JP2009505049A - 関節リウマチにおいて形成される自己抗体を検出するための方法 - Google Patents
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Abstract
I型コラーゲンおよびII型コラーゲンのC−テロペプチド由来のシトルリン化ペプチドに対して反応する自己抗体が、関節リウマチを有する患者において見出される。これらは、I型コラーゲンのα1鎖由来の配列−YYXAもしくはα2鎖由来の配列−FYXA、またはII型コラーゲンのα1鎖由来の配列−YMXA(式中、Xはシトルリンである)を検出する。これらの抗体は、抗フィラグリン抗体とは異なる。本発明のペプチドは、関節リウマチの診断において使用できる。シトルリン化ペプチドの経口投与は、寛容を誘導し、関節リウマチの治療を導き得る。
Description
本発明は、関節リウマチ(RA)を有する患者において見出される自己抗体を検出するための方法に関する。
関節リウマチは、世界人口の約1%が罹患している一般的な自己免疫疾患である。この疾患は、早期段階で認識することが難しく、この疾患は次に、軟骨を破壊することおよび関節周囲の骨のびらんを導くことによって、関節における不可逆的な損傷へと進行する。
シトルリンは、酵素ペプチジルアルギニンデイミナーゼ(PAD)によって、ペプチドまたはタンパク質中のアルギニンから翻訳後に形成されるアミノ酸である。RA患者におけるいくつかの自己抗体はシトルリンを含むタンパク質に対するものであるので、この構造は、リウマチ学においてかなりの注意を引いてきた。最初のこのような自己抗体は、早くも1964年にはNeinhuisおよびMandemaによって記載された、抗核周囲因子(APF)であった(Ann Rheum Dis 1964;23:302〜305頁)。この抗原は、ヒト頬粘膜細胞の核の周囲のケラトヒアリン顆粒中に存在する。1979年に、Youngら(BMJ 1979;2:97〜99頁)は、ラット食道の切片を使用した間接的免疫蛍光によって、抗ケラチン抗体(AKA)を発見した。Schellekensら(J Clin Invest 1998;101:273〜281頁)およびGirbal−Neuhauserら(J Immunol 1999;162:585〜594頁)は後に、APFおよびAKAの両方が、シトルリン残基を含む(プロ)フィラグリンに特異的に結合することを、独立して示した。これらの自己抗体は、American College of Rheumatologyによって提唱された分類基準の1つを構成する特定の従来の自己抗体(例えば、リウマチ因子)よりも、RAに対して特異的である(Arnettら、Arthritis Rheum 1988;31:315〜324頁)。他方、それらの特異性に起因して、シトルリン化タンパク質に対する抗体は、RAの病因および/または病原に関与し得ると推測されてきた(van Boekelら、Arthritis Res 2002;4:87〜93頁)。しかし、抗シトルリン化フィラグリン抗体の産生が疾患の発病に先立つという事実は、シトルリン化および/または抗シトルリン化フィラグリン抗体がそれ自体病原性であるという単純な仮説と矛盾している(Yamadaら、Front Biosci 2005;10:54〜64頁)。例えば、関節周囲の組織における軟骨の深在性の破壊および骨びらんは、これらの自己抗体によっては誘導できない。
シトルリン化タンパク質に対する自己抗体の結合は、いくつかの方法によって検出され得る。最初に使用された免疫染色法は、臨床検査室において慣用的に使用するには適していなかったが、後に、環状シトルリン化ペプチドを抗原(抗CCP)として用いた酵素結合免疫吸着検定法(ELISA)の導入は、良好な再現性でこのような抗体の決定を大いに簡略化した(Schellekensら、Arthritis Rheum 2000;43:155〜163頁)。抗CCP抗体の存在は、見た目には健康な個人におけるRAの発症(Rantapaa−Dahlqvistら、Arthritis Rheum 2003;48:2741〜2749頁およびNielenら、Arthritis Rheum 2004;50:380〜386頁)およびRAへの未分化関節炎の進行(van Gaalenら、Arthritis Rheum 2004;50:709〜715頁)を予測することが報告されている。これらの抗体の病原の役割に関する可能な手がかりには、アポトーシスとシトルリン化との関連、臨床症状の発生前の抗CCP抗体の出現およびRAに対するそれらの特異性、ならびにRAに関連するシトルリン化の増加を導く示唆された遺伝的リスク因子が含まれる(van Gaalen FAら、Arthritis Rheum 2004;50:709〜715頁を参照のこと)。
関節内には抗CCP抗原は存在せず、このことは、これらの抗原と反応する自己抗体はいずれも、免疫交差反応を反映しているに過ぎない可能性が最も高いことを意味する(Yamadaら、Front Biosci 2005;10:54−64頁)。本来の免疫原の可能な候補には、滑膜組織中のフィブリンのシトルリン化されたα鎖およびβ鎖(Masson−Bessiereら、J Immunol 2001;166:4177〜4184頁)ならびにシトルリン化ビメンチンとして同定されたSa抗原(Vossenaarら、Arthritis Res Ther 2004;6:R142〜R150)が含まれる。
コラーゲンに対する自己免疫は、RAの病原に関与し得ると長く想定されていた。しかし、その証拠は、状況証拠に過ぎない。特定の動物種(例えば、ラット、マウス、ウサギおよびサル)において、II型コラーゲンでの免疫は、ヒトRAに似た多発性関節炎の発症を生じる。II型コラーゲンは翻訳後に修飾され、これらの修飾(例えば、264位でのリジンのグリコシル化)のなかには、T細胞により認識され得るものがある(Holmdahlら、Ageing Res Rev 2002;1:135〜147頁)。抗コラーゲン抗体は、軟骨コラーゲンに対して形成されるだけではなく、骨(I型コラーゲン)および軟組織コラーゲン(例えば、III型およびV型コラーゲン)に対しても形成される(Stuartら、Arthritis Rheum 1983;26:832〜840頁)。変性コラーゲンに対する抗体は、ネイティブなコラーゲンに対する抗体よりも、RA血清においてより高頻度かつより高濃度で存在する(Nijenhuisら、Clin Chem Acta 2004;350:17〜34頁およびNomura K、Arch Biochem Biophys 1992;293:362〜369頁)。これらの抗コラーゲン抗体は、決してRAに特異的なのではなく、それらの形成はこの疾患の原因ではなく、結合組織の破壊に対して二次的なものであり得る。
数年前、経口投与されたII型コラーゲンによる関節リウマチの治療を扱う多数の論文が刊行された(Trenthamら、Science 1993;262:1727〜1730頁)。しかし、これらの実験は何の利益も示さなかった(Cazzolaら、Clin Exp Rheumatol 2000;18:571〜577頁)、あるいはごく僅かなRAの疾患の改善しか示さなかったため(Choyら、Arthritis Rheum 2001;44:1993〜1997頁)、この仮説における興味はそれ以来失われていた。
Burckhardtら(Eur J.Immunol 2005.35:1643〜1652頁)は、コラーゲンII(CII)が、この軟骨特異的自己抗原に対する自己寛容の破壊を生じ得る、PAD酵素による構造的修飾の基質であり得るか否かという仮説を試験した。その結果は、PAD2(PADアイソタイプ2)が、自己抗体形成のための免疫優勢なCII領域における、アルギニンのシトルリンへの変換を触媒するという証拠を与え、早期RA患者においてシトルリン化三重螺旋コラーゲンペプチドCIIのアミノ酸残基359〜369に特異的に結合する循環自己抗体の存在を示した。Burkhardtらによれば、彼らの結果は、シトルリン化コラーゲンの自己免疫認識が早期RAにおいて頻繁な事象であることを示している。著者らはさらに、シトルリン化CIIに対するIgG抗体が、RAの早期マーカーとして使用される抗CCP自己抗体の存在と相関するということに、さらに注目している。
