JP2744001B2 - 膵臓チモーゲンの遊離活性化ペプチドの免疫分析による診断、厳密な予測および監視 - Google Patents
膵臓チモーゲンの遊離活性化ペプチドの免疫分析による診断、厳密な予測および監視Info
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Description
【発明の詳細な説明】
技術分野
本発明は、カルボキシ末端の存在する遊離の膵臓の活
性化ペプチドに対する体液の特異的分析に関する。 背景の技術 急性及び慢性の膵炎は、近年事例数のかなりの増大を
示す人間の病気である［１］。急性膵炎は吐き気の状態
を呈し、一方慢性の膵炎は一般に慢性的又は断続的な腹
痛という異なる診断を含む。 外分泌膵臓は、活性形で生合成されたアミラーゼ及び
リパーゼを含む消化酵素及び不活性なプロ酵素又はチモ
ーゲン（酵素源ということもある）として合成されるト
リプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、プロエラスタ
ーゼ、プロカルボキシペプチダーゼ及びプロホスホリパ
ーゼA2を含むその他のものをある範囲で産生し且つ貯蔵
する。酵素源の活性化は、普通膵液の十二指腸への分泌
に続いて起こり、十二指腸のエンテロペプチダーゼによ
るトリプシノーゲンの活性なトリプシンへの特異的接触
転化を含む（E.C.3.4.21.9）。これはテトラ−Ｌ−アス
パルチリ−Ｌ−リシンのシーケンスを含むアミノ末端の
オリゴペプチドをトリプシノーゲンから除去し、これに
続いて一連の蛋白質分解開裂により他のプロ酵素のトリ
プシン活性化を行なう。この生理学的課程で遊離される
膵臓の酵素源の活性化ペプチドは十二指腸のオリゴペプ
チダーゼによつて分解されると考えられる。 急性の膵炎は２つの明白な臨床病理学的種類が特色で
ある［２］。急性浮腫の膵炎において、膵臓のアシナー
（acinar）細胞の損傷は、不活性な消化酵素源を活性な
アミラーゼ及びリパーゼと共に腹腔内及び循環系へ漏出
する。この活性な酵素は得られる腹水並びに血液及び尿
中において同定することができ、一方プロテイナーゼ消
化酵素源及びプロホスホリパーゼは活性化されていない
ままである。局所的な炎症及び活性リパーゼによる脂肪
ネクローゼが起こるけれど、この状態は一般に致命的で
なく、伝統的な処置により数日間で回復する。一方急性
の壊死性膵炎では、膵臓のアシナー細胞の損傷及び消化
酵素の遊離が種々の程度の消化酵素源の活性化を付随す
る。膵臓のプロテイナーゼと循環する巨大分子禁止剤の
間に複合体が生成するけれど、これらの複合体のいくつ
かは触媒性を保持している。ホスホリパーゼA2も血漿中
で活性である。広い局所的な及び広がった多器官の損傷
は高い死亡率と致死をもたらす。 急性膵炎の生化学的診断は、伝統的には病気の結果と
して膵臓から遊離される膵臓の消化酵素又はその酵素源
の、血漿、血清、尿、又は腹水中での検出に依存した。
血清中の全アミラーゼ活性の定量化は使用されてきた主
な診断試験であつた［３］。敏感な免疫学的方法の導入
はトリプシン及びトリプシノーゲン［４〜18］、エラス
ターゼ［19、20］、キモトリプシン［21］、ホスホリパ
ーゼ［22、23］、カルボキシペプチダーゼ［24］及び更
にリパーゼ［25、26］及び膵臓トリプシン禁止剤［27、
28］を含む膵臓の蛋白質分解酵素及びその酵素源に対す
る分析の開発を可能にした。これらの免疫分析のいくつ
か、特にポリクローナルな抗血清を用いるものは、その
標的分子の種々の蛋白質分解のため複雑であつた。これ
らの分析に関連する他の問題は、巨大分子禁止剤との複
合体において標的酵素に結合する抗体の立体的禁止のた
めに生ずる［29、30］。更に親酵素源及び活性酵素の双
方を認識する抗体は双方間を識別することができない。 アミラーゼ分析は、膵臓のイソアミラーゼと他の器
官、特に唾液腺からのアミラーゼの活性間を識別するよ
うに改良された［31〜33］。しかしながら、急性膵炎を
もつ多数の患者において、これらの試験の多くを同時に
詳細に評価すれば、リパーゼ又は免疫反応性トリプシノ
ーゲンの検知が膵臓のイソアミラーゼだけの測定よりも
初期の診断精度を改善せず、また深刻な急性の壊死病の
生化学的認識を可能にしないということがわかる［3
4］。膵臓病の診断におけるアミラーゼの評価は、高ア
ミラーゼ血症の散在的事例、膵臓のアミラーゼを他の起
源からのそれと識別する必要性、深刻な急性膵炎と関連
したアミラーゼ活性の種々の劣化、及び血清アミラーゼ
量を膵炎の深刻さと結びつける又は壊死の徴候を同定す
ることの不可能性、のために複雑である。血清アミラー
ゼの評価もエタノールで誘導された膵炎の認識に関して
信頼性がない［35〜37］。触媒的に活性な膵臓のホスホ
リパーゼA2に対する分析によつて進行度の予知の精度を
改良する試みは、より実りある手法であることが証明さ
れた［38］。しかしながら、これはホスホリパーゼA2が
大食細胞、顆粒球、血小板及び他の細胞中に存在し［3
9］及び他の急性の腹部症状及び敗血症シヨツクの際に
血液中で増加する［40］から特異性に関して難点を有す
るようである。 それ故に急性膵炎における主な臨床学的診断の難点
は、浮腫性の膵炎による高アミラーゼ血症を伴う深刻な
腹痛を、強力な処置、特異的酵素禁止剤、及び更に外科
的介入及び部分的切除が生命を救いうる時の病気の極く
早い時間におけるより深刻な壊死形態から識別すること
であつた。 慢性の膵炎においては、慢性膵炎による亜急性又は断
続的な腹痛が血清殿粉酵素増加と関係なく且つそのよう
な徴候の多くの他の潜在的な原因からの区別が必要とさ
れるから、診断の問題は別の問題である。 詳細の説明 本発明は、利用可能なカルボキシ末端の存在する遊離
の膵臓活性化ペプチドPAP（活性化中に限定された蛋白
質分解によつて特異的に開裂する膵臓酵素源の活性化ペ
プチド）に対する体液の特異的分析に基づく。そのよう
な分析は、膵臓酵素源の活性化を認識し且つ定量化する
正確な方法を始めて提供しよう。本発明は膵炎の異なる
形態がPAPの特異的遊離などと関係するという本発明者
の判断に基づく。この一般的な方法は酵素源の活性化を
伴つて又は伴なわずに起こる膵炎の形態間を識別するで
あろうし、また急性膵炎における診断、進行の予測及び
病気の過程の監視に対して臨床的に適用しうる。これは
悪化している慢性膵炎に対する正確診断試験も提供しよ
う。 この試験では、患者の体液、特に血液の血漿、血清、
尿又は腹水の試料を１つ又はそれ以上のPAPについて分
析する。そのような方法に対して利用可能なPAPは、D4K
シーケンスがそれ自体膵臓の蛋白質分解に耐性のあるト
リプシノーゲン活性化ペプチド（TAP）を含有するテト
ラ−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−リシン（D4Kはこの及び続
いて言及するPAPに関連して用いられる単一文字アミノ
酸コード）を含む。他の適当な活性ペプチドはDSGISPR
［41］、即ち人間の膵臓のプロホスホリパーゼA2の活性
化ペプチド（PLAP）及びAPGPR［42］、即ちプロコリパ
ーゼの活性化ペプチド（CLAP）である。更にプロエラス
ターゼＩ及びII活性化ペプチド［43］又はその限られた
蛋白質分解の誘導体、並びにプロカルボキシペプチダー
ゼＡ及びＢから開裂した大きい（アミノ酸90〜100）ア
ミノ末端残基も考慮しうる。本発明において特に重要な
ことは、特異的にカルボキシ末端でPAPに向く抗体を用
いるという手法である。これは、限定された加水分解に
よる酵素源の活性化が確かに起つた時だけ抗体の結合と
分析における陽性の結果が報告されること、及びPAPが
そのカルボキシ末端で結合している酵素源それ自体が認
識されないことを保証する。 実施例 トリプシノーゲン活性化ペプチド（TAP）の免疫分析 以下の記述において、しばしばトリプシノーゲン活性
化ペプチドTAPの免疫分析が参照される。これはPAPの例
であるが、TAPに関する以下の記述に述べられているも
のは上記及び下記の他のPAPにも同様に当てはまる。TAP
を参照すると、これは存在するであろうTAPが異なるア
ミノ末端アミノ酸残基が存在しうるから必ずペンタペプ
チドD4Kそれ自体だけであるということを暗示しない。
これらはトリシノーゲン・イソ酵素間で異なり、或いは
アミノ末端分解で改変されていてもよい。分析で認識さ
れるTAPペプチドはカルボキシ末端にD4Kシーケンスを含
み、またそれが認識しうるD4Kシーケンスである。 トリプシノーゲンの活性化ペプチドは背つい動物の進
化において高度に保存され、そして特異的蛋白質分解活
性化中に開裂するリシル−イソロイシル標的結合の上流
にポリアニオン性シーケンス（又は配列）D4Kを含む（4
4、45）。アミノ酸シーケンスD4Kに対する試料の分析は
Ｃ−末端D4Kペプチドに対する特異性を有するD4Kシーケ
ンスを認識する抗体を用いることにより最も満足に行な
われ、そのような抗体は本発明の異なる観点を構成す
る。これらの抗体はポリクローナル又はモノクローナル
であつてよい。本発明のポリクローナル抗体は、免疫源
として、D4K又は短いリーダー配列（例えば、システイ
ンを有してもよいアラニル−プロリル−フエニルアラニ
ル）をアミノ末端に有するD4Kを用いるか、或いはハプ
テン化したD4Kを用いる通常の技法によって動物中に増
加せしめうる。ハプテン化が必要な場合、D4Kシーケン
ス又はそれを含有するペプチドは通常のペプチドハプテ
ン例えば牛の血清アルブミン（BSA）又はチログロブリ
ン（TG）に化学的に結合していてもよい。 モノクローナル抗体を必要とする場合、それらは再び
D4K又はD4Kを含むアミノ酸シーケンス又は免疫源として
使用する前にハプテン化したD4Kを用いる通常の雑種（h
ybridoma）技術によつて製造しうる。D4Kに対するモノ
クローナル抗体も、予じめ調製した抗D4K抗体に結合し
たD4Kを免疫源として用いることによつて製造しうる。 本発明は、D4KシーケンスのようなPAPの分析が患者の
膵臓の変調の存在及び本質に関する有用なあいまいでな
い情報を提供しうるという本発明者の認識に基づいてい
る。分析を行なう正確な方法は限定されるものでなく、
現存する直接的又は間接的（競争）分析並びに二点（si
te）サンドウイツチ分析及び抗体占有の定量化を含む分
析のいずれかが利用できる。分析は普通D4Kペプチドが
存在する試料における、D4Kシーケンスと抗体を含むペ
プチド間の共役体の生成を含む。該共役体は顕在化する
（或いは、直接又は間接的に検出しうる）標識を有し且
つ固／液相の反応混合物の固有又は液相のいずれかにお
いて生成せしめ、固相を液相から分離し、そして固相又
は液相のいずれかにおける顕在化する標識の存在又は量
を、試料中のD4Kシーケンスを含むペプチドのそれぞれ
の存在又は量の尺度として決定する。競争分析は通常D4
Kに競争する顕在化する標識の付与を必要とするが、第
２の抗D4K抗体の標識化は二点サンドウイツチ分析に対
して必要である。通常の顕在化する標識のいずれかが使
用でき、免疫蛍光法も使用しうるが酵素標識及び放射線
標識は好適である。酵素又は放射線標識の選択は125I、
即ち好適な放射線活性標識の１つであつてもよく、また
西洋ワサビのペルオキシダーゼ又はアルカリホスフアタ
ーゼは好適な酵素標識である。ビオチンも使用しうる。
顕在化する標識を有するポリクローナル又はモノクロー
ナル抗D4Kは、他のポリペプチドに共役した標識された
ペンタペプチドを含む成分アミノ酸及びポリペプチドの
１つに直接結合した顕在化する標識をもつペンタペプチ
ドD4Kと同様に、本発明の更なる観点を構成する。増巾
法、例えばD4Kペプチドに結合したアルカリホスフアタ
ーゼに結合するものを、NADP+をNAD+に転化するのに用
いてもよい。次いでこのように生成したNAD+は強く色の
ついたホルマザン（formazan）染料を与えるNAD+−特異
性のレドツクスサイクルを触媒的に活性化する［46］。 抗D4Kは本発明に従い、通常の放射線免疫分析におい
て、酵素に結合した又は酵素で増巾した免疫分析におい
て、開発された技術に従い、或いは化学発光、生物発
光、光電子放出蛍光分析、電子発光、偏光蛍光、時間解
析又は他の技術を用いる他の免疫分析において使用する
ことができる。これらは補助実験室、医者の事務所、患
者部門、病室又は集中管理室における使用に適用できる
参照実験室免疫分析又は簡単化された方法の基礎を形成
しよう。これらの方法は不活性な固体物質例えば試験溶
液を通流することのできるカラムに充填しうるラテツク
ス粒子又はポリスチレン球又は粉末へ結合させることに
より抗D4K抗体又はD4Kそれ自体を固定化することを必要
とする。そのような固定化したポリクローナル又はモノ
クローナル抗D4K及び固定化ペプチドは、顕在化する標
識を付着又は未付着のリジン（Ｋ）をカルボキシ末端と
して有するD4Kシーケンスを含んでなり、本発明の異な
る観点を構成する。 更に本発明は診断用試験キツトを提供する。そのよう
なキツトは本発明の標識されたペプチド（単独又は他の
ペプチドへ共役したもの）或いは本発明の標識された抗
体を１つの成分として含んでなる。他の試験キツトは、
固体成分が本発明の固定化されたペプチド又は抗体であ
り且つ成分の１つが好ましくは酵素又は放射線活性標識
で標識されているという固体及び液体成分を含んでなる
ものである。 一般に固定化された抗D4Kを用いる本発明による分析
