SE459372B - Humant pankreasspecifikt protein (hpasp), framstaellning av antikroppar mot proteinet och diagnostiskt foerfarande vid akut pankreatit - Google Patents

Description

459 372 ' 2- tillstånd i HPASP-innehållande organ, främst vid pankreatit.

Uppfinningens underordnade aspekter är HPASP-preparationer, bestämningsmetoder för HPASP, speciellt immunkemiska sådana, och antikroppspreparationer, s k anti-HPASP-antikropps- preparationer riktade mot i HPASP förekomande antigena determinanter vilka kan utnyttjas f vävnader och fysiologiska vätskor. ör att påvisa HPASP i HPASP karakteriseras av att molvikten bestämd med SDS-gel- elektrofores är omkring 44 500 dalton (15 %), dess iso- elektriska punkt är pH 6,9 (15 2) och dess aminosyrasamman- sättning enligt tabell l. Dessa värden gäller givetvis för de analysmetoder som använts i exemplifieringen. Med en HPASP-preparation enligt uppfinningen avses även olika fragment och derivat av proteinet, vilka uppvisar minst en antigen determinant som kan utnyttjas vid immunkemisk bestämning av proteinet. Sålunda kan HPASP enligt uppfin- ningen vara försett med någon av de anlytiskt indikerbara grupper som är välkända inom immunkemisk bestämningsmeto- dologi, t ex radioaktiva, enzymatiskt aktiva, fluoregena, kemiluminogena, biotinyl- etc grupper.

HPASP kan även vara bundet till någon av de olika typer av bärarmolekyler som är välkända inom immunkemisk metodologi och i imunsorbentsam- manhang. Av humana proteiner i uppfinningens HPASP-prepara- tioner utgör HPASP vanligtvis huvuddelen, d v s >50 %.

Preparationer anrikade med avseende på HPASP kan framställas genom att proteinet extraheras från humana vävnader eller fysiologiska vätskor som innehåller proteinet, företrädesvis från pankreas. Mest praktiskt är att man utgår från cytosol från pankreas och renar fram HPASP från denna. Därvid kan ett flertal olika biokemiska separationsförfaranden ut- nyttjas, såsom elektrofores, främst isoelektrisk fokusering, centrifugering och/eller vätskekromatografi. Bland de senare kan nämnas högtrycksvätskekromatografi (HPLC), gel-, affini- tets- och jonbyteskromatografi. Speciellt med hjälp av kromatofokusering kan HPASP enkelt och snabbt erhållas i AL-HB/Hlt 1986-06-17 * - - -3- 459 372 gott utbyte och med hög renhet, men även kombinationen av gelkromatografi (speciellt HPLC) och elektrofores kan ge proteinet i högren form.

Uppfinningen omfattar även anti-HPASP-antikroppsprepara- tioner. Med en sådan preparation avses, att den är riktad mot HPASP och ej reagerar immunkemiskt med andra substanser på ett för en given användning störande sätt. Anti-HPASP- antikroppar kan framställas på för antikroppar gängse sätt medelst immunisering av lämpligt djur (t ex kanin, råtta, mus etc) följt av upparbetning av de så erhållna antikrop- parna till lämplig renhet och form (derivat, fragment o s v). Framställningen av anti-HPASP-antikroppar kan omfatta även s k monoklonalteknik. Antikroppspreparationens anti-HPASP-antikroppar kan således föreligga som ett anti- serum eller vara affinitetsrenade, derivatiserade (t ex vara kovalent bundna till någon av de tidigare nämnda typerna av analytiskt indikerbara grupper eller vara kemiskt eller fysikaliskt bundna till en i vattenhaltigt medium olöslig fas, s k fastfas) eller fragmenterade till olika anti-HPASP- antikroppsaktiva komponenter,'såsom Fab, Fab' eller F(ab')2.

För vissa varianter av uppfinningen-kan man utnyttja anti- kroppar eller HPASP i s k fastfasbunden form; Att binda proteiner till fasta faser och använda dem i immunologiska bestämningsmetoder tillhör känd teknik (se t ex ref 12). Som exempel på fasta faser kan nämnas partikulära hydrofila och till gel svällbara men vattenolösliga matriser innehållande OH- eller NH2-grupper (exempelvis polyamider, polysacka- rider, poly(hydroxyalkylakrylater) och motsvarande meta- krylater etc). Uppfinningens antikropp eller HPASP kan vara kovalent eller adsorptivt bunden till en i vatten olöslig matris.

