úgy távolítottul el, hogy a metszeteket ö,2 % BSA~t tartalmazó PBS-ben, PSS-ben, majd desztillált vízben mostuk.

A betegszérum alkalmazásával az ECM egyértelműén, festőd# tt. az. IgA-osztályú ellenanyagokkal, amely festődés növekvő koncentrációjú tTG hozzáadásával gátolható volt, de BSA-val történő előinkubáiással nem. Az egészséges egyénekből származó szérum alkalmazásán alapuló kontroll, esetében a nyelőcsőmetszsten festődén nem volt megfigyelhető.

3. példa

3.1 IgA-ellenanyagok kímutatasán alapuló sprue-specifikus BUSA kifejlesztése, sprue diagnózisára és utánkövefáséra

Egy (1) ug tengerimalac transzglutamínázt (Sigma f5398) 100 μΐ PBS-ben polisztirén mikrotítráló lemezek ♦ ♦ « Λ« **··♦ > « &

(Greíner Laborteohnik, 96 mélyületű lemezek) mélyüieteibe pipettáztunk, és a lemezeket lassú körkörös mozgatás mellett, 2 órán át, 37 ’C-on inknbáltuk. A nem-kötődött tTG~t •PBS-sel történő mosással, távolítottuk el (3x200 μΐ), a mélyületek szabad kötőhelyeit 250 μΐ, 1 % szarvasmarha szérvrsalbumlnt (Sigma) tartalmazó PBS-sel blokkoltuk, agy éjszakán át, 4 'C-on. Miután a mélyületeket 0,1 % Tween-20detergenst tartalmazó PBS-sel mostuk (3x200 pl), azokhoz 0,1% ?ween-20-áetergenst tartalmazó PBS-ben, csökkenő koncentrációjú szérumhigitás sort adtunk, és a lemezeket 1 órán át, szobahőmérsékleten, lassú körkörös mozgatás mellett inknbáltuk, majd Tween-20-detergenst tartalmazó PBSsel mostuk (3x200 μί) , végül 1 órán át, szobahőmérsékleten, humán IgA-val szemben irányuló, peroxidázzai konjugált nyúl ellenanyagokkal (Dianova) inknbáltuk (amelyet 100 ui, 0,1 % Tween~2ö~detergenst tartalmazó· PBS-ben, 1/400 arányban hígítva alkalmaztunk). Miután a méiyüieteket PBS-sel mostuk (3-szor), a lemezeket 30 percig, szobahőmérsékleten, sötétben, 200 ul, következő összetételű oldattal ínkubáituk:

0,1 mől/1 citrát-puffér, 17,6 mmől./l B/Ce; 5,5 mmó.1/1 o~ f eníiéndíamin-hidroklorid (Sigma) (pü-4,2); majd a képződött színes terméket SLISA-olvasovai (MRX, Bynatech Laboratories), 450 nm hullámhosszon kimutattuk.

Húsz (20), sprueban szenvedő betegtől származó szérumot. teszteltünk gluténmentes terápia megkezdését megelőzően, és azt követően, azaz, a betegség aktív és kevésbe aktív fázisaiban. A tesztrendszer nagy mértékben szenzltívnek bizonyult, az értékek a sprue aktív fázisának megfelelően « * * X κ* ♦ * X X

-X ♦ ♦ X t φ* ♦* alakultak. A diéta betartásának eredményeképp, terápia sikerét a tTG-val szemben irányuló IgA-ellenanyagok mennyiségének csökkenése jelezte, A teszt magas .fokú specifitása 'nyilvánvaló volt az egészséges egyénektől származó kontrollszérumo'k, Colitis ulcerosában, máj zsugorban, különböző tumorokban, Sjoegren szindrómában, stb, szenvedő betegektől· származó szérumok alacsony fenyeinyelési értékei (alacsony háttér szintje? alapján (3. ábra),

3.2 Egyéb osztályba tartozó ellenanyagok, például IgGsllenanyagok kimutatásán alapuló SLISA-eljárás kifejlesztése, sprue diagnózisára és utánkövetésére