は、D4Kペプチドを含む疑いのある液体試料を、顕在化
する試剤を有するD4Kと競争的にポリクローナル又はモ
ノクローナル抗D4Kを含む固相と接触させ、そして顕在
化する試剤を有するD4Kの存在に関して固相又は液相の
いずれかを分析し且つその共役体の存在を試料のD4K含
量の尺度として採用するという過程を含むであろう。本
発明による分析は、D4Kペプチドを含む疑いのあう液体
試料を、結合したポリクローナル又はモノクローナル抗
D4Kを有する固相と接触させ、固体を液相から分離し、
そして固定化された抗D4Kによつて結合したD4Kを、顕在
化する試剤を有するモノクローナルの第２の抗D4K抗体
を用いて定量化するという方法を含む。他の方法、即ち
試験試料に露呈した後の固相上における１つ又は２つの
寸法での抗体又は固定化されたD4Kペプチドの占有を、
顕在化する試剤に結合したD4Kペプチド又は抗体を続い
て用いることによつて定量化するという方法も使用でき
る。本発明による分析は、顕在化する試剤を有する又は
有さない抗D4Kポリクローナル又はモノクローナル抗体
を試験すべき試料に添加し、そしてこの処理した試料を
固相上に固定化したD4Kペプチドと直接又は介在物を通
して接触させるという方法も含み、そのような固定化さ
れD4Kペプチドは本発明の一部を構成する。膜又は他の
固相担体上のD4Kペプチドは、中央に凹み、環、又はミ
ニカラムを有して、円形をしていてよい。試験は結合し
た顕在化する試剤或いは抗D4K Igに対する第２の抗体に
結合した顕在化する試剤を用いることによつて、固定化
されたD4Kに結合する抗D4Kの強度及び／又は分布によつ
て読みとられよう。また本発明による分析は、D4Kペプ
チドを含む疑いのある試料を、不活性な固体担体上に固
定化された且つ顕在化する試剤を含む又は含まない抗D4
K抵抗及びD4Kを含んでなる複合体と接触させる方法を含
む。D4Kが直接担体に結合するならば、抗体はいずれか
の顕在化する試剤を有し、またその逆も可能である。次
いで固相から最初のD4Kを試料中のD4Kペプチドで置き換
えて定量化することができる。 本発明による分析は膵炎の深刻な進行を監視するため
にも使用しうる。これをするために、体液の試料を、互
いに１〜４時間の間隔を置いて少くとも２つの別々の場
合に患者から採取し、各試料をD4Kペプチドの濃度に関
して分析する。いくつかの試料を24時間にわたつて患者
から採取することにより、患者の状態の進行度が変化す
るかどうか、また外科的又は他の特異的処置を必要とす
るかどうかを決定することが可能である。 D4Kペプチド及び他のPAPは、それらが親和性クロマト
グラフイーによつてポリクローナル又はモノクローナル
抗D4K又は他の抗PAPの精製に使用しうるという点でも有
用である。そのような精製法においては、D4Kペプチド
又は他のPAPを普通立体的に近づきうる具合に固体担体
例えばポリスチレン又は多糖類例えばポリデキストリン
上に固定化し、そして比較的不純な抗D4K又は他の抗PAP
を含む液体試料を、担体上においてD4K/抗D4K又は他のP
AP/抗PAP共役体を生成する固定化されたD4Kペプチド又
は他のPAPと接触させる。固相を洗浄した後、抗D4K又は
他の抗PAPを流出させて抗D4K又は他の抗PAPの比較的よ
り純粋な形を含有する溶液を得る。 次の実施例は本発明を例示するために示す。 これらの実施例において、１文字及び３文字のアミノ
酸の略号は次のようにして使用する： Ｄ Asp アスパラギン酸 Ｋ Lys リジン Ｙ Tyr チロシン Ｃ Cys システイン Ａ Ala アラニン Ｐ Pro プロリン Ｆ Phe フエニルアラニン Ｓ Ser セリン Ｇ Gly グリシン Ｉ Ile イソロイシン Ｒ Arg アルギニン Ｔ Thr スレオニン Asp4−Lys（D4K）ペプチドの合成 人間のトリプシノーゲンに見出される活性化ペプチド
に相当するペプチド、Asp−Asp−Asp−Asp−Lys（D4K）
及びAla−Pro−Phe−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys（APFD
4K）を、蛋白質担体に化学的に架橋しうる側鎖を与える
べく特別な残基Tyr及びCysをその各Ｎ末端に有して合成
した。D4Kシーケンスは攻撃的酸によつて分解するか
ら、可逆的なα−Ｎ−末端保護のために塩基で除去しう
るＮ−フルオロエネイルメトキシカルボニル（Fmoc）基
を使用した「47」。ペプチドYD4K及びCAPFD4Kを、酸で
除去しうるｐ−アルコキシベンジルアルコールＣ末端結
合剤を用いてポリスチレン固相担体上に合体させた［4
8］。合成には、不必要であることがわかつたジオキサ
ン;H2Oでの洗浄を省略し且つジクロルメタン中よりもむ
しろDMF中において20％ピペリジンで脱プロトン化する
以外メイエンホフア−（Meienhofer）等の方法［49］の
改変法を使用した。 本発明者の最初の研究は、１つの保護されたアスパル
チル基を固定化されたＣ末端（Ｎ−ｔ−Boc）Lys残基に
結合させる場合、α−アミノFmoc基の塩基触媒による除
去時にジペプチドAsp−Lysが環化し、その残基が樹脂か
ら遊離されるということを示した。それ故にテトラアス
パルチルシーケンスは、樹脂に結合したペプチドへのカ
ツプリング中のラセミ化を抑制するためにヒドロキシベ
ンゾトリアゾールカツプリングを用いることにより、予
じめ製造した保護されたAsp−Aspジペプチドを用いて合
体させた。各添加後のペプチド結合の生成の完了はニン
ヒドリン又はプロリンに対するフルオレサミン（fluore
scamine）で監視した。各Asp−Aspジペプチドに対して
及びFmoc（Trt）Cysに対して２重カツプリングが必要で
あつた。樹脂からの開裂とｔ−ブチル側鎖保護基の脱保
護基を、CH2Cl2中50％TFA（CAPFD4Kの場合に５％エチル
メチルスルフイドも含有）を用いて同時に行なつた後、
ペプチドを連続的なゲル濾過及びイオン交換クロマトグ
ラフイーによつて精製して必要なペプチドを62％（YD
4K）及び35％（CAPFD4K）の収率で製造した。このペプ
チドは、pH6.5における高電圧の紙での電気泳動におい
て１つのニンヒドリン陽性スポツト（RAspYD4K＝0.79、
及びRAspCAPFD4K＝0.76）を示し且つ酸での加水分解後
に満足しうるアミノ酸分析値を示すので均質であること
がわかつた。本発明者は13C−NMRにより、この方法によ
つて合成したトリプシノーゲン活性化ペプチドがα−β
トランスペプチド化を含まないということをすでに示し
た［50］。 D4Kペプチドのハプテン化 合成トリプシノーゲン活性化ペプチドの、蛋白質担体
への特異的アミノ末端カツプリングによつて２つのハプ
テンを製造した。バツシリ（Bassiri）及びウチガー（U
tiger）（1972）［52］の記述するように、ベンジジン
二塩酸塩を用い、Tyr残基でビスジアゾ化することによ
り、YD4Kを牛の血清アルブミン（BSA）に架橋した。精
製した付加物BSA−YD4Kのアミノ酸分析は、BSA分子当り
８つのペプチドの置換を示した。ペプチドCAPFD4Kのス
ルフイドリル基を、ヘテロ二官能性結合剤ｍ−マレイミ
ドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドを用いて牛
のチログロブリン（TG）上のLysのε−アミノ基にカツ
プリングさせて［52］、チログロブリン分子当りペプチ
ド40モルの置換したTG−CAPFD4Kを製造した。 特異的抗D4K抗血清の生成 フロインドの完全アジユバント［マイルス研究所（Mi
les Laboratories）］BSA−YD4K2.9mg/ml又はTG−CAPFD
4K1.1mg/mlとの等量の乳化液を氷上での超音波により調
製した。NSWラビツトを１つ又は他の乳化液2.0mlで皮下
的に及び筋肉内的に免疫にし、そして、乳化液又は対応
するハプテン−ペプチドを、毎月与えるフロインドの不
完全アジユバントと共に用いることにより増強した。免
疫化前に及び各誘発試験から10日後に血清を得、そして
固相免疫放射線分析を用いて抗D4K抗体の分析に関して
試験した。50mM Tris−HCl、20mM CaCl2、0.1％ナトリ
ウムアジド（TCA緩衝液）中蛋白質60μg/mlの50μを
４℃に16時間保温することによつてBSA−YD4K及びTG−C
APFD4K共役体を別々の96のウエル（well）を有するポリ
塩化ビニル製ミクロ滴定プレート［ダイナテク（Dynate
ch）１−220−24型］中で固定化した。次いでプレート
を、TCAを含有する10％（v/v）の熱照射した馬の血清
［TCA−HS、テイツシユ・カルチヤ・サービシーズ（Tis
sue Culture Services、Berkshire、UK）］で室温下に
洗浄し、そしてTCA−HSと共に１時間培養することによ
り過剰な点をブロツクした。次いで試験すべき免疫血清
の50ml試料部分をD4K10-5Mの存在又は不存在下にウエル
に添加し、室温で２時間培養した。BSA−YD4Kで誘発し
たウサギからの血清を固定化したTG−CAPFD4K上で試験
し、その逆も行なつた。次いでプレートをTCA−HSで３
回洗浄し、そしてTCA−HS中125I−ヤギの抗ウサギIg
（マイルズAFA）50,000cpm/ウエルの50μと共に更に1
6時間培養した。プレートを洗浄し、乾燥し、そしてウ
エルをLKBガンマ計数器で計数した。競争するD4Kペプチ
ド10-5Mの存在又は不存在下に結合したcpmでの差から特
異的抗D4K抗体の力価を得た。 BSA−YD4Kで免疫にした６匹のウサギのうち３匹は３
週間以内に抗D4Kを発現した。これらの動物の力価は２
〜３ケ月にわたつて増加し、次いで減少した。これらの
動物の２匹では力価が連続した誘発で再び４ケ月で及び
再び６ケ月でピークまで上昇した。TG−CAPFD4Kで免疫
にした４匹のウサギのうち３匹は抗D4K抗体を発現し、
特異的抗体の力価のピークは２及び３ケ月に、そして６
ケ月に再び存在した。 Ca2+イオンの存在は免疫血清中の抗体の活性ペプチド
の結合を高めることが発見された。この向上の程度は個
々のウサギにおいて異なつた。１つのウサギ（１）から
の血清は、キレート化量のEDTAの存在下にバツクグラン
ド値まで減ぜられる125I−YD4Kに結合するCa2+に完全に
依存することを示した。３匹のウサギにおいて（第１
図）、結合は1mM Ca2+で及びそれ以上で観察される最大
値まで濃度依存的に増加し、次いで40mM Ca2+まで低下
した。試験した他の２価の金属イオンMg2+、Zn2+、B
a2+、Hg2+は結合を増大させなかつた。抗D4K抗体の細区
分（Subpopulation）のCa2+依存性は、生体内での自然
のCa2+結合に続くウサギの免疫細胞によるD4Kペブチド
単独よりもむしろ存在する２対のAsp−βカルボキシル
のCa2+キレート性及びペプチドのCa2+キレートの選択的
識別の結果であると考えられる。 抗D4KIgの特異的抗血清から親和性精製親和性吸着剤の
製造 活性化されたCH−セフアローズ（Sepharose）4B［フ
ア−マシア・フアイン・ケミカルズ（Pharamacia Fine
Chemicals）］を1mM HCl（100ml）中に懸濁させ、更に1
mM HCl 900mlで洗浄した。次いで0.5M NaClを含有する
0.1M NaHCO325ml中Tyr−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys（60m
g）を添加し、ゲルを４℃で１時間振とうした。過剰な
配位体を0.1M NaHCO3100mlで洗い流し、残存する活性点
を、ゲルを0.1M Tris−HCl（pH8）と共に４℃で１時間
振とうすることによりブロツクした。次いでゲルを、0.
5M NaClを含む0.1M酢酸ナトリウム（pH4）50mlで洗浄し
た。次いで更に２回0.1M Tris−HCl（pH8）50mlで洗浄
した。 6M HCl中110℃で20時間加水分解し且つアミノ酸分析
に供したゲルの少割合は、置換の程度が1.10ミリモル／
ゲルmlであることを示した。 固定化されたYD4K上での親和性クロマトグラフイー BSA−YD4Kで免疫にしたウサギ１及び２（R1、R2）か
ら６週間の間の間隔を置いてとつた２つの血清試料を別
々に貯蔵した。TG−CAPFD4Kで免疫にしたR17及びR18か
らの２つの同様の試料を一緒に貯蔵した。これらの集め
た血清を別々に次のようにして親和性クロマトグラフイ
ーに供した：硫酸アンモニウムの飽和溶液の同容量を血
清に添加し、そして混合物を４℃で夜通し放置した。沈
殿した蛋白質を４℃下に9,200xgavでの遠心分離によつ
て集め、50mM Tris−HCl（pH7.4）、150mM NaCl、20mM
CaCl2の元の容量（第１表参照）中に再懸濁させ、同一
の緩衝液２を２回変えて透析した。この透析した蛋白
質を、セフアローズに固定化されたD4Kの親和性マトリ
ツクの1.5×10cmのカラムに流速20ml/時で適用した。吸
光度が０に戻るまで結合していない蛋白質を操作してい
る緩衝液で流出させた。次いでCa2+依存性抗体を、50mM
Tris（pH7.4）、150mM NaClを50mM EDTAと共に用いて
置換し、続いてCa2+に依存しない1Mプロピンオン酸で流
出させた。画分を透析し、125I−YD4K（比放射線活性2.