Uppfinningens anti-HPASP-antikropps- och HPASP-preparationer kan användas för att in vitro bilda immunkomplex, som innehåller minst en anti-HPASP-antikroppsaktiv komponent immunkemiskt bunden till HPASP. I sådana immunkomplex AL-HB/Hlt 1986-06-17 * 459- 3-72 - 4 - härstammar antingen HPASP, anti-HPASP-komponenten eller båda från en preparation enligt uppfinningen. Att bilda dessa immunkomplex har som huvudsakligt användningsområde a) immun- sorbentrening av HPASP eller anti -HPASP-antikroppar eller b) immunkemisk bestämning, företrädesvis av HPASP. Uppfin- ningen avser båda dessa aspekter, inklusive en reagenssats för deras genomförande. Sådana reagenssatser uppvisar minst en preparation enligt uppfinningen.

För att bilda immunkomplexen blandas (administreras) en preparation enligt uppfinningen med (till) ett prov, som innehåller en immunologisk motpart till det som finns i preparationen, under sådana betingelser att inununkomplexet kan bildas.

Detta kan ske på olika sätt. Antingen sätts provet till en preparation enligt uppfinningen eller omvänt.

Används flera olika preparationer enligt uppfinningen, bestäms den exakta ordningen användas till. Betingelserna vanliga, d v s vattenhaltiga normalt ligger mellan pH 3,5 av vad immunkomplexet skall är de för immunreaktioner medier buffrade till ett pH som och 9,0, företrädesvis 5,0 - 8,6 Buffertar och detergenter, som ej verkar störande pà immun- reaktionen eller dess resultat, kan vara tillsatta.

Den aspekt av uppfinningen som omfattar immunsorbentrening av HPASP, innebär att fastfasbundna anti-HPASP-antikroppar användes för bildning av immunkomplex, och att dessa i immunkomplexbunden form separeras från reaktionsblandningen, varefter HPASP pà för immunsorbentrening känt sätt frisättes och vid behov upparbetas vidare. Vid rening av anti-HPASP- antikroppar användes analogt fastfasbunden HPASP. vid bestämning av HPASP enligt uppfinningens diagnostiska metoder kan varje analysmetod, som specifikt förmår skilja HPASP från övriga proteiner i ett prov, utnyttjas. Sålunda är det möjligt att medelst isoelektrisk fokusering av serum separera HPASP fràn övriga serumproteiner för att därefter AL-HB/Hlt 1986-06-17 * _ . -s- 459 572 medelst proteinanalys kvantitera proteinmängden i HPASP- fraktionen. Ett funnet HPASP-värde i serum kan sedan korre- leras till pankreasfunktionen hos patienten ifråga, varvid ett förhöjt värde är ett tecken på pankreatit.

Den mest praktiska metodologin för klinisk rutinverksamhet är dock immunkemisk bestämning. Denna innebär att anti- kroppar, som är riktade mot HPASP, får reagera med i ett prov förekommande HPASP till bildande av ett (HPASP - anti-HPÄSP)-immunkomplex, vars bildning och mängd utgör ett kvalitativt respektive kvantitativt mått pá förekomsten av HPASP i provet. För att underlätta detektion och kvanti- tering tillsättes ofta ytterligare immunreaktanter eller andra reaktanter, som biospecifikt kan reagera med i komp- lexet ingående komponenter. Det kan vara HPASP eller anti- HPASP-antikroppar, vilka är bundna till fast fas eller försedda med analytiskt indikerbara grupper. Om märkt reaktant tillsättes, anpassas mängderna av respektive reaktant, så att mängden märkt reaktant som blir bunden till immunkomplexet eller som inte är det, utgör ett mått på mängden analyt (HPASP) i provet.