Suzukiら(Bioch Biophys Res Commun 2005;33:418〜426頁)は、免疫スクリーニングによるRA滑膜細胞cDNAライブラリーを使用して、ヒトI型コラーゲンがこの自己抗原の1つであり得ることを見出した。彼らは、I型コラーゲンおよびII型コラーゲンが、シトルリン化の基質として使用され得るか否かという仮説を試験した。以前の論文(Burckhardtら、Eur J Immonul 2005;35:1643〜1652頁)の知見とは対照的に、RAにおいてシトルリン化II型コラーゲンに対する特異的抗体は存在しなかったが、シトルリン化I型コラーゲンに対する抗体は見出された。
抗CCP自己抗体は、関節リウマチに非常に特異的ではあるが、おそらく無害である。なぜなら、この自己抗体は、軟骨および関節周囲の骨の破壊を担い得ないからである。抗CCPに対する公開された第1のアッセイ(マーク1)は、−STXG−(式中、Xはシトルリンである)の配列を有するシトルリン化フィラグリンを検出する(Schellekensら、Arthritis Rheum 2000;43:155〜163頁)。抗CCPに対する公開された第2のアッセイ(マーク2)は、RA血清とコントロール血清との間の識別に基づいてランダムに作成された合成ペプチドから選択された、いくつかのペプチド配列に基づく(Zendman Aら、Rheumatology 2006、45:20−5およびKinloch AJら、Expert Rev Clin Immunol 2006;2;365〜375頁)。これらの配列は公開されていないが、フィラグリンにもヒトの身体において見出される任意の他のタンパク質のいずれにも関係していない。
Lundbergら(Arthritis Res Ther 2005;7:R458〜R467)は、未修飾ラット血清アルブミン(RSA)と比較して、ラットT細胞およびB細胞の、シトルリン化ラット血清アルブミン(Cit−RSA)に対する応答を試験した。Cit−RSA抗原およびRSA抗原の両方に対して抗体が産生されたことから、Cit−RSAが免疫寛容の破壊を導くことが見出された。しかし、RSA単独では抗体をまったく誘導しなかった。シトルリン化II型コラーゲン(Cit−CII)は、ネイティブの対応物よりも高い発生率およびより早期の発生で、関節炎を誘導した。シトルリン化タンパク質および酵素PAD4の量は、Lundbergらによれば、炎症の重篤度に相関し、健康な関節においては検出不能であった。
公知のコラーゲンのアミノ酸配列の例は、例えば、データベースEMBL−EBI、AC Q8N473、01−OCT−2002、UniProtKB/TrEMBL、I型コラーゲンα1、前タンパク質、EMBL−EBI、AC Q7Z5S6、01−OCT−2003、UniProtKB/TrEMBL、I型コラーゲンα2、EMBL−EBI、AC Q96IT5、01−DEC−2001、UniProtKB/TrEMBL、COL2A1タンパク質(II型コラーゲンα1)において見出され得る。
I型コラーゲンの架橋されたカルボキシ末端テロペプチド(ICTP)についてのアッセイは、関節リウマチなどのいくつかの病理的状態においてI型コラーゲン分解の増加を反映していることが示された。ICTPアッセイによって認識される抗原決定基は、ヒトI型コラーゲンの2つのα1鎖のカルボキシ末端テロペプチド(ヒトI型コラーゲン中のAGFDFSFL)の疎水性フェニルアラニンリッチ領域内に存在することが、Sassi M.−L.ら(Bone、April 2000;26(4):367〜373頁によって示された。Nordic Bioscience diagnostics CrossLaps(登録商標)ELISA(http://www.nbdiagnostics.com)アッセイは、骨吸収の評価に使用され得る。これは、破骨細胞の骨吸収の間に生成されるI型コラーゲンフラグメントを検出し、異性体化形態中のエピトープGlu−Lys−Ala−His−Asp−β−Gly−Gly−Argを含むI型コラーゲンα1鎖のC−テロペプチドフラグメントを認識するモノクローナル抗体を使用する。
関節リウマチを診断する際の使用が示唆されるペプチドを開示する、いくつかの特許公報が存在する。国際特許公開WO95/08115号は、体液中のコラーゲンフラグメントを決定するための方法を記載している。この方法は、架橋のための潜在的な部位を含むコラーゲン由来の合成ペプチドを使用する。米国特許第6355442号においても、コラーゲンフラグメントを決定するための方法が開示されている。国際特許公開WO03/050542号は、関節リウマチに罹患している患者から自己抗体を検出するための方法を記載している。この方法は、XGモチーフおよびX非Gを含むペプチド単位の使用を含み、ここでXは、シトルリン残基またはそのアナログであり、Gはアミノ酸グリシンであり、非Gはグリシン以外のアミノ酸である。国際特許公開WO2004/07898号は、エピトープを共有するMHCクラスII分子に対する親和性が増加したシトルリン化ペプチドを開示している。このようなペプチドは、関節リウマチを診断する際に使用されることが示唆される。国際特許公開WO2004/087747号は、線状シトルリン化合成ペプチドおよびそれらを含む複数の抗原ペプチドを開示している。これらのペプチドは、関節リウマチを診断する際に使用されることも示唆される。
NeinhuisおよびMandema、Ann Rheum Dis 1964;23:302〜305頁
Youngら、BMJ 1979;2:97〜99頁
Schellekensら、J Clin Invest 1998;101:273〜281頁
Girbal〜Neuhauserら、J Immunol 1999;162:585〜594頁
Arnettら、Arthritis Rheum 1988;31:315〜324頁
van Boekelら、Arthritis Res 2002;4:87〜93頁
Yamadaら、Front Biosci 2005;10:54〜64頁
Schellekensら、Arthritis Rheum 2000;43:155〜163頁
Rantapaa−Dahlqvistら、Arthritis Rheum 2003;48:2741〜2749頁
Nielenら、Arthritis Rheum 2004;50:380〜386頁
van Gaalenら、Arthritis Rheum 2004;50:709〜715頁
Masson−Bessiereら、J Immunol 2001;166:4177〜4184頁
Vossenaarら、Arthritis Res Ther 2004;6:R142〜R150
Holmdahlら、Ageing Res Rev 2002;1:135〜147頁
Stuartら、Arthritis Rheum 1983;26:832〜840頁
Nijenhuisら、Clin Chem Acta 2004;350:17〜34頁
Nomura K、Arch Biochem Biophys 1992;293:362〜369頁
Trenthamら、Science 1993;262:1727〜1730頁
Cazzolaら、Clin Exp Rheumatol 2000;18:571〜577頁
Choyら、Arthritis Rheum 2001;44:1993〜1997頁
Burckhardtら、Eur J.Immunol 2005.35:1643〜1652頁
Suzukiら、Bioch Biophys Res Commun 2005;33:418〜426頁
Zendman Aら、Rheumatology 2006、45:20−5
Kinloch AJら、Expert Rev Clin Immunol 2006;2;365〜375頁
Lundbergら、Arthritis Res Ther 2005;7:R458〜R467
Sassi M.−L.ら、Bone、April 2000;26(4):367〜373頁
国際特許公開WO95/08115号
米国特許第6355442号
国際特許公開WO03/050542号
国際特許公開WO2004/07898号
国際特許公開WO2004/087747号
Merrifiel、1964.J.Am.Chem.Assoc.65:2149
J.Amer.Chem.Soc.85:2149(1963)
Int.J.Peptide Protein Res.35:161〜214頁(1990)
Methods of Organic Chemistry、E.Wansch(Ed.Vol.15pts.I and II.Thieme、Stuttgart(1987))
本発明の目的は、関節リウマチを診断するための改善された方法を提供することである。本発明の目的はまた、関節リウマチの治療のためおよびこのような治療をモニタリングするための新規方法を提供することである。