7×108cpm/μｇ）を結合させることによつて活性に対し
て分析し、抗体を含有する画分を集めた。 ウサギ１からの免疫グロブリンの流出傾向は、EDTAで
の流出によつて抗体の巾広いピークが得られたが、1Mプ
ロピオン酸中に蛋白質又は抗体が流出しないことを示し
（第2a図）、この血清中に存在する抗D4KがCa2+依存性
であることを確認した。第１表は、BSA−YD4Kで免疫に
したウサギ２からの抗血清がCa2+依存性及びCa2+非依存
性の抗D4Kに抗体を含むことを示す。これはD4K分子にお
ける２つのエピトープの存在を示し、また１つ又は両方
の確認が個々の動物に依存することを示す。TG−CAPFD4
Kで免疫にしたウサギ17及び18から集めた血清の流出傾
向（第26図）は、EDTAで置換されるCa2+依存性の抗体及
び1Mプロピオン酸を用いて置換されるCa2+非依存性抗体
の双方を示す。（ａ）1:1000希釈×容量（ml）における125I−YD4Kへの
結合％、 （ｂ）10-5M D4Kの存在及び固定化されたペプチドに結
合する、D4Kの不存在における1:100希釈時のcpm単位で
の差;125I−ヤギの抗ウサギ×容量（ml）によつて検出 Ｃ−末端D4Kペプチドに対する抗体の特異性 ウサギ１からの血清中に存在する親和性精製したCa2+
依存性抗体の、種々のペプチドに対する相対的親和性
を、第２の抗体、即ちロバの抗ウサギ抗体で沈殿させる
ことによつて測定される125I−YD4Kへの結合競争を決定
することによつて検査した。合成ペプチドD4K、VD4K及
びAPFD4Kは10-8Mまでの範囲においてIC50値を有する同
様の濃度での結合を置換した（第３図）。これと対照的
に、Asp、Lys、Asp−Lys、Asp−Glu、ポリAsp、及び人
間のガストリン（gastrin）（ペンタGluシーケンスを含
有する残基１〜17）は10-14M程度の高濃度において125I
−YD4Kへの結合を置換しなかつた（第３図）。Asp2Lys
へのいくらかの結合は見られた。他のウサギからの親和
性精製したCa2+依存性及びCa2+非依存性抗体はテトラ−
Ｌ−アスパルチル−Ｌ−リシンシーケンスに対して非常
に類似の特異的親和性及び特異性を示した。 一例であるPAP分析の一般的な原理に対して非常に重
要なものには、またこれらの特異的抗D4K抗体の、膵臓
病の診断に対する適用については、抗D4K抗体がペプチ
ドのＣ末端に対するものであり、且つ100μg/mlまでの
酵素源の濃度でトリプリノーゲン（蛋白質のＣ末端にペ
プチドが結合している場合）によって置換されなかった
との発見である。しかしながらトリプシノーゲンをエン
テロペプチダーゼと共にインキユベーシヨン（以下、培
養ともいう）した時、遊離されたC4K含有の活性化ペプ
チドは合成125I−YD4Kの結合を活性的に置換し、トリプ
シノーゲンの２μg/溶液mlの活性化後に50％の置換を与
えた（第４図）。犬の膵液中の天然のトリプシノーゲン
も、免疫反応性のD4Kペプチダーゼを遊離するエンテロ
ペプチダーゼによつて活性化され（第４図）、10-8の
膵液の活性化後の競争的溶液相免疫分析において50％の
置換を示した。それ故にここに記述される新規なD4K特
異性の抗体は、内因的トリプシン禁止剤を含む体液に適
用しうるエンテロペプチダーゼ及びトリプシノーゲンに
対する新しい感度のよい分析法も提供する。 本発明者の製造する新規な抗D4K抗体のD4Kペプチドに
対する独特な特異性は、両生類キセノプス・ラエビス
（Xenopus laevis）の皮膚の分泌を検査することによつ
て更に示される。より大きい蛋白質中の内部シーケンス
としてのテトラアスパルチル−リシルペプチドは、対応
する核酸シーケンスを、皮膚のmRNAに由来するcDNAクロ
ーン中で見出すことによりこの動物種の皮膚で産するこ
とが予想された［53］。この両生類からの皮膚の分泌物
は種々のペプチドを、CCK、ガストリン、エンケフアリ
ン、TRH及びソマトスタチンを含む哺乳動物の神経系に
おける同等物（counterparts）を含むことが知られてい
る。本発明者はこの種の皮膚に由来する粗ペプチド抽出
物を得、これをC8カラムでの逆相HPLCに供した。多くの
ペプチドを示す流出傾向を第５図に示す。しかしながら
２つのピークだけがD4Kペプチドに対する免疫反応性で
あると同定され、そしてこれらを、合成D4K及びAPFD4K
に対してこの系で同定される移動位置に関し共クロマト
グラフイー処理した。遊離のＣ末端は前駆物資の処理に
より粗ペプチド混合物中に生じたと考えられたが、存在
するD4KのＣ末端の力価はペプチド抽出物のトリプシン
分解によつて増大し、いくらかの処理されない前駆物質
の存在を示した。カエルの皮膚におけるD4Kシーケンス
は哺乳動物のトリプシノーゲンに対して遠位の進化の関
係の結果として生ずるものと考えられる。この両性類か
ら得られる粗混合物中のD4Kペプチドの特異的認識は更
に親和性精製した抗D4K抗体の特異性を示す。 D4Kペプチドの免疫分析 溶液相の競争免疫放射分析 50mM Tris−HCl、20mM CaCl2、0.1％（w/v）BSA、pH
7.4（RIA緩衝剤）中の抗D4K抗血清の1:250希釈物或いは
親和性精製した抗D4K抗体の希釈物250μを0.2％（v/
v）の正常のウサギの血清をポリスチレン試験管中に含
有するRIA緩衝液中125I−YD4K（10,000cpm）の100μ
に添加した。次いでRIA緩衝液中で希釈した種々の標準
ペプチド或いは未知の血漿試料を含有する溶液100μ
を添加し、続いて0.2％の正常のウサギの血清を有するR
IA緩衝液で1:10に希釈したロバの抗ウサギIg血清［ウエ
ルカム・バイオテクノロジー（Wellcome Biotechnolog
y）］50μを添加した。この混合物を４℃で18時間培
養し、次いで試験管を４℃下に45分間3,000rpmで遠心分
離にかけ、上澄液を吸い取つた。沈殿中の放射能をLKB
ラツク−ガンマ計数管で決定した。 固相の競争免疫放射線分析 競争的沈殿放射線分析と関連したものよりも免疫分析
の簡便性及び感度を改良するために、固相技術を用いて
２種の分析を開発した。最初の方法では、PVCのミクロ
滴定プレートのウエルに60μg/mlの蛋白質濃度でBSA−Y
D4Kを塗布した。次いで合成の活性化ペプチドの標準濃
度を親和性精製した抗D4K抗体と共に予備培養し、これ
をウエルに適用した。そして固定化されたペプチドハプ
テンに付着する抗体を、125Iで標識したヤギの抗ウサギ
抗体で決定した。Ca2+非依存性抗体を用いることによる
典型的な標準曲線を第６図に示す。競争ペプチドの濃度
に対する急勾配の依存性は10-6〜10-9Mの範囲で明らか
であり、IC50は５×10-7であつた。 放射線分析の第２の方法は、固定化された親和性精製
した抗D4K抗体を用いて行なわれる。ミクロ滴定プレー
トのウエルに、0.1％（w/v）ナトリウムアジドを有する
50mM Tris−HCl（pH7.4）中Ca2+非依存性抗体（50μg/m
l）50μにより４℃で終夜塗布した。次いでプレート
を、10％ウマの血清（Ｔ−HS緩衝液）を含有する50mM T
ris−HCl（pH7.4）で３回洗浄し、室温で１時間Ｔ−HS
緩衝液と共に培養して残存する点をブロツクした。125I
−YD4K（100,000cpm）及び種々の濃度のD4K（10-4〜10
-13M）をＴ−HS緩衝液中に含有する溶液（60μ）を準
備した。この50μ部分を抗体の塗布したウエルに移
し、次いで室温下に５時間培養した。プレートをＴ−HS
緩衝液で３回洗浄し、室温で放置して乾燥させた。この
ウエルを切りとり、上述のように放射能を決定した。結
果（第７図）は、競争ペプチドの10-6〜10-12M間におい
て結合したcpmへの広い依存性を示し、そして約10-9Mの
IC50値を示す。これは感度の10倍の増加を表わす。 固相における酵素と関連した免疫分析 0.2M HCl（2ml）中ベンジジン２塩酸塩（10.2mg）
を、水（0.2ml）中亜硝酸ナトリウム（7.8mg）を添加す
ることにより４℃で１時間ジアゾ化し、次いで0.25Mホ
ウ酸ナトリウム/0.2M NaClの3.2mlでpH9に緩衝させた。
次いで0.16Mホウ酸ナトリウム/0.14M NaCl（pH9）の10.
8ml中において、ベンジジン試薬を＋４℃で添加し且つ
２時間培養することにより、YD4K（4.9mg）を西洋ワサ
ビのペルオキシダーゼ［シグマ（Sigma）;49.2mg］にカ
ツプリングさせた。次いで0.15M NaCl、水、更に0.15M
NaClに対して厳しく透析することによつて過剰の試剤及
びペプチドを除去し、3.2mg/mlの共役体の溶液を得た。 50mM Tris（pH7.4）、0.1％ナトリウムアジド中Ca2+
非依存性抗体（25μg/）の塗布したプレートを用いる
ことにより、第２の放射線分析法に対して上述したよう
にエリサ（ELISA）分析を行なつた。プレートを50mM Tr
is（pH7.4）、10％（v/v）ウマの血清、0.5％ツウイー
ン（Tween）20で３回洗浄し、50mM Tris（pH7.4）、10
％（v/v）ウマの血清で30分間ブロツクし、次いで50mM
Tris（pH7.4）、0.05％ツウイーン20中1:10,000ペルオ
キシダーゼ−D4Kペプチド共役体及び未知試料又は標準
的量のペプチドの混合物と共に培養した。20℃で１時間
後、プレートを３回洗浄し、そして0.1M酢酸ナトリウム
／クエン酸（pH6.6）中0.01％（w/v）3,3′、5,5′−テ
トラメチレンベンジジンと共に20℃で１時間培養するこ
とにより発色させた。反応を2M H2SO450mlの添加によつ
て停止させ、色を450nmで評価した。得られた置換曲線
は第７図に示す放射線分析と同様の感度を示した。 生体内におけるD4Kペプチドの安定性と分布の分析 D4Kペプチドは人間の血清及び活性化された膵液中で
安定であることがわかつた。免疫反応性のD4Kは、変性
していない人間の血清と共に37℃で６時間及び４℃で48
時間培養することにより変化しなかつた。人間の血清中
で保温した後のセフアデツクスＧ−100でのクロマトグ
ラフイーは、免疫反応性D4Kペプチドが緩衝液中遊離の
ペプチドと共に共クロマトグラフイー処理され且つ血清
成分と複合体を形成しないことを示した。 APFD4K及びD4Kの安定性は活性化された膵液と共に培
養することによつて検査し、そして生成物の化学的同定
はpH6.5における高電圧ペーパー電気泳動により行なつ
た。結果はAPFD4Kが遊離のAla、Pro及びPhe及びD4Kに迅
速に転化するが、D4Kシーケンスそれ自体が37℃で24時
間安定であることを示した。３つの別々の実験におい
て、新しい犬の膵臓の複数の65〜75mg部分を、改変した
バンク（Bank）の媒体通に入れ、そして100単位のエン
テロキナーゼ（シグマ・ケミカル社、EO885）の存在又
は不存在に37℃で４時間及び22℃で更に20時間培養し
た。培養媒体の上澄液の複数の100μ試料をある間隔
でとり、RIA緩衝液で2:1に希釈し、10分間沸とうさせ、
遠心分離にかけた。次いで上澄液をD4Kペプチドの分析
まで−20℃で貯蔵した。 ３回の実験の各において、エンテロキナーゼでの培養
を、膵臓組織の分解及び免疫反応性D4Kペプチドの迅速
な遊離と関連づけた。これらの変化はエンテロキナーゼ
なしでは短期間の培養において見られなかつた（第８
図）。培養媒体中のD4K免疫反応性ペプチドは24時間の
培養後高値で存在し続け、それが組合せられた膵臓の蛋
白質分解作用に対して耐性のあることを示した。 循環するペプチドの運命を決定するために、フエノバ
ルビタルで麻酔をかけたラツトの左の大脳静脈にD4K
（0.28ml、1mg/ml）を注射した。２時間の間15分毎に血
液試料（0.5ml）を集め、免疫分析に供した。この結果
は、投与した免疫反応性のD4Kが半減期約15分で、生体
内における血清から消えたことを示した。第２系列のそ
のような実験において、PBS1ml中YD4K100μg/kgを、３
匹の健康な絶食させたグレイハウンド犬の各に静脈内注
射した。４時間にわたりある間隔で血液と尿の試料をと
り、分析まで−20℃で貯蔵した。血液中におけるD4Kペ
プチドの平均半減期は犬の場合8.3分であるが、血清中
にはそれぞれ２時間の間D4Kが検知できた。D4Kは静脈内
投与の５分以内に尿に現われ、３〜４時間の長きにわた
り持続した（第９図）。 免疫反応性のD4Kペプチドの組織分布を決定するため
に限定された検討を行なつた。ペプスタチン0.1mg/ml、
キモスタチン0.1mg/ml、エラスチナル0.1mg/ml、及びト
ラシロール2000KN/mlを含有するHCl24ml中にいおて均質
化し且つ超音波処理することにより、ラツトの脳、膵
臓、十二指腸及び下垂体の抽出物を調製した。この抽出