Ett flertal olika immunkemiska bestämningsmetoder finns tillgängliga, och fackmannen kan med utgångspunkt från förekomsten av en given analyt avgöra vilken som är mest lämpad. Detta gäller även för HPASP. Bland olika metoder kan nämnas: kompetitiva (inhibitions) och icke-kompetitiva metoder, precipitationsmetoder, heterogena och homogena metoder, olika metoder med namn efter den analytiskt indi- kerbara grupp som användes, immunelektrofores, partikel- agglutination, immundiffusion och mikroskopiering med hjälp av märkta antikroppar.

På nuvarande stadium anser vi att s k inhibitionsmetoder (kompetetiva metoder) är att föredra vid bestämning av HPASP.

AL-HB/Hlt 1986-06-17 * 459 372- " 5' Uppfinningens reagenssats innehåller alltid HPASP eller anti-HPASP-antikroppsaktiva komponenter, vilka, beroende på avsedd användning, kan föreligga som en, två eller flera preparationer enligt uppfinningen. Är satsen avsedd för ett för rening av anti-HPASP-anti- kroppsaktiva komponenter, innehåller den en preparation i vilken HPASP är bundet till fastfas. Är den avsedd för rening av HPASP, innehåller den anti-HPASP- antikroppsaktiva komponenter som är bundna till fastfas. Är satsen avsedd för ett immunkemiskt bestâmningsförfarande innehåller den alltid en anti-HPASP-antikroppspreparation. Är förfarandet kompetitivt kan satsen, förutom anti-HPASP- antikroppsaktiva komponenter som eventuellt är fastfas- bundna, även innehålla en HPASP-preparation en ligt uppfin- ningen.

Beroende pà det kompetitiva system som skall ut- nyttjas kan immunreaktanterna (HPASP och anti-HPASP- kroppsaktiva komponenter) som ingår i satsen vara anti- lösliga eller olösliga, märkta eller omärkta. Avses ett icke-kompe- titivt förfarande, t ex ett sandwich-system, kan satsen innehålla tvâ olika slag av anti-HPASP-antikroppsaktiva komponenter vilka i huvudsak samtidigt skall kunna föreligga immunologiskt bundna till HPASP. Beroende på det speciella förfarandet, som man avser utföra, kan satsens antikropps- komponenter vara bundna till fastfas, märkta med analytiskt indikerbara grupper eller omärkta och olösliga.

Olika aspekter av uppfinningen framgår av till texten bifogade patentkrav som utgör en del av densamma.

Uppfinningen skall nu áskâdliggöras med det vetenskapliga arbete som möjliggjort uppfinningen.

AL-HB/Hlt 1986-06-17 * - . -1- 459 372 MATERIAL OCH METODER: Vävnadsgrov Humana vävnader togs från avlidna 24 - 28 timmar efter döden. Det tillsågs, att givarna ej lidit av sjukdomar som berörde det analyserade organet. I vissa fall togs proverna i samband med operation. Vävnaderna frystes till -20 OC, efter det att de tagits ut. Efter upptining homogeniserades de i den tredubbla volymen av iskall buffert A (Tris 50mM, EDTA lmM, NaCl 50mM, pH 7,4) med en Ultraturrax® homogeni- sator. Homogenatet centrifugerades sedan i 60 min vid 100 500 x g, varefter det ovanpå liggande lipidlagret avlägsnades och den kvarvarande supernatanten dekanterades och lagrades vid -70 OC, tills dess att den användes.

Serumgrov Blodtagning skedde genom venpunktur, och det erhållna blodet fick koagulera, varefter serum framställdes genom centri~ fugering vid 3 000 x g i 20 minuter. Serum lagrades vid -20 OC, tills dess att det analyserades.

Protein och DNA-bestämning Bestämning av protein utfördes enligt Lowry et al (6). För att kunna applicera en korrekt mängd protein på gelerna vid den isoelektriska fokuseringen, mättes proteinhalten i HPLC- eluatet ur adsorbansdifferensen vid 280 och 310 nm .

DNA analyserades enligt Burton (7).