本発明の1つの目的は、関節リウマチに関連する自己抗体を検出するための方法である。この方法は、この疾患の診断において使用され得る。
この方法は、関節リウマチを有する患者において自己抗体がコラーゲンペプチドの部分に対して形成されたという知見に基づいている。特に、コラーゲンペプチドのこのような部分はテロペプチドであり、より具体的にはカルボキシ末端テロペプチドである。C−テロペプチドが、−YYXA、−FYXAおよび−YMXA(式中、Xは、シトルリンに変換されたアルギニンを示す)の群から選択されるペプチド配列を含むことが見出された。−YYXAは、I型コラーゲンのα1鎖中に見出され、−FYXAは、I型コラーゲンのα2鎖中に見出され、−YMXAは、II型コラーゲンのα1鎖中に見出された。これらの自己抗体は、フィラグリンに基づく配列を用いて検出されたものとは異なっていた。従って、先行技術(Schellekensら、Arthritis Rheum 2000;43:155〜163頁)において示唆された抗CCP法は、関節リウマチに関連する正確なペプチド配列を検出できなかった。
本発明のさらなる1つの目的は、RAを治療するためのペプチドおよび医薬組成物である。シトルリン化コラーゲンの部分がコラーゲンの潜在的に有害なシトルリン化に対する免疫寛容を誘導し得ることが、本発明において見出された。従って、RA患者は、シトルリン化コラーゲンの部分を投与することによって治療され得る。特に、コラーゲンのこのような部分は、テロペプチド、より具体的にはカルボキシ末端テロペプチド由来であった。C−テロペプチドが−YYXA、−FYXAおよび−YMXA(式中、Xは、シトルリンに変換されたアルギニンを示す)の群から選択されるペプチド配列を含むことが見出された。
先行技術の刊行物は、RAを有する患者における自己抗体形成におけるコラーゲンテロペプチドの役割の研究を開示していない。その理由は、このような自己抗体が、ペプシン消化によって可溶性になったコラーゲン調製物を使用することによって主に試験されてきたからである。このプロテアーゼは、コラーゲンのカルボキシテロペプチドを除去し、従って、先行技術の刊行物の著者らは、テロペプチドの観察をまったくできていなかった。
さらに、本発明は、本発明のペプチドで治療されたRAを有する患者をモニタリングするために使用され得る。
この研究において開発されたアッセイは、自己抗体を検出して患者においてRAを診断するため、および本発明のペプチドで治療されたRAを有する患者をモニタリングするための両方に使用され得る。
抗CCP法は、関節リウマチの診断において充分に機能する。しかし、この方法によって検出される自己抗体は、軟骨および骨の分解を担い得ない。従って、薬物による最も積極的な治療を必要とする患者を認識することが重要である。
関節リウマチを有するかまたは関節リウマチを有すると疑われる患者を治療するために使用される多数の薬物は、いくつかの副作用を引き起こす。従って、この薬物を全ての患者に与えることはできない。患者がシトルリン化コラーゲンに対する抗体を有することが示された場合、これは、最も積極的な様式で患者を治療する理由である。最も最近の薬物は非常に高価でもあり、それらの広範な使用を妨げている。本発明の方法を使用することによって、最も有効な治療を必要とする患者を認識でき、この治療を適正な患者群に向けることができる。
「関節リウマチ」(RA)は、滑膜炎症およびパンヌス形成によって特徴付けられる一般的な自己免疫疾患であり、軟骨および骨の分解を導き得る。
3つのクラスのヒトコラーゲンが記載されている。第1の群は、いくつかのコラーゲン型(例えば、I型、II型、III型およびV型)を含む。これらのうち、I型コラーゲンは、有機骨基質の90%より多くを占める。II型コラーゲンは、関節の軟骨中に豊富な分子である。I型コラーゲンおよびII型コラーゲンは、コアコラーゲン分子に結合したN末端およびC末端のプロペプチド配列を含むプロコラーゲンとして合成される。プロペプチドが除去されると、コラーゲン分子の残りのコアは、非螺旋の短い末端テロペプチド配列を有する三重螺旋ドメインからなる。
用語「自己抗体」は、関節リウマチを有する患者において、アルギニン含有ペプチドまたはそのシトルリン化形態に対して形成された抗体を意味する。これらの自己抗体は、軟骨および骨の分解に関連して形成される。
本発明において、特に、カルボキシ末端テロペプチドが自己抗体の検出において使用され得る配列を含むことが見出された。このような配列は、I型コラーゲンのα1鎖、I型コラーゲンのα2鎖およびII型コラーゲンのα1鎖から特異的に見出された。さらに、ペプチド配列中の最後のアルギニン残基がシトルリンに変換されている場合、これらのカルボキシ末端部分由来の配列を含むペプチド配列が、自己抗体の検出において使用され得ることが見出された。
I型コラーゲンのα1鎖のカルボキシ末端テロペプチドの長さは、26アミノ酸である。I型コラーゲンα2鎖のカルボキシ末端テロペプチドの長さは17アミノ酸であり、II型コラーゲンのα1鎖のカルボキシ末端テロペプチドの長さは27アミノ酸である。
本発明は、カルボキシ末端テロペプチドのC末端部分のアミノ酸配列を含むペプチドを特に包含する。免疫複合体の形成に適した条件下で生体液試料と接触させた場合に、自己抗体複合体の形成を誘導し得るテロペプチド(1種または複数)の部分が、特に対象となる。
このペプチドは好ましくは、−YYXA、−FYXAおよび−YMXA(式中、Xはシトルリンである)を含む群から選択される配列で終わる。
本発明の最も好ましい実施形態によれば、このペプチドは、EKAHDGGRYYXA(配列番号1)、YDFGYDGDFYXA(配列番号2)およびEKGPDPLQYMXA(配列番号3)(式中、Xはシトルリンである)を含む群から選択された配列を含むかまたは有する。
表現「カルボキシ末端テロペプチド由来の配列を含むペプチド配列」とは、そのペプチド配列が、カルボキシ末端テロペプチドと同じ配列を含むか、またはそのペプチド配列が同じ様式でなお機能するようなアミノ酸変化を有していることを意味する。好ましくは、このペプチド配列は、カルボキシ末端テロペプチドと同じ配列を含む。
本発明のペプチド配列の長さは、好ましくは10〜30アミノ酸、より好ましくは12〜27アミノ酸である。好ましくは、それらの長さは少なくとも12アミノ酸、より好ましくは少なくとも17アミノ酸、最も好ましくは少なくとも26アミノ酸である。
ペプチド配列は、組織コラーゲンから単離され得、アルギニンはin vitroでシトルリンへと変換され得る。精製は、当業者に周知のタンパク質精製方法によって達成され得る。タンパク質精製方法は、例えば、クロマトグラフィー法(例えば、ゲル濾過、イオン交換および免疫親和性、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)、高速等電点電気泳動法ならびに疎水性相互作用クロマトグラフィー)、または沈降、特に免疫沈降である。
アルギニンは、脱イミノ化を介してシトルリンへと翻訳後修飾され得る。このプロセスは、酵素ペプチジルアルギニンデイミナーゼ(PAD)によって触媒される。この脱イミノ化プロセスはin vitroで実施され得る。
ペプチド配列は、当業者に周知の方法でも合成できる。このような方法は、例えば、固相合成(Merrifiel、1964.J.Am.Chem.Assoc.65:2149;J.Amer.Chem.Soc.85:2149(1963)およびInt.J.Peptide Protein Res.35:161〜214頁(1990))などの化学合成法であるか、またはこの合成は、均質溶液中で実施され得る(Methods of Organic Chemistry、E.Wansch(Ed.Vol.15pts.I and II.Thieme、Stuttgart(1987))。
ペプチド配列は、当業者に周知の組換えDNA技術によっても調製できる。脱イミノ化プロセスは、酵素ペプチジルアルギニンデイミナーゼ(PAD)を使用することによってin vitroで実施され得る。
体液試料は、好ましくは、血清試料または別の生体液の試料、例えば、滑液試料である。
本発明のペプチド配列は、種々のアッセイにおけるそれらの検出を促進するために、標識で標識してもよい。このような標識の例は、例えば、放射性標識、蛍光標識、発光標識、ランタニドまたは酵素である。
