JP2003202338A - 体液中のコラーゲン断片を測定する方法、該方法を実施するためのテストキット及び手段、並びにコラ−ゲンの代謝に関連する疾患の存在を診断するために該方法を使用する方法・用途 - Google Patents
体液中のコラーゲン断片を測定する方法、該方法を実施するためのテストキット及び手段、並びにコラ−ゲンの代謝に関連する疾患の存在を診断するために該方法を使用する方法・用途Info
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-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/78—Connective tissue peptides, e.g. collagen, elastin, laminin, fibronectin, vitronectin or cold insoluble globulin [CIG]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
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-
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- G01N2800/10—Musculoskeletal or connective tissue disorders
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】コラーゲンの代謝に関する疾患を診断するため
に体液中のコラーゲン断片を測定する方法の提供。 【解決手段】体液の試料をコラーゲン断片に対する少な
くとも一つの免疫学的結合性パ−トナ−と接触させるこ
とから成る体液中のコラーゲン断片を測定する方法にお
いて、前記免疫学的結合性パ−トナ−が、実質的にコラ
ーゲンに由来する配列を有する合成ペプチドと免疫反応
性を示し且つ架橋のための可能な部位を含有するもので
ある前記測定方法。該免疫学的結合性パ−トナ−は、全
抗体としてか又はその免疫学的に活性な断片としてのい
ずれかで、試料中のコラーゲン断片を定量するための測
定方法に組み込まれる。免疫学的結合性パ−トナ−の一
つ又は複数と接触させること以外に、該試料は対応する
合成ペプチドに直接接触させても構わない。更に、該方
法を実施するためのテストキットおよび具体的な手段を
包含する。また、特異的ペプチドの構造も説明・記載す
る。
に体液中のコラーゲン断片を測定する方法の提供。 【解決手段】体液の試料をコラーゲン断片に対する少な
くとも一つの免疫学的結合性パ−トナ−と接触させるこ
とから成る体液中のコラーゲン断片を測定する方法にお
いて、前記免疫学的結合性パ−トナ−が、実質的にコラ
ーゲンに由来する配列を有する合成ペプチドと免疫反応
性を示し且つ架橋のための可能な部位を含有するもので
ある前記測定方法。該免疫学的結合性パ−トナ−は、全
抗体としてか又はその免疫学的に活性な断片としてのい
ずれかで、試料中のコラーゲン断片を定量するための測
定方法に組み込まれる。免疫学的結合性パ−トナ−の一
つ又は複数と接触させること以外に、該試料は対応する
合成ペプチドに直接接触させても構わない。更に、該方
法を実施するためのテストキットおよび具体的な手段を
包含する。また、特異的ペプチドの構造も説明・記載す
る。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、体液中のコラーゲ
ン断片を測定する方法に関する。本発明は、さらに、本
発明の該方法を実施するのに用いる、合成ペプチド、モ
ノクローナルおよびポリクローナル抗体ならびに細胞系
を含む手段に関する。なおさらに、本発明は、コラーゲ
ンの代謝に関連する疾患、特に骨粗鬆症を診断するため
に前記方法を使用する方法・用途に関する。
ン断片を測定する方法に関する。本発明は、さらに、本
発明の該方法を実施するのに用いる、合成ペプチド、モ
ノクローナルおよびポリクローナル抗体ならびに細胞系
を含む手段に関する。なおさらに、本発明は、コラーゲ
ンの代謝に関連する疾患、特に骨粗鬆症を診断するため
に前記方法を使用する方法・用途に関する。
【０００２】
【従来の技術とその問題点】コラーゲンとコラーゲン代
謝疾患 骨粗鬆症はヒトにおいて最も広範に認められる骨の疾病
である。原発性骨粗鬆症は、高い骨折受傷性を伴うので
あるが、骨格の骨質量の漸進的減少に起因する疾患であ
り、アメリカ合衆国だけでも１５００万乃至２０００万
の人々が罹患していると推定されている。この疾患の基
礎は、骨の再形成、即ち骨組織の形成および吸収の速度
が年齢に依存して不均衡になることである。
謝疾患 骨粗鬆症はヒトにおいて最も広範に認められる骨の疾病
である。原発性骨粗鬆症は、高い骨折受傷性を伴うので
あるが、骨格の骨質量の漸進的減少に起因する疾患であ
り、アメリカ合衆国だけでも１５００万乃至２０００万
の人々が罹患していると推定されている。この疾患の基
礎は、骨の再形成、即ち骨組織の形成および吸収の速度
が年齢に依存して不均衡になることである。
【０００３】アメリカ合衆国においては毎年、骨粗鬆症
に関連した骨折が約１２０万件も老人に起こっており、
これには約５３８０００の脊髄の圧縮骨折、約２２７０
００の股関節骨折および相当数の末梢骨の初期骨折を含
む。股関節骨折については、その１２乃至２０％が致命
的である。その理由は、重度の外傷および出血を引き起
こし、而も助かった患者の半分は家庭での看護を必要と
する。骨粗鬆症関連傷害から生じる合計コストは今や、
米国で年間少なくとも１００億ドルに達する（Riggs, N
ew England Journal of Medicine. 327:620-727(199
2))。
に関連した骨折が約１２０万件も老人に起こっており、
これには約５３８０００の脊髄の圧縮骨折、約２２７０
００の股関節骨折および相当数の末梢骨の初期骨折を含
む。股関節骨折については、その１２乃至２０％が致命
的である。その理由は、重度の外傷および出血を引き起
こし、而も助かった患者の半分は家庭での看護を必要と
する。骨粗鬆症関連傷害から生じる合計コストは今や、
米国で年間少なくとも１００億ドルに達する（Riggs, N
ew England Journal of Medicine. 327:620-727(199
2))。
【０００４】骨粗鬆症は、閉経後の女性に最も広範に生
起するのであるが、それは平均して閉経後１０年以内に
その骨の質量の１５％を失うからである。またこの疾病
は、老齢になるに従い男性でもまた若い無月経の女性運
動競技者でも起こる。骨粗鬆症が持つ社会的かつ経済的
影響の重要性は大きく而も増大しているにも係わらず、
患者または健常な被験者において骨吸収速度を測定する
ための信頼できる測定方法は、その利用可能性は極めて
限定されている。コラーゲン代謝の異常を必然的に伴う
（およびこれに関連した）他の疾患としては、パジェッ
ト病、マルファン症候群、骨形成不全、コラーゲン組織
における新生物増殖、小人症、慢性関節リウマチ、変形
性関節症および脈管炎症候群などがある。
起するのであるが、それは平均して閉経後１０年以内に
その骨の質量の１５％を失うからである。またこの疾病
は、老齢になるに従い男性でもまた若い無月経の女性運
動競技者でも起こる。骨粗鬆症が持つ社会的かつ経済的
影響の重要性は大きく而も増大しているにも係わらず、
患者または健常な被験者において骨吸収速度を測定する
ための信頼できる測定方法は、その利用可能性は極めて
限定されている。コラーゲン代謝の異常を必然的に伴う
（およびこれに関連した）他の疾患としては、パジェッ
ト病、マルファン症候群、骨形成不全、コラーゲン組織
における新生物増殖、小人症、慢性関節リウマチ、変形
性関節症および脈管炎症候群などがある。
【０００５】ヒトコラーゲンには、これまでに三種類の
ものが公知であり報告されている。クラスＩコラーゲン
は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型およびＸＩ型にさら
に細分され、フィブリルを形成することが知られてい
る。Ｉ型乃至ＩＩＩ型のアミノ酸配列を（これまでに解
明されたところまで）添付書類Ａとして添付する。
ものが公知であり報告されている。クラスＩコラーゲン
は、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型およびＸＩ型にさら
に細分され、フィブリルを形成することが知られてい
る。Ｉ型乃至ＩＩＩ型のアミノ酸配列を（これまでに解
明されたところまで）添付書類Ａとして添付する。
【０００６】Ｉ型コラーゲンは、骨の有機マトリックス
の９０％以上を占めており、従って原理的にはＩ型コラ
ーゲンの分解を追跡することによって骨吸収速度を推定
することが可能でる。同様に、結合組織を包含する他の
疾病状態は多数あるが、コラーゲンの分解を測定するこ
とによって追跡することが出来る。その例としては、慢
性関節リウマチおよび変形性関節症に関連するＩＩ型コ
ラーゲンの分解および脈管炎症候群におけるＩＩＩ型コ
ラーゲンの分解が挙げられる。
の９０％以上を占めており、従って原理的にはＩ型コラ
ーゲンの分解を追跡することによって骨吸収速度を推定
することが可能でる。同様に、結合組織を包含する他の
疾病状態は多数あるが、コラーゲンの分解を測定するこ
とによって追跡することが出来る。その例としては、慢
性関節リウマチおよび変形性関節症に関連するＩＩ型コ
ラーゲンの分解および脈管炎症候群におけるＩＩＩ型コ
ラーゲンの分解が挙げられる。
【０００７】ヒトＩＩＩ型コラーゲン、ヒト・プロα１
（ＩＩ）コラーゲン及びヒトＩＩＩ型コラーゲンの全プ
レプロα１（ＩＩＩ）鎖のアミノ酸配列並びにこれらに
対応するｃＤＮＡクローンが、いくつかのグループの研
究者によって研究されその結果決定されている；即ち、
Loil et al., Nucleic Acids Research 12:9383-9394(1
984);Sangiorgi et al., Nucleic Acids Research, 13:
2207-2225(1985); Baldwin et al., Biochem. J., 262:
521-528(1989);およびAla-Kokko et al., Biochem. J.
260:509-516(1989)を参照。
（ＩＩ）コラーゲン及びヒトＩＩＩ型コラーゲンの全プ
レプロα１（ＩＩＩ）鎖のアミノ酸配列並びにこれらに
対応するｃＤＮＡクローンが、いくつかのグループの研
究者によって研究されその結果決定されている；即ち、
Loil et al., Nucleic Acids Research 12:9383-9394(1
984);Sangiorgi et al., Nucleic Acids Research, 13:
2207-2225(1985); Baldwin et al., Biochem. J., 262:
521-528(1989);およびAla-Kokko et al., Biochem. J.
260:509-516(1989)を参照。
【０００８】Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ型コラーゲンは全
て、プロコラーゲン分子として生体内で形成されるので
あるが、このプロコラ−ゲン分子は、コアコラーゲン分
子に結合したＮ−末端およびＣ−末端プロペプチド配列
から構成されて成る。コアコラーゲン合成の過程で生体
内で自然に生成するプロペプチドを除去すると、残るコ
ラーゲン分子のコアは、その大半は非三重ラセンである
末端テロペプチド配列を有する三重ラセンから成ってい
る。これらのテロペプチド配列は、細胞外でのコラーゲ
ンフィブリルの分子間架橋が起こる部位として重要な機
能を有する。またこのアルファラセン領域も架橋可能な
部位を含んでいるが、この領域から得られるペプチドは
本発明の一部を構成する。
て、プロコラーゲン分子として生体内で形成されるので
あるが、このプロコラ−ゲン分子は、コアコラーゲン分
子に結合したＮ−末端およびＣ−末端プロペプチド配列
から構成されて成る。コアコラーゲン合成の過程で生体
内で自然に生成するプロペプチドを除去すると、残るコ
ラーゲン分子のコアは、その大半は非三重ラセンである
末端テロペプチド配列を有する三重ラセンから成ってい
る。これらのテロペプチド配列は、細胞外でのコラーゲ
ンフィブリルの分子間架橋が起こる部位として重要な機
能を有する。またこのアルファラセン領域も架橋可能な
部位を含んでいるが、この領域から得られるペプチドは
本発明の一部を構成する。
【０００９】分子間架橋結合は、コラーゲンフィブリル
に対して生物力学的安定性を付与する。これらの架橋結
合の形成は、リシンおよびヒドロキシリシンの対応する
アルデヒドへの修飾によって開始される。コラーゲンの
隣接鎖に位置するそれらの残基のうちのいくつかは、自
発的に相異なる分子間架橋結合を形成する。コラーゲン
テロペプチド上にラセン領域から架橋する部位の正確な
位置は、既に以前に報告済である。例えば、Kuehn, K.,
Immunochemistry of the extracellular matrix, 1:1-
29、CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida (1982) 、
Eyre, D.R.,Ann. Rev. Biochem., 53:717-48(1984)また
は米国特許第５１４０１０３号を参照。さらに、Ｉ型、
ＩＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンにおいて架橋するため
のいくつかの潜在的可能性のある部位について、アミノ
酸配列を後記表１に示す。
に対して生物力学的安定性を付与する。これらの架橋結
合の形成は、リシンおよびヒドロキシリシンの対応する
アルデヒドへの修飾によって開始される。コラーゲンの
隣接鎖に位置するそれらの残基のうちのいくつかは、自
発的に相異なる分子間架橋結合を形成する。コラーゲン
テロペプチド上にラセン領域から架橋する部位の正確な
位置は、既に以前に報告済である。例えば、Kuehn, K.,
Immunochemistry of the extracellular matrix, 1:1-
29、CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida (1982) 、
Eyre, D.R.,Ann. Rev. Biochem., 53:717-48(1984)また
は米国特許第５１４０１０３号を参照。さらに、Ｉ型、
ＩＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンにおいて架橋するため
のいくつかの潜在的可能性のある部位について、アミノ
酸配列を後記表１に示す。
【００１０】繊維状蛋白質であるコラーゲンおよびエラ
スチンは、リシンまたはヒドロキシリシンの側鎖からの
アルデヒド形成に基づくユニークな機構によって架橋さ
れる。架橋の４つの相同な座がＩ型、ＩＩ型およびＩＩ
Ｉ型コラーゲンの分子で明らかにされている（総説につ
いては、Kuehn, K., Immunochemistry of the extra-ce
llular matrix, 1:1-29 (1982)）を参照）。２つはアル
デヒド部位であり、それぞれ各テロペプチド領域におけ
るものである。残りの二つの部位は、分子の各末端から
約９０残基離れて対称的に位置するヒドロキシリシンで
ある。コラーゲン分子がフィブリルにパックすると、ラ
セン領域におけるこれらの後者の部位は一列に配列し、
隣接分子中のテロペプチドアルデヒドと反応する。かく
して、３−ヒドロキシピリジニウム残基がヒドロキシリ
シン由来アルデヒドからの成熟架橋結合であるという強
力な証拠が得られる。しかしながら、別の経路、すなわ
ち、リシン残基のアルデヒド結合からの成熟架橋残基は
依然知られていない。
スチンは、リシンまたはヒドロキシリシンの側鎖からの
アルデヒド形成に基づくユニークな機構によって架橋さ