Mivel a sprue betegek mintegy 2 %-e IgA-deficiens, a szérumokat a bennük található tTG-vel szemben irányuló IgGellenanyagok szentit!vitására és spéci irtására teszteltük. Az ELISA-éljárast á 3.1. példában Ismertetettek szerint végeztük, csupán azzal, az eltéréssel, hogy abban a peroxiházzal konjugált, humán IgA-val. szemben, irányuló nyúl ellenanyagok (Dianova; 'helyett anti-humán-IgG-ellenanyagokat alkalmaztunk (Dianova). Szenzitlvitásuk tekintetében, a sprue betegek esetében meghatározott értékek, mind a gluténmentes diéta megkezdését megelőzően, mind azt követően, megfeleltek az IgA-ellenanyagok kimutatásával kapott eredményeknek

Néhány kontroli szérum esetében, kis mértékben megnövekedett értékeket találtunk, ami összhangban volt azokkal a korábbi, megfigyelésekkel, hogy az sodorni zi urnái szemben irányuló, IgG-osztálvba tartozó ellenanyagok indirekt immunfluoreszcens eljárással történő kimutatása alacsonyabb specifitású vizsgálat (4. ábra).

3,3. ELISA-eljárás: - például IgA-elienanyagok kamutatásán alapuló ilyen eljárás - kifejlesztése tTG-vel szerben irányuló immunreakcfőval járó egyéb betegségek diagnózisára és után követ és ér-e

Az EEISA-eljárást a 3.2 példában ismertetettek szerint végeztük.

Krónikus gyulladással járó betegségben vagy autoimmun betegségben [például Coiitis ulcerosában iC.U;b, Crohn-betegségben, akut autoimmun hepatitisben] szenvedő betegek szérumai esetében kis mértékben vagy mérsékelten emelkedett, értékeket tapasztaltunk.

A tTG-vel szemben irányuló sutoantigének kimutatására alkalmas Ig-G~ specifikus EL ISA.-el j árás alkalmazható tehát tTG-vel szemben irányuló immunreakólóval járó betegségekben szenvedő betegek esetében diagnózisra, és a terápia hatásosságának ellenőrzésére.

4. példa

A szöveti_____transzglutamináz________(t?G) eddig nem_____ismert funkciójának kimutatása, gliadín-keresztkötések létrehozásában

Mig a tTG által katalizált reakciókban acü-akceptorok széles spektruma vehet részt, az acii-donor szerepének betöltésére csak néhány molekula képes. Egy in vitro kísérletben radioaktívan jelölt putreszcin gliadinba történő, tTG által katalizált beépülését, és ezen keresztül azt *4 « V» *« * vizsgáltuk, hogy a gliadin képes~e a tTG donorszubsztrátjaként funkcionálni. 'Százhatvan (160} μΐ pufferben (0,1 mól/l Trís-HCl; ISO mmól/l MaCl; 5 mmól/l CaCl₂ '{pH~7,5}] 1 ag szubsztrátot (glladínt vagy kontroli proteineket, például albumint), 2 gCi [^}H]-putreszoint és X ng tTG-t (tengerimalac eredetű proteint; Sigma) inkubáltunk 2 órán át, 37 ^öC-on. A reakciót 100 μ1, 50 %-os trikiórecetsav („tricnloracetic acid, ICA; hozzáadásával állítottuk le, és a proteineket 4 °C~on, egy éjszakán át precipitálfcuk. Centrifugálást követően, a peiieteket 10 % TCA-val mostuk, SDS tartalmú reakciópufserben szuszpendáituk, majd egyrészt - SDS-EAGS-gélen szétválasztottuk; másrészt, szcintillácíós számlálóban a beütésszámot meghatároztuk.

Míg a kontrollok esetében, nem volt észlelhető putreszeínbeépüiés, gliadin alkalmazása esetén egyértelműen kimutatható volt a pH] ~pu.tr eszein beépülése, mind a szlntillációs számlálóval meghatározott eredmények alapján, mint az SDSPAGE alapján, bizonyítékát szolgáltatva annak, hogy a gliadin kitűnő szubsztrátja a tTG-nek.

k κ» *<* * + * »x · * (i * * X * * „ * *xx » -> ♦ « -* ♦ * Η * w * *♦ * * *'♦ '

A leírásban a következő- rövidítéseket -alkalmaztuk:

Ab: {„Antíbody; el1enanyag;

AEAAP: alkaiikus foszfátás ~ anti- alkaiikus foszfátét;