物をpH5.6に調節し、0.1Mコハク酸塩緩衝液（pH5.6）で
希釈し、そして37℃で１時間エンテロペプチダーゼによ
り消化させた。エンテロペプチダーゼでの消化後、ラツ
トの膵臓及び十二指腸の抽出物にはそれぞれD4K6×10-7
モル／蛋白質mg及びD4K1.5×10-7モル／蛋白質mgが見出
された。ラツトの脳呼び下垂体の抽出物にはD4Kペプチ
ドが検出されず、同様に調製したモルモツトの脳の抽出
物の分析後も何も検出されなかつた。主膵臓導管のカヌ
ーレ処置及び続くCCK刺激によつて得た犬の膵液は、エ
ンテロペプチダーゼ活性化前に免疫反応性D4Kペプチド
を何も示さず、活性化後にD4K5.7×10-4モル/mlを示し
た。３匹の犬及び６人の正常な人間の固体からの多数の
試料における絶食している或いはポストプラデイアルな
血清又は尿においてD4K免疫反応性は同定できなかつ
た。穿孔した十二指腸潰瘍、腸管膜梗塞、虫垂炎、大動
脈瘤、クローン病又は胃腸内出血の患者の血清試料中に
はD4K免疫反応性が見出せなかつた。またアルツハイマ
ー病、リユーマチ性関節炎又はいずれか他の試験した非
膵臓病との関連において、人間の血清にはD4Kが検知で
きなかつた。 実験的及び人間の膵炎におけるD4Kペプチドの分析 22匹麻酔をかけたラツトについて、10〜20ミリモル／
のグリコデオキシコレートを単独で或いは50ngの高度
に精製した人間のエンテロペプチダーゼと共に含有する
緩衝液75μを30分間にわたり制御された膵臓内導管中
をミクロ潅流させることにより、急性の壊死性膵炎を実
験的に誘導した［54］。続いてラツトはCCK−33の10IDU
/kg/時を用いることにより、膵臓の刺激と一緒に連続的
な静脈内の鎮痛剤を受けた。導管内潅流前及び３時間後
に血液を採取し、遊離のD4Kに関して分析した。膵臓の
組織学的検査はそれぞれの場合深刻な急性膵炎を示し
た。循環する免疫反応性D4Kペプチドは見かけの平均基
礎値の5pモル/mlから３時間後の平均84pモル/mlまで22
匹の動物の各において病気の進行と共に上昇した。これ
に対し、CCK−８刺激過多によつて誘導された急性の浮
腫性膵炎の６匹のマウスからの膵臓均質物中には遊離の
D4Kペプチドは同定されなかつた。 D4Kペプチドが前述した如き深刻な急性膵炎の患者か
らの血清又は尿中で同定しうるかどうかを決定するため
に、予備的な臨床研究を行なつた。膵炎の22人の患者か
ら任意に血清といくつかの場合には尿の試料を集めた。
これらの試料はすべてが病気の初期の時間にとつたもの
ではなかつた。ランソン（Ranson）の基準［56］に基づ
けば、14人の患者は、軽い浮腫性の肝炎をもち、８人の
患者は深刻な壊死性膵炎を有するものと評価できた。浮
腫性は病気の患者からの試料には、すべてにおいて血清
アミラーゼが実質的に上昇したにも拘らず、免疫反応性
D4Kペプチドが見出せなかつた。一方D4Kは重い膵炎と判
定された８人のうち６人からの血清及び／又は尿試料中
にはD4Kが同定できた（第２表）。 セント・ジヨージ（St.George）において1985年１月
〜1987年３月に集められたランダム試料のTAP分析。−2
0℃で貯蔵。 JS血清試料のセフアローズG15におけるクロマトグラ
フイーは、免疫活性が標準的なAPFD4Kと共に移動すると
いうことを示した（第10図）。更に腹痛と予め75％の遠
位膵臓切除を受けた慢性膵炎の憎悪とを呈する１人の患
者（PD）から血清を得た。この試料からは10-8Mの程度
でD4Kペプチドが検出できた。 第２の臨床研究において、スコツトランドのグラスゴ
ー・ロイヤル・インフアーマリー（Glasgow Royal Infi
rmary）に及びグラスゴー地区の他の病院に認められた6
9人の患者から日常的に毎日試料採取している間に貯つ
た血清についてD4Kペプチドに対する分析を行なつた。
血清を−20℃で凍結して貯蔵し、そして融解して一部を
とり、更に再凍結し、その後再融解して分析した。279
の貯蔵した血清の全部は５日間までの間に69人の患者か
ら採取した血清試料を表わすが、いくつかの場合には１
回だけの試料であつた。D4Kペプチドに対する分析は膵
炎の進行度又は臨床学的経過について予備知識なしに行
なつた。浮腫性膵炎を有すると評価された39人の患者の
うち36人（92％）はD4K陰性であり、より深刻な患者23
人のうち13人（56％）はD4K陽性であつた。この一連の
日常的な凍結−融解−凍結−融解の血清だけの試料につ
いて回顧的に行なつたD4K分析の全精度は79％であつ
た。見かけの偽りの陽性（３）は多分臨床学的評価法の
公知の不適性を反映する。見かけの偽りの陰性（10）
は、日常的な１日１回の血清試料採取の、変化する臨床
的状態からの遊離によつて導入される誤差及び尿分析に
よつてもたらされる更なる情報の不存在と一緒にこれを
反映しているようである。 セント・シヨージ病院（London、SW17、英国）に認め
られ且つ急性膵炎と高アミラーゼ血症を、意図に沿つて
D4K分析を用いて検討し、病気の深刻さ及び進行を監視
した。これをするために、許可時に及び最初の48時間４
〜６時間間隔で、その後８時間毎に血液と（得られるな
らば）尿の試料を同時にとつた。試料をD4Kの分析のた
めに−20℃で凍結貯蔵した。軽い／重い膵炎を有する
が、後に偽のう胞を発現した１人の患者TP（第12図）は
許可から24時間後に250pモル/mlの初期尿D4K値を有した
が、この時点で血清中にはD4Kは検知できなかつた。こ
れは尿分析の進歩しない性能及び犬において実験的に同
定した静脈投与後のD4Kペプチドの長期にわたる尿分泌
を反映している。入院第４日目に、D4Kペプチドは血清
中に一時的に現われ、後に尿中で上昇した。これらの変
化は明確な臨床学的状態と適合し、D4K及び他のPAP分析
の、正確な病気の過程の監視胞としての役割りを支持す
る。 この系列において軽い膵炎をもつているが、呼吸器不
全である第２の患者CMにおいて、許可時に血清のD4Kは3
8pモル/mlであり、また尿のD4Kは100pモル/mlであつ
た。双方は数時間以内に０まで低下し、その後陰性のま
まであつたが、続いて2cmの偽のう胞及び小網嚢の液体
採取物か同定できた。これはD4K分析の、小さい面積の
膵臓壊死でさえ予知しうる能力を更に支持する。腹痛と
血清アミラーゼ＞7000単位を有する許可されたこの群の
第３の患者CTMは、初期の徴候にも拘らず５日間以上に
わたつて血清及び尿のD4Kが陰性のままであつた（第12
図）。この患者は浮腫性膵炎と共に胆石を有し、続いて
これを５日間にわたつて散らした。これもまた急性の病
気における正確な深刻度の指標として、陰性のD4K分析
の役割を支持した。これらの結果は、グラスゴーの血清
だけの研究におけるかなりの数の偽りの陰性D4K分析が
しばしばの血液及び尿の試料採取の併用で起こらなかつ
たであろうし、また本分析が上述したように臨床的に適
用しうることも示唆した。 慢性の再発した悪い膵炎を有する２人の患者からの更
なる血清試料は正常の限界内のD4K値及び血清アミラー
ゼ値を示した。これは慢性の病気におけるD4K分析の診
断的可能性を支持しよう。臨床的及び実験的な発見をD4
Kに分析と一緒にすると、本発明の、膵炎の診断、進行
度の予測及び病気の過程の監視における提案した役割が
強く支持されよう。また発見は、Ｃ末端に向いた抗体を
膵臓の病気に用いることによる体液の、遊離のPAP分子
に対する特異的分析に対して本発明で具現化された本質
も支持する。 本発明の他のPAP分析 本発明に従いＣ末端に向いた抗体を遊離の種に対して
用いることよる特異的分析に適当である他の膵臓の酵素
源の活性化ペプチドは、ホスホリパーゼA2、プロコリパ
ーゼ、プロエステラーゼ１及びプロエステラーゼ２、プ
レカレクレイン、及びプロカルボキシペプチダーゼＡ及
びＢのそれを含む。これらの例はプロホスホリパーゼA2
のカルボキシ末端シーケンスAsp−Ser−Gly−Ile−Ser
−Pro−Argを含むペプチド［41］、プロコリパーゼのカ
ルボキシ末端Ala−Pro−Gly−Pro−Argを含むペプチド
［42］、及びプロエステラーゼ２のカルボキシ末端Gly
−Asp−Pro−Thr−Tyr−Pro−Pro−Tyr−Val−Thr−Arg
を含むペプチド［43］或いはプロエステラーゼ１又はプ
レカレクレインの活性化ペプチドのシーケンスを含むペ
プチドである。５つ又はそれ以上の蛋白質分解オリゴペ
プチドを表わすこれらのシーケンス部分例えばプロエス
テラーゼ２からのPro−Pro−Tyr−Val−Thr−Argも使用
しうる。プロカルボキシペプチダーゼＡ及びＢの非常に
大きい活性化ペプチドも標的として適当なオリゴペプチ
ドシーケンスを含有しうる。Ｃ末端に向いた抗体の使用
は、人間の血漿及び尿中に普通存在する酵素源形［57］
が、、すでに詳細な例として示したトリプシノーゲンか
らの、D4K含有の遊離ペプチドの分離における如く分析
において認識されないことを保証しよう。 更に興味あり且つ重要であるものは、プロホスホリパ
ーゼA2（PLAP）の活性化ペプチドである。プロホスホリ
パーゼA2は大食細胞［58］、肺胞大食細胞［59］、凝集
した血小板、及びポリモルフヌクレアー（polymorphnuc
lear）白血球［61］を初めとし、並びに一般にリソソー
ム中に存在する多くの細胞種に豊富に存在する。活性ホ
スホリパーゼA2は内毒素衝撃［63］、呼吸器病症候群、
急性の腹部症状を含むいくつかの炎症状態［62］におい
て、またミコバクテリア［61］、ペプチド［60］及びCa
2+［39］に呼応してこれから遊離される。これらの起源
からのプロホスホリパーゼA2は膵臓プロホスホリパーゼ
A2と同一の遺伝子の生成物であり且つ同一のシーケンス
Asp−Ser−Gly−Ile−Ser−Pro−Argの活性化ヘプチド
を有する場合、本発明で定義される如きPLAP分析はこれ
らの変調の認識及び進行度の予測に適用しうる。有用な
試験でもあろう。非膵臓プロホスホリパーゼA2の活性化
ペプチドが膵臓プロホスホリパーゼA2と異なるシーケン
スを有するならば、PLAP分析は膵臓の病気に特異的にな
ろう。 ホスホリパーゼA2の活性化ペプチド（PLAP）及びプロコ
リパーゼの活性化ペプチド（CLAP）の合成 本発明の更なる実施例は、PLAP及びCLAPにＣ末端的に
特異的な免疫分析の開発と関連したペプチドの合成を含
む。これらのペプチドはAsp−Ser−Gly−Ile−Ser−Pro
−Arg、Cys−Tyr−Asp−Ser−Gly−Ile−Ser−Pro−Ar
g、Ala−Pro−Gly−Pro−Arg、及びCys−Tyr−Ala−Pro
−Gly−Pro−Argである。合成は一時的な塩基で除去し
うるFmoc/α−アミノ基の保護及び次の改変以外クリフ
（Cliffe）ら［50］の記述する方法を用いることによ
り、ｐ−アルコキシベンジルアルコールの誘導体化され
たポリスチレン［スイス国、バヘム・フエインケミカリ
エン社（Bachem Feinchemikalien AG）からの0.67ミリ
当量/g］上で行なつた。Ｃ−末端残基を混合無水物法に
よりその保護された誘導体Fmoc（Mtr）Argとしてカツプ
リングさせた。保護したArgの２当量を、ジメチルホル
ムアミド中2,6−ジクロルベンゾイルクロライド２当量
及び蒸留ピリジン３当量と共に、アルコキシベンジル基
１当量を有する樹脂と16時間培養した。続いてすべて、
Fmocアミノ酸を１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエス
テルとして２倍過剰量でカツプリングさせた。次の誘導
体を使用した:Fmoc−Pro、Fmoc−（OtBu）Ser、Fmoc−I
le、Fmoc−Gly、Fmoc−（OtBu）Asp、Fmoc−（OtBu）Ty
r及びFmoc−（SAcM）Cys。合成の終りに、Ｎ末端のFmoc
基を20％（v/v）ピペリジンでの処理により10分間開裂
し、そしてペプチドを開裂し且つ50％（v/v）トリフル
オル酢酸、５％チオアニソール、45％（v/v）ジクロル
メタンで処理して部分的に保護基を除去した。これを蒸
発させ、エーテルで４回洗浄し、そして凍結乾燥した。
保護された（SAcM）システイニル基を含有するペプチド
の部分（250mg）を最小容量の水中に抽出し、NH4OHでpH
4に調節した。次いで酢酸水銀（200mg）を添加し、pH4
に再調節した。１時間後にペプチドを50mlまで希釈し、
H2Sを15分間、続いてN2を10分間溶液中に通じた。黒色
の沈殿（HgS）を遠心分離によつて分離し且つペプチド
を凍結乾燥によつて分離した。 ペプチドを0.1M酢酸中セフアデツクスＧ−15でのゲル
クロマトグラフイーにより精製し、逆相HPLC及びアミノ
酸分析によつて同定した。1.0ml/分で22分間にわたる0.