ペプチド配列と生体液試料との間の免疫反応は、固相中で実施され得る。これらのペプチドは、金もしくはポリスチレンのミクロスフィア、スライド、チップまたはマイクロタイタープレートの壁などの固体担体に共有結合または非共有結合によりカップリングさせてもよい。ペプチド配列は、直接的に、または例えばストレプトアビジンを介して間接的に、試験管またはプレートに結合され得る。
あるいは、ペプチド配列と生体液試料との間の免疫反応は、液相中で実施してもよく、ペプチド配列は、直接的に、または例えばストレプトアビジンを介して間接的に、固体粒子(例えば、磁性粒子)に結合させてもよい。
本発明は、医薬組成物もまた包含する。この医薬組成物は、少なくとも1つの本発明のペプチド配列の有効量を含む。この医薬組成物は、患者へのin vivoの投与に適した、生物学的に適合した形態である。このような組成物は、いずれの毒性効果も有するべきではない。医薬組成物は、有効量のペプチド配列および医薬として許容される添加物を含む。添加物とは、ゼラチン、デキストリン、ペクチン、寒天、油、生理食塩水、スクロース、ラクトース、リン酸カルシウムおよび水などの医薬として許容される担体、炭水化物(例えば、マンニトール、デンプン、スクロース、デキストリン、グルコースおよびソルビトール)、タンパク質(例えば、カゼインおよびアルブミン)などの安定剤、ならびに緩衝剤を意味する。医薬組成物はまた、1種または複数のアジュバントを含み得る。
「有効量」とは、ヒトにおいて所望される結果を達成するために必要な投薬量および期間で有効な量である。所望の結果は、ヒトにおける免疫応答であり、年齢、体重、健康状態、性別または疾患状態に依存し得る。この医薬組成物は、1〜50μg/日の量で投与され得る。好ましくは、この量は、1〜25μg/日である。投与量は、投与経路、投与時間に依存し得、個体の免疫応答に依存して変動し得る。
適切な投与経路は、皮下注射、筋内注射、静脈内注射または腹腔内注射、経口および鼻腔内投与である。最も適切な経路は、経口投与または注射である。
関節リウマチを治療するための方法は、そのような治療を必要とする個体に、少なくとも1つの本発明のペプチドの有効量を投与することを含む。投与は、医薬組成物の形態で与えられ得る。
I型コラーゲンおよび/またはII型コラーゲンに対する免疫寛容を誘導するための方法は、少なくとも1つの本発明のペプチドの有効量を個体に投与することを含む。
キットは、本発明による少なくとも1種のペプチドを含む。試験キットは、本発明による診断方法またはモニタリング方法で使用され得る。
本発明の好ましい実施形態によれば、生物学的流体試料中の自己抗体は、本発明のシトルリン化ペプチドでコーティングした固体基板(例えば、マイクロタイタープレート)を使用することによって検出され得る。生体液の試料は、基板上に吸着したペプチドと接触するように配置され、これらと共にインキュベートされる。生物学的試料の非結合物質は、洗浄によって除去される。シトルリン化ペプチド/抗シトルリン化ペプチド抗体複合体中に存在する任意の抗体を結合し得るインジケータ抗体が、固体基板に添加される。このインジケータは、抗ヒトIgG免疫グロブリンであり得る。固体基板上のシトルリン化ペプチド/抗シトルリン化ペプチド抗体/インジケータ抗体複合体の存在が検出される。この検出は、例えば、ルミノメータによって検出される化学発光および放射光に基づき得る。
本発明の別の好ましい実施形態によれば、このアッセイは、ELISA法によって実施され、このとき、インジケータ抗体は酵素にコンジュゲートしている。適切な酵素は、例えば、発色基質の使用によって検出できる酵素である。このような酵素は、例えば、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼである。発色基質は、酵素との反応の結果として着色産物を生じる。この着色産物は、分光分析法によって検出できる。
生体液試料中の自己抗体の存在は、例えばELISA法または化学発光イムノアッセイを使用することによって、本発明のペプチドとの免疫反応として検出され得る。生体液中の自己抗体の豊富さは、分光光度計による吸光度の強度またはルミノメータによって定量される化学発光反応の光として測定され得る。本発明のペプチドによるRAの治療は、治療前後で患者における自己抗体の量を比較することによってモニタリングできる。
関節リウマチには正常なI型コラーゲンおよびII型コラーゲンに対する抗体も存在するので、シトルリン化形態に対する特異的抗体を検出するために、I型コラーゲンまたはII型コラーゲンのカルボキシテロペプチドのアルギニン含有ペプチドおよびシトルリン含有ペプチドの両方を使用する2つのアッセイを実施すべきである。アルギニン含有ペプチドの吸光度がシトルリン含有ペプチドの吸光度から減算されるか、またはシトルリン含有ペプチドとアルギニン含有ペプチドとの結合比が計算される。あるいは、シトルリン化ペプチドを用いるアッセイバージョンのみを使用して、免疫学的結合の阻害剤としての可溶性形態の同じまたは類似のペプチドの添加ありおよびなしの両方で、それを実施することが可能である。
本発明をさらに詳細に説明するために以下に実施例を示すが、本発明の範囲はこれらの実施例によって限定されるものではない。
ELISAアッセイ
120人のRAを有する患者由来の血清試料を、Division of Rheumatology of Oulu University Hospitalから得た。コントロールは、年齢および性別が一致した健康な人由来の81の血清からなった。6対のビオチン化ペプチドを、NeoMPS(Strasbourg、France)によって合成した。図1は、ヒトI型コラーゲンおよびII型コラーゲンの一次構造における選択されたペプチドの配列および位置を示す。図1A〜Cは、II型コラーゲン中のペプチドCC1〜CC4の位置およびそれらの配列を示す。括弧内の数字はアルギニン残基を示す:CC1(1059)、CC2(1048)、CC3(799)およびCC4(28)。コラゲナーゼ切断部位は、図1A中で矢印で示される−GPPGPQG│LAGQRGE−(配列番号9)。図1Bは、配列CC1 EKGPDPLQYMXA(配列番号3)、CC2 SAFAGLGPXEKGPD(配列番号6)、CC3 LAGQXGIVGLP(配列番号7)およびCC4 GPMGPXGPPGPA(配列番号8)を示す。Xはアルギニン/シトルリンである。図1Cは、II型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチドの詳細な構造を示す(GPPは螺旋に属する)。II型コラーゲンのC−テロペプチドは、配列GPGIDMSAFAGLGPREKGPDPLQYMXAを有する。配列GPPGPGIDMSAFAGLGPREKGPDPLQYMXAは、配列番号10として配列表に示される。カルボキシ末端の12アミノ酸は、ペプチドCC1を示す。図1Dは、I型コラーゲンのα1鎖(EKAHDGGRYYXA;配列番号1)およびα2鎖(YDFGYDGDFYXA;配列番号2)のカルボキシ末端テロペプチドの配列を示す。各対の一方のメンバーは、それぞれの遺伝子によって予測されるアルギニンを含んだが、一方でその対の他方のメンバーでは、このアルギニンはシトルリンで置換されていた。
120人のRAを有する患者由来の血清試料を、Division of Rheumatology of Oulu University Hospitalから得た。コントロールは、年齢および性別が一致した健康な人由来の81の血清からなった。6対のビオチン化ペプチドを、NeoMPS(Strasbourg、France)によって合成した。図1は、ヒトI型コラーゲンおよびII型コラーゲンの一次構造における選択されたペプチドの配列および位置を示す。図1A〜Cは、II型コラーゲン中のペプチドCC1〜CC4の位置およびそれらの配列を示す。括弧内の数字はアルギニン残基を示す:CC1(1059)、CC2(1048)、CC3(799)およびCC4(28)。コラゲナーゼ切断部位は、図1A中で矢印で示される−GPPGPQG│LAGQRGE−(配列番号9)。図1Bは、配列CC1 EKGPDPLQYMXA(配列番号3)、CC2 SAFAGLGPXEKGPD(配列番号6)、CC3 LAGQXGIVGLP(配列番号7)およびCC4 GPMGPXGPPGPA(配列番号8)を示す。Xはアルギニン/シトルリンである。図1Cは、II型コラーゲンのカルボキシ末端テロペプチドの詳細な構造を示す(GPPは螺旋に属する)。II型コラーゲンのC−テロペプチドは、配列GPGIDMSAFAGLGPREKGPDPLQYMXAを有する。配列GPPGPGIDMSAFAGLGPREKGPDPLQYMXAは、配列番号10として配列表に示される。カルボキシ末端の12アミノ酸は、ペプチドCC1を示す。図1Dは、I型コラーゲンのα1鎖(EKAHDGGRYYXA;配列番号1)およびα2鎖(YDFGYDGDFYXA;配列番号2)のカルボキシ末端テロペプチドの配列を示す。各対の一方のメンバーは、それぞれの遺伝子によって予測されるアルギニンを含んだが、一方でその対の他方のメンバーでは、このアルギニンはシトルリンで置換されていた。