Högtrycksvätskekromatografi (= HPLC) En Varian isoelectric model 5010 vätskekromatograf hölls i kylrum vid 0 ~ 4 OC och användes enligt tillverkarens bruksanvisning. Kolonnerna (SW 3 000 (Varian)) ekvilibre~ _rades i buffert A innan de användes. Baserat pà preliminära AL-HB/Hlt 1986-06-17 * 459 172 - s försök användes alltid tvâ huvudprinciper; 1) hölls lodrät, och 2), när två kolonner användes, placerades de parallellt och anslöts till varandra med ett kort U- format rör. Eluatet uppsamlades i 0,5 ml kolonnerna fraktioner, och det tillsàgs att dödutrymet mellan kolonn och fraktionssamlare hölls vid ett minimum. eller 1 ml/min, 60 atm, Flödeshastigheten sattes till 0,5 vilket gav ett initialtryck på ca 30 eller beroende på om en respektive tvâ kolonner användes.

För att kalibrera kolonnen användes: Dextran blue (Pharmacia AB, voidvolym 2 x 106 dalton), humant gamma-globulin (Sigma) MW 153 000 dalton, bovint serum albumin (Sigma) MW 67 000 dalton, kolsyraanhydras (Sigma) MW 30 000 dalton, myoglobin (Sigma) MW 17 500 dalton, RNase (Sigma) MW 13 700 dalton, Cytokrom C (Sigma) MW 12 600 dalton och CuSO4 (som fri fraktion).

Proteinkoncentrationen i eluatfraktionerna mättes ur skill- naden i adsorbans vid 280 och 310 nm , och med ledning av de erhållna värdena togs prover för ytterligare analys. Rutin- mässigt samlades endast fraktioner som svarade mot den använda kolonnens separationsomràde, d v s enbart fraktioner som låg mellan Dextran blue och CuSO4.

Isoelektrisk fokusering på polyakrylamidgel Färdiggjorda geler, pH 3,9 - 9 (LKB Produkter AB, Bromma, Sverige) användes. Isoelektrisk fokusering utfördes med en Multiphor eller en Ultrophor 2217 (LKB Produkter AB).

Elektrodremsor índränkta i 1 M NaOH (katod) och 1 M svavel- syra (anod) applicerades och gelen prefokuserades i 15 - 20 minuter med 15 mA ström. Provramar om 0,3 ml akryl- plast användes för provpàsättning. Efter det att gelen prefokuserats placerades provramarna på gelytan 0,8 - l cm från katodens elektrodremsa där pH var 8 - 8,5. Ferritin (pl 5,0) och hemoglobin (pl 7,4) upplösta i vatten och en blandning av komersiellt tillgängliga standardproteiner (Pharmacia AB, Uppsala, Sverige), användes som standarder och fokuserades separat. Vanligtvis fokuserades átta prov samtidigt. Den isoelektriska fokuseringen startades med AL-HB/Hlt 1986-06-17 * - - -9- 459 372 S0 mA ström. Spänningen ökades sedan stegvis till I 000 - 2 000 V. När ferritinstandarden var fokuserad nära anoden och hemoglobinstandarden framför provramen (efter omkring l timme), sögs vätskan inuti provramen bort med en Pasteur-pipett, varefter provramarna avlägsnades. Resterande provlösning pà gelen sögs sedan bort med hjälp av filtrer- papper.

Fokuseringen fick pågå, till dess att strömmen var konstant.

Den totala tiden för fokuseringen räknat från provpásätt- ningen var omkring 1,5 timmar. Av största betydelse var en effektiv kylning, och analyserna utfördes därför vid 2 - 4 OC, genom att isvatten hela tiden pumpades genom apparatens kylplatta. pH mättes vid samma temperatur med hjälp av en ytelektrod (Type 403-30, Ingold, Zürich, Schweiz).

Proteinfärgning Gelerna färgades med Coomassie-blått.

Rening av HPASP En pool av 200 ml pankreascytosol framställdes enligt vad som angetts under avsnittet vävnadsprover. 30 ml tinades på is och dialyserades mot startbuffert (0,025 M etanolamin pH 8,6).

Detta material sattes till en 10 ml kromatofokuseringskolonn (Mono P, Pharmacia AB, Sverige) som var jämviktad i start- bufferten. Efter noggrann tvättning till dess att någon adsorbans ej kunde påvisas vid 280 och 310 nm, eluerades det adsorberade materialet med 30 ml Polybuffer 74 (pH 6 - 7, Pharmacia AB) och fraktionerna som svarade mot huvudprotein- toppen för pH 6,9 sammanslogs, karakteriserades ytterligare och användes efter frystorkning för att utveckla en radio- immunologisk analysmetod.