れる。架橋の４つの相同な座がＩ型、ＩＩ型およびＩＩ
Ｉ型コラーゲンの分子で明らかにされている（総説につ
いては、Kuehn, K., Immunochemistry of the extra-ce
llular matrix, 1:1-29 (1982)）を参照）。２つはアル
デヒド部位であり、それぞれ各テロペプチド領域におけ
るものである。残りの二つの部位は、分子の各末端から
約９０残基離れて対称的に位置するヒドロキシリシンで
ある。コラーゲン分子がフィブリルにパックすると、ラ
セン領域におけるこれらの後者の部位は一列に配列し、
隣接分子中のテロペプチドアルデヒドと反応する。かく
して、３−ヒドロキシピリジニウム残基がヒドロキシリ
シン由来アルデヒドからの成熟架橋結合であるという強
力な証拠が得られる。しかしながら、別の経路、すなわ
ち、リシン残基のアルデヒド結合からの成熟架橋残基は
依然知られていない。
【００１１】コラーゲン分解に関する先行技術による測
定方法 これまでに生体内（in vivo）でのコラーゲンの分解を
追跡するため開発されてきた測定方法は、コラーゲンの
分解産物を含む種々の生化学的マーカーを測定すること
によるものであった。しかしながら、これらの方法はい
ずれも、架橋可能部位を持つコラーゲン断片から本質的
に誘導した配列を有する合成ペプチドと免疫反応性を示
す抗体の形態をとる免疫学的結合性パ−トナ−を使用す
るものではなかった。
定方法 これまでに生体内（in vivo）でのコラーゲンの分解を
追跡するため開発されてきた測定方法は、コラーゲンの
分解産物を含む種々の生化学的マーカーを測定すること
によるものであった。しかしながら、これらの方法はい
ずれも、架橋可能部位を持つコラーゲン断片から本質的
に誘導した配列を有する合成ペプチドと免疫反応性を示
す抗体の形態をとる免疫学的結合性パ−トナ−を使用す
るものではなかった。
【００１２】例えば、ヒドロキプロリンは、その大半が
コラーゲンおよび骨や他の全ての結合組織における主要
構造タンパク質に限定されているアミノ酸であるが、尿
中に排泄される。その排泄速度は、ある種の状態、特に
前記したごときパジェット病−骨の代謝回転が大幅に増
大する代謝的骨疾患である−において増加することが知
られている。
コラーゲンおよび骨や他の全ての結合組織における主要
構造タンパク質に限定されているアミノ酸であるが、尿
中に排泄される。その排泄速度は、ある種の状態、特に
前記したごときパジェット病−骨の代謝回転が大幅に増
大する代謝的骨疾患である−において増加することが知
られている。
【００１３】このような理由で、これまで尿中ヒドロキ
シプロリンがコラーゲン分解についてのアミノ酸マーカ
ーとして広く使用されてきたのである；Singer, F.R. e
t al., Metabolic Bone Disease, Vol. II (eds. Aviol
i, L.V., and Kane,S.M.), 489-575(1978), Academic P
ress, New York を参照。
シプロリンがコラーゲン分解についてのアミノ酸マーカ
ーとして広く使用されてきたのである；Singer, F.R. e
t al., Metabolic Bone Disease, Vol. II (eds. Aviol
i, L.V., and Kane,S.M.), 489-575(1978), Academic P
ress, New York を参照。
【００１４】米国特許第３、６００、１３２号は、コラ
ーゲン代謝における変動を追跡するため血清、尿、腰椎
液やその他の細胞間液などの体液中のヒドロキシプロリ
ンの測定方法を開示している。該特許においては、ヒド
ロキシプロリンは、パジェット病、マルファン症候群、
骨形成不全、コラーゲン組織における新生物増殖及び種
々の形態の小人症のような病理学的状態に関連して、コ
ラーゲンの同化および異化が増大することと相関関係が
ある旨述べられている。
ーゲン代謝における変動を追跡するため血清、尿、腰椎
液やその他の細胞間液などの体液中のヒドロキシプロリ
ンの測定方法を開示している。該特許においては、ヒド
ロキシプロリンは、パジェット病、マルファン症候群、
骨形成不全、コラーゲン組織における新生物増殖及び種
々の形態の小人症のような病理学的状態に関連して、コ
ラーゲンの同化および異化が増大することと相関関係が
ある旨述べられている。
【００１５】パジェット病に関連する骨吸収はまた、骨
コラーゲンの分解の後に尿に排泄されるヒドロキシプロ
リンを含んだ小さいペプチドを測定することによっても
追跡されてきた；Russel et al., Metab. Bone Dis. an
d Rel. Res. 4 and 5, 255-262(1981) 及び前掲Singer,
F.R., et al.を参照。
コラーゲンの分解の後に尿に排泄されるヒドロキシプロ
リンを含んだ小さいペプチドを測定することによっても
追跡されてきた；Russel et al., Metab. Bone Dis. an
d Rel. Res. 4 and 5, 255-262(1981) 及び前掲Singer,
F.R., et al.を参照。
【００１６】パジェット病の場合は、尿中ヒドロキシプ
ロリンの増加は恐らくは、その大半は骨分解に基くもの
であろう；しかしながら、ヒドロキシプロリンは一般に
は、骨分解についての特異的指標としては使用すること
は出来ない。尿中のヒドロキシプロリンの多くは、新規
のコラーゲン合成（新たに産生された蛋白質のうちのか
なりの量が組織繊維に一体化させることなく分解され、
排泄される）に由来し且つある種の血中タンパク質やヒ
ドロキシプロリンを含有する他のタンパク質の代謝変化
に由来する可能性があるからである。
ロリンの増加は恐らくは、その大半は骨分解に基くもの
であろう；しかしながら、ヒドロキシプロリンは一般に
は、骨分解についての特異的指標としては使用すること
は出来ない。尿中のヒドロキシプロリンの多くは、新規
のコラーゲン合成（新たに産生された蛋白質のうちのか
なりの量が組織繊維に一体化させることなく分解され、
排泄される）に由来し且つある種の血中タンパク質やヒ
ドロキシプロリンを含有する他のタンパク質の代謝変化
に由来する可能性があるからである。
【００１７】さらには、タンパク質分解に由来する遊離
ヒドロキシプロリンの約８０％は肝臓で代謝され、決し
て尿には出現しない。Kiviriko, K.I., Int. Rev. Conn
ect.Tissue Res. 5:93(1970)及びWeiss, P.H. and Klei
n, L., J. Clin. Invest. 48:1(1969)を参照。ヒドロキ
シプロリンは骨粗鬆症の良好なマーカーであるが、扱う
のが面倒であって、骨に含まれるコラーゲンに特異的で
ある。
ヒドロキシプロリンの約８０％は肝臓で代謝され、決し
て尿には出現しない。Kiviriko, K.I., Int. Rev. Conn
ect.Tissue Res. 5:93(1970)及びWeiss, P.H. and Klei
n, L., J. Clin. Invest. 48:1(1969)を参照。ヒドロキ
シプロリンは骨粗鬆症の良好なマーカーであるが、扱う
のが面倒であって、骨に含まれるコラーゲンに特異的で
ある。
【００１８】ヒドロキシリシンおよびその配糖体誘導体
は、共にコラーゲン性タンパク質にとって独特なもので
あって、コラーゲン分解のマーカーとしてヒドロキシプ
ロリンよりも正確であると考えられてきた。しかしなが
ら、ヒドロキシプロリンについて前記したと同様の理由
によって、ヒドロキシリシンおよびその配糖体は、恐ら
くは骨吸収の非特異的マーカーとしては同等であろう；
Krane, S.M. and Simon, L.S., Develop. Biochem. 22:
185(1981)を参照。
は、共にコラーゲン性タンパク質にとって独特なもので
あって、コラーゲン分解のマーカーとしてヒドロキシプ
ロリンよりも正確であると考えられてきた。しかしなが
ら、ヒドロキシプロリンについて前記したと同様の理由
によって、ヒドロキシリシンおよびその配糖体は、恐ら
くは骨吸収の非特異的マーカーとしては同等であろう；
Krane, S.M. and Simon, L.S., Develop. Biochem. 22:
185(1981)を参照。
【００１９】また別の研究者は、関節疾病におけるコラ
ーゲン分解の指標として架橋性化合物である３−ヒドロ
キシピリジニウムを測定してきている。その背景および
例については、Wu and Eyre, Biochemistry, 23:1850
(1984); Black et al., Annals of the Rhematic Disea
ses, 48:641-644(1989); Robins et al; Annals ofthe
Rhematic Diseases, 45:969-973(1986);およびSeibel e
t al., The Journalof Dermatology, 16:964 (1989)を
参照。本発明とは異なって、これらの先行研究者は体液
から得たペプチドを加水分解し、次いで個々の３−ヒド
ロキシピリジニウム残基の存在を探索していたのであ
る。
ーゲン分解の指標として架橋性化合物である３−ヒドロ
キシピリジニウムを測定してきている。その背景および
例については、Wu and Eyre, Biochemistry, 23:1850
(1984); Black et al., Annals of the Rhematic Disea
ses, 48:641-644(1989); Robins et al; Annals ofthe
Rhematic Diseases, 45:969-973(1986);およびSeibel e
t al., The Journalof Dermatology, 16:964 (1989)を
参照。本発明とは異なって、これらの先行研究者は体液
から得たペプチドを加水分解し、次いで個々の３−ヒド
ロキシピリジニウム残基の存在を探索していたのであ
る。
【００２０】Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型コラーゲンの
分解を測定するための測定方法は、米国特許第４、９７
３、６６６号および米国特許第５、１４０、１０３号に
開示されている。しかしながら、これらの両特許とも、
架橋剤である３−ヒドロキシピリジニウムを含有するコ
ラーゲン断片に限定されており、一方本発明は、この具
体的な特別の架橋構造の存在または不存在に依存しない
のである。さらに、前記した測定方法は、抗体を産生さ
せるためおよび測定における抗原のために用いる３−ヒ
ドロキシピリジニウムを含有するコラーゲン断片を尿か
ら精製するという退屈で複雑な操作を必要とする。
分解を測定するための測定方法は、米国特許第４、９７
３、６６６号および米国特許第５、１４０、１０３号に
開示されている。しかしながら、これらの両特許とも、
架橋剤である３−ヒドロキシピリジニウムを含有するコ
ラーゲン断片に限定されており、一方本発明は、この具
体的な特別の架橋構造の存在または不存在に依存しない
のである。さらに、前記した測定方法は、抗体を産生さ
せるためおよび測定における抗原のために用いる３−ヒ
ドロキシピリジニウムを含有するコラーゲン断片を尿か
ら精製するという退屈で複雑な操作を必要とする。
【００２１】現在のところ、米国特許第４、９７３、６
６６号および米国特許第５、１４９、１０３号に記載さ
れたアプローチを用いる臨床データはほとんど利用でき
ない。特に、（前記特許に記載された方法によって測定
した）Ｉ型コラーゲンのテロペプチドを含有する３−ヒ
ドロキシピリジニウムの尿中濃度と（骨デンシトメトリ
ーによって反復測定した数値により測定した）現実の骨
損失との間の相関関係に関するデータは公表されていな
い。尿中でのテロペプチドを含有する３−ヒドロキシピ
リジニウムの存在は、骨再吸収過程前の異なる時点にお
いてこのような特異的架橋構造が骨組織において正当に
形成されることを必要とする。これらの過程については
情報は、殆ど入手出来ないので、本発明においては、架
橋構造の正確な形成という、このような依存性を回避し
ようと意図したのである。更には予備的データによれ
ば、本発明の一つの実施態様においてはこの測定方法で
反応性を有する分子の大部分は分子量が４、０００ダル
トン以上であることが判っている。これとは逆に、２、
０００ダルトン未満の分子量を持つ分子のみが本測定方
法で用いたモノクローナル抗体によって尿中で同定され
るのである；Hanson et al., Journal of Bone and Min
eral Research 7: 1251-1258(1992)を参照。このこと
は、本発明の方法は反応性のプロフィールが極めて多様
であること、即ち、この方法は前記米国特許に記載され
た方法とは違って、極めて異なる分子を検出することを
証明するものである。
６６号および米国特許第５、１４９、１０３号に記載さ
れたアプローチを用いる臨床データはほとんど利用でき
ない。特に、（前記特許に記載された方法によって測定
した）Ｉ型コラーゲンのテロペプチドを含有する３−ヒ
ドロキシピリジニウムの尿中濃度と（骨デンシトメトリ
ーによって反復測定した数値により測定した）現実の骨
損失との間の相関関係に関するデータは公表されていな
い。尿中でのテロペプチドを含有する３−ヒドロキシピ
リジニウムの存在は、骨再吸収過程前の異なる時点にお
いてこのような特異的架橋構造が骨組織において正当に
形成されることを必要とする。これらの過程については
情報は、殆ど入手出来ないので、本発明においては、架
橋構造の正確な形成という、このような依存性を回避し
ようと意図したのである。更には予備的データによれ
ば、本発明の一つの実施態様においてはこの測定方法で
反応性を有する分子の大部分は分子量が４、０００ダル
トン以上であることが判っている。これとは逆に、２、
０００ダルトン未満の分子量を持つ分子のみが本測定方
法で用いたモノクローナル抗体によって尿中で同定され
るのである；Hanson et al., Journal of Bone and Min
eral Research 7: 1251-1258(1992)を参照。このこと
は、本発明の方法は反応性のプロフィールが極めて多様
であること、即ち、この方法は前記米国特許に記載され
た方法とは違って、極めて異なる分子を検出することを
証明するものである。
【００２２】前記研究者は何れも、本発明に記載するよ
うに、コラーゲン分解に際して生体内(in vivo) で自然
に生成する線状の架橋可能コラーゲン断片を特異的に測
定することを報告していない。
うに、コラーゲン分解に際して生体内(in vivo) で自然
に生成する線状の架橋可能コラーゲン断片を特異的に測
定することを報告していない。
【００２３】英国特許出願第２、２０５、６４３号で
は、体内でのＩＩＩ型コラーゲンの分解は、体液中のＩ
ＩＩ型コラーゲン由来のＮ−末端テロペプチドの濃度を
測定することによって定量的に測定出来ることが報告さ
れている。この方法は、架橋可能構造の周辺における特
異的で、低分子量である配列と反応性を有する抗体を使
用する方法に関するものではない。つまりこの方法は、
ＩＩＩ型コラーゲンを細菌性コラゲナーゼで分解するこ
とによって放出・遊離されたＮ−末端テロペプチドに対
して生成した抗体を使用するものであって、前記テロペ
プチドは、この方法においては標識されたうえで使用さ
れるのである。
は、体内でのＩＩＩ型コラーゲンの分解は、体液中のＩ
ＩＩ型コラーゲン由来のＮ−末端テロペプチドの濃度を
測定することによって定量的に測定出来ることが報告さ
れている。この方法は、架橋可能構造の周辺における特
異的で、低分子量である配列と反応性を有する抗体を使
用する方法に関するものではない。つまりこの方法は、
ＩＩＩ型コラーゲンを細菌性コラゲナーゼで分解するこ
とによって放出・遊離されたＮ−末端テロペプチドに対
して生成した抗体を使用するものであって、前記テロペ
プチドは、この方法においては標識されたうえで使用さ