ビオチン化ペプチドを、10μg/ウェルの濃度で、ストレプトアビジンでコーティングされた96穴アッセイプレート(BioBind Assembly、Thermo Labsystems Oy、Vantaa、Finland)にカップリングさせた。このカップリングは、室温でpH7.5で2時間実施した。ストレプトアビジンでコーティングしたウェルは、非特異的結合を防止するために、製造者によってブロッキングされたものであった。
試験すべき血清を、1%ウサギ血清を補充したアッセイ緩衝液(10mM Tris−HCl、350mM NaCl、1% BSA、1%[体積/体積]Triton X−100、0.5%[重量/体積]デオキシコール酸Na、0.1% SDS;pH7.6)中に希釈し、室温で1時間インキュベートした。洗浄(PBS/0.05%[体積/体積]Tween−20で3回)後、EIA緩衝液(20mM Tris−HCl、150mM NaCl、0.1% BSA、0.05% Tween−20、pH7.5)中に1:7500希釈した、ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗ヒトIgG(Product #31412、Pierce、Rockford、IL、USA)を100μl添加した。室温で1時間インキュベートした後、プレートを洗浄した(PBS/Tween−20で3回)。結合した抗体を、基質として3,3’−5,5’−テトラメチル−ベンジジン(Sigma−Aldrich、St.Louis、MN、USA)(100mM 酢酸ナトリウム3水和物、1.5mM クエン酸1水和物、0.0015% H2O2中、1ウェル当たり0.01mg/100μl)を用いて検出した。30分後、100μlの2M硫酸/ウェルを添加することによって反応を停止させた。プレートを、Victor2機器(Wallac、Turku、Finland)中で450nmの波長で読み取り、Multicalc(Wallac)によって計算した。全ての血清は2連で試験した。変動係数は一般に10%未満であった。
単一のペプチドを直接分析したところ、RAを有する患者のうち42%〜53%が、特にII型コラーゲン由来のペプチドの結合の増加を示した(表1)。
各ペプチド対を試験したとき、コントロール試料の差異の平均(シトルリン化ペプチドの吸光度値−アルギニンペプチドの吸光度値)および分散は、CC1について−0.026(SD 0.032)、CC2について−0.027(0.029)、CC3について−0.001(0.026)およびCC4について+0.005(0.020)。RA血清のCC3およびCC4のシトルリン化形態への特異的結合は存在しなかった。しかし、RA患者中のペプチドCC2および特にペプチドCC1は差異を示した。なぜなら、ペプチドCC2群中の2つの血清およびペプチドCC1群中の12の血清は、正常なペプチドよりもシトルリン化ペプチドと結合したからである。I型コラーゲンのα1鎖について、コントロール試料の差異の平均(シトルリン化ペプチドの吸光度値−アルギニンペプチドの吸光度値)および分散は、約+0.026(0.074)であった。I型コラーゲン由来のα2鎖のC−テロペプチドを用いると、コントロール試料間の差異の平均および分散は、+0.071(0.252)であった。20のRA血清は、それぞれのアルギニンペプチドよりも強力に、I型コラーゲンのα1鎖(α1(I)テロペプチド)由来のシトルリン化カルボキシテロペプチドと結合した。
本発明者らは、ペプチドCC1およびより低い程度までペプチドCC2が、シトルリン化タンパク質に対する自己抗体に特異的に結合することを見出した。これらの結果は、アルギニンが、PAD酵素の作用に感受性のカルボキシ末端に近いことを示す。
化学発光アッセイ
測定を、ヒトI型コラーゲンおよびII型コラーゲンのα1鎖の合成C−テロペプチド(それぞれ、NeoMPS、Strasbourg、France製のEKAHDGGRYYRA(配列番号4)およびEKGPDPLQYMRA(配列番号5)、またはEKAHDGGRYYXA(配列番号1)およびEKGPDPLQYMXA(配列番号3)(式中、Xはシトルリンを示す))に対するIgG抗体を検出する2部位化学発光イムノアッセイで実施した。最初に、血清試料を、10mM Tris−HCl、350mM NaCl、1% BSA、1%[体積/体積]Triton X−100、0.5%[重量/体積]デオキシコール酸Na、0.1% SDSを含む緩衝液(pH7.6)中に1:10希釈し、適切な濃度の上記ペプチドの1つ(ビオチン化形態)およびストレプトアビジンでコーティングした磁性粒子と共に、37℃で10分間インキュベートした。未結合のビオチン化抗原および抗体を、反応混合物の吸引および引き続く洗浄によって、磁性粒子に結合した複合体から分離した。その後、アクリジニウム標識した抗ヒトIgG抗体を反応混合物に添加し、その後もう10分間インキュベートして、サンドイッチ複合体を生成した。未結合の標識を、反応混合物の吸引および引き続く洗浄によって分離した。洗浄した、複合体を伴う磁性粒子に、本発明者らは、化学発光反応を開始するトリガー1および2を注入した。トリガー1溶液は、希酸中に過酸化水素を含み、トリガー2溶液は希水酸化ナトリウムを含んだ。
測定を、ヒトI型コラーゲンおよびII型コラーゲンのα1鎖の合成C−テロペプチド(それぞれ、NeoMPS、Strasbourg、France製のEKAHDGGRYYRA(配列番号4)およびEKGPDPLQYMRA(配列番号5)、またはEKAHDGGRYYXA(配列番号1)およびEKGPDPLQYMXA(配列番号3)(式中、Xはシトルリンを示す))に対するIgG抗体を検出する2部位化学発光イムノアッセイで実施した。最初に、血清試料を、10mM Tris−HCl、350mM NaCl、1% BSA、1%[体積/体積]Triton X−100、0.5%[重量/体積]デオキシコール酸Na、0.1% SDSを含む緩衝液(pH7.6)中に1:10希釈し、適切な濃度の上記ペプチドの1つ(ビオチン化形態)およびストレプトアビジンでコーティングした磁性粒子と共に、37℃で10分間インキュベートした。未結合のビオチン化抗原および抗体を、反応混合物の吸引および引き続く洗浄によって、磁性粒子に結合した複合体から分離した。その後、アクリジニウム標識した抗ヒトIgG抗体を反応混合物に添加し、その後もう10分間インキュベートして、サンドイッチ複合体を生成した。未結合の標識を、反応混合物の吸引および引き続く洗浄によって分離した。洗浄した、複合体を伴う磁性粒子に、本発明者らは、化学発光反応を開始するトリガー1および2を注入した。トリガー1溶液は、希酸中に過酸化水素を含み、トリガー2溶液は希水酸化ナトリウムを含んだ。
早期RAを有する120人の患者由来の血清試料を、Division of Rheumatology of Oulu University Hospitalから得た。コントロールは、年齢および性別が一致した健康な個人由来の81の血清からなった。
120人中44人のRA患者において、血清は、I型コラーゲンのα1鎖由来のシトルリン化合成C−テロペプチドの結合の増加を示した(コントロールと比較してp=0.003)。II型コラーゲンのα1鎖由来の対応するC−テロペプチド対について、35人の患者の血清はアルギニンペプチドよりも強力にシトルリン化ペプチドに結合したが、コントロールと比較した差異は有意ではなかった(p=0.074)。2つのカルボキシテロペプチド間の相関は、r=0.473(p<0.001)であった。
関節リウマチ患者の血清における自己抗体の特異性