05％トリフルオロ酢酸及び５〜25％（v/v）アセトニト
リル中のブラウンリー（Brownlee）Ｃ−８アクアポア
（Aquapore）RP−300において、ペプチドはCYAPGPRに対
して9.14分に、APGPRに対して5.49分に単一のピークを
与えた。0.5ml/分で30分間にわたる0.05％トリフルオル
酢酸及び５〜50％のグラジエントのアセトニトリル中の
μボンダパク（Bondapak）C18において、CYDSGISPRは1
1.7分で及びDSGISPRは7.8分で流出した。アミノ酸分析
はこれらのペプチドの正しい組成を確認した。 Cys−Tyrアミノ末端延長部を有するペプチドは、ハプ
テン化或いは顕在化剤又は固相の結合、及び固相上に用
いるための元のペプチドに対して、又は本発明のD4K例
に記述した如き競争配位体として使用される。ポリクロ
ーナル又はモノクローナルのいずれかの特異的Ｃ末端抗
体は対応する固定化されたペプチドでの親和性クロマト
グラフイーで精製され、これをD4Kの例に詳述したよう
な固相又は液相分析の際に使用する。顕在化剤を有し又
は固相上に固定化されたペプチド並びに顕在化剤を有す
る又は有さない及び遊離の又は固相に結合した特異的抗
ペプチド抗体及びそのような試剤の、病気の診断及び進
行度の監視におけるPAP分析の遂行における使用は、本
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性化ペプチドに対する体液の特異的分析に関する。 背景の技術 急性及び慢性の膵炎は、近年事例数のかなりの増大を
示す人間の病気である［１］。急性膵炎は吐き気の状態
を呈し、一方慢性の膵炎は一般に慢性的又は断続的な腹
痛という異なる診断を含む。 外分泌膵臓は、活性形で生合成されたアミラーゼ及び
リパーゼを含む消化酵素及び不活性なプロ酵素又はチモ
ーゲン（酵素源ということもある）として合成されるト
リプシノーゲン、キモトリプシノーゲン、プロエラスタ
ーゼ、プロカルボキシペプチダーゼ及びプロホスホリパ
ーゼA2を含むその他のものをある範囲で産生し且つ貯蔵
する。酵素源の活性化は、普通膵液の十二指腸への分泌
に続いて起こり、十二指腸のエンテロペプチダーゼによ
るトリプシノーゲンの活性なトリプシンへの特異的接触
転化を含む（E.C.3.4.21.9）。これはテトラ−Ｌ−アス
パルチリ−Ｌ−リシンのシーケンスを含むアミノ末端の
オリゴペプチドをトリプシノーゲンから除去し、これに
続いて一連の蛋白質分解開裂により他のプロ酵素のトリ
プシン活性化を行なう。この生理学的課程で遊離される
膵臓の酵素源の活性化ペプチドは十二指腸のオリゴペプ
チダーゼによつて分解されると考えられる。 急性の膵炎は２つの明白な臨床病理学的種類が特色で
ある［２］。急性浮腫の膵炎において、膵臓のアシナー
（acinar）細胞の損傷は、不活性な消化酵素源を活性な
アミラーゼ及びリパーゼと共に腹腔内及び循環系へ漏出
する。この活性な酵素は得られる腹水並びに血液及び尿
中において同定することができ、一方プロテイナーゼ消
化酵素源及びプロホスホリパーゼは活性化されていない
ままである。局所的な炎症及び活性リパーゼによる脂肪
ネクローゼが起こるけれど、この状態は一般に致命的で
なく、伝統的な処置により数日間で回復する。一方急性
の壊死性膵炎では、膵臓のアシナー細胞の損傷及び消化
酵素の遊離が種々の程度の消化酵素源の活性化を付随す
る。膵臓のプロテイナーゼと循環する巨大分子禁止剤の
間に複合体が生成するけれど、これらの複合体のいくつ
かは触媒性を保持している。ホスホリパーゼA2も血漿中
で活性である。広い局所的な及び広がった多器官の損傷
は高い死亡率と致死をもたらす。 急性膵炎の生化学的診断は、伝統的には病気の結果と
して膵臓から遊離される膵臓の消化酵素又はその酵素源
の、血漿、血清、尿、又は腹水中での検出に依存した。
血清中の全アミラーゼ活性の定量化は使用されてきた主
な診断試験であつた［３］。敏感な免疫学的方法の導入
はトリプシン及びトリプシノーゲン［４〜18］、エラス
ターゼ［19、20］、キモトリプシン［21］、ホスホリパ
ーゼ［22、23］、カルボキシペプチダーゼ［24］及び更
にリパーゼ［25、26］及び膵臓トリプシン禁止剤［27、
28］を含む膵臓の蛋白質分解酵素及びその酵素源に対す
る分析の開発を可能にした。これらの免疫分析のいくつ
か、特にポリクローナルな抗血清を用いるものは、その
標的分子の種々の蛋白質分解のため複雑であつた。これ
らの分析に関連する他の問題は、巨大分子禁止剤との複
合体において標的酵素に結合する抗体の立体的禁止のた
めに生ずる［29、30］。更に親酵素源及び活性酵素の双
方を認識する抗体は双方間を識別することができない。 アミラーゼ分析は、膵臓のイソアミラーゼと他の器
官、特に唾液腺からのアミラーゼの活性間を識別するよ
うに改良された［31〜33］。しかしながら、急性膵炎を
もつ多数の患者において、これらの試験の多くを同時に
詳細に評価すれば、リパーゼ又は免疫反応性トリプシノ
ーゲンの検知が膵臓のイソアミラーゼだけの測定よりも
初期の診断精度を改善せず、また深刻な急性の壊死病の
生化学的認識を可能にしないということがわかる［3
4］。膵臓病の診断におけるアミラーゼの評価は、高ア
ミラーゼ血症の散在的事例、膵臓のアミラーゼを他の起
源からのそれと識別する必要性、深刻な急性膵炎と関連
したアミラーゼ活性の種々の劣化、及び血清アミラーゼ
量を膵炎の深刻さと結びつける又は壊死の徴候を同定す
ることの不可能性、のために複雑である。血清アミラー
ゼの評価もエタノールで誘導された膵炎の認識に関して
信頼性がない［35〜37］。触媒的に活性な膵臓のホスホ
リパーゼA2に対する分析によつて進行度の予知の精度を
改良する試みは、より実りある手法であることが証明さ
れた［38］。しかしながら、これはホスホリパーゼA2が
大食細胞、顆粒球、血小板及び他の細胞中に存在し［3
9］及び他の急性の腹部症状及び敗血症シヨツクの際に
血液中で増加する［40］から特異性に関して難点を有す
るようである。 それ故に急性膵炎における主な臨床学的診断の難点
は、浮腫性の膵炎による高アミラーゼ血症を伴う深刻な
腹痛を、強力な処置、特異的酵素禁止剤、及び更に外科
的介入及び部分的切除が生命を救いうる時の病気の極く
早い時間におけるより深刻な壊死形態から識別すること
であつた。 慢性の膵炎においては、慢性膵炎による亜急性又は断
続的な腹痛が血清殿粉酵素増加と関係なく且つそのよう
な徴候の多くの他の潜在的な原因からの区別が必要とさ
れるから、診断の問題は別の問題である。 詳細の説明 本発明は、利用可能なカルボキシ末端の存在する遊離
の膵臓活性化ペプチドPAP（活性化中に限定された蛋白
質分解によつて特異的に開裂する膵臓酵素源の活性化ペ
プチド）に対する体液の特異的分析に基づく。そのよう
な分析は、膵臓酵素源の活性化を認識し且つ定量化する
正確な方法を始めて提供しよう。本発明は膵炎の異なる
形態がPAPの特異的遊離などと関係するという本発明者
の判断に基づく。この一般的な方法は酵素源の活性化を
伴つて又は伴なわずに起こる膵炎の形態間を識別するで
あろうし、また急性膵炎における診断、進行の予測及び
病気の過程の監視に対して臨床的に適用しうる。これは
悪化している慢性膵炎に対する正確診断試験も提供しよ
う。 この試験では、患者の体液、特に血液の血漿、血清、
尿又は腹水の試料を１つ又はそれ以上のPAPについて分
析する。そのような方法に対して利用可能なPAPは、D4K
シーケンスがそれ自体膵臓の蛋白質分解に耐性のあるト
リプシノーゲン活性化ペプチド（TAP）を含有するテト
ラ−Ｌ−アスパルチル−Ｌ−リシン（D4Kはこの及び続
いて言及するPAPに関連して用いられる単一文字アミノ
酸コード）を含む。他の適当な活性ペプチドはDSGISPR
［41］、即ち人間の膵臓のプロホスホリパーゼA2の活性
化ペプチド（PLAP）及びAPGPR［42］、即ちプロコリパ
ーゼの活性化ペプチド（CLAP）である。更にプロエラス
ターゼＩ及びII活性化ペプチド［43］又はその限られた
蛋白質分解の誘導体、並びにプロカルボキシペプチダー
ゼＡ及びＢから開裂した大きい（アミノ酸90〜100）ア
ミノ末端残基も考慮しうる。本発明において特に重要な
ことは、特異的にカルボキシ末端でPAPに向く抗体を用
いるという手法である。これは、限定された加水分解に
よる酵素源の活性化が確かに起つた時だけ抗体の結合と
分析における陽性の結果が報告されること、及びPAPが
そのカルボキシ末端で結合している酵素源それ自体が認
識されないことを保証する。 実施例 トリプシノーゲン活性化ペプチド（TAP）の免疫分析 以下の記述において、しばしばトリプシノーゲン活性
化ペプチドTAPの免疫分析が参照される。これはPAPの例
であるが、TAPに関する以下の記述に述べられているも
のは上記及び下記の他のPAPにも同様に当てはまる。TAP
を参照すると、これは存在するであろうTAPが異なるア
ミノ末端アミノ酸残基が存在しうるから必ずペンタペプ
チドD4Kそれ自体だけであるということを暗示しない。
これらはトリシノーゲン・イソ酵素間で異なり、或いは
アミノ末端分解で改変されていてもよい。分析で認識さ
れるTAPペプチドはカルボキシ末端にD4Kシーケンスを含
み、またそれが認識しうるD4Kシーケンスである。 トリプシノーゲンの活性化ペプチドは背つい動物の進
化において高度に保存され、そして特異的蛋白質分解活
性化中に開裂するリシル−イソロイシル標的結合の上流
にポリアニオン性シーケンス（又は配列）D4Kを含む（4
4、45）。アミノ酸シーケンスD4Kに対する試料の分析は
Ｃ−末端D4Kペプチドに対する特異性を有するD4Kシーケ
ンスを認識する抗体を用いることにより最も満足に行な
われ、そのような抗体は本発明の異なる観点を構成す
る。これらの抗体はポリクローナル又はモノクローナル
であつてよい。本発明のポリクローナル抗体は、免疫源
として、D4K又は短いリーダー配列（例えば、システイ
ンを有してもよいアラニル−プロリル−フエニルアラニ
ル）をアミノ末端に有するD4Kを用いるか、或いはハプ
テン化したD4Kを用いる通常の技法によって動物中に増
加せしめうる。ハプテン化が必要な場合、D4Kシーケン
ス又はそれを含有するペプチドは通常のペプチドハプテ
ン例えば牛の血清アルブミン（BSA）又はチログロブリ
ン（TG）に化学的に結合していてもよい。 モノクローナル抗体を必要とする場合、それらは再び
D4K又はD4Kを含むアミノ酸シーケンス又は免疫源として
使用する前にハプテン化したD4Kを用いる通常の雑種（h
ybridoma）技術によつて製造しうる。D4Kに対するモノ
クローナル抗体も、予じめ調製した抗D4K抗体に結合し
たD4Kを免疫源として用いることによつて製造しうる。 本発明は、D4KシーケンスのようなPAPの分析が患者の
膵臓の変調の存在及び本質に関する有用なあいまいでな
い情報を提供しうるという本発明者の認識に基づいてい
る。分析を行なう正確な方法は限定されるものでなく、
現存する直接的又は間接的（競争）分析並びに二点（si
te）サンドウイツチ分析及び抗体占有の定量化を含む分
析のいずれかが利用できる。分析は普通D4Kペプチドが
存在する試料における、D4Kシーケンスと抗体を含むペ
プチド間の共役体の生成を含む。該共役体は顕在化する
（或いは、直接又は間接的に検出しうる）標識を有し且
つ固／液相の反応混合物の固有又は液相のいずれかにお
いて生成せしめ、固相を液相から分離し、そして固相又
は液相のいずれかにおける顕在化する標識の存在又は量
を、試料中のD4Kシーケンスを含むペプチドのそれぞれ
の存在又は量の尺度として決定する。競争分析は通常D4
Kに競争する顕在化する標識の付与を必要とするが、第
２の抗D4K抗体の標識化は二点サンドウイツチ分析に対
して必要である。通常の顕在化する標識のいずれかが使
用でき、免疫蛍光法も使用しうるが酵素標識及び放射線
標識は好適である。酵素又は放射線標識の選択は125I、
即ち好適な放射線活性標識の１つであつてもよく、また
西洋ワサビのペルオキシダーゼ又はアルカリホスフアタ
ーゼは好適な酵素標識である。ビオチンも使用しうる。
顕在化する標識を有するポリクローナル又はモノクロー
ナル抗D4Kは、他のポリペプチドに共役した標識された
ペンタペプチドを含む成分アミノ酸及びポリペプチドの
１つに直接結合した顕在化する標識をもつペンタペプチ
ドD4Kと同様に、本発明の更なる観点を構成する。増巾
法、例えばD4Kペプチドに結合したアルカリホスフアタ
ーゼに結合するものを、NADP+をNAD+に転化するのに用
いてもよい。次いでこのように生成したNAD+は強く色の
ついたホルマザン（formazan）染料を与えるNAD+−特異
性のレドツクスサイクルを触媒的に活性化する［46］。 抗D4Kは本発明に従い、通常の放射線免疫分析におい
て、酵素に結合した又は酵素で増巾した免疫分析におい
て、開発された技術に従い、或いは化学発光、生物発
光、光電子放出蛍光分析、電子発光、偏光蛍光、時間解
析又は他の技術を用いる他の免疫分析において使用する
ことができる。これらは補助実験室、医者の事務所、患
者部門、病室又は集中管理室における使用に適用できる
参照実験室免疫分析又は簡単化された方法の基礎を形成
しよう。これらの方法は不活性な固体物質例えば試験溶
液を通流することのできるカラムに充填しうるラテツク
ス粒子又はポリスチレン球又は粉末へ結合させることに
より抗D4K抗体又はD4Kそれ自体を固定化することを必要
とする。そのような固定化したポリクローナル又はモノ
クローナル抗D4K及び固定化ペプチドは、顕在化する標
識を付着又は未付着のリジン（Ｋ）をカルボキシ末端と
して有するD4Kシーケンスを含んでなり、本発明の異な
る観点を構成する。 更に本発明は診断用試験キツトを提供する。そのよう