れるのである。
【００２４】Schroeter-Kermani らは、Immunol. Invse
t. 19:475-491(1990) においてＩ型およびＩＩ型コラー
ゲンのＣＮＢｒ断片に基づいた免疫学的測定システムを
記載報告している。ペプシン可溶化コラーゲンを用い、
かかるテロペプチドは組織に残される（前記英国特許出
願第２、２０５、６４３号参照）。従って、断片および
それから生成した抗体の間に一致関係はない。更にはこ
の文献には、抽出された組織試料についての測定値しか
記載されていない。
t. 19:475-491(1990) においてＩ型およびＩＩ型コラー
ゲンのＣＮＢｒ断片に基づいた免疫学的測定システムを
記載報告している。ペプシン可溶化コラーゲンを用い、
かかるテロペプチドは組織に残される（前記英国特許出
願第２、２０５、６４３号参照）。従って、断片および
それから生成した抗体の間に一致関係はない。更にはこ
の文献には、抽出された組織試料についての測定値しか
記載されていない。
【００２５】ペプシン可溶化Ｉ型コラーゲンに対して生
成させたモノクローナル抗体の開発が、Werkmeisterら
によってEur. J. Biochem. 187:439-443(1990)に記載報
告されている。この抗体は、組織セグメントの免疫組織
学的染色を行うためにまた細胞培養液中のコラーゲン含
量を測定するために使用される。このような測定は体液
について実施されるものではない。
成させたモノクローナル抗体の開発が、Werkmeisterら
によってEur. J. Biochem. 187:439-443(1990)に記載報
告されている。この抗体は、組織セグメントの免疫組織
学的染色を行うためにまた細胞培養液中のコラーゲン含
量を測定するために使用される。このような測定は体液
について実施されるものではない。
【００２６】欧州特許出願第０５０５２１０号は、Ｉ型
コラーゲン由来のＣ−末端テロペプチドに対する抗体試
薬の開発について記載している。免疫原は、ヒト骨コラ
ーゲンを細菌性コラゲナーゼで可溶化することによって
調製される。このようにして調製された抗体は、架橋お
よび非架橋テロペプチドとも反応する能力があり、ピリ
ジノリン以外の架橋剤を使用することができる。しかし
ながら、この方法は、本発明の測定方法とは顕著に異な
る免疫測定方法が得られることになる。
コラーゲン由来のＣ−末端テロペプチドに対する抗体試
薬の開発について記載している。免疫原は、ヒト骨コラ
ーゲンを細菌性コラゲナーゼで可溶化することによって
調製される。このようにして調製された抗体は、架橋お
よび非架橋テロペプチドとも反応する能力があり、ピリ
ジノリン以外の架橋剤を使用することができる。しかし
ながら、この方法は、本発明の測定方法とは顕著に異な
る免疫測定方法が得られることになる。
【００２７】国際特許出願ＷＯ９１／０９１１４号によ
れば、固体基質への細胞接着を促進するのに使用され
る、幾つかの合成ペプチドが開示されている。免疫学的
試薬としての合成ペプチドの使用については、言及され
ていない。
れば、固体基質への細胞接着を促進するのに使用され
る、幾つかの合成ペプチドが開示されている。免疫学的
試薬としての合成ペプチドの使用については、言及され
ていない。
【００２８】コラーゲン分解は、ある種のプロコラーゲ
ンペプチドを数量化することによって測定できることを
示す多数の報告がある。プロペプチドは、プロコラーゲ
ン分子中の位置および生体内(in vivo) でのその切断の
タイミングによってコラーゲンコアのテロペプチドおよ
びアルファラセン領域から区別される；米国特許第４，
５０４，５８７号；米国特許第４，３１２，８５３号；
Pierard et al., Analytical Biochemistry 141:127-13
6(1984); Niemala, Clin. Chem. 31/8: 1301-1304(198
5); およびRohde et al., European Journal of Clinic
al Investigation, 9:451-459(1979)を参照。
ンペプチドを数量化することによって測定できることを
示す多数の報告がある。プロペプチドは、プロコラーゲ
ン分子中の位置および生体内(in vivo) でのその切断の
タイミングによってコラーゲンコアのテロペプチドおよ
びアルファラセン領域から区別される；米国特許第４，
５０４，５８７号；米国特許第４，３１２，８５３号；
Pierard et al., Analytical Biochemistry 141:127-13
6(1984); Niemala, Clin. Chem. 31/8: 1301-1304(198
5); およびRohde et al., European Journal of Clinic
al Investigation, 9:451-459(1979)を参照。
【００２９】欧州特許出願第０２９８２１０号および第
０３３９４４３号は共に、ＩＩＩ型プロコラーゲンペプ
チドおよびその断片の免疫学的測定を記載している。更
には、プロコラーゲンの測定に基づく方法が欧州特許出
願０４６５１０４号に開示されている。プロコラーゲン
ペプチドの形成およびコラーゲン断片の形成は異なる時
期に起こり、且つこのような断片はコラーゲン分子の異
なる部分に由来するので、これらの方法は、本発明の方
法とは明らかに異なる。
０３３９４４３号は共に、ＩＩＩ型プロコラーゲンペプ
チドおよびその断片の免疫学的測定を記載している。更
には、プロコラーゲンの測定に基づく方法が欧州特許出
願０４６５１０４号に開示されている。プロコラーゲン
ペプチドの形成およびコラーゲン断片の形成は異なる時
期に起こり、且つこのような断片はコラーゲン分子の異
なる部分に由来するので、これらの方法は、本発明の方
法とは明らかに異なる。
【００３０】免疫学的試薬を開発するためにＩＸ型コラ
ーゲンに由来する配列を有する合成ペプチドの使用が、
ＰＣＴ特許出願ＷＯ９０／０８１９５号に開示されてい
る。また同様に、該出願には、体液中のＩＸ型コラーゲ
ン断片の測定するためにこのようにして産生された抗体
を使用する用途が記載されている。ＩＸ型コラーゲン
は、架橋可能な部位を含有していないので、この特許出
願は本発明を予測させるものではない。
ーゲンに由来する配列を有する合成ペプチドの使用が、
ＰＣＴ特許出願ＷＯ９０／０８１９５号に開示されてい
る。また同様に、該出願には、体液中のＩＸ型コラーゲ
ン断片の測定するためにこのようにして産生された抗体
を使用する用途が記載されている。ＩＸ型コラーゲン
は、架橋可能な部位を含有していないので、この特許出
願は本発明を予測させるものではない。
【００３１】米国特許第４、７７８、７６８号は、滑液
の液状試料中のプロテオグリカンモノマーまたはその抗
原断片の定量を行うことから成る、関節軟骨内部で生起
する変化を測定する方法に関するものである。この米国
特許は、分解コラーゲンに由来するコラーゲン断片の検
出には関するものではない。
の液状試料中のプロテオグリカンモノマーまたはその抗
原断片の定量を行うことから成る、関節軟骨内部で生起
する変化を測定する方法に関するものである。この米国
特許は、分解コラーゲンに由来するコラーゲン断片の検
出には関するものではない。
【００３２】Dodge, J. は、Clin. Invest.83:647-661
(1981)において、ヒトおよびウシのＩＩ型コラーゲンの
解かれたアルファ鎖および臭化シアン誘導ペプチドと特
異的に反応するポリクローナル抗血清を用いるＩＩ型コ
ラーゲンの分解を分析する方法を幾つか開示している。
本発明とは異なり、コラーゲンの分解産物は体液中にて
検出されるのではなく、細胞培養の染色によって、即ち
「in situ」検出によって組織化学的に検出されているの
である。Dodgeと本発明の間の主要な差異は、DodgeはＩ
Ｉ型コラーゲンの分解をin situにて測定する点であ
る。
(1981)において、ヒトおよびウシのＩＩ型コラーゲンの
解かれたアルファ鎖および臭化シアン誘導ペプチドと特
異的に反応するポリクローナル抗血清を用いるＩＩ型コ
ラーゲンの分解を分析する方法を幾つか開示している。
本発明とは異なり、コラーゲンの分解産物は体液中にて
検出されるのではなく、細胞培養の染色によって、即ち
「in situ」検出によって組織化学的に検出されているの
である。Dodgeと本発明の間の主要な差異は、DodgeはＩ
Ｉ型コラーゲンの分解をin situにて測定する点であ
る。
【００３３】前記文献のいずれも、分解したフィブリル
コラーゲンの量をin vivoで測定するために実測可能で
あるような、具体的なテロペプチドまたはアルファラセ
ンの構造を特定してはいない。
コラーゲンの量をin vivoで測定するために実測可能で
あるような、具体的なテロペプチドまたはアルファラセ
ンの構造を特定してはいない。
【００３４】１９９４年２月１７日に公開された国際出
願９４／０３８１３号は、とりわけすべての締約国につ
いての欧州特許を指定している。従って、それはＥＰＣ
第５４（３）条の規定になる先行技術となる。
願９４／０３８１３号は、とりわけすべての締約国につ
いての欧州特許を指定している。従って、それはＥＰＣ
第５４（３）条の規定になる先行技術となる。
【００３５】該出願は、試料中のコラーゲンまたはコラ
ーゲン断片を検出するに際して、コラーゲンのＣ−末端
またはＮ−末端ドメインに対応する合成線状ペプチドを
含有する結合性パ−トナ−を線状合成ペプチドに対する
抗体および試料と共にインキュベートし、該抗体の該結
合性パ−トナ−に対する抗体の結合を測定することから
成る競合的免疫測定方法を記載している。この特許出願
は、架橋出来る潜在的な部位を含有する合成ペプチドに
言及しておらず、従って、本出願の新規性を阻害するも
のではない。
ーゲン断片を検出するに際して、コラーゲンのＣ−末端
またはＮ−末端ドメインに対応する合成線状ペプチドを
含有する結合性パ−トナ−を線状合成ペプチドに対する
抗体および試料と共にインキュベートし、該抗体の該結
合性パ−トナ−に対する抗体の結合を測定することから
成る競合的免疫測定方法を記載している。この特許出願
は、架橋出来る潜在的な部位を含有する合成ペプチドに
言及しておらず、従って、本出願の新規性を阻害するも
のではない。
【００３６】
【課題を解決するための手段】本発明は、患者および健
常なヒト被験者の体液中において特定のコラーゲン断片
が存在するという発見に基づく。このコラーゲン断片
は、コラーゲン分解と共に生成されるので、架橋出来る
潜在的な部位の存在によって、例えば、リシンまたはヒ
ドロキシリシンの存在によって部分的に特徴づけられる
（Kuehn, K., Immunochemistry of the extracellular
matrix, 1:1-29(1982))。
常なヒト被験者の体液中において特定のコラーゲン断片
が存在するという発見に基づく。このコラーゲン断片
は、コラーゲン分解と共に生成されるので、架橋出来る
潜在的な部位の存在によって、例えば、リシンまたはヒ
ドロキシリシンの存在によって部分的に特徴づけられる
（Kuehn, K., Immunochemistry of the extracellular
matrix, 1:1-29(1982))。
【００３７】本発明の方法は、Ｉ型、ＩＩ型及びIII 型
のヒト・コラーゲンの分解の測定に使用可能である。
のヒト・コラーゲンの分解の測定に使用可能である。
【００３８】本発明は、コラーゲン分解に際してin viv
oで産生される特定種のコラーゲン断片の存在およびそ
の量を測定し；次いで、健常な個人、即ちコラーゲン代
謝に影響を及ぼす疾患に罹患していない個人において同
一種のコラーゲンを測定することによって作成した所定
の標準値と前記コラーゲン断片検出値とを比較してコラ
ーゲンの分解を測定する方法を提供するものである。な
お、該個人は試験を受けるべき被験者と性別および年齢
は一致させるものとする。
oで産生される特定種のコラーゲン断片の存在およびそ
の量を測定し；次いで、健常な個人、即ちコラーゲン代
謝に影響を及ぼす疾患に罹患していない個人において同
一種のコラーゲンを測定することによって作成した所定
の標準値と前記コラーゲン断片検出値とを比較してコラ
ーゲンの分解を測定する方法を提供するものである。な
お、該個人は試験を受けるべき被験者と性別および年齢
は一致させるものとする。
【００３９】本発明は、これらの架橋構造を有さない合
成ペプチドと免疫反応性を示す抗体を用いる。
成ペプチドと免疫反応性を示す抗体を用いる。
【００４０】好ましいある実施態様においては、本方法
は、体液中のコラーゲン断片とコラーゲンに実質的に由
来する合成ペプチドとが免疫学的結合性パ−トナ−に対
して起こる競争的結合に基づく。
は、体液中のコラーゲン断片とコラーゲンに実質的に由
来する合成ペプチドとが免疫学的結合性パ−トナ−に対
して起こる競争的結合に基づく。
【００４１】本発明は、コラーゲン分解に際して生じる
コラーゲン断片の（定性的および定量的）検出を行うた
の新規でかつ非常に簡単な方法を提供する。
コラーゲン断片の（定性的および定量的）検出を行うた
の新規でかつ非常に簡単な方法を提供する。
【００４２】本明細書において開示し特許請求する本発
明の目的のために、下記する用語は以下の通り定義され
る。
明の目的のために、下記する用語は以下の通り定義され
る。
【００４３】「抗体」：モノクローナルもしくはポリク
ローナル抗体またはその免疫反応性断片（即ち、同一の
抗原決定基に結合できる能力を持つ）、Ｆａｂ、Ｆａ
ｂ’およびＦ（ａｂ')2 断片を含むがこれらに限定され
ない。
ローナル抗体またはその免疫反応性断片（即ち、同一の
抗原決定基に結合できる能力を持つ）、Ｆａｂ、Ｆａ
ｂ’およびＦ（ａｂ')2 断片を含むがこれらに限定され
ない。
【００４４】「架橋可能部位」：in vivoで他のコラー
ゲン分子のテロペプチドまたはラセンアミノ酸配列とで
架橋結合を形成できるリシンまたはヒドロキシリシンを
含有するコラーゲンのテロペプチドまたはラセンアミノ
酸配列における座。
ゲン分子のテロペプチドまたはラセンアミノ酸配列とで
架橋結合を形成できるリシンまたはヒドロキシリシンを
含有するコラーゲンのテロペプチドまたはラセンアミノ
酸配列における座。
【００４５】「架橋可能ペプチド」：少なくとも１つの
架橋可能部位を含むコラーゲン配列の断片を含有するペ
プチド。
架橋可能部位を含むコラーゲン配列の断片を含有するペ
プチド。
【００４６】テストキット：測定を行うのに用いる試薬
と指示薬の組合せ。
と指示薬の組合せ。
【００４７】実質的に由来する（構造について）：類似
の抗原性を持つ構造、すなわち、前記合成ペプチド何れ
もが該合成ペプチドに対して免疫反応性を持つ免疫学的
結合性パ−トナ−に結合するのを、非関連ペプチドのレ
ベルを超えて阻害する能力を持つ構造。
の抗原性を持つ構造、すなわち、前記合成ペプチド何れ
もが該合成ペプチドに対して免疫反応性を持つ免疫学的
結合性パ−トナ−に結合するのを、非関連ペプチドのレ
ベルを超えて阻害する能力を持つ構造。
【００４８】CrossLaps ELISA：α１（１）Ｃ１アミノ
酸配列ＥＫＡＨＤＧＧＲに対する抗血清の反応性に基づ
く競合的免疫測定。この測定は８ＡＡ ELISAとも呼ば
れる。
酸配列ＥＫＡＨＤＧＧＲに対する抗血清の反応性に基づ
く競合的免疫測定。この測定は８ＡＡ ELISAとも呼ば
れる。
【００４９】この方法は又動物体液中のコラーゲン断片
を測定するためにも、例えばコラーゲン代謝を測定する
ために用いることもできると想定される。また本方法
は、新規医薬品のコラーゲン代謝に対する影響を評価す
るために該医薬品の臨床試験中においても使用すること
もできる。
を測定するためにも、例えばコラーゲン代謝を測定する
ために用いることもできると想定される。また本方法
は、新規医薬品のコラーゲン代謝に対する影響を評価す
るために該医薬品の臨床試験中においても使用すること
もできる。
【００５０】より具体的には、本発明は、コラーゲンの
前記配列に対応した合成ペプチドを使用することによっ
てコラーゲン断片を測定する方法に関する。一般に、こ