抗体特異性を検出するために、本発明者らは、I型コラーゲンおよびII型コラーゲンの両方のテロペプチドアッセイおよび抗CCPマーク2アッセイキットを試験した。患者の血清を、各アッセイにおける最初の結合がそれぞれのペプチドで著しく阻害できるように、アッセイ緩衝液中に希釈した。競合ペプチド(α1(I)およびα1(II)のコラーゲンC−テロペプチドのアルギニン形態およびシトルリン形態)の段階希釈物を添加した(図2)。プレートにカップリングされたものと同じペプチドの可溶性形態による阻害は、両方のテロペプチドアッセイにおいて、特異性コントロールとして機能した。抗CCPアッセイについて、このようなペプチドは特異性試験には利用可能でなかった。%阻害を、可溶性ペプチドの濃度に対してプロットした。ヒト血清のみ(最初の結合)で得られたシグナル(450nmの波長)を0%阻害として定義し、ブランク(血清試料なし)のシグナルを100%阻害として定義した。本発明者らは、可溶性形態の正常抗原またはシトルリン化抗原のいずれかとの結合を阻害した。可溶性テロペプチド抗原は、I型コラーゲンおよびII型コラーゲンの両方のテロペプチドアッセイにおいて結合を阻害した(図2Aおよび2B)。
抗体特異性を検出するために、本発明者らは、I型コラーゲンおよびII型コラーゲンの両方のテロペプチドアッセイおよび抗CCPマーク2アッセイキットを試験した。患者の血清を、各アッセイにおける最初の結合がそれぞれのペプチドで著しく阻害できるように、アッセイ緩衝液中に希釈した。競合ペプチド(α1(I)およびα1(II)のコラーゲンC−テロペプチドのアルギニン形態およびシトルリン形態)の段階希釈物を添加した(図2)。プレートにカップリングされたものと同じペプチドの可溶性形態による阻害は、両方のテロペプチドアッセイにおいて、特異性コントロールとして機能した。抗CCPアッセイについて、このようなペプチドは特異性試験には利用可能でなかった。%阻害を、可溶性ペプチドの濃度に対してプロットした。ヒト血清のみ(最初の結合)で得られたシグナル(450nmの波長)を0%阻害として定義し、ブランク(血清試料なし)のシグナルを100%阻害として定義した。本発明者らは、可溶性形態の正常抗原またはシトルリン化抗原のいずれかとの結合を阻害した。可溶性テロペプチド抗原は、I型コラーゲンおよびII型コラーゲンの両方のテロペプチドアッセイにおいて結合を阻害した(図2Aおよび2B)。
図2.競合アッセイ。1つの血清試料を、3つの異なるELISAにおいて試験した:I型コラーゲン(A)およびII型コラーゲン(B)のα1鎖のシトルリン化カルボキシテロペプチドアッセイならびに抗CCPアッセイ(C)。阻害剤は、EKAHDGGRYYRA(配列番号4)(白三角)、EKAHDGGRYYXA(配列番号1)(黒三角、I型コラーゲンアッセイにおける固定化抗原に対応する)、EKGPDPLQYMRA(配列番号5)(白四角)およびEKGPDPLQYMXA(配列番号3)(黒四角、II型コラーゲンアッセイにおける固定化抗原に対応する)であった。
このように、同一または類似の抗体が結合に関与するようである。しかし、コラーゲンテロペプチドは、抗CCPアッセイとは異なる抗体種に結合する。なぜなら、抗CCP結合は、これらのペプチドを阻害できないからである(図2C)。
コラーゲンに対する自己抗体は、抗CCPアッセイで検出されたものとは異なるが、両方の自己抗体が、関節リウマチを有する患者において増加する。表2中に示すように、これらの自己抗体間には有意な相関が存在した。
阻害アッセイ
関節リウマチにおいて、正常なI型コラーゲンおよびII型コラーゲンに対する抗体もまた存在するので、シトルリン化形態に対する特異的抗体を検出するために、I型またはII型のカルボキシテロペプチドのアルギニン含有ペプチドおよびシトルリン含有ペプチドの両方を使用する2つのアッセイを実施すべきである。次いで、アルギニン含有ペプチドとの反応の吸光度を、それぞれのシトルリン含有ペプチドとの反応の吸光度から減算するか、またはシトルリン含有ペプチドとアルギニン含有ペプチドとの結合比を計算する。
関節リウマチにおいて、正常なI型コラーゲンおよびII型コラーゲンに対する抗体もまた存在するので、シトルリン化形態に対する特異的抗体を検出するために、I型またはII型のカルボキシテロペプチドのアルギニン含有ペプチドおよびシトルリン含有ペプチドの両方を使用する2つのアッセイを実施すべきである。次いで、アルギニン含有ペプチドとの反応の吸光度を、それぞれのシトルリン含有ペプチドとの反応の吸光度から減算するか、またはシトルリン含有ペプチドとアルギニン含有ペプチドとの結合比を計算する。
優先的に、シトルリン化ペプチドアッセイバージョンのみを使用することも可能であり、このとき、このアッセイは標準条件で、アッセイ溶液中の同じまたは類似の可溶性ペプチド(200μg/ml)を添加して実施される。
RA患者(n=120)由来の血清およびコントロール(n=81)由来の血清を、アッセイ緩衝液および/または阻害緩衝液(可溶性シトルリン含有ペプチド(200μg/ml)を含む)中に1:100希釈した。阻害時間は30分間であった。阻害反応後、血清を、ビオチン化したシトルリン含有ペプチドをカップリングさせておいた、ストレプトアビジンでコーティングした96穴アッセイプレートのウェルに移した。洗浄(PBS/0.05%[体積/体積]Tween−20で3回)後、EIA緩衝液(20mM Tris−HCl、150mM NaCl、0.1% BSA、0.05% Tween−20、pH7.5)中に1:7500希釈した、ペルオキシダーゼにコンジュゲートした抗ヒトIgG(Product#31412、Pierce、Rockford、IL、USA)を100μl添加した。室温で1時間インキュベートした後、プレートを洗浄した(PBS/Tween−20で3回)。結合した抗体を、基質として3,3’−5,5’−テトラメチル−ベンジジン(Sigma−Aldrich、St.Louis、MN、USA)(100mM 酢酸ナトリウム3水和物、1.5mM クエン酸1水和物、0.0015% H2O2中、1ウェル当たり0.01mg/100μl)を用いて検出した。30分後、100μlの2M硫酸/ウェルを添加することによって反応を停止させた。プレートを、Victor2機器(Wallac、Turku、Finland)中で450nmの波長で読み取った。全ての血清は2連で試験した。変動係数は一般に10%未満であった。
ELISA実験においてII型コラーゲンカルボキシテロペプチドを用いたとき、コントロール中のそれぞれの可溶性抗原による阻害%は5.4%±3.8(平均±SD)であり、RA患者において、120人中38人が阻害の増加を示した(13.0%を上回る阻害)。
このように、これらの自己抗体が対応する可溶性抗原で阻害され得ることがさらに確認された場合、これは、テロペプチドのシトルリン化形態を用いたアッセイを行うのに充分である。1つのアッセイのみが使用されるので、この修飾は変動を減少させ、2つのELISAアッセイを使用した試験よりも、驚くほど多くのポジティブが見出された。
Claims (24)
- 関節リウマチに関連して形成された自己抗体を検出するための方法であって、
1種または複数の免疫複合体の形成に適した条件下で1種または複数のペプチドを生体液試料と接触させるステップ、および
形成された自己抗体を検出し、その量を任意選択で測定するステップからなり、
前記ペプチドが、
I型コラーゲンのα1鎖のカルボキシ末端テロペプチド由来の配列からなるペプチド、
I型コラーゲンのα2鎖のカルボキシ末端テロペプチド由来の配列からなるペプチド、
II型コラーゲンのα1鎖のカルボキシ末端テロペプチド由来の配列からなるペプチド、
からなる群から選択され、ペプチド配列中の少なくとも最後のアルギニン残基がシトルリンに変換されている、方法。 - ペプチド(1種または複数)が、−YYXA、−FYXAおよび−YMXAからなる群から選択される配列で終わり、Xがシトルリンである、請求項1に記載の方法。
- ペプチド(1種または複数)が組織コラーゲンから単離され、アルギニン(1種または複数)がin vitroでシトルリン(1種または複数)に変換される、請求項1または2に記載の方法。
- ペプチド(1種または複数)が、部分的または完全に合成ペプチドである、請求項1または2に記載の方法。
- ペプチド(1種または複数)の長さが、10〜50アミノ酸、好ましくは12〜30アミノ酸である、請求項1乃至4のいずれか1項に記載の方法。
- ペプチド(1種または複数)が、EKAHDGGRYYXA(配列番号1)、YDFGYDGDFYXA(配列番号2)およびEKGPDPLQYMXA(配列番号3)からなる群から選択される配列を含み、Xがシトルリンである、請求項1乃至5のいずれか1項に記載の方法。
- 生体液試料が、血清試料または滑液試料である、請求項1乃至6のいずれか1項に記載の方法。
- ペプチド(1種または複数)が、放射性標識、発光標識、蛍光標識、ランタニドおよび酵素からなる群から選択される標識を含む、請求項1乃至7のいずれか1項に記載の方法。