なキツトは本発明の標識されたペプチド（単独又は他の
ペプチドへ共役したもの）或いは本発明の標識された抗
体を１つの成分として含んでなる。他の試験キツトは、
固体成分が本発明の固定化されたペプチド又は抗体であ
り且つ成分の１つが好ましくは酵素又は放射線活性標識
で標識されているという固体及び液体成分を含んでなる
ものである。 一般に固定化された抗D4Kを用いる本発明による分析
は、D4Kペプチドを含む疑いのある液体試料を、顕在化
する試剤を有するD4Kと競争的にポリクローナル又はモ
ノクローナル抗D4Kを含む固相と接触させ、そして顕在
化する試剤を有するD4Kの存在に関して固相又は液相の
いずれかを分析し且つその共役体の存在を試料のD4K含
量の尺度として採用するという過程を含むであろう。本
発明による分析は、D4Kペプチドを含む疑いのあう液体
試料を、結合したポリクローナル又はモノクローナル抗
D4Kを有する固相と接触させ、固体を液相から分離し、
そして固定化された抗D4Kによつて結合したD4Kを、顕在
化する試剤を有するモノクローナルの第２の抗D4K抗体
を用いて定量化するという方法を含む。他の方法、即ち
試験試料に露呈した後の固相上における１つ又は２つの
寸法での抗体又は固定化されたD4Kペプチドの占有を、
顕在化する試剤に結合したD4Kペプチド又は抗体を続い
て用いることによつて定量化するという方法も使用でき
る。本発明による分析は、顕在化する試剤を有する又は
有さない抗D4Kポリクローナル又はモノクローナル抗体
を試験すべき試料に添加し、そしてこの処理した試料を
固相上に固定化したD4Kペプチドと直接又は介在物を通
して接触させるという方法も含み、そのような固定化さ
れD4Kペプチドは本発明の一部を構成する。膜又は他の
固相担体上のD4Kペプチドは、中央に凹み、環、又はミ
ニカラムを有して、円形をしていてよい。試験は結合し
た顕在化する試剤或いは抗D4K Igに対する第２の抗体に
結合した顕在化する試剤を用いることによつて、固定化
されたD4Kに結合する抗D4Kの強度及び／又は分布によつ
て読みとられよう。また本発明による分析は、D4Kペプ
チドを含む疑いのある試料を、不活性な固体担体上に固
定化された且つ顕在化する試剤を含む又は含まない抗D4
K抵抗及びD4Kを含んでなる複合体と接触させる方法を含
む。D4Kが直接担体に結合するならば、抗体はいずれか
の顕在化する試剤を有し、またその逆も可能である。次
いで固相から最初のD4Kを試料中のD4Kペプチドで置き換
えて定量化することができる。 本発明による分析は膵炎の深刻な進行を監視するため
にも使用しうる。これをするために、体液の試料を、互
いに１〜４時間の間隔を置いて少くとも２つの別々の場
合に患者から採取し、各試料をD4Kペプチドの濃度に関
して分析する。いくつかの試料を24時間にわたつて患者
から採取することにより、患者の状態の進行度が変化す
るかどうか、また外科的又は他の特異的処置を必要とす
るかどうかを決定することが可能である。 D4Kペプチド及び他のPAPは、それらが親和性クロマト
グラフイーによつてポリクローナル又はモノクローナル
抗D4K又は他の抗PAPの精製に使用しうるという点でも有
用である。そのような精製法においては、D4Kペプチド
又は他のPAPを普通立体的に近づきうる具合に固体担体
例えばポリスチレン又は多糖類例えばポリデキストリン
上に固定化し、そして比較的不純な抗D4K又は他の抗PAP
を含む液体試料を、担体上においてD4K/抗D4K又は他のP
AP/抗PAP共役体を生成する固定化されたD4Kペプチド又
は他のPAPと接触させる。固相を洗浄した後、抗D4K又は
他の抗PAPを流出させて抗D4K又は他の抗PAPの比較的よ
り純粋な形を含有する溶液を得る。 次の実施例は本発明を例示するために示す。 これらの実施例において、１文字及び３文字のアミノ
酸の略号は次のようにして使用する： Ｄ Asp アスパラギン酸 Ｋ Lys リジン Ｙ Tyr チロシン Ｃ Cys システイン Ａ Ala アラニン Ｐ Pro プロリン Ｆ Phe フエニルアラニン Ｓ Ser セリン Ｇ Gly グリシン Ｉ Ile イソロイシン Ｒ Arg アルギニン Ｔ Thr スレオニン Asp4−Lys（D4K）ペプチドの合成 人間のトリプシノーゲンに見出される活性化ペプチド
に相当するペプチド、Asp−Asp−Asp−Asp−Lys（D4K）
及びAla−Pro−Phe−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys（APFD
4K）を、蛋白質担体に化学的に架橋しうる側鎖を与える
べく特別な残基Tyr及びCysをその各Ｎ末端に有して合成
した。D4Kシーケンスは攻撃的酸によつて分解するか
ら、可逆的なα−Ｎ−末端保護のために塩基で除去しう
るＮ−フルオロエネイルメトキシカルボニル（Fmoc）基
を使用した「47」。ペプチドYD4K及びCAPFD4Kを、酸で
除去しうるｐ−アルコキシベンジルアルコールＣ末端結
合剤を用いてポリスチレン固相担体上に合体させた［4
8］。合成には、不必要であることがわかつたジオキサ
ン;H2Oでの洗浄を省略し且つジクロルメタン中よりもむ
しろDMF中において20％ピペリジンで脱プロトン化する
以外メイエンホフア−（Meienhofer）等の方法［49］の
改変法を使用した。 本発明者の最初の研究は、１つの保護されたアスパル
チル基を固定化されたＣ末端（Ｎ−ｔ−Boc）Lys残基に
結合させる場合、α−アミノFmoc基の塩基触媒による除
去時にジペプチドAsp−Lysが環化し、その残基が樹脂か
ら遊離されるということを示した。それ故にテトラアス
パルチルシーケンスは、樹脂に結合したペプチドへのカ
ツプリング中のラセミ化を抑制するためにヒドロキシベ
ンゾトリアゾールカツプリングを用いることにより、予
じめ製造した保護されたAsp−Aspジペプチドを用いて合
体させた。各添加後のペプチド結合の生成の完了はニン
ヒドリン又はプロリンに対するフルオレサミン（fluore
scamine）で監視した。各Asp−Aspジペプチドに対して
及びFmoc（Trt）Cysに対して２重カツプリングが必要で
あつた。樹脂からの開裂とｔ−ブチル側鎖保護基の脱保
護基を、CH2Cl2中50％TFA（CAPFD4Kの場合に５％エチル
メチルスルフイドも含有）を用いて同時に行なつた後、
ペプチドを連続的なゲル濾過及びイオン交換クロマトグ
ラフイーによつて精製して必要なペプチドを62％（YD
4K）及び35％（CAPFD4K）の収率で製造した。このペプ
チドは、pH6.5における高電圧の紙での電気泳動におい
て１つのニンヒドリン陽性スポツト（RAspYD4K＝0.79、
及びRAspCAPFD4K＝0.76）を示し且つ酸での加水分解後
に満足しうるアミノ酸分析値を示すので均質であること
がわかつた。本発明者は13C−NMRにより、この方法によ
つて合成したトリプシノーゲン活性化ペプチドがα−β
トランスペプチド化を含まないということをすでに示し
た［50］。 D4Kペプチドのハプテン化 合成トリプシノーゲン活性化ペプチドの、蛋白質担体
への特異的アミノ末端カツプリングによつて２つのハプ
テンを製造した。バツシリ（Bassiri）及びウチガー（U
tiger）（1972）［52］の記述するように、ベンジジン
二塩酸塩を用い、Tyr残基でビスジアゾ化することによ
り、YD4Kを牛の血清アルブミン（BSA）に架橋した。精
製した付加物BSA−YD4Kのアミノ酸分析は、BSA分子当り
８つのペプチドの置換を示した。ペプチドCAPFD4Kのス
ルフイドリル基を、ヘテロ二官能性結合剤ｍ−マレイミ
ドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシサクシニミドを用いて牛
のチログロブリン（TG）上のLysのε−アミノ基にカツ
プリングさせて［52］、チログロブリン分子当りペプチ
ド40モルの置換したTG−CAPFD4Kを製造した。 特異的抗D4K抗血清の生成 フロインドの完全アジユバント［マイルス研究所（Mi
les Laboratories）］BSA−YD4K2.9mg/ml又はTG−CAPFD
4K1.1mg/mlとの等量の乳化液を氷上での超音波により調
製した。NSWラビツトを１つ又は他の乳化液2.0mlで皮下
的に及び筋肉内的に免疫にし、そして、乳化液又は対応
するハプテン−ペプチドを、毎月与えるフロインドの不
完全アジユバントと共に用いることにより増強した。免
疫化前に及び各誘発試験から10日後に血清を得、そして
固相免疫放射線分析を用いて抗D4K抗体の分析に関して
試験した。50mM Tris−HCl、20mM CaCl2、0.1％ナトリ
ウムアジド（TCA緩衝液）中蛋白質60μg/mlの50μを
４℃に16時間保温することによつてBSA−YD4K及びTG−C
APFD4K共役体を別々の96のウエル（well）を有するポリ
塩化ビニル製ミクロ滴定プレート［ダイナテク（Dynate
ch）１−220−24型］中で固定化した。次いでプレート
を、TCAを含有する10％（v/v）の熱照射した馬の血清
［TCA−HS、テイツシユ・カルチヤ・サービシーズ（Tis
sue Culture Services、Berkshire、UK）］で室温下に
洗浄し、そしてTCA−HSと共に１時間培養することによ
り過剰な点をブロツクした。次いで試験すべき免疫血清
の50ml試料部分をD4K10-5Mの存在又は不存在下にウエル
に添加し、室温で２時間培養した。BSA−YD4Kで誘発し
たウサギからの血清を固定化したTG−CAPFD4K上で試験
し、その逆も行なつた。次いでプレートをTCA−HSで３
回洗浄し、そしてTCA−HS中125I−ヤギの抗ウサギIg
（マイルズAFA）50,000cpm/ウエルの50μと共に更に1
6時間培養した。プレートを洗浄し、乾燥し、そしてウ
エルをLKBガンマ計数器で計数した。競争するD4Kペプチ
ド10-5Mの存在又は不存在下に結合したcpmでの差から特
異的抗D4K抗体の力価を得た。 BSA−YD4Kで免疫にした６匹のウサギのうち３匹は３
週間以内に抗D4Kを発現した。これらの動物の力価は２
〜３ケ月にわたつて増加し、次いで減少した。これらの
動物の２匹では力価が連続した誘発で再び４ケ月で及び
再び６ケ月でピークまで上昇した。TG−CAPFD4Kで免疫
にした４匹のウサギのうち３匹は抗D4K抗体を発現し、
特異的抗体の力価のピークは２及び３ケ月に、そして６
ケ月に再び存在した。 Ca2+イオンの存在は免疫血清中の抗体の活性ペプチド
の結合を高めることが発見された。この向上の程度は個
々のウサギにおいて異なつた。１つのウサギ（１）から
の血清は、キレート化量のEDTAの存在下にバツクグラン
ド値まで減ぜられる125I−YD4Kに結合するCa2+に完全に
依存することを示した。３匹のウサギにおいて（第１
図）、結合は1mM Ca2+で及びそれ以上で観察される最大
値まで濃度依存的に増加し、次いで40mM Ca2+まで低下
した。試験した他の２価の金属イオンMg2+、Zn2+、B
a2+、Hg2+は結合を増大させなかつた。抗D4K抗体の細区
分（Subpopulation）のCa2+依存性は、生体内での自然
のCa2+結合に続くウサギの免疫細胞によるD4Kペブチド
単独よりもむしろ存在する２対のAsp−βカルボキシル
のCa2+キレート性及びペプチドのCa2+キレートの選択的
識別の結果であると考えられる。 抗D4KIgの特異的抗血清から親和性精製親和性吸着剤の
製造 活性化されたCH−セフアローズ（Sepharose）4B［フ
ア−マシア・フアイン・ケミカルズ（Pharamacia Fine
Chemicals）］を1mM HCl（100ml）中に懸濁させ、更に1
mM HCl 900mlで洗浄した。次いで0.5M NaClを含有する
0.1M NaHCO325ml中Tyr−Asp−Asp−Asp−Asp−Lys（60m
g）を添加し、ゲルを４℃で１時間振とうした。過剰な
配位体を0.1M NaHCO3100mlで洗い流し、残存する活性点
を、ゲルを0.1M Tris−HCl（pH8）と共に４℃で１時間
振とうすることによりブロツクした。次いでゲルを、0.
5M NaClを含む0.1M酢酸ナトリウム（pH4）50mlで洗浄し
た。次いで更に２回0.1M Tris−HCl（pH8）50mlで洗浄
した。 6M HCl中110℃で20時間加水分解し且つアミノ酸分析
に供したゲルの少割合は、置換の程度が1.10ミリモル／
ゲルmlであることを示した。 固定化されたYD4K上での親和性クロマトグラフイー BSA−YD4Kで免疫にしたウサギ１及び２（R1、R2）か
ら６週間の間の間隔を置いてとつた２つの血清試料を別
々に貯蔵した。TG−CAPFD4Kで免疫にしたR17及びR18か
らの２つの同様の試料を一緒に貯蔵した。これらの集め
た血清を別々に次のようにして親和性クロマトグラフイ
ーに供した：硫酸アンモニウムの飽和溶液の同容量を血
清に添加し、そして混合物を４℃で夜通し放置した。沈
殿した蛋白質を４℃下に9,200xgavでの遠心分離によつ
て集め、50mM Tris−HCl（pH7.4）、150mM NaCl、20mM
CaCl2の元の容量（第１表参照）中に再懸濁させ、同一
の緩衝液２を２回変えて透析した。この透析した蛋白
質を、セフアローズに固定化されたD4Kの親和性マトリ
ツクの1.5×10cmのカラムに流速20ml/時で適用した。吸
光度が０に戻るまで結合していない蛋白質を操作してい
る緩衝液で流出させた。次いでCa2+依存性抗体を、50mM
Tris（pH7.4）、150mM NaClを50mM EDTAと共に用いて
置換し、続いてCa2+に依存しない1Mプロピンオン酸で流
出させた。画分を透析し、125I−YD4K（比放射線活性2.