AL-HB/Hlt 1986-06-17 * 459 372 -lø- Mätnina av lipas- och amylasaktivitet Prover av fraktionerna som erhölls vid kromatofokuseringen av cytosol undersöktes med avseende på amylasaktivitet (CBR-alfa-amylas, Boehringer Mannheim, Tyskland) och pankreas- lipasaktivitet (Enzygnost® lipase, Behring, Tyskland).

Gelelektrofores pà polyakrylamid Polyakrylamidgelelektrofores utfördes på 10 % tvärbunden gel både i närvaro och frånvaro av SDS (= Natrium dodecyl- sulfat). Elektrodbufferten hade pH 8,6 (fosfat). När elektro- foresen utfördes på radioaktivt märkt HPASP skars gelen (efter elektrofores) i skivor (8 mm breda) vinkelrätt mot elektroforesriktningen. Respektive skiva lades i rör och deras radioaktivitet bestämdes.

Analys av aminosyrasammansättning HPASP från kromatofokuseringen rekromatograferades pà Sephadex G-25 för att erhålla ett fullständigt buffertbyte till 0,0l M natriumfosfat, pH 7,4. Aminosyrasammansättning bestämdes enligt standardprocedur vid Central Amino Acid Analysis Laboratory (Biokemiska Inst, Uppsala, Sverige). Sur hydrolys i 24 och 72 timar användes. Värdena för treonin och serin erhölls genom extrapolation till hydrolystiden noll för att korrigera för ofullständig hydrolys. Metionin och cystin bestämdes efter oxidation med permyrsyra.

Tryptofan analyserades efter hydrolys med merkaptoetansulfonsyra.

Framställning av 125I-märkt HPASP Radiojodering skedde med hjälp av kloramin-T-metoden (10).

Metoden gav preparationer vars specifika radioaktivitet var 100 - 260 Ci/g protein.

AL-HB/Hlt 1986-06-17 * . 9:' ' - _ - 11 - 459 372 Immunisering. Framtagning av antikroppar Fyra stycken två år gamla (mixed breed) kaniner immunise- rades med rent HPASP enligt Vaitukaitis et al (9). Proteinet, 100 /ug i 500 /ul 0,9 % NaCl, blandades med 1 500 /ul Freunds kompletta adjuvant, och blandningen injicerades subkutant på 20 olika ställen på kaninernas ryggar. Serum- prov togs vid olika tidpunkter och testades på sin förmåga att binda 1251-märkt HPASP med den radioimmunkemiska metod som anges nedan. Efter 2 månader gav djuren antisera med tillräckligt hög titer för att kunna användas i en immun- kemisk metod.

Radioimmunologisk bestämningsmetod Fosfatbufferten beskriven av Wide et al (ll) användes. Får anti-kanin-gamma-globulin belagda partiklar (DASP, Organon N.V.

Oss., Holland) användes i en koncentration av en ampull per 100 ml buffert för separation av HPASP bundet till sin homologa kanin-antikropp från obundet HPASP. Antiserumet späddes 1:10 000. Standardkurvan omfattade koncentrationer l25I från 5 upp till 1 000 /ug av rent protein per l. -märkt HPASP användes i en koncentration av ca 100 /ug per ml.

Den totala inkubationsblandningen bestod av 100 /ul 1251- märkt protein, 100 /ul standard eller lämpligt utspätt prov och 100 /ul antiserum. Efter inkubation i rumstemperatur under 2 timmar, tillsattes 1 ml suspension av partiklarna belagda med får anti-kanin-gamma-globulin till varje rör, rören tillslöts och roterades sakta i rumstemperatur i ytterligare 16 - 20 timmar. Efter centrifugering vid 1 000 x g i 3 min, sögs supernatanten av och partiklarna tvättades tvâ gånger med 0,9 % NaCl, varefter den till partiklarna bundna radioaktiviteten bestämdes i en gama-räknare.