- ペプチドと生体液試料との間の免疫反応が固相中で実施され、ペプチドが、試験管もしくはプレートまたは対応する固相に直接的または間接的に結合する、請求項1乃至8のいずれか1項に記載の方法。
- ペプチドと生体液試料との間の免疫反応が液相中で実施され、ペプチド配列が液体中で固体粒子に直接的または間接的に結合する、請求項1乃至9のいずれか1項に記載の方法。
- ELISAアッセイにおける吸光度の強度として、自己抗体が検出されるかまたは自己抗体の量が測定される、請求項1乃至10のいずれか1項に記載の方法。
- 化学発光アッセイにおける放射光として、自己抗体が検出されるかまたは自己抗体の量が測定される、請求項1乃至11のいずれか1項に記載の方法。
- 結合したシトルリンペプチドが、結合したアルギニンペプチドと比較されるように、自己抗体が検出されるかまたは自己抗体の量が測定される、請求項1乃至12のいずれか1項に記載の方法。
- 可溶性シトルリンペプチドからなるアッセイ溶液中で、自己抗体が検出されるかまたは自己抗体の量が測定される、請求項1乃至13のいずれか1項に記載の方法。
- I型コラーゲンのα1鎖のカルボキシ末端テロペプチド由来の配列をからなるペプチド、
I型コラーゲンのα2鎖のカルボキシ末端テロペプチド由来の配列からなるペプチド、
II型コラーゲンのα1鎖のカルボキシ末端テロペプチド由来の配列からなるペプチド、
からなる群から選択されるシトルリン化ペプチドであって、ペプチド配列中の少なくとも最後のアルギニン残基がシトルリンに変換されている、ペプチド。 - −YYXA、−FYXAおよび−YMXAからなる群から選択される配列で終わり、Xがシトルリンである、請求項15に記載のシトルリン化ペプチド。
- ペプチド(1種または複数)の長さが、10〜50アミノ酸、好ましくは12〜30アミノ酸である、請求項15または16に記載のシトルリン化ペプチド。
- ペプチド配列が、EKAHDGGRYYXA(配列番号1)、YDFGYDGDFYXA(配列番号2)およびEKGPDPLQYMXA(配列番号3)からなる群から選択される配列からなる、請求項15乃至17のいずれか1項に記載のシトルリン化ペプチド。
- 請求項15乃至18のいずれか1項に記載の少なくとも1種のシトルリン化ペプチドを含む、キット。
- 請求項15乃至18のいずれか1項に記載のペプチドの少なくとも1種の有効量を含む、医薬組成物。
- 経口投与または注射に適している、請求項20に記載の医薬組成物。
- 1〜50μg/日、好ましくは1〜25μg/日の量で患者に投与される、請求項20または21に記載の医薬組成物。
- 関節リウマチを治療するための方法であって、そのような治療を必要とする個体に請求項15乃至18のいずれか1項に記載のペプチドの少なくとも1種の有効量を投与することを含む、方法。
- I型および/またはII型コラーゲンに対する免疫寛容を誘導するための方法であって、そのような治療を必要とする個体に請求項15乃至18のいずれか1項に記載のペプチドの少なくとも1種の有効量を投与することを含む、方法。
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Cited By (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017008046A (ja) * | 2010-08-10 | 2017-01-12 | エコール・ポリテクニーク・フェデラル・ドゥ・ローザンヌ(ウペエフエル)Ecole Polytechnique Federale de Lausanne (EPFL) | 赤血球結合療法 |
US9850296B2 (en) | 2010-08-10 | 2017-12-26 | Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) | Erythrocyte-binding therapeutics |
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US11253579B2 (en) | 2017-06-16 | 2022-02-22 | The University Of Chicago | Compositions and methods for inducing immune tolerance |
WO2022202876A1 (ja) * | 2021-03-24 | 2022-09-29 | 積水メディカル株式会社 | I型コラーゲンc末端テロペプチドの免疫学的分析方法 |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB0708585D0 (en) | 2007-05-03 | 2007-06-13 | Queen Mary & Westfield College | Novel antibody and use in diagnosis and therapy of arthropathies |
EP2058663A1 (en) * | 2007-11-12 | 2009-05-13 | Euro-Diagnostica B.V. | Method for the immobilization of an analyte on a solid support |
ES2584438T3 (es) | 2008-03-21 | 2016-09-27 | Universiteit Hasselt | Biomarcadores para artritis reumatoide |
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EP2402368A1 (en) | 2010-07-02 | 2012-01-04 | Toscana Biomarkers S.r.l. | Histone citrullinated peptides and uses thereof |
US20150218546A1 (en) | 2011-04-05 | 2015-08-06 | Lars Klareskog | Novel peptides that bind to types of mhc class ii and their use on diagnosis and treatment |
EP2527841A1 (en) | 2011-05-25 | 2012-11-28 | Toscana Biomarkers S.r.l. | Methods for the diagnosis of rheumatoid arthritis |
GB201302036D0 (en) * | 2013-02-05 | 2013-03-20 | Queen Mary & Westfield College | Diagnosis |
CN112384204B (zh) | 2018-02-26 | 2023-03-14 | 安托瑞斯公司 | 致耐受性脂质体及其使用方法 |
CN111868073B (zh) * | 2019-05-31 | 2021-04-30 | 广州市雷德生物科技有限公司 | 一种类风湿关节炎相关的特异性多肽及其应用 |
CN110456074B (zh) * | 2019-08-27 | 2022-06-03 | 广东菲鹏生物有限公司 | 瓜氨酸肽及其应用、类风湿关节炎的检测试剂与试剂盒 |
CN113109574A (zh) * | 2021-04-15 | 2021-07-13 | 北京森美希克玛生物科技有限公司 | 检测抗突变型瓜氨酸化波形蛋白抗体的试剂盒以及检测方法 |
CN113917135A (zh) * | 2021-10-18 | 2022-01-11 | 北京和杰创新生物医学科技有限公司 | 抗角蛋白抗体的免疫球蛋白g的检测方法 |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61274262A (ja) * | 1985-04-17 | 1986-12-04 | ハイル、ヘミツシエ−フアルマツオイテイツシエ、フアブリツク、ゲ−エムベ−ハ−、ウント、コンパニ−、カ−ゲ− | 免疫学的テストキツト |
JP2003202338A (ja) * | 1993-09-17 | 2003-07-18 | Osteometer Biotech As | 体液中のコラーゲン断片を測定する方法、該方法を実施するためのテストキット及び手段、並びにコラ−ゲンの代謝に関連する疾患の存在を診断するために該方法を使用する方法・用途 |