7×108cpm/μｇ）を結合させることによつて活性に対し
て分析し、抗体を含有する画分を集めた。 ウサギ１からの免疫グロブリンの流出傾向は、EDTAで
の流出によつて抗体の巾広いピークが得られたが、1Mプ
ロピオン酸中に蛋白質又は抗体が流出しないことを示し
（第2a図）、この血清中に存在する抗D4KがCa2+依存性
であることを確認した。第１表は、BSA−YD4Kで免疫に
したウサギ２からの抗血清がCa2+依存性及びCa2+非依存
性の抗D4Kに抗体を含むことを示す。これはD4K分子にお
ける２つのエピトープの存在を示し、また１つ又は両方
の確認が個々の動物に依存することを示す。TG−CAPFD4
Kで免疫にしたウサギ17及び18から集めた血清の流出傾
向（第26図）は、EDTAで置換されるCa2+依存性の抗体及
び1Mプロピオン酸を用いて置換されるCa2+非依存性抗体
の双方を示す。（ａ）1:1000希釈×容量（ml）における125I−YD4Kへの
結合％、 （ｂ）10-5M D4Kの存在及び固定化されたペプチドに結
合する、D4Kの不存在における1:100希釈時のcpm単位で
の差;125I−ヤギの抗ウサギ×容量（ml）によつて検出 Ｃ−末端D4Kペプチドに対する抗体の特異性 ウサギ１からの血清中に存在する親和性精製したCa2+
依存性抗体の、種々のペプチドに対する相対的親和性
を、第２の抗体、即ちロバの抗ウサギ抗体で沈殿させる
ことによつて測定される125I−YD4Kへの結合競争を決定
することによつて検査した。合成ペプチドD4K、VD4K及
びAPFD4Kは10-8Mまでの範囲においてIC50値を有する同
様の濃度での結合を置換した（第３図）。これと対照的
に、Asp、Lys、Asp−Lys、Asp−Glu、ポリAsp、及び人
間のガストリン（gastrin）（ペンタGluシーケンスを含
有する残基１〜17）は10-14M程度の高濃度において125I
−YD4Kへの結合を置換しなかつた（第３図）。Asp2Lys
へのいくらかの結合は見られた。他のウサギからの親和
性精製したCa2+依存性及びCa2+非依存性抗体はテトラ−
Ｌ−アスパルチル−Ｌ−リシンシーケンスに対して非常
に類似の特異的親和性及び特異性を示した。 一例であるPAP分析の一般的な原理に対して非常に重
要なものには、またこれらの特異的抗D4K抗体の、膵臓
病の診断に対する適用については、抗D4K抗体がペプチ
ドのＣ末端に対するものであり、且つ100μg/mlまでの
酵素源の濃度でトリプリノーゲン（蛋白質のＣ末端にペ
プチドが結合している場合）によって置換されなかった
との発見である。しかしながらトリプシノーゲンをエン
テロペプチダーゼと共にインキユベーシヨン（以下、培
養ともいう）した時、遊離されたC4K含有の活性化ペプ
チドは合成125I−YD4Kの結合を活性的に置換し、トリプ
シノーゲンの２μg/溶液mlの活性化後に50％の置換を与
えた（第４図）。犬の膵液中の天然のトリプシノーゲン
も、免疫反応性のD4Kペプチダーゼを遊離するエンテロ
ペプチダーゼによつて活性化され（第４図）、10-8の
膵液の活性化後の競争的溶液相免疫分析において50％の
置換を示した。それ故にここに記述される新規なD4K特
異性の抗体は、内因的トリプシン禁止剤を含む体液に適
用しうるエンテロペプチダーゼ及びトリプシノーゲンに
対する新しい感度のよい分析法も提供する。 本発明者の製造する新規な抗D4K抗体のD4Kペプチドに
対する独特な特異性は、両生類キセノプス・ラエビス
（Xenopus laevis）の皮膚の分泌を検査することによつ
て更に示される。より大きい蛋白質中の内部シーケンス
としてのテトラアスパルチル−リシルペプチドは、対応
する核酸シーケンスを、皮膚のmRNAに由来するcDNAクロ
ーン中で見出すことによりこの動物種の皮膚で産するこ
とが予想された［53］。この両生類からの皮膚の分泌物
は種々のペプチドを、CCK、ガストリン、エンケフアリ
ン、TRH及びソマトスタチンを含む哺乳動物の神経系に
おける同等物（counterparts）を含むことが知られてい
る。本発明者はこの種の皮膚に由来する粗ペプチド抽出
物を得、これをC8カラムでの逆相HPLCに供した。多くの
ペプチドを示す流出傾向を第５図に示す。しかしながら
２つのピークだけがD4Kペプチドに対する免疫反応性で
あると同定され、そしてこれらを、合成D4K及びAPFD4K
に対してこの系で同定される移動位置に関し共クロマト
グラフイー処理した。遊離のＣ末端は前駆物資の処理に
より粗ペプチド混合物中に生じたと考えられたが、存在
するD4KのＣ末端の力価はペプチド抽出物のトリプシン
分解によつて増大し、いくらかの処理されない前駆物質
の存在を示した。カエルの皮膚におけるD4Kシーケンス
は哺乳動物のトリプシノーゲンに対して遠位の進化の関
係の結果として生ずるものと考えられる。この両性類か
ら得られる粗混合物中のD4Kペプチドの特異的認識は更
に親和性精製した抗D4K抗体の特異性を示す。 D4Kペプチドの免疫分析 溶液相の競争免疫放射分析 50mM Tris−HCl、20mM CaCl2、0.1％（w/v）BSA、pH
7.4（RIA緩衝剤）中の抗D4K抗血清の1:250希釈物或いは
親和性精製した抗D4K抗体の希釈物250μを0.2％（v/
v）の正常のウサギの血清をポリスチレン試験管中に含
有するRIA緩衝液中125I−YD4K（10,000cpm）の100μ
に添加した。次いでRIA緩衝液中で希釈した種々の標準
ペプチド或いは未知の血漿試料を含有する溶液100μ
を添加し、続いて0.2％の正常のウサギの血清を有するR
IA緩衝液で1:10に希釈したロバの抗ウサギIg血清［ウエ
ルカム・バイオテクノロジー（Wellcome Biotechnolog
y）］50μを添加した。この混合物を４℃で18時間培
養し、次いで試験管を４℃下に45分間3,000rpmで遠心分
離にかけ、上澄液を吸い取つた。沈殿中の放射能をLKB
ラツク−ガンマ計数管で決定した。 固相の競争免疫放射線分析 競争的沈殿放射線分析と関連したものよりも免疫分析
の簡便性及び感度を改良するために、固相技術を用いて
２種の分析を開発した。最初の方法では、PVCのミクロ
滴定プレートのウエルに60μg/mlの蛋白質濃度でBSA−Y
D4Kを塗布した。次いで合成の活性化ペプチドの標準濃
度を親和性精製した抗D4K抗体と共に予備培養し、これ
をウエルに適用した。そして固定化されたペプチドハプ
テンに付着する抗体を、125Iで標識したヤギの抗ウサギ
抗体で決定した。Ca2+非依存性抗体を用いることによる
典型的な標準曲線を第６図に示す。競争ペプチドの濃度
に対する急勾配の依存性は10-6〜10-9Mの範囲で明らか
であり、IC50は５×10-7であつた。 放射線分析の第２の方法は、固定化された親和性精製
した抗D4K抗体を用いて行なわれる。ミクロ滴定プレー
トのウエルに、0.1％（w/v）ナトリウムアジドを有する
50mM Tris−HCl（pH7.4）中Ca2+非依存性抗体（50μg/m
l）50μにより４℃で終夜塗布した。次いでプレート
を、10％ウマの血清（Ｔ−HS緩衝液）を含有する50mM T
ris−HCl（pH7.4）で３回洗浄し、室温で１時間Ｔ−HS
緩衝液と共に培養して残存する点をブロツクした。125I
−YD4K（100,000cpm）及び種々の濃度のD4K（10-4〜10
-13M）をＴ−HS緩衝液中に含有する溶液（60μ）を準
備した。この50μ部分を抗体の塗布したウエルに移
し、次いで室温下に５時間培養した。プレートをＴ−HS
緩衝液で３回洗浄し、室温で放置して乾燥させた。この
ウエルを切りとり、上述のように放射能を決定した。結
果（第７図）は、競争ペプチドの10-6〜10-12M間におい
て結合したcpmへの広い依存性を示し、そして約10-9Mの
IC50値を示す。これは感度の10倍の増加を表わす。 固相における酵素と関連した免疫分析 0.2M HCl（2ml）中ベンジジン２塩酸塩（10.2mg）
を、水（0.2ml）中亜硝酸ナトリウム（7.8mg）を添加す
ることにより４℃で１時間ジアゾ化し、次いで0.25Mホ
ウ酸ナトリウム/0.2M NaClの3.2mlでpH9に緩衝させた。
次いで0.16Mホウ酸ナトリウム/0.14M NaCl（pH9）の10.
8ml中において、ベンジジン試薬を＋４℃で添加し且つ
２時間培養することにより、YD4K（4.9mg）を西洋ワサ
ビのペルオキシダーゼ［シグマ（Sigma）;49.2mg］にカ
ツプリングさせた。次いで0.15M NaCl、水、更に0.15M
NaClに対して厳しく透析することによつて過剰の試剤及
びペプチドを除去し、3.2mg/mlの共役体の溶液を得た。 50mM Tris（pH7.4）、0.1％ナトリウムアジド中Ca2+
非依存性抗体（25μg/）の塗布したプレートを用いる
ことにより、第２の放射線分析法に対して上述したよう
にエリサ（ELISA）分析を行なつた。プレートを50mM Tr
is（pH7.4）、10％（v/v）ウマの血清、0.5％ツウイー
ン（Tween）20で３回洗浄し、50mM Tris（pH7.4）、10
％（v/v）ウマの血清で30分間ブロツクし、次いで50mM
Tris（pH7.4）、0.05％ツウイーン20中1:10,000ペルオ
キシダーゼ−D4Kペプチド共役体及び未知試料又は標準
的量のペプチドの混合物と共に培養した。20℃で１時間
後、プレートを３回洗浄し、そして0.1M酢酸ナトリウム
／クエン酸（pH6.6）中0.01％（w/v）3,3′、5,5′−テ
トラメチレンベンジジンと共に20℃で１時間培養するこ
とにより発色させた。反応を2M H2SO450mlの添加によつ
て停止させ、色を450nmで評価した。得られた置換曲線
は第７図に示す放射線分析と同様の感度を示した。 生体内におけるD4Kペプチドの安定性と分布の分析 D4Kペプチドは人間の血清及び活性化された膵液中で
安定であることがわかつた。免疫反応性のD4Kは、変性
していない人間の血清と共に37℃で６時間及び４℃で48
時間培養することにより変化しなかつた。人間の血清中
で保温した後のセフアデツクスＧ−100でのクロマトグ
ラフイーは、免疫反応性D4Kペプチドが緩衝液中遊離の
ペプチドと共に共クロマトグラフイー処理され且つ血清
成分と複合体を形成しないことを示した。 APFD4K及びD4Kの安定性は活性化された膵液と共に培
養することによつて検査し、そして生成物の化学的同定
はpH6.5における高電圧ペーパー電気泳動により行なつ
た。結果はAPFD4Kが遊離のAla、Pro及びPhe及びD4Kに迅
速に転化するが、D4Kシーケンスそれ自体が37℃で24時
間安定であることを示した。３つの別々の実験におい
て、新しい犬の膵臓の複数の65〜75mg部分を、改変した
バンク（Bank）の媒体通に入れ、そして100単位のエン
テロキナーゼ（シグマ・ケミカル社、EO885）の存在又
は不存在に37℃で４時間及び22℃で更に20時間培養し
た。培養媒体の上澄液の複数の100μ試料をある間隔
でとり、RIA緩衝液で2:1に希釈し、10分間沸とうさせ、
遠心分離にかけた。次いで上澄液をD4Kペプチドの分析
まで−20℃で貯蔵した。 ３回の実験の各において、エンテロキナーゼでの培養
を、膵臓組織の分解及び免疫反応性D4Kペプチドの迅速
な遊離と関連づけた。これらの変化はエンテロキナーゼ
なしでは短期間の培養において見られなかつた（第８
図）。培養媒体中のD4K免疫反応性ペプチドは24時間の
培養後高値で存在し続け、それが組合せられた膵臓の蛋
白質分解作用に対して耐性のあることを示した。 循環するペプチドの運命を決定するために、フエノバ
ルビタルで麻酔をかけたラツトの左の大脳静脈にD4K
（0.28ml、1mg/ml）を注射した。２時間の間15分毎に血
液試料（0.5ml）を集め、免疫分析に供した。この結果
は、投与した免疫反応性のD4Kが半減期約15分で、生体
内における血清から消えたことを示した。第２系列のそ
のような実験において、PBS1ml中YD4K100μg/kgを、３
匹の健康な絶食させたグレイハウンド犬の各に静脈内注
射した。４時間にわたりある間隔で血液と尿の試料をと
り、分析まで−20℃で貯蔵した。血液中におけるD4Kペ
プチドの平均半減期は犬の場合8.3分であるが、血清中
にはそれぞれ２時間の間D4Kが検知できた。D4Kは静脈内
投与の５分以内に尿に現われ、３〜４時間の長きにわた
り持続した（第９図）。 免疫反応性のD4Kペプチドの組織分布を決定するため
に限定された検討を行なつた。ペプスタチン0.1mg/ml、
キモスタチン0.1mg/ml、エラスチナル0.1mg/ml、及びト
ラシロール2000KN/mlを含有するHCl24ml中にいおて均質
化し且つ超音波処理することにより、ラツトの脳、膵
臓、十二指腸及び下垂体の抽出物を調製した。この抽出
物をpH5.6に調節し、0.1Mコハク酸塩緩衝液（pH5.6）で
希釈し、そして37℃で１時間エンテロペプチダーゼによ
り消化させた。エンテロペプチダーゼでの消化後、ラツ
トの膵臓及び十二指腸の抽出物にはそれぞれD4K6×10-7
モル／蛋白質mg及びD4K1.5×10-7モル／蛋白質mgが見出
された。ラツトの脳呼び下垂体の抽出物にはD4Kペプチ
ドが検出されず、同様に調製したモルモツトの脳の抽出
物の分析後も何も検出されなかつた。主膵臓導管のカヌ
ーレ処置及び続くCCK刺激によつて得た犬の膵液は、エ
ンテロペプチダーゼ活性化前に免疫反応性D4Kペプチド
を何も示さず、活性化後にD4K5.7×10-4モル/mlを示し
た。３匹の犬及び６人の正常な人間の固体からの多数の
試料における絶食している或いはポストプラデイアルな
血清又は尿においてD4K免疫反応性は同定できなかつ
た。穿孔した十二指腸潰瘍、腸管膜梗塞、虫垂炎、大動
脈瘤、クローン病又は胃腸内出血の患者の血清試料中に
はD4K免疫反応性が見出せなかつた。またアルツハイマ
ー病、リユーマチ性関節炎又はいずれか他の試験した非
膵臓病との関連において、人間の血清にはD4Kが検知で
きなかつた。 実験的及び人間の膵炎におけるD4Kペプチドの分析 22匹麻酔をかけたラツトについて、10〜20ミリモル／
のグリコデオキシコレートを単独で或いは50ngの高度
に精製した人間のエンテロペプチダーゼと共に含有する
緩衝液75μを30分間にわたり制御された膵臓内導管中
をミクロ潅流させることにより、急性の壊死性膵炎を実
験的に誘導した［54］。続いてラツトはCCK−33の10IDU
/kg/時を用いることにより、膵臓の刺激と一緒に連続的
な静脈内の鎮痛剤を受けた。導管内潅流前及び３時間後
に血液を採取し、遊離のD4Kに関して分析した。膵臓の
組織学的検査はそれぞれの場合深刻な急性膵炎を示し
た。循環する免疫反応性D4Kペプチドは見かけの平均基
礎値の5pモル/mlから３時間後の平均84pモル/mlまで22
匹の動物の各において病気の進行と共に上昇した。これ
に対し、CCK−８刺激過多によつて誘導された急性の浮
腫性膵炎の６匹のマウスからの膵臓均質物中には遊離の
D4Kペプチドは同定されなかつた。 D4Kペプチドが前述した如き深刻な急性膵炎の患者か
らの血清又は尿中で同定しうるかどうかを決定するため
に、予備的な臨床研究を行なつた。膵炎の22人の患者か
ら任意に血清といくつかの場合には尿の試料を集めた。
これらの試料はすべてが病気の初期の時間にとつたもの
ではなかつた。ランソン（Ranson）の基準［56］に基づ
けば、14人の患者は、軽い浮腫性の肝炎をもち、８人の
患者は深刻な壊死性膵炎を有するものと評価できた。浮
腫性は病気の患者からの試料には、すべてにおいて血清
アミラーゼが実質的に上昇したにも拘らず、免疫反応性
D4Kペプチドが見出せなかつた。一方D4Kは重い膵炎と判
定された８人のうち６人からの血清及び／又は尿試料中
にはD4Kが同定できた（第２表）。 セント・ジヨージ（St.George）において1985年１月
〜1987年３月に集められたランダム試料のTAP分析。−2