れらの合成ペプチドは全コラーゲン分子よりも少ないア
ミノ酸残基を有し、１０アミノ酸よりも少ない場合が多
いであろう。また、体液、例えば尿中に存在する分子に
対応する合成ペプチドは架橋出来る潜在的部位、好まし
くはリシンまたはヒドロキシリシンを構造中に結合させ
ているであろう。
前記配列に対応した合成ペプチドを使用することによっ
てコラーゲン断片を測定する方法に関する。一般に、こ
れらの合成ペプチドは全コラーゲン分子よりも少ないア
ミノ酸残基を有し、１０アミノ酸よりも少ない場合が多
いであろう。また、体液、例えば尿中に存在する分子に
対応する合成ペプチドは架橋出来る潜在的部位、好まし
くはリシンまたはヒドロキシリシンを構造中に結合させ
ているであろう。
【００５１】本発明は、前記合成ペプチドに対して免疫
反応性を持つ抗体を使用することによってコラーゲン断
片を測定することを包含するが、なお該ペプチドは各々
架橋可能部位を有するコラーゲン断片に由来する配列を
有する。
反応性を持つ抗体を使用することによってコラーゲン断
片を測定することを包含するが、なお該ペプチドは各々
架橋可能部位を有するコラーゲン断片に由来する配列を
有する。
【００５２】また、本発明は、前記合成ペプチドと免疫
反応性のモノクローナル抗体を産生する細胞系（例え
ば、ハイブリドーマ）をも含む。更には本発明は、融合
細胞ハイブリッドによって産生されたモノクローナル抗
体、および検出可能なマーカーにカップリングしたその
抗体（ならびにその結合性断片、例えばＦａｂ）を含
む。検出可能なマーカーの例としては、以下に限定され
るものではないが、酵素、発色団、発蛍光団、補酵素、
酵素阻害剤、化学ルミネッセンス物質、常磁性金属、ス
ピン標識および放射性同位体が挙げられる。
反応性のモノクローナル抗体を産生する細胞系（例え
ば、ハイブリドーマ）をも含む。更には本発明は、融合
細胞ハイブリッドによって産生されたモノクローナル抗
体、および検出可能なマーカーにカップリングしたその
抗体（ならびにその結合性断片、例えばＦａｂ）を含
む。検出可能なマーカーの例としては、以下に限定され
るものではないが、酵素、発色団、発蛍光団、補酵素、
酵素阻害剤、化学ルミネッセンス物質、常磁性金属、ス
ピン標識および放射性同位体が挙げられる。
【００５３】本発明の方法は、体液中においてコラーゲ
ン分解に由来する特定のコラーゲン断片の濃度を数量化
することから成り、代表的な測定法において、患者体液
中のコラーゲン断片および固体表面に固定化された合成
ペプチドを、合成ペプチドに免疫反応性を持つ免疫学的
結合性パ−トナ−と接触させる。適当な体液としては、
例えば、ヒト尿、血液、血清、血漿および滑液がある。
また本方法は、例えば唾液および汗に対しても使用可能
であることも想定している。この体液はそのまま使用す
るか又は接触工程に先立って精製しても構わない。この
精製工程は、例えば以下に限定されるものではないが、
カートリッジ吸着および溶出、分子ふるいクロマトグラ
フィー、透析、イオン交換、アルミナクロマトグラフィ
ー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、および
それらの組合せを含めた多数の標準的な手法を用いて実
施することができる。
ン分解に由来する特定のコラーゲン断片の濃度を数量化
することから成り、代表的な測定法において、患者体液
中のコラーゲン断片および固体表面に固定化された合成
ペプチドを、合成ペプチドに免疫反応性を持つ免疫学的
結合性パ−トナ−と接触させる。適当な体液としては、
例えば、ヒト尿、血液、血清、血漿および滑液がある。
また本方法は、例えば唾液および汗に対しても使用可能
であることも想定している。この体液はそのまま使用す
るか又は接触工程に先立って精製しても構わない。この
精製工程は、例えば以下に限定されるものではないが、
カートリッジ吸着および溶出、分子ふるいクロマトグラ
フィー、透析、イオン交換、アルミナクロマトグラフィ
ー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、および
それらの組合せを含めた多数の標準的な手法を用いて実
施することができる。
【００５４】本発明は、体液中のコラーゲン断片の定量
のための簡便化された方法を実現することにある。ある
代表的な方法において、架橋出来る潜在的な部位を含有
する合成ペプチドを抗体の産生に使用し、その後にコラ
ーゲン分解によってin vivoで生じたコラーゲン断片の
定量のための検定に組み込み使用するのである。従っ
て、該合成ペプチドも免疫原性剤として特徴ずけられ、
免疫原性組成物で使用できる。
のための簡便化された方法を実現することにある。ある
代表的な方法において、架橋出来る潜在的な部位を含有
する合成ペプチドを抗体の産生に使用し、その後にコラ
ーゲン分解によってin vivoで生じたコラーゲン断片の
定量のための検定に組み込み使用するのである。従っ
て、該合成ペプチドも免疫原性剤として特徴ずけられ、
免疫原性組成物で使用できる。
【００５５】また本発明は、体液中においてコラーゲン
の分解に由来するコラーゲン断片の量を定量するのに有
用なキットを包含する。本キットは、少なくとも１種の
免疫学的結合性パ−トナ−、例えばコラーゲンの分解に
由来するペプチドに特異的なモノクローナルまたはポリ
クローナル抗体から成る。所望ならば、テストキットの
免疫学的結合性パ−トナ−は前記したもののごとき検出
可能なマーカーに結合してもよい。従って一般的に言っ
て、免疫学的結合性パ−トナ−も診断剤としてに有用で
ある。 以下に本発明を詳細に説明する。添付図面を参
照されたい。
の分解に由来するコラーゲン断片の量を定量するのに有
用なキットを包含する。本キットは、少なくとも１種の
免疫学的結合性パ−トナ−、例えばコラーゲンの分解に
由来するペプチドに特異的なモノクローナルまたはポリ
クローナル抗体から成る。所望ならば、テストキットの
免疫学的結合性パ−トナ−は前記したもののごとき検出
可能なマーカーに結合してもよい。従って一般的に言っ
て、免疫学的結合性パ−トナ−も診断剤としてに有用で
ある。 以下に本発明を詳細に説明する。添付図面を参
照されたい。
【００５６】
【発明の実施の態様】本発明の方法の好ましい一つの実
施態様においては、尿中のＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型コラ
ーゲン断片は、尿試料を計量して取り、コラーゲンに由
来する配列を有する合成ペフチドおよび該合成ペプチド
に免疫反応性を示す抗体とこの試料とを接触させること
によって行う阻害ELISA （酵素結合イムノソルベント検
定法）を用いて測定する。合成ペプチドは固体支持体に
固定化し、また抗体は該合成ペプチドに対して生成させ
る。
施態様においては、尿中のＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型コラ
ーゲン断片は、尿試料を計量して取り、コラーゲンに由
来する配列を有する合成ペフチドおよび該合成ペプチド
に免疫反応性を示す抗体とこの試料とを接触させること
によって行う阻害ELISA （酵素結合イムノソルベント検
定法）を用いて測定する。合成ペプチドは固体支持体に
固定化し、また抗体は該合成ペプチドに対して生成させ
る。
【００５７】これら試薬と試料を合わせてインキュベー
トし、ペルオキシダーゼ結合（リビーリング）（reveal
ing)抗体を添加する。もう１度インキベーションした
後、ペルオキシダーゼ基質溶液を添加する。最終のイン
キュベーションを短時間で行った後、酵素反応を停止
し、吸光度を４５０ｎｍで測定し、同一手法によって標
準溶液で得られた標準曲線と比較する。
トし、ペルオキシダーゼ結合（リビーリング）（reveal
ing)抗体を添加する。もう１度インキベーションした
後、ペルオキシダーゼ基質溶液を添加する。最終のイン
キュベーションを短時間で行った後、酵素反応を停止
し、吸光度を４５０ｎｍで測定し、同一手法によって標
準溶液で得られた標準曲線と比較する。
【００５８】合成ペプチドを標準の調製に用いる。関連
合成ペプチドのストック溶液中の合成ペプチドの濃度
を、アミノ酸定量測定法によって測定する。ストック溶
液の３倍希釈物を調製し、引き続いて、阻害ELISA にお
ける標準曲線の作成で用いる。
合成ペプチドのストック溶液中の合成ペプチドの濃度
を、アミノ酸定量測定法によって測定する。ストック溶
液の３倍希釈物を調製し、引き続いて、阻害ELISA にお
ける標準曲線の作成で用いる。
【００５９】合成ペプチドの調製
合成ペプチドの調製は、当該分野でよく知られた手法に
準じて、例えば、通常「Merrifield合成」 と表記される
固相ペプチド合成技術によって行うことができる。ま
た、古典的液相技術を用いることもできる。対象となる
配列は、潜在的架橋可能な部位を含む（例えば、Kuehn,
K., Immunochemistry of the extra-cellular matrix,
1:1-29(1982)、Eyre, D.R., Ann, Rev. Biochem. 53:7
17-48(1984)、または米国特許第５、１４０、１０３号
参照）。このようなペプチド配列の例を幾つか後記表１
に示す。
準じて、例えば、通常「Merrifield合成」 と表記される
固相ペプチド合成技術によって行うことができる。ま
た、古典的液相技術を用いることもできる。対象となる
配列は、潜在的架橋可能な部位を含む（例えば、Kuehn,
K., Immunochemistry of the extra-cellular matrix,
1:1-29(1982)、Eyre, D.R., Ann, Rev. Biochem. 53:7
17-48(1984)、または米国特許第５、１４０、１０３号
参照）。このようなペプチド配列の例を幾つか後記表１
に示す。
【００６０】合成ペプチドに関しては、（ａ）対応する
天然コラーゲン断片を認識する抗体を生起させる、また
は（ｂ）かかる抗体の天然断片への結合を阻害する、と
いう二つの能力を損失させることなく、架橋可能部位か
ら（またはそれへ）１以上のアミノ酸残基を省略（また
は付加）することができる。抗体を生成させるためによ
り長いコラーゲン断片および／またはキメラペプチドを
用いることができ、原理的には、本測定法において免疫
原および競合体と同一のペプチドを用いる必要はない。
天然コラーゲン断片を認識する抗体を生起させる、また
は（ｂ）かかる抗体の天然断片への結合を阻害する、と
いう二つの能力を損失させることなく、架橋可能部位か
ら（またはそれへ）１以上のアミノ酸残基を省略（また
は付加）することができる。抗体を生成させるためによ
り長いコラーゲン断片および／またはキメラペプチドを
用いることができ、原理的には、本測定法において免疫
原および競合体と同一のペプチドを用いる必要はない。
【００６１】
【表１】
抗体の調製
モノクローナルおよびポリクローナル両抗体の調製方法
は当該分野でよく知られている。例えば、Campbell, A.
M., Laboratory Techniques in Biochemistryand Molec
ular Biology, Vol. 13 (1986)を参照。免疫化によって
合成ペプチドに対する抗体を産生できる。しかしなが
ら、これらの化合物は分子量が比較的小さいため、ハプ
テンを担体分子に結合させるのが好ましい。適当な担体
分子としては、以下に限定されるものではないが、例え
ばウシ血清アルブミン、チログロブリン、オバルミン、
破傷風毒素及びキイホール・リンペット(keyhole limpe
t)ヘモシアニンがある。好ましい担体は、ウシ血清アル
ブミンである。免疫化動物の抗体産生細胞に対してその
最も免疫原性の高い形態でハプテンを提示するために、
多数の代替カップリングプロトコルを使用できる。適当
な手法としては、以下に限定されるものではないが、グ
ルタルアルデヒド、カルボジイミドおよび過ヨウ素酸塩
が挙げられる。好ましい結合剤は、グルタルアルデヒド
およびカルボジイミドである。
は当該分野でよく知られている。例えば、Campbell, A.
M., Laboratory Techniques in Biochemistryand Molec
ular Biology, Vol. 13 (1986)を参照。免疫化によって
合成ペプチドに対する抗体を産生できる。しかしなが
ら、これらの化合物は分子量が比較的小さいため、ハプ
テンを担体分子に結合させるのが好ましい。適当な担体
分子としては、以下に限定されるものではないが、例え
ばウシ血清アルブミン、チログロブリン、オバルミン、
破傷風毒素及びキイホール・リンペット(keyhole limpe
t)ヘモシアニンがある。好ましい担体は、ウシ血清アル
ブミンである。免疫化動物の抗体産生細胞に対してその
最も免疫原性の高い形態でハプテンを提示するために、
多数の代替カップリングプロトコルを使用できる。適当
な手法としては、以下に限定されるものではないが、グ
ルタルアルデヒド、カルボジイミドおよび過ヨウ素酸塩
が挙げられる。好ましい結合剤は、グルタルアルデヒド
およびカルボジイミドである。
【００６２】抗体の調製は、コラーゲン断片または担体
に結合させた合成ペプチドによる免疫化を含む従来公知
の技法によって行われる。免疫原性を改善するために
は、注射前に免疫原をアジュバントと混合する。アジュ
バントの例としては、以下に限定されるものではない
が、水酸化アルミニウム、フロイントのアジュバント、
および免疫刺激複合体（ISCOM ）がある。ISCOM は、Mo
rein, B.ら（Nature 308:457-560(1984))によって記載
されている方法に準じて作成できる。
に結合させた合成ペプチドによる免疫化を含む従来公知
の技法によって行われる。免疫原性を改善するために
は、注射前に免疫原をアジュバントと混合する。アジュ
バントの例としては、以下に限定されるものではない
が、水酸化アルミニウム、フロイントのアジュバント、
および免疫刺激複合体（ISCOM ）がある。ISCOM は、Mo
rein, B.ら（Nature 308:457-560(1984))によって記載
されている方法に準じて作成できる。
【００６３】ハプテン担体分子に対するモノクローナル
またはポリクローナル抗体はいずれでも産生させること
が出来る。モノクロ−ナル抗体の産生を行うには、マウ
スを免疫化するのが好ましい。免疫化マウスから紕臓細
胞を収集し、ホモジナイズし、その後にポリエチレング
リコールの存在下で癌細胞と融合させて、コラーゲンに
由来するペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体を
産生する細胞ハイブリッドを得る。適当な癌細胞として
は、以下に限定されるものではないが、骨髄腫、肝癌、
および肉腫細胞がある。モノクローナル抗体の産生につ
いての詳細な記載は、Goding, J.M.のMonoclonal Antib
odies: Principles and Practice（1986)においてなさ
れている。好ましい予備的スクリーニングプロトコル
は、担体に結合され且つマイクロタイタープレートの固
体表面に被覆された合成ペプチドを使用することから成
る。
またはポリクローナル抗体はいずれでも産生させること
が出来る。モノクロ−ナル抗体の産生を行うには、マウ
スを免疫化するのが好ましい。免疫化マウスから紕臓細
胞を収集し、ホモジナイズし、その後にポリエチレング
リコールの存在下で癌細胞と融合させて、コラーゲンに
由来するペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体を
産生する細胞ハイブリッドを得る。適当な癌細胞として
は、以下に限定されるものではないが、骨髄腫、肝癌、
および肉腫細胞がある。モノクローナル抗体の産生につ
いての詳細な記載は、Goding, J.M.のMonoclonal Antib
odies: Principles and Practice（1986)においてなさ
れている。好ましい予備的スクリーニングプロトコル