JP2006501302A (ja) * | 2002-09-30 | 2006-01-12 | シュライナーズ・ホスピタル・フォー・チルドレン | コラーゲンの分解を制御するための生成物およびその同定方法 |
JP2006133177A (ja) * | 2004-11-09 | 2006-05-25 | Institute Of Physical & Chemical Research | 関節リウマチの診断および治療におけるシトルリン化アンチトロンビン3の利用 |
JP2007515647A (ja) * | 2003-12-23 | 2007-06-14 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 抗ccpおよびインターロイキン6の測定による慢性関節リウマチの評価方法 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2000079284A1 (en) * | 1999-06-17 | 2000-12-28 | Washington Research Foundation | Cartilage resorption assays |
WO2003032909A2 (en) * | 2001-10-18 | 2003-04-24 | Ilex Products, Inc. | Methods of treating skin with diphosphonate derivatives |
NL1019540C2 (nl) * | 2001-12-11 | 2003-07-01 | Stichting Tech Wetenschapp | Werkwijze voor het detecteren van auto-antilichamen van patienten die lijden aan reumatoïde artritis, peptide en assaykit. |
CA2475924C (en) * | 2002-02-12 | 2016-03-29 | The Regents Of The University Of California | Non-invasive method for measuring rates of biosynthesis of biological molecules by label incorporation |
AU2004216925B2 (en) * | 2003-03-07 | 2010-04-22 | London Health Sciences Centre Research Inc. | Peptides associated with HLA-DR MHC class II molecules involved in autoimmune diseases |
ITTO20030246A1 (it) * | 2003-03-31 | 2004-10-01 | Univ Pisa | Nuovi peptidi sintetici citrullinati e loro usi. |
-
2005
- 2005-08-11 FI FI20050814A patent/FI20050814A0/fi unknown
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Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS61274262A (ja) * | 1985-04-17 | 1986-12-04 | ハイル、ヘミツシエ−フアルマツオイテイツシエ、フアブリツク、ゲ−エムベ−ハ−、ウント、コンパニ−、カ−ゲ− | 免疫学的テストキツト |
JP2003202338A (ja) * | 1993-09-17 | 2003-07-18 | Osteometer Biotech As | 体液中のコラーゲン断片を測定する方法、該方法を実施するためのテストキット及び手段、並びにコラ−ゲンの代謝に関連する疾患の存在を診断するために該方法を使用する方法・用途 |
JP2006501302A (ja) * | 2002-09-30 | 2006-01-12 | シュライナーズ・ホスピタル・フォー・チルドレン | コラーゲンの分解を制御するための生成物およびその同定方法 |
JP2007515647A (ja) * | 2003-12-23 | 2007-06-14 | エフ.ホフマン−ラ ロシュ アーゲー | 抗ccpおよびインターロイキン6の測定による慢性関節リウマチの評価方法 |
JP2006133177A (ja) * | 2004-11-09 | 2006-05-25 | Institute Of Physical & Chemical Research | 関節リウマチの診断および治療におけるシトルリン化アンチトロンビン3の利用 |
Cited By (24)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US10919963B2 (en) | 2010-08-10 | 2021-02-16 | École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) | Erythrocyte-binding therapeutics |
US11246943B2 (en) | 2010-08-10 | 2022-02-15 | École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) | Antigen-specific tolerance and compositions for induction of same |
US9878048B2 (en) | 2010-08-10 | 2018-01-30 | Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) | Compositions for generating immune tolerance by targeting erythrocytes |
US9901645B2 (en) | 2010-08-10 | 2018-02-27 | Ecole Polytechnique Fedrale de Lausanne (EPFL) | Methods for reducing immune responses |
US9901646B2 (en) | 2010-08-10 | 2018-02-27 | Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (Epfl) | Methods for induction of antigen-specific immune tolerance |
US10800838B2 (en) | 2010-08-10 | 2020-10-13 | École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) | Erythrocyte-binding therapeutics |
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JP2017008046A (ja) * | 2010-08-10 | 2017-01-12 | エコール・ポリテクニーク・フェデラル・ドゥ・ローザンヌ(ウペエフエル)Ecole Polytechnique Federale de Lausanne (EPFL) | 赤血球結合療法 |
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US10953101B2 (en) | 2014-02-21 | 2021-03-23 | École Polytechnique Fédérale De Lausanne (Epfl) | Glycotargeting therapeutics |
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WO2022202876A1 (ja) * | 2021-03-24 | 2022-09-29 | 積水メディカル株式会社 | I型コラーゲンc末端テロペプチドの免疫学的分析方法 |
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