AL-HB/Hlt 1986-06~l7 * 459 372 -12- RESULTAT Högtrycksvätskekromatografi (HPLC) Metoden utarbetades genom att använda pooler av cytosoler framställda från 6 - 8 normala pankreas för varje pool. HPLC gav en acceptabel separation efter molvikt. Försök gjordes med olika mängder vid kromatograferingen. För analys av pankreascytosol var 50 eller 100 /ul optimalt och gav en noggrann'separation på HPLC och tillräckligt med material för detektion med proteininfärgning efter isoelektrisk fokusering. Av de testade kolonnerna var en optimal kombi- nation för pankreascytosol tvâ 300 mm SW 3000 kolonner. Även buffertar innehållande högre saltkoncentrationer prövades, men eftersom eluaten då måste avsaltas användes som rutin buffertar med låg koncentration.

Isoelektrisk fokusering i polyakrylamidgel (= IFPAGE) Isoelektrisk fokusering är känd för att ge en optimal upplösning med avseende pà isoelektrisk punkt. Kombinationen HPLC och IFPAGB gav en excellent separation, och efter proteininfârgning kunde olika band observeras. bevarades vanligtvis, Gelerna eftersom inga fotografier kunde visa hela det proteinspektrum som fanns.

Av de synliga proteinerna var HPASP det med pl 6,9.

Rening av HPASP Efter preliminära försök kunde den ovan angivna renings- metoden utföras, och den gav i ett enda steg en nästan homogen produkt. Proteinet som eluerades vid pH 6,9 hade ett pl 6,9. När en immunkemisk bestämningsmetod tagits fram, kontrollerades alltid att den cytosolpreparation som skulle upparbetas hade en hög halt HPASP.

AL-HB/Hlt 1986-06-17 * » - - 13 - 459 372 Homogenitet ocn aminqgyrasammansättning av HPASP Elektrofores pá polyakrylamidgel i både närvaro och frånvaro av SDS visade ett band. Om HPASP märkts radioaktivt före elektroforesen kunde all radioaktivitet hänföras till bandet som svarade mot HPASP. Resultaten visade att den framtagna preparationen var homogen. Molekylvikten kunde också be- räknas ur gelelektroforesdata. Dessa gav en molvikt på 44 S00 dalton (iL§_§). Aminosyrasammansättningen var med felgränserna i 0,1 %.

Tabell 1 Asparginsyra 9,4 Isoleucin 2,3 Treonin 5,9 Leucin 10,7 Serin 5,1 Norleucin 0 Glutaminsyra 14,2 Tyrosin 2,6 Prolin 4,7 Fenylalanin 4,6 Glycin 3,0 Histidin 2,7 Alanin 7,9 Lysin 10,3 Halv-Cystin 5,1 Tryptofan 0,3 Valin 4,0 Arginin _å¿l Metionin 0,9 Total- - 98,7 (Ovan angivna felgränser beror huvudsakligen pà de förore- ningar som skulle kunna finnas i den preparation pá vilken analysen utförts.) Bestämning av lipas- och amylasaktivitet Renat HPASP visade inte på någon amylasaktivitet. Dessutom visades att amylasaktivitet och HPASP separerade vid kro- matofokusering. Serieutspädningar av HPASP visade att mindre än l % av materialet reagerade immunkemiskt i en immunkemisk metod avsedd för pankreaslipas. Således är föroreningen av lipas mindre än 1 %.

AL-HB/Hlt 1986-06-17 * 459 57.2. - 14 - Immunisering och radioimmunologisk bestämningsmetod Seriespädning av human pankreascytosol gav en dos-respons- kurva som var identisk med standardkurvan för HPASP. Paral- lella kurvor erhölls också när en pool sera från patienter med akut pankreatit analyserades. Höga koncentrationer av HPASP i normala individer kunde endast detekteras i pankreas.

En något förhöjd koncentration, relativt serum, kunde påvisas i prostata. I övriga studerade organ kunde bara nivåerna svarande mot de i perifert serum påvisas (Fig 1).

HPASP kunde kvantiteras i serum. Hos 26 friska individer (13 av vardera könet) låg nivån på 10 - 100 /ug/l, under det att den som var tiodubb- . Patienter med buksjukdomar som ej involverade pankreas visade inga förhöjda värden. patienter med akut pankreatit visade vär lade (Fig 2) Fig 1: Koncentration av HPASP i cytosol preparerad från olika humana vävnader. Varje punkt representerar ett värde funnet för en individ.