は、担体に結合され且つマイクロタイタープレートの固
体表面に被覆された合成ペプチドを使用することから成
る。
【００６４】コラーゲンに由来するペプチド断片と反応
性を示すポリクローナル抗体を調製するには、種々の動
物種を免疫化させればよい。適当な動物種としては、以
下に限定されるものではないが、ニワトリ、ウサギ、お
よびヤギがある。ニワトリおよびウサギが好ましい。
性を示すポリクローナル抗体を調製するには、種々の動
物種を免疫化させればよい。適当な動物種としては、以
下に限定されるものではないが、ニワトリ、ウサギ、お
よびヤギがある。ニワトリおよびウサギが好ましい。
【００６５】抗体断片は、当該分野で公知である種々の
方法によって調製される（E.Ishikawa, Journal of Imm
unoassay 3:209-327(1983) 参照)。
方法によって調製される（E.Ishikawa, Journal of Imm
unoassay 3:209-327(1983) 参照)。
【００６６】免疫学的測定法の実施
従って、前記した方法で調製した抗体を用いた免疫学的
測定を利用することによって、事前に分別または加水分
解することなく生物学的流体試料を測定することができ
る。生物学的液体中で所望コラーゲンが持つ特異性は、
測定構成法において一種の合成ペプチド( 抗体の産生に
際して用いたか又は何れにしろ抗体が免疫化学的な反応
性を示す）の使用と組み合わせるとかかる抗体によって
供されるのである。
測定を利用することによって、事前に分別または加水分
解することなく生物学的流体試料を測定することができ
る。生物学的液体中で所望コラーゲンが持つ特異性は、
測定構成法において一種の合成ペプチド( 抗体の産生に
際して用いたか又は何れにしろ抗体が免疫化学的な反応
性を示す）の使用と組み合わせるとかかる抗体によって
供されるのである。
【００６７】この代替法として、かかる免疫学的測定を
モノクローナル抗体を用いて実施しても構わない。この
測定設計の基礎的考え方は、検定の特異性を抗原（コラ
ーゲンに対する合成ペプチド）から抗体（モノクローナ
ル抗体に対するウサギ抗血清からの）にシフトさせるこ
とである。このような構成法を用いると、測定は合成ペ
プチドを用いる必要がない。このような免疫学的測定の
変法は、精製したコラゲナーゼ処理コラーゲンで予め被
覆したマイクロタイタープレート中でペルオキシダーゼ
結合抗体溶液と共に患者試料または標準溶液をインキュ
ベートすることによって行われる。洗浄した後、プレー
トのウェルを基質溶液と共に暗所でインキュベートす
る。停止溶液の添加によって発色反応を停止し、最後に
吸光度を測定する。
モノクローナル抗体を用いて実施しても構わない。この
測定設計の基礎的考え方は、検定の特異性を抗原（コラ
ーゲンに対する合成ペプチド）から抗体（モノクローナ
ル抗体に対するウサギ抗血清からの）にシフトさせるこ
とである。このような構成法を用いると、測定は合成ペ
プチドを用いる必要がない。このような免疫学的測定の
変法は、精製したコラゲナーゼ処理コラーゲンで予め被
覆したマイクロタイタープレート中でペルオキシダーゼ
結合抗体溶液と共に患者試料または標準溶液をインキュ
ベートすることによって行われる。洗浄した後、プレー
トのウェルを基質溶液と共に暗所でインキュベートす
る。停止溶液の添加によって発色反応を停止し、最後に
吸光度を測定する。
【００６８】これらの免疫学的測定法それ自体は、当該
分野で広く公知となっている種々の標準的な測定プロト
コルから選択されるいずれかの手法を用いて行われる。
一般に理解されているように、測定法の構成は、特異的
免疫学的結合性パ−トナ−と所望の特異性分析物との相
互反応に依存し且つ分析物と免疫学的結合性パ−トナ−
とによって形成された複合体を検出する何らかの手段を
利用するものである。免疫学的結合性パ−トナ−は，固
体支持体に複合体化し、分析物に対する捕捉性免疫学的
結合性パ−トナ−として使用される。このプロトコル
は，直接的形態で実行出来るのであって、この場合は分
析物／免疫学的結合性パ−トナ−の複合体の形成は、例
えば、蛍光、放射性または酵素標識によって検出され
る。又は競合的形態で実行可能であって、この場合標識
化標準は免疫学的結合性パ−トナ−を求めて分析物と競
合するのである。このような形態はまた、凝集測定法と
して構成してもよく又は複合体を適当な沈殿剤を反応混
合物に添加することによって沈殿させてもよい。この免
疫学的測定のプロトコルの具体的設計は、種々幅広い選
択が可能であって、当該分野で利用可能な臨床測定装置
およびプロトコルの数は膨大である。このような種々の
プロトコルについては、米国特許第５、００１、２２５
号を参照。
分野で広く公知となっている種々の標準的な測定プロト
コルから選択されるいずれかの手法を用いて行われる。
一般に理解されているように、測定法の構成は、特異的
免疫学的結合性パ−トナ−と所望の特異性分析物との相
互反応に依存し且つ分析物と免疫学的結合性パ−トナ−
とによって形成された複合体を検出する何らかの手段を
利用するものである。免疫学的結合性パ−トナ−は，固
体支持体に複合体化し、分析物に対する捕捉性免疫学的
結合性パ−トナ−として使用される。このプロトコル
は，直接的形態で実行出来るのであって、この場合は分
析物／免疫学的結合性パ−トナ−の複合体の形成は、例
えば、蛍光、放射性または酵素標識によって検出され
る。又は競合的形態で実行可能であって、この場合標識
化標準は免疫学的結合性パ−トナ−を求めて分析物と競
合するのである。このような形態はまた、凝集測定法と
して構成してもよく又は複合体を適当な沈殿剤を反応混
合物に添加することによって沈殿させてもよい。この免
疫学的測定のプロトコルの具体的設計は、種々幅広い選
択が可能であって、当該分野で利用可能な臨床測定装置
およびプロトコルの数は膨大である。このような種々の
プロトコルについては、米国特許第５、００１、２２５
号を参照。
【００６９】標準的な検出プロトコル、例えば、放射性
同位体標識、蛍光標識又はELISA を用いた疫学的測定法
を実施するための抗体およびリビーリング試薬は、直接
的または競合的形態の何れであっても、測定のために必
要な成分および指示を含むキットとして好便に供されて
もよい。本発明の一つの具体例においては、かかるキッ
トは、関連合成ペプチドで被覆したマイクロタイタープ
レート、標準曲線の作成のための標準溶液、分析実行の
定性的テストのための尿対照、前記合成ペプチドと反応
性のウサギ抗体、基質溶液、停止溶液、洗浄緩衝液およ
び指示マニュアルを含む。
同位体標識、蛍光標識又はELISA を用いた疫学的測定法
を実施するための抗体およびリビーリング試薬は、直接
的または競合的形態の何れであっても、測定のために必
要な成分および指示を含むキットとして好便に供されて
もよい。本発明の一つの具体例においては、かかるキッ
トは、関連合成ペプチドで被覆したマイクロタイタープ
レート、標準曲線の作成のための標準溶液、分析実行の
定性的テストのための尿対照、前記合成ペプチドと反応
性のウサギ抗体、基質溶液、停止溶液、洗浄緩衝液およ
び指示マニュアルを含む。
【００７０】免疫学的測定法の構成は、抗体および特異
的合成ペプチドを用いて行うことが出来るので、適宜の
生物学的液体中における対応するコラーゲン断片配列の
比並びにその個別の含有量とその合計を測定すればよ
い。即ち、この測定法は、いくつかの天然ペプチド配列
を決定できるか又は単一のペプチド配列か若しくはこれ
らの如何なる所望の組合せをも決定できるような抗体を
含むように設計することが可能である。
的合成ペプチドを用いて行うことが出来るので、適宜の
生物学的液体中における対応するコラーゲン断片配列の
比並びにその個別の含有量とその合計を測定すればよ
い。即ち、この測定法は、いくつかの天然ペプチド配列
を決定できるか又は単一のペプチド配列か若しくはこれ
らの如何なる所望の組合せをも決定できるような抗体を
含むように設計することが可能である。
【００７１】骨吸収のインジケーターとして本明細書で
特定したペプチドを使用するのに加えて、骨代謝バラン
スの測定も、同一個体から採取した同一または他の適宜
の生物学的液体中における骨形成マーカーを実質的に同
時に測定することによって有利に行える。「実質的に同
時」とは、同一日、好ましくは４時間以内を意味する。
例えばかかるマーカーとしては、（ＢＧＰの骨ＧＬＡ蛋
白質としても公知の）オステオカルチン、Ｉ型プロコラ
ーゲン、骨アルカリ性ホスファターゼおよび合成アルカ
リ性ホスファターゼがある。これらのマーカーの適当な
測定方法は、例えば、Delmase, P.D.らのJ. Bone Min,
Res.(1986)1:333-337に見い出すことができる。
特定したペプチドを使用するのに加えて、骨代謝バラン
スの測定も、同一個体から採取した同一または他の適宜
の生物学的液体中における骨形成マーカーを実質的に同
時に測定することによって有利に行える。「実質的に同
時」とは、同一日、好ましくは４時間以内を意味する。
例えばかかるマーカーとしては、（ＢＧＰの骨ＧＬＡ蛋
白質としても公知の）オステオカルチン、Ｉ型プロコラ
ーゲン、骨アルカリ性ホスファターゼおよび合成アルカ
リ性ホスファターゼがある。これらのマーカーの適当な
測定方法は、例えば、Delmase, P.D.らのJ. Bone Min,
Res.(1986)1:333-337に見い出すことができる。
【００７２】本発明の測定方法は、分解が起こった場合
コラーゲン誘導ペプチドを生じるような組織の代謝状態
を測定するための指標を提供するものであるので、種々
の意味で有用である。先ずＩ型コラーゲンの分解を検討
する場合、これら測定法は、例えば過剰骨吸収を明示す
ることによって被験者の異常状態を評価する方法とな
る。つまりこのことによって、骨粗鬆症症状の存在また
は悪性疾患の転移的進行が判る。過剰骨吸収によって特
徴付けられる他の疾患症状としては、パジェット病およ
び上皮小体亢進症がある。同様に、結合組織に関係する
多くの他の疾病状態を、コラーゲンの分解の測定によっ
て追跡できる。その例としては、慢性関節リウマチおよ
び変形性関節症に関連するＩＩ型コラーゲン分解および
脈管炎症候群におけるＩＩＩ型コラーゲン分解がある。
被験者の状態は連続的に追跡できるので、これらの測定
法の適用は、これらのまたは他の症状を治療するために
適用した療法の進行状態を追跡するのにも使用できる。
さらにこれらの測定法は、毒性物質の投与はしばしば組
織分解の結果をもたらすので、毒性の尺度としても使用
できる。
コラーゲン誘導ペプチドを生じるような組織の代謝状態
を測定するための指標を提供するものであるので、種々
の意味で有用である。先ずＩ型コラーゲンの分解を検討
する場合、これら測定法は、例えば過剰骨吸収を明示す
ることによって被験者の異常状態を評価する方法とな
る。つまりこのことによって、骨粗鬆症症状の存在また
は悪性疾患の転移的進行が判る。過剰骨吸収によって特
徴付けられる他の疾患症状としては、パジェット病およ
び上皮小体亢進症がある。同様に、結合組織に関係する
多くの他の疾病状態を、コラーゲンの分解の測定によっ
て追跡できる。その例としては、慢性関節リウマチおよ
び変形性関節症に関連するＩＩ型コラーゲン分解および
脈管炎症候群におけるＩＩＩ型コラーゲン分解がある。
被験者の状態は連続的に追跡できるので、これらの測定
法の適用は、これらのまたは他の症状を治療するために
適用した療法の進行状態を追跡するのにも使用できる。
さらにこれらの測定法は、毒性物質の投与はしばしば組
織分解の結果をもたらすので、毒性の尺度としても使用
できる。
【００７３】即ち、これら測定法は、疾患症状、治療ま
たは被験者に直接投与された物質または被験者が環境で
暴露された物質の効果の指標としてコラーゲン組織の代
謝状態を使用することが可能である如何なる状況におい
ても適用して構わない。
たは被験者に直接投与された物質または被験者が環境で
暴露された物質の効果の指標としてコラーゲン組織の代
謝状態を使用することが可能である如何なる状況におい
ても適用して構わない。
【００７４】
【実施例】以下に記載する実施例は、本発明を具体的に
説明するものであって、本発明を限定するものではな
い。
説明するものであって、本発明を限定するものではな
い。
【００７５】実施例１：尿中の特異的ペプチド配列の免
疫学的測定 固相技術によって調製した３種のペプチド（α１（Ｉ）
Ｃ１、α１（Ｉ）Ｎ１およびα２（Ｉ）Ｎ１）（20及び
21ペ−ジ、表１参照）を免疫原の調製に用いる。免疫化
を行うために、当該分野でよく知られたグルタルアルデ
ヒド試薬および方法を用いて、該ペプチドをウシ血清ア
ルブミンに共有結合させる。モノクローナルおよびポリ
クローナル両抗体を該ペプチドに対して生成させる。モ
ノクローナル抗体の産生のために、Ｂａｌｂ／ｃマウス
をペプチド−ＢＳＡ結合体で免疫化し、紕臓またはリン
パ節からの細胞とＡｇ８骨髄腫細胞とを融合させて標準
的な技術を用いて、ハイブリドーマ細胞系を調製する。
ポリクローナルをウサギおよびニワトリで生起させる。
抗血清およびハイブリドーマ細胞培地のスクリーニング
は、カルボジイミド試薬および当該分野で公知の方法を
用いて調製した適当なペプチド−ゼラチン結合体で被覆
したマイクロタイタープレートを用いてELISA によって
行った。
疫学的測定 固相技術によって調製した３種のペプチド（α１（Ｉ）
Ｃ１、α１（Ｉ）Ｎ１およびα２（Ｉ）Ｎ１）（20及び
21ペ−ジ、表１参照）を免疫原の調製に用いる。免疫化
を行うために、当該分野でよく知られたグルタルアルデ
ヒド試薬および方法を用いて、該ペプチドをウシ血清ア
ルブミンに共有結合させる。モノクローナルおよびポリ
クローナル両抗体を該ペプチドに対して生成させる。モ
ノクローナル抗体の産生のために、Ｂａｌｂ／ｃマウス
をペプチド−ＢＳＡ結合体で免疫化し、紕臓またはリン
パ節からの細胞とＡｇ８骨髄腫細胞とを融合させて標準
的な技術を用いて、ハイブリドーマ細胞系を調製する。
ポリクローナルをウサギおよびニワトリで生起させる。
抗血清およびハイブリドーマ細胞培地のスクリーニング
は、カルボジイミド試薬および当該分野で公知の方法を
用いて調製した適当なペプチド−ゼラチン結合体で被覆
したマイクロタイタープレートを用いてELISA によって
行った。
【００７６】尿中における３種のペプチド配列（α１
（Ｉ）Ｃ１、α１（Ｉ）Ｎ１およびα２（Ｉ）Ｎ１）の
測定は、阻害ELISA によって以下のように行う。
（Ｉ）Ｃ１、α１（Ｉ）Ｎ１およびα２（Ｉ）Ｎ１）の
測定は、阻害ELISA によって以下のように行う。
【００７７】各々、コラーゲン断片を可能性として含有
する尿試料（１０または２５μｌ）または参照標準とし
て０. ０５〜１５μｇペプチド／ｍｌを含有する溶液
を、０. １％Tween-20界面活性剤ＰＢＳ−Ｔ）を含有し
且つ０. １％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食
塩水中に１：５, ０００〜１：２０, ０００に希釈した
ペプチドに対する免疫学的結合性パ−トナ−７５μｌに
添加する。各試料は、適当なペプチドを含有するゼラチ
ン結合体で予め被覆した平底９６−ウェルのマイクロタ
イタープレートにおいて二回繰り返して調製する。６０
分後、該プレートをＰＢＳ−Ｔ（３回）で洗浄し、一次
抗体の種に対して調製したホースラディッシュペルオキ
シダーゼ標識抗体を用いる標準的技法によって結合抗体
を検出する。ペルオキシダーゼ基質を添加し、１ＭＨ3
ＰＯ4を用いて酵素反応を停止させた後に自動マイクロ
タイタープレート中で発色を４５０ｎｍで測定する。分
析物を含有する試料は、プレート中の固定化ペプチドに
対する一次抗体の結合を減少させ、かくして色濃度が低
下する。試料中の分析物の量は、ｌｏｇ−ｌｉｎプロッ
トを用いてコンピューター計算した各プレートに含まれ
る標準からの予め確立した曲線を参照して定量する。図
１、２および３は、α１（Ｉ）Ｃ１（CrossLaps）免疫
測定（図１）、α１（Ｉ）Ｎ１免疫測定（図２）および
α２（Ｉ）Ｎ１免疫測定（図３）についての典型的な標
準曲線を示す。
する尿試料（１０または２５μｌ）または参照標準とし