0℃で貯蔵。 JS血清試料のセフアローズG15におけるクロマトグラ
フイーは、免疫活性が標準的なAPFD4Kと共に移動すると
いうことを示した（第10図）。更に腹痛と予め75％の遠
位膵臓切除を受けた慢性膵炎の憎悪とを呈する１人の患
者（PD）から血清を得た。この試料からは10-8Mの程度
でD4Kペプチドが検出できた。 第２の臨床研究において、スコツトランドのグラスゴ
ー・ロイヤル・インフアーマリー（Glasgow Royal Infi
rmary）に及びグラスゴー地区の他の病院に認められた6
9人の患者から日常的に毎日試料採取している間に貯つ
た血清についてD4Kペプチドに対する分析を行なつた。
血清を−20℃で凍結して貯蔵し、そして融解して一部を
とり、更に再凍結し、その後再融解して分析した。279
の貯蔵した血清の全部は５日間までの間に69人の患者か
ら採取した血清試料を表わすが、いくつかの場合には１
回だけの試料であつた。D4Kペプチドに対する分析は膵
炎の進行度又は臨床学的経過について予備知識なしに行
なつた。浮腫性膵炎を有すると評価された39人の患者の
うち36人（92％）はD4K陰性であり、より深刻な患者23
人のうち13人（56％）はD4K陽性であつた。この一連の
日常的な凍結−融解−凍結−融解の血清だけの試料につ
いて回顧的に行なつたD4K分析の全精度は79％であつ
た。見かけの偽りの陽性（３）は多分臨床学的評価法の
公知の不適性を反映する。見かけの偽りの陰性（10）
は、日常的な１日１回の血清試料採取の、変化する臨床
的状態からの遊離によつて導入される誤差及び尿分析に
よつてもたらされる更なる情報の不存在と一緒にこれを
反映しているようである。 セント・シヨージ病院（London、SW17、英国）に認め
られ且つ急性膵炎と高アミラーゼ血症を、意図に沿つて
D4K分析を用いて検討し、病気の深刻さ及び進行を監視
した。これをするために、許可時に及び最初の48時間４
〜６時間間隔で、その後８時間毎に血液と（得られるな
らば）尿の試料を同時にとつた。試料をD4Kの分析のた
めに−20℃で凍結貯蔵した。軽い／重い膵炎を有する
が、後に偽のう胞を発現した１人の患者TP（第12図）は
許可から24時間後に250pモル/mlの初期尿D4K値を有した
が、この時点で血清中にはD4Kは検知できなかつた。こ
れは尿分析の進歩しない性能及び犬において実験的に同
定した静脈投与後のD4Kペプチドの長期にわたる尿分泌
を反映している。入院第４日目に、D4Kペプチドは血清
中に一時的に現われ、後に尿中で上昇した。これらの変
化は明確な臨床学的状態と適合し、D4K及び他のPAP分析
の、正確な病気の過程の監視胞としての役割りを支持す
る。 この系列において軽い膵炎をもつているが、呼吸器不
全である第２の患者CMにおいて、許可時に血清のD4Kは3
8pモル/mlであり、また尿のD4Kは100pモル/mlであつ
た。双方は数時間以内に０まで低下し、その後陰性のま
まであつたが、続いて2cmの偽のう胞及び小網嚢の液体
採取物か同定できた。これはD4K分析の、小さい面積の
膵臓壊死でさえ予知しうる能力を更に支持する。腹痛と
血清アミラーゼ＞7000単位を有する許可されたこの群の
第３の患者CTMは、初期の徴候にも拘らず５日間以上に
わたつて血清及び尿のD4Kが陰性のままであつた（第12
図）。この患者は浮腫性膵炎と共に胆石を有し、続いて
これを５日間にわたつて散らした。これもまた急性の病
気における正確な深刻度の指標として、陰性のD4K分析
の役割を支持した。これらの結果は、グラスゴーの血清
だけの研究におけるかなりの数の偽りの陰性D4K分析が
しばしばの血液及び尿の試料採取の併用で起こらなかつ
たであろうし、また本分析が上述したように臨床的に適
用しうることも示唆した。 慢性の再発した悪い膵炎を有する２人の患者からの更
なる血清試料は正常の限界内のD4K値及び血清アミラー
ゼ値を示した。これは慢性の病気におけるD4K分析の診
断的可能性を支持しよう。臨床的及び実験的な発見をD4
Kに分析と一緒にすると、本発明の、膵炎の診断、進行
度の予測及び病気の過程の監視における提案した役割が
強く支持されよう。また発見は、Ｃ末端に向いた抗体を
膵臓の病気に用いることによる体液の、遊離のPAP分子
に対する特異的分析に対して本発明で具現化された本質
も支持する。 本発明の他のPAP分析 本発明に従いＣ末端に向いた抗体を遊離の種に対して
用いることよる特異的分析に適当である他の膵臓の酵素
源の活性化ペプチドは、ホスホリパーゼA2、プロコリパ
ーゼ、プロエステラーゼ１及びプロエステラーゼ２、プ
レカレクレイン、及びプロカルボキシペプチダーゼＡ及
びＢのそれを含む。これらの例はプロホスホリパーゼA2
のカルボキシ末端シーケンスAsp−Ser−Gly−Ile−Ser
−Pro−Argを含むペプチド［41］、プロコリパーゼのカ
ルボキシ末端Ala−Pro−Gly−Pro−Argを含むペプチド
［42］、及びプロエステラーゼ２のカルボキシ末端Gly
−Asp−Pro−Thr−Tyr−Pro−Pro−Tyr−Val−Thr−Arg
を含むペプチド［43］或いはプロエステラーゼ１又はプ
レカレクレインの活性化ペプチドのシーケンスを含むペ
プチドである。５つ又はそれ以上の蛋白質分解オリゴペ
プチドを表わすこれらのシーケンス部分例えばプロエス
テラーゼ２からのPro−Pro−Tyr−Val−Thr−Argも使用
しうる。プロカルボキシペプチダーゼＡ及びＢの非常に
大きい活性化ペプチドも標的として適当なオリゴペプチ
ドシーケンスを含有しうる。Ｃ末端に向いた抗体の使用
は、人間の血漿及び尿中に普通存在する酵素源形［57］
が、、すでに詳細な例として示したトリプシノーゲンか
らの、D4K含有の遊離ペプチドの分離における如く分析
において認識されないことを保証しよう。 更に興味あり且つ重要であるものは、プロホスホリパ
ーゼA2（PLAP）の活性化ペプチドである。プロホスホリ
パーゼA2は大食細胞［58］、肺胞大食細胞［59］、凝集
した血小板、及びポリモルフヌクレアー（polymorphnuc
lear）白血球［61］を初めとし、並びに一般にリソソー
ム中に存在する多くの細胞種に豊富に存在する。活性ホ
スホリパーゼA2は内毒素衝撃［63］、呼吸器病症候群、
急性の腹部症状を含むいくつかの炎症状態［62］におい
て、またミコバクテリア［61］、ペプチド［60］及びCa
2+［39］に呼応してこれから遊離される。これらの起源
からのプロホスホリパーゼA2は膵臓プロホスホリパーゼ
A2と同一の遺伝子の生成物であり且つ同一のシーケンス
Asp−Ser−Gly−Ile−Ser−Pro−Argの活性化ヘプチド
を有する場合、本発明で定義される如きPLAP分析はこれ
らの変調の認識及び進行度の予測に適用しうる。有用な
試験でもあろう。非膵臓プロホスホリパーゼA2の活性化
ペプチドが膵臓プロホスホリパーゼA2と異なるシーケン
スを有するならば、PLAP分析は膵臓の病気に特異的にな
ろう。 ホスホリパーゼA2の活性化ペプチド（PLAP）及びプロコ
リパーゼの活性化ペプチド（CLAP）の合成 本発明の更なる実施例は、PLAP及びCLAPにＣ末端的に
特異的な免疫分析の開発と関連したペプチドの合成を含
む。これらのペプチドはAsp−Ser−Gly−Ile−Ser−Pro
−Arg、Cys−Tyr−Asp−Ser−Gly−Ile−Ser−Pro−Ar
g、Ala−Pro−Gly−Pro−Arg、及びCys−Tyr−Ala−Pro
−Gly−Pro−Argである。合成は一時的な塩基で除去し
うるFmoc/α−アミノ基の保護及び次の改変以外クリフ
（Cliffe）ら［50］の記述する方法を用いることによ
り、ｐ−アルコキシベンジルアルコールの誘導体化され
たポリスチレン［スイス国、バヘム・フエインケミカリ
エン社（Bachem Feinchemikalien AG）からの0.67ミリ
当量/g］上で行なつた。Ｃ−末端残基を混合無水物法に
よりその保護された誘導体Fmoc（Mtr）Argとしてカツプ
リングさせた。保護したArgの２当量を、ジメチルホル
ムアミド中2,6−ジクロルベンゾイルクロライド２当量
及び蒸留ピリジン３当量と共に、アルコキシベンジル基
１当量を有する樹脂と16時間培養した。続いてすべて、
Fmocアミノ酸を１−ヒドロキシベンゾトリアゾールエス
テルとして２倍過剰量でカツプリングさせた。次の誘導
体を使用した:Fmoc−Pro、Fmoc−（OtBu）Ser、Fmoc−I
le、Fmoc−Gly、Fmoc−（OtBu）Asp、Fmoc−（OtBu）Ty
r及びFmoc−（SAcM）Cys。合成の終りに、Ｎ末端のFmoc
基を20％（v/v）ピペリジンでの処理により10分間開裂
し、そしてペプチドを開裂し且つ50％（v/v）トリフル
オル酢酸、５％チオアニソール、45％（v/v）ジクロル
メタンで処理して部分的に保護基を除去した。これを蒸
発させ、エーテルで４回洗浄し、そして凍結乾燥した。
保護された（SAcM）システイニル基を含有するペプチド
の部分（250mg）を最小容量の水中に抽出し、NH4OHでpH
4に調節した。次いで酢酸水銀（200mg）を添加し、pH4
に再調節した。１時間後にペプチドを50mlまで希釈し、
H2Sを15分間、続いてN2を10分間溶液中に通じた。黒色
の沈殿（HgS）を遠心分離によつて分離し且つペプチド
を凍結乾燥によつて分離した。 ペプチドを0.1M酢酸中セフアデツクスＧ−15でのゲル
クロマトグラフイーにより精製し、逆相HPLC及びアミノ
酸分析によつて同定した。1.0ml/分で22分間にわたる0.
05％トリフルオロ酢酸及び５〜25％（v/v）アセトニト
リル中のブラウンリー（Brownlee）Ｃ−８アクアポア
（Aquapore）RP−300において、ペプチドはCYAPGPRに対
して9.14分に、APGPRに対して5.49分に単一のピークを
与えた。0.5ml/分で30分間にわたる0.05％トリフルオル
酢酸及び５〜50％のグラジエントのアセトニトリル中の
μボンダパク（Bondapak）C18において、CYDSGISPRは1
1.7分で及びDSGISPRは7.8分で流出した。アミノ酸分析
はこれらのペプチドの正しい組成を確認した。 Cys−Tyrアミノ末端延長部を有するペプチドは、ハプ
テン化或いは顕在化剤又は固相の結合、及び固相上に用
いるための元のペプチドに対して、又は本発明のD4K例
に記述した如き競争配位体として使用される。ポリクロ
ーナル又はモノクローナルのいずれかの特異的Ｃ末端抗
体は対応する固定化されたペプチドでの親和性クロマト
グラフイーで精製され、これをD4Kの例に詳述したよう
な固相又は液相分析の際に使用する。顕在化剤を有し又
は固相上に固定化されたペプチド並びに顕在化剤を有す
る又は有さない及び遊離の又は固相に結合した特異的抗
ペプチド抗体及びそのような試剤の、病気の診断及び進
行度の監視におけるPAP分析の遂行における使用は、本
発明の更なる観点を構成する。 参考文献 1.Corfield A.P.et al（1985）.Gut 26:724−729. 2.Hermon−Taylor J and Heywood G.C.（1985）.Scand.
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27. 62.Franson R.C.et al（1978）.J.Lipid.Res.19:18−2
3. 63.Vadas P.（1984）.J.Lab.Clin.Med.104:873−881.
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(72)発明者 オーステン，ブライアン・マクスウエル
イギリス国ロンドン エスダブリユー17
０アールイー・クランマーテラス
（番地なし）セントジヨージズホスピタ
ルメデイカルスクール・デパートメント
オブサージエリイ内
(56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，Ｒ
ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．60（２），820−
824（1974)
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．活性化中の蛋白質分解によつて特異的に開裂される
膵臓チモーゲンの活性化ペプチド（PAP）であるペプチ
ドの存在又は不存在に関して患者に由来する体液試料を
分析することを含んでなる患者の膵臓チモーゲンの活性
化の検出方法。 ２．分析されるペプチドがリジン（Ｋ）をカルボキシ末
端として有するアミノ酸配列D4Kを含んでなるトリプシ
ノーゲン活性化ペプチド（TAP）である特許請求の範囲
第１項に記載の方法。 ３．分析されるペプチドが、アルギニン（Ｒ）をカルボ
キシ末端として有するアミノ酸配列 DSGISPR を含んでなる人間の膵臓のプロホスホリパーゼA2活性化
ペプチド（PLAP）、又はＲをカルボキシ末端として有す
るアミノ酸配列 APGPR を含んでなるプロコリパーゼ活性化ペプチド（CLAP）、
又はＲをカルボキシ末端として有するアミノ酸配列 GDPTYPPYVTR を含んでなるプロエステラーゼ２活性化ペプチド（PEA
P）もしくはＲをカルボキシ末端として有するアミノ酸
配列 PPYVTR を含んでなるプロエステラーゼ２活性化ペプチド（PEA
P）の分解生成物、 である特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ４．体液が血液血清、腹水、又は尿である特許請求の範
囲第１〜３項のいずれか１つに記載の方法。 ５．体液を、PAPに対して特異性を有するＣ末端指向性
抗体と接触させる特許請求の範囲第１〜４項のいずれか
１つに記載の方法。 ６．抗体がTAP、PLAP、CLAP又はPEAPに対して特異性を
有する特許請求の範囲第５項に記載の方法。 ７．直接又は間接的に検出しうる標識を有し且つ固／液
相反応混合物の固相又は液相のいずれかに生成する、PA
Pと抗体との間の共役体を生成せしめ、固相を液相から
分離し、そして固相又は液相のいずれかにおける標識の
存在又は量を、それぞれ試料中のPAPの存在又は量の尺
度として測定することを含んでなる特許請求の範囲第５
又は６項に記載の方法。 ８．エリサ（ELISA）として或いはビオチンで標識した
抗体を用いて行なう特許請求の範囲第７項に記載の方
法。 ９．エリサとして或いはビオチンで標識したPAPを用い
て行なう特許請求の範囲第７項に記載の方法。 １０．（１）直接又は間接的に検出しうる標識を有する
PAPに対する抗体、或いは （２）直接又は間接的に検出しうる標識を有するPAP、 のいずれかを結合した不活性な固体担体を含んでなる固
相と試料を接触させる特許請求の範囲第１〜９項のいず
れか１つに記載の方法。 １１．互いに少くとも２時間の間隔をおいた少くとも２
つの別の状態の患者に由来する体液試料を膵炎の深刻な
進行を監視する尺度としてPAPの濃度に関して分析する
特許請求の範囲第１〜10項のいずれか１つに記載の方
法。 １２．PAPに対して特異性を有するＣ末端指向性抗体。 １３．TAP、PLAP、CLAP又はPEAPに対して特異性を有す
る特許請求の範囲第12項に記載の抗体。 １４．抗体がモノクローナル抗体である特許請求の範囲
第12又は13項に記載の抗体。 １５．PAPアミノ酸配列を含む免疫原で免疫化した動物
の血清から分離される特許請求の範囲第12又は13項に記
載の抗体。 １６．直接又は間接的に検出しうる標識を有する特許請
求の範囲第12〜15項のいずれか１つに記載の抗体。 １７．不活性な固体担体上に固定化された特許請求の範
囲第12〜16項のいずれか１つに記載の抗体。 １８．PAPに対して特異性を有するＣ末端指向性抗体を
含んでなる患者の膵臓チモーゲンの活性化の検出用試験
キツト。
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