Pig 2: Koncentration av HPASP i periferat serum från 58 personer. Friska frivilliga var 26 och resterande var sera uppsamlade på akutmottagning. De senare har uppdelats efter diagnos.

AL-HB/Hlt 1986-06-17 * 1. 459 372 REFERENSER Scheele, G.A.

Two-dimensional gel analysis of soluble proteins.

J. Biol. Chem. ig (1975) 5375 - 5385. 2. Magid, E., Horsing, M., Rune, S.J.

On the quantítation of isoamylases in serum and the díagnostic value of serum pancreatic type amylase in chronic pancreatitis.

Scand. J. Gastroent. lå (1977) 621 - 627. 3. Skude, G., Eriksson, S.

Serum isoamylases in chronic pancreatitis.

Scand. J. Gastroenterol 11 (1976) 525 - 527. 4. Weaver, D., Douwman, D., Waltz, A., Clink, D., Resto, A., Stephany, J.

A correlation between clinical pancreatitis and ísoenzyme patterns of amylase.

J. Surgery 22 (1982) 576 - 580. 5. Goodale, R., Condre, R., Dressel, T., Taylor T., Gajl-Pecjalska, K.

A study of secretory proteins, cytology and tumor site in pancreatic cancer.

Ann. Surg. låg (1979) 340 - 344. 6. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A., Randall, R.J.

Protein measurement with the Folin phenol reagent.

J. Biol. Chem- låå (1951) 265 - 275. 7. Burton, K.

Determination of DNA concentration with dephenylamine.

Meth. Enzymol. (Ed. Grossman and Moldave) låg (1968) 163 - 166.

AL-HB/Hit 1986-06-17 * 459 37.2. _ 15 _ 8. Pousette, A., Carlström, K., Sköldefors, H., Wilking, N., Theve, N-O.

Purification and partial characterization of a estradiol- -17-beta-binding macromolecule in the human pancreas.

Cancer Res. gå (1982) 633 - 637. 9. Vaitukaitis, I., Robbíns, J.B., Nieschlag, E., Ross, G.T.

A method for producing specific antisera with small doses of ímmunogen.

J. Clin. Endocrinol. Metab. åâ (1971) 988 - 991. 10. Hunter, W.H., Greenwood, F.L.

Preparation of Iodine-131-labeled human growth hormone of high specific acitvity.

Nature låg (1962) 495 - 496. 11. Wide, L., Willius, S.J., Gemzell, C., Ross, P.

In: Radioimmunosorbent assay of follicle-stimulating hormone and luteinizing hormone in serum and urine from men and women.

Acta Endocrinol. (Kbh) lå (1973) Suppl. 174, ll - 15. 12. Wide, L et al In: Radioimmunoassay and related Procedures in Medicine, Vol I (1978) 143-54.

AL-HB /Hlt 1986-06-17 *

Claims (4)

~ _ ”f” 459 372 PATENTKRAV

1. Humant pankreasspecifikt protein med molvikt 44 500 dalton och pI 6,9 som kan isoleras från pankreascytosol medelst kromatofokusering eller isoelektrisk fokusering varvid fraktionen med pI 6,9 svarar mot proteinet och tillvaratas.

2. Framställning av antikropp specifikt riktad mot humant pankreasspecifikt protein, k ä n n e t e c k n a t av att man immuniserar med ett humant pankreasspecifikt protein som har molvikt 44 500 dalton och pI 6,9 och som kan isoleras fràn pankreascytosol medelst kromato~ fokusering eller isoelektrisk fokusering varvid frak- tionen med pI 6,9 svarar mot proteinet och tillvaratas.

3. Diagnostiskt förfarande för patienter som misstänks lida av akut pankreatit, k ä n n e t e c k n a t av l) att man i ett vätskeprov från en patient bestämmer ett humant pankreasspecifikt protein med pI 6,9 och molvikt 44 500 dalton som kan isoleras från pankreas- cytosol medelst kromatofokusering eller isoelektrisk fokusering och tillvaratagande av fraktionen med pI 6,9, och 2) att ett förhöjt värde tas som en indi- kation pâ att patienten lider av akut pankreatit.

4. Diagnostiskt förfarande enligt krav 3, k ä n n e ~ t e c k n a t av att bestämningen sker sker immun- kemiskt. AL-HB/pb/asw 1988-05-26 *