て０. ０５〜１５μｇペプチド／ｍｌを含有する溶液
を、０. １％Tween-20界面活性剤ＰＢＳ−Ｔ）を含有し
且つ０. １％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含むリン酸緩衝生理食
塩水中に１：５, ０００〜１：２０, ０００に希釈した
ペプチドに対する免疫学的結合性パ−トナ−７５μｌに
添加する。各試料は、適当なペプチドを含有するゼラチ
ン結合体で予め被覆した平底９６−ウェルのマイクロタ
イタープレートにおいて二回繰り返して調製する。６０
分後、該プレートをＰＢＳ−Ｔ（３回）で洗浄し、一次
抗体の種に対して調製したホースラディッシュペルオキ
シダーゼ標識抗体を用いる標準的技法によって結合抗体
を検出する。ペルオキシダーゼ基質を添加し、１ＭＨ3
ＰＯ4を用いて酵素反応を停止させた後に自動マイクロ
タイタープレート中で発色を４５０ｎｍで測定する。分
析物を含有する試料は、プレート中の固定化ペプチドに
対する一次抗体の結合を減少させ、かくして色濃度が低
下する。試料中の分析物の量は、ｌｏｇ−ｌｉｎプロッ
トを用いてコンピューター計算した各プレートに含まれ
る標準からの予め確立した曲線を参照して定量する。図
１、２および３は、α１（Ｉ）Ｃ１（CrossLaps）免疫
測定（図１）、α１（Ｉ）Ｎ１免疫測定（図２）および
α２（Ｉ）Ｎ１免疫測定（図３）についての典型的な標
準曲線を示す。
【００７８】実施例２：ＨＰＬＣにてのピリジノリン測
定に対する相関関係 多数の非選択尿試料について、全ピリジノリンの濃度
（ＨＰＬＣ法、例えば、Uebelhart, D., Bone and Mine
ral, 8:87-96(1990）参照）を測定した。このHPLCシス
テムで得られた値は、二回の免疫学的測定で得られた値
（CrossLapsおよびα１（Ｉ）Ｎ１ペプチドに基づく測
定）と相関関係にあった。
定に対する相関関係 多数の非選択尿試料について、全ピリジノリンの濃度
（ＨＰＬＣ法、例えば、Uebelhart, D., Bone and Mine
ral, 8:87-96(1990）参照）を測定した。このHPLCシス
テムで得られた値は、二回の免疫学的測定で得られた値
（CrossLapsおよびα１（Ｉ）Ｎ１ペプチドに基づく測
定）と相関関係にあった。
【００７９】図４は、全ピリジノリン（HPLC）およびCr
ossLaps免疫測定（ｎ＝５９）との相関関係を示す。直
線回帰分析で計算した相関はｒ＝０. ８０である。
ossLaps免疫測定（ｎ＝５９）との相関関係を示す。直
線回帰分析で計算した相関はｒ＝０. ８０である。
【００８０】図５は、全ピリジノリン（HPLC）およびα
１（Ｉ）Ｎ１免疫検定（ｎ＝３６）の間の相関関係を示
す。直線回帰分析で計算した相関はｒ＝０. ９５であ
る。
１（Ｉ）Ｎ１免疫検定（ｎ＝３６）の間の相関関係を示
す。直線回帰分析で計算した相関はｒ＝０. ９５であ
る。
【００８１】実施例３：Ｉ型コラーゲンの分解産物の測
定のためのモノクローナル抗体を用いる測定 モノクローナル抗体は、適当な担体蛋白質に結合させた
α１（Ｉ）Ｃ１合成ペプチドでのマウスの免疫化によっ
て生じさせた。細胞融合、クローニングおよびハイブリ
ドーマ増殖は、標準的操作方法により行った。スクリー
ニング操作には、マイクロタイタープレート中に固定化
したα１（Ｉ）Ｃ１合成ペプチドに対する反応性に関す
る試験を含むものであった。
定のためのモノクローナル抗体を用いる測定 モノクローナル抗体は、適当な担体蛋白質に結合させた
α１（Ｉ）Ｃ１合成ペプチドでのマウスの免疫化によっ
て生じさせた。細胞融合、クローニングおよびハイブリ
ドーマ増殖は、標準的操作方法により行った。スクリー
ニング操作には、マイクロタイタープレート中に固定化
したα１（Ｉ）Ｃ１合成ペプチドに対する反応性に関す
る試験を含むものであった。
【００８２】抗体の特異性は、Ｉ型コラーゲンのＣ−テ
ロペプチドに基く異なる重複配列を用いた阻害実験によ
って試験した。
ロペプチドに基く異なる重複配列を用いた阻害実験によ
って試験した。
【００８３】かかる抗体の一つであるＭＡｂＡ７の特異
性を図６に示す。
性を図６に示す。
【００８４】抗体ＭＡｂＡ７を用い測定を開発した。略
言すれば、グルタルアルデヒドを用いて合成ペプチドα
１（Ｉ）Ｃ１をウシ血清アルブミンに結合させ、該結合
体をマイクロタイタープレートの被覆に用いた。また代
替の物質を用いることもできるが、必須の要件はアルギ
ニンの後で解離切断された配列ＥＫＡＨＤＧＧＲ（Ｒ）
の露呈である。
言すれば、グルタルアルデヒドを用いて合成ペプチドα
１（Ｉ）Ｃ１をウシ血清アルブミンに結合させ、該結合
体をマイクロタイタープレートの被覆に用いた。また代
替の物質を用いることもできるが、必須の要件はアルギ
ニンの後で解離切断された配列ＥＫＡＨＤＧＧＲ（Ｒ）
の露呈である。
【００８５】かかる代替物の一つは、細菌コラゲナーゼ
で処理したＩ型コラーゲンである。また別の代替物は、
組換えペプチドにおけるＥＫＡＨＤＧＧＲ配列の発現物
であってもよく、必須の要件は再度ＥＫＡＨＤＧＧＲ配
列のカルボキシ末端（すなわち、アルギニン残基）の露
呈である。
で処理したＩ型コラーゲンである。また別の代替物は、
組換えペプチドにおけるＥＫＡＨＤＧＧＲ配列の発現物
であってもよく、必須の要件は再度ＥＫＡＨＤＧＧＲ配
列のカルボキシ末端（すなわち、アルギニン残基）の露
呈である。
【００８６】被覆に続き、マイクロタイタープレートの
ウェルを、尿１５μｌおよびホースラディッシュペルオ
キシダーゼに結合したＭＡｂＡ７の１００μｌと共にイ
ンキュベートする。
ウェルを、尿１５μｌおよびホースラディッシュペルオ
キシダーゼに結合したＭＡｂＡ７の１００μｌと共にイ
ンキュベートする。
【００８７】１時間後、該プレートを洗浄し、基質（例
えば、ＴＭＢ）を添加する。
えば、ＴＭＢ）を添加する。
【００８８】ＭＡｂＡ７のエピトープ特異性は図６から
明らかでる。マイクロタイタープレート中での固定化Ｅ
ＫＡＨＤＧＧＲに対するＭＡｂＡ７の反応性は、異なる
合成ペプチドでのコインキュベーションによって開始さ
せた。得られた結果から、アルギニンの後の切断はＭＡ
ｂＡ７ELISA における検出に必須であることが判った。
明らかでる。マイクロタイタープレート中での固定化Ｅ
ＫＡＨＤＧＧＲに対するＭＡｂＡ７の反応性は、異なる
合成ペプチドでのコインキュベーションによって開始さ
せた。得られた結果から、アルギニンの後の切断はＭＡ
ｂＡ７ELISA における検出に必須であることが判った。
【００８９】実施例４：他のペプチド断片および抗体に
基づくELISA測定結果に対するCrossLaps ELISA の相関
関係 ２０人の閉経後婦人から採取した尿についてのCrossLap
s ELISAとＭＡｂＡ７ELISA との間の相関を図７に示
す。ＭＡｂＡ７ ELISA は競合測定であり、ここに、マ
イクロタイタートレイ中に固定化した合成８ＡＡペプチ
ド（ＥＫＡＨＤＧＧＲ）はモノクローナル抗体（ＭＡｂ
Ａ７）への結合について患者試料中のコラーゲン断片と
競合する。
基づくELISA測定結果に対するCrossLaps ELISA の相関
関係 ２０人の閉経後婦人から採取した尿についてのCrossLap
s ELISAとＭＡｂＡ７ELISA との間の相関を図７に示
す。ＭＡｂＡ７ ELISA は競合測定であり、ここに、マ
イクロタイタートレイ中に固定化した合成８ＡＡペプチ
ド（ＥＫＡＨＤＧＧＲ）はモノクローナル抗体（ＭＡｂ
Ａ７）への結合について患者試料中のコラーゲン断片と
競合する。
【００９０】結果は高い相関関係を示し、二回の測定結
果は同一または関連した代謝過程を反映していることが
判る。
果は同一または関連した代謝過程を反映していることが
判る。
【００９１】同様に、CrossLapsとＮα２ ELISA 間の相
関関係を図８に示す。Ｎα２は競合測定法であり、この
場合Ｉ型コラーゲンにおけるα２鎖中のＮ−テロペプチ
ドからのＮα２（Ｉ）Ｎ１ペプチド断片（ＱＹＤＧＫＧ
ＶＧ）は、前記と同様に生成させた抗−ＱＹＤＧＫＧＶ
Ｇ抗血清に対する結合につき、患者試料中のコラーゲン
断片と競合する。結果は高い相関関係を示し、これから
二回の測定結果は同一または関連する代謝過程を反映す
ることが判る。
関関係を図８に示す。Ｎα２は競合測定法であり、この
場合Ｉ型コラーゲンにおけるα２鎖中のＮ−テロペプチ
ドからのＮα２（Ｉ）Ｎ１ペプチド断片（ＱＹＤＧＫＧ
ＶＧ）は、前記と同様に生成させた抗−ＱＹＤＧＫＧＶ
Ｇ抗血清に対する結合につき、患者試料中のコラーゲン
断片と競合する。結果は高い相関関係を示し、これから
二回の測定結果は同一または関連する代謝過程を反映す
ることが判る。
【００９２】実施例５：CrossLaps ELISAの検討
現在好ましい合成ペプチドGlu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gl
y-Arg（またはＥＫＡＨＤＧＧＲ）を、前記したように
「CrossLapsTTM」と命名される酵素結合イムノソルベン
ト測定法（ELISA ）において一体化させた。CrossLaps
ELISA は、フランスの専門家（Garnroら）のグループに
よって調べられており、結果はJ. Clin.Indocrinol. Me
tab. 79, No.3(1994)に発表されるであろう。
y-Arg（またはＥＫＡＨＤＧＧＲ）を、前記したように
「CrossLapsTTM」と命名される酵素結合イムノソルベン
ト測定法（ELISA ）において一体化させた。CrossLaps
ELISA は、フランスの専門家（Garnroら）のグループに
よって調べられており、結果はJ. Clin.Indocrinol. Me
tab. 79, No.3(1994)に発表されるであろう。
【００９３】検討結果の要約を以下に記載する。
【００９４】CrossLaps ELISA は、Ｉ型コラーゲンのα
１鎖のＣ−テロペプチドの一部（Glu-Lys-Ala-His-Asp-
Gly-Gly-Arg, CrossLaps 抗原）に特異的な８個のアミ
ノ酸（８ＡＡ）のアミノ酸配列を持つ固定化合成ペプチ
ドに基づく。この配列に対して生成させた抗体でのイン
キュベーションの間に、該固定化ペプチドと尿中のＩ型
コラーゲンのα１鎖の分解産物との間で競合が起こる。
１鎖のＣ−テロペプチドの一部（Glu-Lys-Ala-His-Asp-
Gly-Gly-Arg, CrossLaps 抗原）に特異的な８個のアミ
ノ酸（８ＡＡ）のアミノ酸配列を持つ固定化合成ペプチ
ドに基づく。この配列に対して生成させた抗体でのイン
キュベーションの間に、該固定化ペプチドと尿中のＩ型
コラーゲンのα１鎖の分解産物との間で競合が起こる。
【００９５】略言すれば、２５μＬ尿試料または標準を
CrossLaps抗原−被覆マクイロプレートの各ウェルに添
加し、続いて、７５μＬの抗−CrossLaps抗血清に添加
する。該プレートを撹拌下で室温にて１時間インキュベ
ートし、洗浄緩衝液で５回洗浄する。ヤギ抗ウサギ免疫
グロブリンＧホースラディッシュペルオキシダーゼ結合
体（１００μＬ）を各ウェルに添加する。室温での１時
間のインキュベーションの後に、プレートを前記したご
とくに５回洗浄する。酵素基質（１００μＬ／ウェル）
を添加し、暗所での１５分間のインキュベーションの後
に、１００μＬのリン酸（１モル／Ｌ）を添加すること
によって反応を停止する。４５０ｎｍにおける光学密度
をマクイロプレートリーダーにて測定する。二回の重複
測定を各尿試料について行い、データを、標準比色技術
によって測定して、尿クレアチニン（Ｃｒ）ｍｍｏｌ当
たりのマイクログラムとして表す。
CrossLaps抗原−被覆マクイロプレートの各ウェルに添
加し、続いて、７５μＬの抗−CrossLaps抗血清に添加
する。該プレートを撹拌下で室温にて１時間インキュベ
ートし、洗浄緩衝液で５回洗浄する。ヤギ抗ウサギ免疫
グロブリンＧホースラディッシュペルオキシダーゼ結合
体（１００μＬ）を各ウェルに添加する。室温での１時
間のインキュベーションの後に、プレートを前記したご
とくに５回洗浄する。酵素基質（１００μＬ／ウェル）
を添加し、暗所での１５分間のインキュベーションの後
に、１００μＬのリン酸（１モル／Ｌ）を添加すること
によって反応を停止する。４５０ｎｍにおける光学密度
をマクイロプレートリーダーにて測定する。二回の重複
測定を各尿試料について行い、データを、標準比色技術
によって測定して、尿クレアチニン（Ｃｒ）ｍｍｏｌ当
たりのマイクログラムとして表す。
【００９６】いくつかの試料においては、Ｐｙｒおよび
Ｄ−Ｐｙｒの全排出量を、HPLCによって加水分解試料に
ついて測定し、尿中ヒドロキシプロリンを分光光度法に
よって測定した。
Ｄ−Ｐｙｒの全排出量を、HPLCによって加水分解試料に
ついて測定し、尿中ヒドロキシプロリンを分光光度法に
よって測定した。
【００９７】CrossLaps ELISA を用いて、年齢が３１〜
８９歳である１４６人の婦人および６０人の男性からな
る健康成人の標本においてまた代謝的骨疾病に罹患した
患者において、骨マトリックス分解の間に放出されたＩ
型コラーゲンペプチドの尿中排泄量を測定した。測定内
および測定間の変動係数は、各々、１０％および１３％
以下であった。尿試料からのCrossLaps抗原の回収率は
９２〜１１５％の範囲であり、該ELISA は連続試料希釈
について直線的であった。CrossLaps測定は、遊離ピリ
ジノリン（Ｐｙｒ）または遊離デオキシピリジノリン
（Ｄ−Ｐｙｒ）いずれとも交差反応しない。ELISA によ
って測定したCrossLapsおよび高速液体クロマトグラフ
ィーによって測定したＰｙｒの全排泄量は、正常婦人に
おいて高度に相関していた（ｎ＝９１；ｒ＝０. ７３；
Ｐ＜０. ００１）。尿中CrossLaps排泄量は婦人の年齢
と共に増加したが、男性ではそうはならなかった。婦人
においては、閉経は、HPLCによって測定した全Ｄ−Ｐｙ
ｒ（＋９１％）および全Ｐｙｒ（＋４７％）り平均増加
よりも高い骨アルカリ性ホスファターゼ（＋４８％）お
よびオステオカルチン［＋４１％；２１７ないし５２４
μｇ／ｍｍｏｌクレアチニン（Ｃｒ）］のCrossLaps 排
泄量が１４１％増加したことによって反映された。尿中
CrossLaps排泄量は、パジェット病において（ｎ＝３
２；平均、１８１０±２３００μｇ／ｍｍｏｌＣｒ；Ｐ
＜０. ００１）、および一次上皮小体亢進症を持つ患者
において（ｎ＝１０；平均、７８０±３８０μｇ／ｍｍ
ｏｌ Ｃｒ；Ｐ＜０. ００１）、および甲状腺機能亢進
症を持つ患者において（ｎ＝２７；平均、１２８０±９
７０μｇ／ｍｍｏｌ Ｃｒ；Ｐ＜０. ００１）、対照値
から増加しており、Ｚ−スコア（性別および年齢が合致
した対照の平均からのＳＤ数）は各々４. ４±６. ６、
１. ５±１. ２および６. ７±６. ５であった。パジェ
ット病の患者においては、尿中ヒドロキシプロリンのレ
ベルと高度に相関し（ｒ＝０. ９１；Ｐ＜０. ００
１）、３日間のビス・ホスホネートパミドロネートによ
る静脈内治療を行った場合、尿中CrossLaps排泄量の減
少は尿中ヒドロキシプロリンのそれよりも大きかった
（−７１％−対−−１７％；Ｐ＜０. ００１）。甲状腺
機能亢進症の患者においては、CrossLaps排泄量はほと
んどの患者において（７８％）正常範囲を超えて上昇
し、甲状腺機能亢進症の治療１カ月内に正常に戻った。
８９歳である１４６人の婦人および６０人の男性からな
る健康成人の標本においてまた代謝的骨疾病に罹患した
患者において、骨マトリックス分解の間に放出されたＩ
型コラーゲンペプチドの尿中排泄量を測定した。測定内
および測定間の変動係数は、各々、１０％および１３％
以下であった。尿試料からのCrossLaps抗原の回収率は
９２〜１１５％の範囲であり、該ELISA は連続試料希釈
について直線的であった。CrossLaps測定は、遊離ピリ
ジノリン（Ｐｙｒ）または遊離デオキシピリジノリン
（Ｄ−Ｐｙｒ）いずれとも交差反応しない。ELISA によ
って測定したCrossLapsおよび高速液体クロマトグラフ