BSA: („bovins sarum, al.foumin'} szarvasmarha szérumalbucm: centiméter;

ΌΜΒΚ: Dulbecco-féle módosított Sagle-tápfolyadék;

EC: enzim osztályozási, hivatkozási szám;

ELISA: („Enzyme-linked immunosőrbent assay; enzimmel jelölt reagens kötődésén alapuló immunoszorbens vizsgálati eljárás;

ECM: extracelluláris mátrix;

FCS; {„tatai oaif serem) totális borjűszárum; h: (hour Cs!j óra, órák;

H₂0í : hi dro gén-pe r ox i d;

HLA: humán limfocita. antigén;

ISL: intraepitheliáli-s iimfociták; lg: immunglobulin;

kDa: Ki1odalton;

mől/1.: mól./liter;

m&: miiliAmper;

MHC: {„major h i s z t o - k omp-at ib í ii t á s-i min.: [„mimete(s)} perc; mmoi/i: millimől/liter;

M_r: relatív molekulatömeg;

kistó comp atibility komplex;

« * »w X# «»# gg: mixrοgramm;

u.i: ’	nikroliter;
•PAOíS %	poli akri Tas	lid gélelektroforézis;
FSS -	(„p-hosphate	nu f f e r} fosztat ~puffér;
PhA?;	foszfoiipáz	—>A .·- *
PVSF:	coli vicc. li c	ién~di fluorid;

SDS: („sodium dodoecyl sültaté5 nátrium- áodeciiszuifát;

TCA; („trfcloracstc acid} triklőrecstsav;

TGF: Gítransforming growth factor} transzformáló növekedési faktor ;

Tris: Tris~ (hidrcxímetil5 -aminomstán;

tTG: („tissue transgiutaminase) szöveti 'ruca-

Claims (8)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. in vitro eljárás; spme vagy eoeiiakiás betegség diagnózisára vagy terápiája 'hatásosságának ellenőrzésére, azzal jelt&nizve, hogy szöveti transzglntamlnáz elleni (areti-fTG) ellenanyagokat mutatuskki valamely tesifolyadékbas, szöveti tsunszglmsimmázzal (iTG-vel}, immuureaktív szekvenciáival vagy analógjaival adóit immtmreakció alapjáé, alsói az immunmakeiőt nent állati vagy embert szövetből nyert szövstmeiszeten hajtják végre.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ozzM je/fewsw, begy humán IgA- és/vagy IgG-eteranyagokai mutatunk ki.
3. 3. Az 1. vagy 3. igénypont szerinti eljárás, aszal jeflemezve, hogy humán, állati, szintetikus vagy:rekoiabt· náas iTG-vel szemben bányaié eHenmtysgokst.mutálunk ki.
4. 4. Az 1-3. Igénypontok bármelyike szerinti eljárás. özss/yeZ/ewtezw, hogy önmagában ismert immunológiai vizsgálati módszert alkalmazunk, előnyösen, a reagáló -anyagok egyikét direkt vagy indirekt módszerrel, jól kimutatható ielölöanyaggal kapcsoljuk össze.
5. 5. A 4. igénypont szerinti elj árás, azzal jeiieníezvíí, hogy a kimutatást szilárd fázisán végezzük.

   ő, A 4. igénypont szerinti eljárás, azztrfjetiemesve, hogy a kimutatást ELBA, RIA vagy sírnmmfluoreszcens eljárással végezzük.
6. 7, tTG, immunreaktiv szekvenciái vagy analógjai alkalmazása sprae vagy eoeiiakiás betegség rá v/íro diagnózisára vagy terápiájís hatásosságának in vizra ellenőrzésére, amely alkalmazás során állati vagy emberi szövetből nyert szöveírrsetszet alkalmazására sem kerül sor,
7. 8. Szájon, át adagolható gyógyászati baióanyag, amely tTG-ί, immunreaktlv szekvenciáit vagy analógjait, valamit ·· adott: esetben - gyógyászatilag tolerálható adjuvánst tartalmaz, sprue vagy eoeiiakiás betegség kezelésében történő alkalmazásra
8. 10. tTG, ránnssreaktiv szekvenciái vagy analógjai alkalmazása apme vagy eoeiiakiás betegség kezelésére alkalmas, szájon, át adagolható gyógyászati hatóanyag előállítására.