ィーによって測定したＰｙｒの全排泄量は、正常婦人に
おいて高度に相関していた（ｎ＝９１；ｒ＝０. ７３；
Ｐ＜０. ００１）。尿中CrossLaps排泄量は婦人の年齢
と共に増加したが、男性ではそうはならなかった。婦人
においては、閉経は、HPLCによって測定した全Ｄ−Ｐｙ
ｒ（＋９１％）および全Ｐｙｒ（＋４７％）り平均増加
よりも高い骨アルカリ性ホスファターゼ（＋４８％）お
よびオステオカルチン［＋４１％；２１７ないし５２４
μｇ／ｍｍｏｌクレアチニン（Ｃｒ）］のCrossLaps 排
泄量が１４１％増加したことによって反映された。尿中
CrossLaps排泄量は、パジェット病において（ｎ＝３
２；平均、１８１０±２３００μｇ／ｍｍｏｌＣｒ；Ｐ
＜０. ００１）、および一次上皮小体亢進症を持つ患者
において（ｎ＝１０；平均、７８０±３８０μｇ／ｍｍ
ｏｌ Ｃｒ；Ｐ＜０. ００１）、および甲状腺機能亢進
症を持つ患者において（ｎ＝２７；平均、１２８０±９
７０μｇ／ｍｍｏｌ Ｃｒ；Ｐ＜０. ００１）、対照値
から増加しており、Ｚ−スコア（性別および年齢が合致
した対照の平均からのＳＤ数）は各々４. ４±６. ６、
１. ５±１. ２および６. ７±６. ５であった。パジェ
ット病の患者においては、尿中ヒドロキシプロリンのレ
ベルと高度に相関し（ｒ＝０. ９１；Ｐ＜０. ００
１）、３日間のビス・ホスホネートパミドロネートによ
る静脈内治療を行った場合、尿中CrossLaps排泄量の減
少は尿中ヒドロキシプロリンのそれよりも大きかった
（−７１％−対−−１７％；Ｐ＜０. ００１）。甲状腺
機能亢進症の患者においては、CrossLaps排泄量はほと
んどの患者において（７８％）正常範囲を超えて上昇
し、甲状腺機能亢進症の治療１カ月内に正常に戻った。
【００９８】これらの観察に基づき、Garneroらは、こ
の新しい便利な測定法は、骨吸収速度の指標として感度
が優れ且つ特異的でありまた骨粗鬆症や他の代謝的骨疾
患の患者の臨床検査および治療的追跡に有用であると結
論づけている。
の新しい便利な測定法は、骨吸収速度の指標として感度
が優れ且つ特異的でありまた骨粗鬆症や他の代謝的骨疾
患の患者の臨床検査および治療的追跡に有用であると結
論づけている。
【００９９】実施例６：ＭＡｂＡ７ELISA の検査
前記したごとく、モノクローナル抗体ＭＡｂ７Ａに基づ
く測定構成では、合成ペプチドを使用する必要がない。
このような種類の測定法は、３段階にて以下のごとくに
実施される。
く測定構成では、合成ペプチドを使用する必要がない。
このような種類の測定法は、３段階にて以下のごとくに
実施される。
【０１００】第１の段階において、精製したコラゲナー
ゼ処理コラーゲン（ＣＴＣ）で事前被覆したマイクロタ
イタープレートのウェルを１５μｌの標準溶液または尿
試料および１００μｌのペルオキシダーゼ結合モノクロ
ーナル抗体溶液と共に室温で１時間インキュベートす
る。
ゼ処理コラーゲン（ＣＴＣ）で事前被覆したマイクロタ
イタープレートのウェルを１５μｌの標準溶液または尿
試料および１００μｌのペルオキシダーゼ結合モノクロ
ーナル抗体溶液と共に室温で１時間インキュベートす
る。
【０１０１】第２の段階で洗浄を行った後、ウェルを１
００μｌの基質溶液と共に室温で１５分間暗所でインキ
ュベートする。最後に、第３の段階において、発色反応
を１００μｌの停止溶液の添加によって停止する。４５
０ｎｍにおける吸光度を２時間以内に測定する。
００μｌの基質溶液と共に室温で１５分間暗所でインキ
ュベートする。最後に、第３の段階において、発色反応
を１００μｌの停止溶液の添加によって停止する。４５
０ｎｍにおける吸光度を２時間以内に測定する。
【０１０２】図９は、閉経に伴う骨吸収の増加に関する
ＭＡｂ７Ａ ELISAの検出を示す。１８人の閉経前および
３８人の閉経後の婦人からの尿試料をテストした。ｔ−
スコア（閉経前婦人の標準偏差数として表した平均値の
差）は、二つの母集団間の分離が相対的に微細になるこ
とを示す。
ＭＡｂ７Ａ ELISAの検出を示す。１８人の閉経前および
３８人の閉経後の婦人からの尿試料をテストした。ｔ−
スコア（閉経前婦人の標準偏差数として表した平均値の
差）は、二つの母集団間の分離が相対的に微細になるこ
とを示す。
【０１０３】図１０は、CrossLaps ELISA によって行っ
た閉経に伴う骨吸収の増加係わる同様の検定を示す。尿
試料は図８のものと同一である。
た閉経に伴う骨吸収の増加係わる同様の検定を示す。尿
試料は図８のものと同一である。
【０１０４】ホルモン代替療法（ＨＲＴ）に過程におい
て生化学的マーカーにおける変化が図１１から明らかで
ある。エストロゲン（塗りつぶした丸）またはプラセボ
（塗りつぶさない丸）を服用した婦人から採取した尿試
料をベースラインにおいて又１２カ月間の治療を行った
後で試験した。１２カ月後の値をベースライン値の１０
０分率として表す。得られた結果から、CrossLaps ELIS
A およびＭＡｂ７Ａ ELISA（被覆剤としてＣＴＣまたは
合成ペプチドＥＫＡＨＤＧＧＲを使用）は、抗吸収治療
に対して同等の感度を有することが判る。
て生化学的マーカーにおける変化が図１１から明らかで
ある。エストロゲン（塗りつぶした丸）またはプラセボ
（塗りつぶさない丸）を服用した婦人から採取した尿試
料をベースラインにおいて又１２カ月間の治療を行った
後で試験した。１２カ月後の値をベースライン値の１０
０分率として表す。得られた結果から、CrossLaps ELIS
A およびＭＡｂ７Ａ ELISA（被覆剤としてＣＴＣまたは
合成ペプチドＥＫＡＨＤＧＧＲを使用）は、抗吸収治療
に対して同等の感度を有することが判る。
【０１０５】実施例７：臨床結果
実施例１に記載した免疫学的測定方法（α１（Ｉ）Ｃ１
ペプチド、即ちCrossLaps ELISAを使用した）を異なる
個体からの尿試料に適用し、分析物の量を数量化した。
得られた値は、尿検定で通常行われているように、尿試
料中の尿クレアチニン含有量と関連づけた。年令マッチ
ングさせた健常婦人（閉経前および閉経後）で得られた
値を表２に示す。
ペプチド、即ちCrossLaps ELISAを使用した）を異なる
個体からの尿試料に適用し、分析物の量を数量化した。
得られた値は、尿検定で通常行われているように、尿試
料中の尿クレアチニン含有量と関連づけた。年令マッチ
ングさせた健常婦人（閉経前および閉経後）で得られた
値を表２に示す。
【０１０６】
【表２】
個々の値については、図１２を参照。閉経前および閉経
後の値の間の差は、高度に有意である(Ｐ＜０. ０００
１) 。定量的試験方法のＺ−スコアは、二つの母集団の
間を差別化する当該方法の能力を表わす。
後の値の間の差は、高度に有意である(Ｐ＜０. ０００
１) 。定量的試験方法のＺ−スコアは、二つの母集団の
間を差別化する当該方法の能力を表わす。
【０１０７】表３は、年令マッチングさせた健常な閉経
前（ｎ＝１４０）および閉経後婦人（ｎ＝１８０）から
採取した同一セットの尿試料に適用した場合におけるCr
ossLaps免疫学的測定法とHPLCによるピリジノリンに関
する最新の技術水準測定法のＺ−スコアを示す。
前（ｎ＝１４０）および閉経後婦人（ｎ＝１８０）から
採取した同一セットの尿試料に適用した場合におけるCr
ossLaps免疫学的測定法とHPLCによるピリジノリンに関
する最新の技術水準測定法のＺ−スコアを示す。
【０１０８】
【表３】
表３から分かるように、２の方法の差別化能力はほぼ同
様である。
様である。
【０１０９】ある測定法を吸収の指標として使用するた
めには、ホルモン代替療法（ＨＲＴ）のインパクトを測
定出来ることが非常に重要である。表４は、かかる検討
においてCrossLaps ELISA で得られた結果を示す。
めには、ホルモン代替療法（ＨＲＴ）のインパクトを測
定出来ることが非常に重要である。表４は、かかる検討
においてCrossLaps ELISA で得られた結果を示す。
【表４】
個々の値については、図１３を参照。ＨＲＴを受ける群
における高度に有意な低下が、１２カ月後に観察される
（Ｐ＜０. ００１）。
における高度に有意な低下が、１２カ月後に観察される
（Ｐ＜０. ００１）。
【０１１０】実施例８：尿中のＩ型コラーゲン分解産物
の定量・数量化に際しての本発明の免疫学的測定法（Cr
ossLaps ELISA）の評価 ピリジノリン（Ｐｙｒ）およびデオキシピリジノリン
（Ｄ−Ｐｙｒ）は成熟コラーゲン間の架橋物であり、主
として骨および軟骨で見い出されるのであるが、他方で
は皮膚には存在しない。Ｄ−ＰｙｒはＰｙｒよりも骨に
より特異的であるが、いずれも絶対的には骨特異的では
ない。しかしながら、ＰｙｒおよびＤ−Ｐｙｒの全排泄
量の測定は、骨吸収の指標として使用できる。Ｐｙｒお
よびＤ−Ｐｙｒは、通常はHPLCを用いて分離した後加水
分解された尿において蛍光分光学的に測定されるのであ
るが、長時間を要する、複雑な方法で、ルーチンの使用
には適さない。
の定量・数量化に際しての本発明の免疫学的測定法（Cr
ossLaps ELISA）の評価 ピリジノリン（Ｐｙｒ）およびデオキシピリジノリン
（Ｄ−Ｐｙｒ）は成熟コラーゲン間の架橋物であり、主
として骨および軟骨で見い出されるのであるが、他方で
は皮膚には存在しない。Ｄ−ＰｙｒはＰｙｒよりも骨に
より特異的であるが、いずれも絶対的には骨特異的では
ない。しかしながら、ＰｙｒおよびＤ−Ｐｙｒの全排泄
量の測定は、骨吸収の指標として使用できる。Ｐｙｒお
よびＤ−Ｐｙｒは、通常はHPLCを用いて分離した後加水
分解された尿において蛍光分光学的に測定されるのであ
るが、長時間を要する、複雑な方法で、ルーチンの使用
には適さない。
【０１１１】本実施例は、尿中においてＰｙｒおよびＤ
−Ｐｙｒの構造とは独立したＩ型コラーゲン特異的ペプ
チド配列を測定する測定法、即ちCrossLaps ELISA を記
載するものである。骨の有機マトリックスは９０％以上
がＩ型コラーゲンから成るので、この測定法で測定した
ペプチド配列は、骨吸収の潜在的なマーカーである。
−Ｐｙｒの構造とは独立したＩ型コラーゲン特異的ペプ
チド配列を測定する測定法、即ちCrossLaps ELISA を記
載するものである。骨の有機マトリックスは９０％以上
がＩ型コラーゲンから成るので、この測定法で測定した
ペプチド配列は、骨吸収の潜在的なマーカーである。
【０１１２】この測定法について参照値を確立するため
に、年齢が３０〜５１歳（平均±１ＳＤ；３９. ３±
５. ５６）の１０２人の健康な閉経前婦人から採取した
試料を検査測定した。全ての婦人は正常な膣出血の経歴
を有し、カルシウム代謝に影響することが知られている
医薬は一切服用していなかった。同様に、年齢が４５〜
５７歳（平均±１ＳＤ；５１. １±２. ３８）の初期閉
経後婦人から採取した料を測定したが、これらの婦人は
全て、自然な閉経の履歴の持主であった（平均閉経年齢
２０.１±９.９０月）。更に年齢が６８〜７２歳（平均
±１ＳＤ；７０.０±１.１９）の後期閉経後婦人から採
取した試料（ｎ＝１６５）を測定したが、これらの婦人
は全て自然な閉経の経歴の持主であった（平均閉経年齢
２６８±６８ ２月）。これらの婦人のいずれもカルシ
ウム代謝に影響することが知られている医薬品は一切服
用していなかった。
に、年齢が３０〜５１歳（平均±１ＳＤ；３９. ３±
５. ５６）の１０２人の健康な閉経前婦人から採取した
試料を検査測定した。全ての婦人は正常な膣出血の経歴
を有し、カルシウム代謝に影響することが知られている
医薬は一切服用していなかった。同様に、年齢が４５〜
５７歳（平均±１ＳＤ；５１. １±２. ３８）の初期閉
経後婦人から採取した料を測定したが、これらの婦人は
全て、自然な閉経の履歴の持主であった（平均閉経年齢
２０.１±９.９０月）。更に年齢が６８〜７２歳（平均
±１ＳＤ；７０.０±１.１９）の後期閉経後婦人から採
取した試料（ｎ＝１６５）を測定したが、これらの婦人
は全て自然な閉経の経歴の持主であった（平均閉経年齢
２６８±６８ ２月）。これらの婦人のいずれもカルシ
ウム代謝に影響することが知られている医薬品は一切服
用していなかった。
【０１１３】テストした測定法及びＤ−Ｐｙｒ（ＨＰＬ
Ｃ法）の比較を行うために、年齢３０. ０〜６５. ０歳
の２１４人の健康な婦人から採取した尿試料を測定し
た。この測定法およびＨｐｒを比較するために、年齢３
０. ０〜５４. ０歳の健康な婦人から成るもう１つの集
団から採取した試料を測定した（ｎ＝４２１）。
Ｃ法）の比較を行うために、年齢３０. ０〜６５. ０歳
の２１４人の健康な婦人から採取した尿試料を測定し
た。この測定法およびＨｐｒを比較するために、年齢３
０. ０〜５４. ０歳の健康な婦人から成るもう１つの集
団から採取した試料を測定した（ｎ＝４２１）。
【０１１４】実験は、８ＡＡ特異的合成ペプチドに基づ
くCrossLaps ELISA については実施例５に概説したのと
実質的に同様に行った。略言すれば、２５μＬの標準ま
たは未知試料を予め被覆したELISA プレート中の適当な
ウェルに二連にてピペットを用いて入れる。次いで、７
５μＬの抗体溶液（８ＡＡに対するウサギ抗体）を各ウ
ェルに添加し、該プレートをシーリングテープで覆い、
振とう器具上室温にて６０分間インキュベートする。ま
た、下記の操作は全て室温で行った。インキュベーショ
ン後に、該プレートを希釈した洗浄緩衝液で３回洗浄し
た。
くCrossLaps ELISA については実施例５に概説したのと
実質的に同様に行った。略言すれば、２５μＬの標準ま
たは未知試料を予め被覆したELISA プレート中の適当な
ウェルに二連にてピペットを用いて入れる。次いで、７
５μＬの抗体溶液（８ＡＡに対するウサギ抗体）を各ウ
ェルに添加し、該プレートをシーリングテープで覆い、
振とう器具上室温にて６０分間インキュベートする。ま
た、下記の操作は全て室温で行った。インキュベーショ
ン後に、該プレートを希釈した洗浄緩衝液で３回洗浄し
た。
【０１１５】ペルオキシダーゼ結合抗体（ウソギＩｇＧ
に対するＨＲＰ−結合ヤギ抗体、１００μＬ／ウェル）
を添加し、シールしたウェルを振とう器具上、６０分間
インキュベートした。もう一度洗浄した後、１００μＬ
のＴＭＢ基質溶液をすべてのウェルに添加し、これをシ
ールし、１５分間インキュベートした。１００μＬの停
止溶液の添加して１５分後酵素反応を停止した。光学密
度を４５０ｎｍでELISA レーダーで読み取った。
に対するＨＲＰ−結合ヤギ抗体、１００μＬ／ウェル）
を添加し、シールしたウェルを振とう器具上、６０分間
インキュベートした。もう一度洗浄した後、１００μＬ
のＴＭＢ基質溶液をすべてのウェルに添加し、これをシ
ールし、１５分間インキュベートした。１００μＬの停
止溶液の添加して１５分後酵素反応を停止した。光学密
度を４５０ｎｍでELISA レーダーで読み取った。
【０１１６】補正曲線は、五つのの標準液（０. ５〜１
０. ５μｇ／ｍｌ）の平均吸光度をプロットすることに
よって対数−直線グラフ紙上で作成した。各患者の試料
における８ＡＡ相当物の濃度を、補正曲線上で内挿法に
よって決定した。
０. ５μｇ／ｍｌ）の平均吸光度をプロットすることに
よって対数−直線グラフ紙上で作成した。各患者の試料
における８ＡＡ相当物の濃度を、補正曲線上で内挿法に
よって決定した。
【０１１７】その他のマーカー
Ｐｙｒの尿中濃度をHPLC法によって測定した。略言すれ
ば、架橋物は、セルロースクロマトグラフィーによって
加水分解尿試料から抽出し、逆相HPLCによって分離し、
分光蛍光光度法によって同定した。蛍光ピークの面積
は、ヒト骨皮質から精製した補正済Ｐｙｒ外部標準との
比較によって数量化した。測定内および全測定変動係数
は、標準曲線の範囲内では１０％以下であった（１４.
４〜２１６ｐｍｏｌ、注入試料容量：１３０μＬ）。
ば、架橋物は、セルロースクロマトグラフィーによって
加水分解尿試料から抽出し、逆相HPLCによって分離し、
分光蛍光光度法によって同定した。蛍光ピークの面積
は、ヒト骨皮質から精製した補正済Ｐｙｒ外部標準との
比較によって数量化した。測定内および全測定変動係数
は、標準曲線の範囲内では１０％以下であった（１４.
４〜２１６ｐｍｏｌ、注入試料容量：１３０μＬ）。
【０１１８】Ｈｐｒの尿中濃度は、分光光度法によって
測定した。測定内および全測定変動係数は標準曲線の範
囲（３８〜３０５μｍｐｌ／Ｌ）では１３％以下であっ
た。
測定した。測定内および全測定変動係数は標準曲線の範
囲（３８〜３０５μｍｐｌ／Ｌ）では１３％以下であっ
た。
【０１１９】８ＡＡ測定、ＰｙｒおよびＨｐｒについて
の値は、正規化のために対応するクレアチニン値で除し
た。
の値は、正規化のために対応するクレアチニン値で除し
た。
【０１２０】結果
図１４は、本測定法にて用いた抗体を生成させるために
選択した８ＡＡペプチドの位置の模式図である。測定で
用いた標準液は、０. ５ないし１０. ５ｍｇ／Ｌの測定
範囲を規定するものである。テストした尿試料の約５％
は１０. ５ｍｇ／Ｌよりも高い値を有していた。これら
の試料を標準液Ａ中で１＋３に希釈し、再テストした。
検出限界（ゼロ標準マイナス２x ＳＤ（ゼロ標準）なる
平均吸光度に等しい吸光度に対応する濃度として定義）
は０. ２ｍｇ／Ｌである。
選択した８ＡＡペプチドの位置の模式図である。測定で
用いた標準液は、０. ５ないし１０. ５ｍｇ／Ｌの測定
範囲を規定するものである。テストした尿試料の約５％
は１０. ５ｍｇ／Ｌよりも高い値を有していた。これら
の試料を標準液Ａ中で１＋３に希釈し、再テストした。
検出限界（ゼロ標準マイナス２x ＳＤ（ゼロ標準）なる
平均吸光度に等しい吸光度に対応する濃度として定義）
は０. ２ｍｇ／Ｌである。
【０１２１】技術的なバリデ−ションを行うために、検
定の精度を計算した。表５には、内部および全変動係数
をまとめて示す。これらのデータは、同一ロットのELIS
A を用いて三つの尿試料を４日間の毎日６回測定した数
値に基づいて計算した。平均の試験内及び全ＣＶ値は、
各々５. ３および６. ６％であった。分析的回収率は、
三つの異なる尿試料に対して合成ペプチドを量を増やし
ながら添加した後に測定したが、平均して１００％であ
った（表６）。
定の精度を計算した。表５には、内部および全変動係数
をまとめて示す。これらのデータは、同一ロットのELIS
A を用いて三つの尿試料を４日間の毎日６回測定した数
値に基づいて計算した。平均の試験内及び全ＣＶ値は、
各々５. ３および６. ６％であった。分析的回収率は、
三つの異なる尿試料に対して合成ペプチドを量を増やし
ながら添加した後に測定したが、平均して１００％であ
った（表６）。
【０１２２】ELISA 法において高濃度の試料を稀釈した
場合の効果を表７に示す。試料は、ゼロ標準液で希釈し
た（５００ｍＭ TRIS 、０. １％ Tween20 、０. １％
ＢＳＡ ｐＨ＝８. ０）。未希釈尿試料中の含有量に対
して、１００％なる数値を割り当てた。尿試料の種々の
希釈液についての全平均は９９％であった。
場合の効果を表７に示す。試料は、ゼロ標準液で希釈し
た（５００ｍＭ TRIS 、０. １％ Tween20 、０. １％
ＢＳＡ ｐＨ＝８. ０）。未希釈尿試料中の含有量に対
して、１００％なる数値を割り当てた。尿試料の種々の
希釈液についての全平均は９９％であった。
【０１２３】
【表５】
これらのデータは、 同一ロットの８ＡＡ ELISAを用い
て三つの尿試料を４日間毎日６回測定した数値に基づい
て計算した。
て三つの尿試料を４日間毎日６回測定した数値に基づい
て計算した。
【０１２４】
【表６】
【０１２５】
【表７】
【０１２６】凍結および解凍を５回まで反復した後本測
定法で測定を行っても、テストした五つの試料において
尿中濃度は有意に変化しなかった（５回の凍結−解凍サ
イクル後の初期値のパーセント：平均±ＳＤ、ｎ＝５：
９８. ５±４. ５％）。さらに、別の五つの試料におい
ては、測定した抗原は、２０℃において少なくとも７日
間、如何なる添加物を加えなくても安定であった（初期
値のパーセント：平均±ＳＤ、ｎ＝５：９９. ８±５.
１％）。
定法で測定を行っても、テストした五つの試料において
尿中濃度は有意に変化しなかった（５回の凍結−解凍サ
イクル後の初期値のパーセント：平均±ＳＤ、ｎ＝５：
９８. ５±４. ５％）。さらに、別の五つの試料におい
ては、測定した抗原は、２０℃において少なくとも７日
間、如何なる添加物を加えなくても安定であった（初期
値のパーセント：平均±ＳＤ、ｎ＝５：９９. ８±５.
１％）。
【０１２７】図１５は、二つの閉経後集団（初期閉経
後、ｎ＝２５４、後期閉経後ｎ＝１６５）における８Ａ
Ａ ELISAの個別値を、ハッチングを施した領域によって
示してある健常な閉経前範囲（平均±２ＳＤ）と比較し
て示してある（閉経後範囲２５０±２２０ｍｇ／ｍｏｌ
Ｃｒ、ｎ＝１０２）。初期閉経後婦人のうち３６. ７
％は、閉経前婦人の３ＳＤ限界を超える値を有してい
た。この数字は、後期閉経後群に対しては３１. ５％で
あった。初期閉経後婦人に対して得られた平均値は後期
閉経後婦人のそれとは異ならず（４１９ｍｈ／ｍｏｌ対
４１２ｍｇ／ｍｏｌ）、閉経年齢の増加に伴って値が変
化する傾向はなかった。
後、ｎ＝２５４、後期閉経後ｎ＝１６５）における８Ａ
Ａ ELISAの個別値を、ハッチングを施した領域によって
示してある健常な閉経前範囲（平均±２ＳＤ）と比較し
て示してある（閉経後範囲２５０±２２０ｍｇ／ｍｏｌ
Ｃｒ、ｎ＝１０２）。初期閉経後婦人のうち３６. ７
％は、閉経前婦人の３ＳＤ限界を超える値を有してい
た。この数字は、後期閉経後群に対しては３１. ５％で
あった。初期閉経後婦人に対して得られた平均値は後期
閉経後婦人のそれとは異ならず（４１９ｍｈ／ｍｏｌ対
４１２ｍｇ／ｍｏｌ）、閉経年齢の増加に伴って値が変
化する傾向はなかった。
【０１２８】図１６は、８ＡＡ ELISAとHPLCで測定した
Ｄ−Ｐｙｒとの間の相関関係を示す。相関関係は高度に
有意であり、ｒ−値として０. ８３が得られた。
Ｄ−Ｐｙｒとの間の相関関係を示す。相関関係は高度に
有意であり、ｒ−値として０. ８３が得られた。
【０１２９】図１７は、ELISA とＨｐｒの間の相関関係
を示す。また、この相関関係も高度に有意であり、ｒ−
値は０. ７８であった。
を示す。また、この相関関係も高度に有意であり、ｒ−
値は０. ７８であった。
【０１３０】上記にて説明した測定法おいては、Ｉ型コ
ラーゲンのＣ−テロペプチドに特異的であって現在のと
ころ好ましいペプチド配列としてGlu-Lys-Ala-His-Asp-
Gly-Gly-Argを抗体の生成に使用した（図１４参照）。
このような分子部分を選択する理由はいくつかあって、
この配列は分子間架橋物にとって重要な領域を含有して
おり、さらに架橋残基の近傍部とこれらの分子の持つコ
ンパクトな構造とが、かかるペプチドが更に一層腎臓分
解されるのを防御することが以前から示唆されている。
従って、成熟Ｉ型コラーゲンの部分的分解から生じるか
かるペプチド配列が尿中で見い出され得ることが予測さ
れる。
ラーゲンのＣ−テロペプチドに特異的であって現在のと
ころ好ましいペプチド配列としてGlu-Lys-Ala-His-Asp-
Gly-Gly-Argを抗体の生成に使用した（図１４参照）。
このような分子部分を選択する理由はいくつかあって、
この配列は分子間架橋物にとって重要な領域を含有して
おり、さらに架橋残基の近傍部とこれらの分子の持つコ
ンパクトな構造とが、かかるペプチドが更に一層腎臓分
解されるのを防御することが以前から示唆されている。
従って、成熟Ｉ型コラーゲンの部分的分解から生じるか
かるペプチド配列が尿中で見い出され得ることが予測さ
れる。
【０１３１】この実験の結果から、評価したELISA 法
は、精度、回収率、および尿試料の希釈の点で良好な性
能を有することが判った（表５、６および７）。尿試料
の長期取扱いおよび測定に関して、テストした試料は反
復して凍結し解凍ことが出来又これらの試料中の抗原は
２０℃で少なくとも７日間安定であることが判明したの
である。図１５から判るように、テストした婦人の各々
３６. ７％および３１.５％は数値が高かった（平均＋
２ＳＤ以上）。またこの知見は、全ての婦人の約１／３
が閉経後に加速された骨損失を経験するものと推定する
従前の知見とよく合致する。
は、精度、回収率、および尿試料の希釈の点で良好な性
能を有することが判った（表５、６および７）。尿試料
の長期取扱いおよび測定に関して、テストした試料は反
復して凍結し解凍ことが出来又これらの試料中の抗原は
２０℃で少なくとも７日間安定であることが判明したの
である。図１５から判るように、テストした婦人の各々
３６. ７％および３１.５％は数値が高かった（平均＋
２ＳＤ以上）。またこの知見は、全ての婦人の約１／３
が閉経後に加速された骨損失を経験するものと推定する
従前の知見とよく合致する。
【０１３２】Ｄ−Ｐｙｒは骨吸収マーカーとして充分に
確立されたものである。Ｄ−Ｐｙｒ測定法（HPLC）およ
び８ＡＡ ELISAにおいて平行試料（ｎ＝２１４）につい
て得られた結果を比較することによって、高度の相関関
係が見い出された（ｒ＝０.８３）。このことは、８Ａ
Ａ ELISA が、ピリジノリンによって反映されることと
類似または平行した代謝過程を反映するものであること
を示唆している。骨吸収のもう１つのよく確立されたマ
ーカーであるＨｐｒに対しても相関関係があるので、さ
らに８ＡＡ ELISAがin vivoでの骨吸収を反映するもの
であることが判る。
確立されたものである。Ｄ−Ｐｙｒ測定法（HPLC）およ
び８ＡＡ ELISAにおいて平行試料（ｎ＝２１４）につい
て得られた結果を比較することによって、高度の相関関
係が見い出された（ｒ＝０.８３）。このことは、８Ａ
Ａ ELISA が、ピリジノリンによって反映されることと
類似または平行した代謝過程を反映するものであること
を示唆している。骨吸収のもう１つのよく確立されたマ
ーカーであるＨｐｒに対しても相関関係があるので、さ
らに８ＡＡ ELISAがin vivoでの骨吸収を反映するもの
であることが判る。
【０１３３】実施例９：骨吸収の新しいマーカーとして
の本発明の免疫学的検査法（Cross-Laps ELISA）の使用 骨吸収NO増大は骨損失が増大したことの直接的な病原性
因子であるため、これまでに骨吸収に対して特異的であ
るマーカーを発見すべく多大な努力が傾注されてきた。
カルシウムやヒドロキシプロリンの尿中排泄量が、骨吸
収の指標として長年使用されてきたが、いずれも骨代謝
に対しては特異的ではない。
の本発明の免疫学的検査法（Cross-Laps ELISA）の使用 骨吸収NO増大は骨損失が増大したことの直接的な病原性
因子であるため、これまでに骨吸収に対して特異的であ
るマーカーを発見すべく多大な努力が傾注されてきた。
カルシウムやヒドロキシプロリンの尿中排泄量が、骨吸
収の指標として長年使用されてきたが、いずれも骨代謝
に対しては特異的ではない。
【０１３４】本実施例は、骨吸収のマーカーとしての本
発明に基づく好ましい免疫学的測定法（CrossLapsTM EL
ISA）を評価する。骨代謝回転に対する他のマーカーも
比較する目的で評価に含める。
発明に基づく好ましい免疫学的測定法（CrossLapsTM EL
ISA）を評価する。骨代謝回転に対する他のマーカーも
比較する目的で評価に含める。
【０１３５】閉経前婦人：血清および尿試料を年齢３０
〜５０歳（平均±１ＳＤ；３９. １±５. ５）の１０４
人の健康な閉経前婦人から採取して分析したが、全ての
婦人は規則的な膣出血の経歴の持主であり、カルシウム
代謝に影響することが知られている医薬品は一切服用し
ていなかった。
〜５０歳（平均±１ＳＤ；３９. １±５. ５）の１０４
人の健康な閉経前婦人から採取して分析したが、全ての
婦人は規則的な膣出血の経歴の持主であり、カルシウム
代謝に影響することが知られている医薬品は一切服用し
ていなかった。
【０１３６】閉経後婦人：閉経後婦人は、二つの大規模
な、二重盲検プラセボ対照、無作為化試験の一部を構成
するものあった。この試験の主要目的は、初期閉経後骨
損失についての異なる予防的療法を評価することであっ
た。
な、二重盲検プラセボ対照、無作為化試験の一部を構成
するものあった。この試験の主要目的は、初期閉経後骨
損失についての異なる予防的療法を評価することであっ
た。
【０１３７】ベースライン値は、年齢４５〜５５歳の１
８０人の無作為に選択した健康な閉経後婦人（平均±１
ＳＤ；５０. ６±２. ３６）で測定したが、これら婦人
は全て６カ月から３年の自然の閉経の履歴を有し（平均
±１ＳＤ；２０. ０±１０.４カ月）また誰もカルシウ
ム代謝に影響することが知られている医薬品を服用して
いなかった。
８０人の無作為に選択した健康な閉経後婦人（平均±１
ＳＤ；５０. ６±２. ３６）で測定したが、これら婦人
は全て６カ月から３年の自然の閉経の履歴を有し（平均
±１ＳＤ；２０. ０±１０.４カ月）また誰もカルシウ
ム代謝に影響することが知られている医薬品を服用して
いなかった。
【０１３８】更に、長期間に亘る血清及び尿試料につい
て、１２カ月間のホルモン代替療法終えて無作為に選択
した８０人の婦人及び１２カ月間のプラセボ治療を終え
て無作為選択した３５人の婦人から採取して測定した。
ホルモン療法は、２ｍｇの経口エストラジオールに１ｍ
ｇのシプロテロンアセテート、０. ７５ｍｇのレボノル
ゲステレル、１ｍｇのデソゲステロル、または１０ｍｇ
のメドロキシプロゲステロンアセテートいずれかを組み
合わせて成るものであった。何れのグループもホルモン
およびプラセボ療法内で同様に反応したので、データは
一緒に分析した。プラセボ治療を受けたこれらの婦人の
うち３５人は２年間追跡し、３カ月毎に反復して前腕骨
質量測定し、これにより骨損失の速度が計算できた（％
／年）。
て、１２カ月間のホルモン代替療法終えて無作為に選択
した８０人の婦人及び１２カ月間のプラセボ治療を終え
て無作為選択した３５人の婦人から採取して測定した。
ホルモン療法は、２ｍｇの経口エストラジオールに１ｍ
ｇのシプロテロンアセテート、０. ７５ｍｇのレボノル
ゲステレル、１ｍｇのデソゲステロル、または１０ｍｇ
のメドロキシプロゲステロンアセテートいずれかを組み
合わせて成るものであった。何れのグループもホルモン
およびプラセボ療法内で同様に反応したので、データは
一緒に分析した。プラセボ治療を受けたこれらの婦人の
うち３５人は２年間追跡し、３カ月毎に反復して前腕骨
質量測定し、これにより骨損失の速度が計算できた（％
／年）。
【０１３９】血液および尿試料
血液試料を採取し、二日目の朝の尿を少なくとも８時間
の絶食の後に午前８と１０時の間にて採集した。試料は
分析するまで−２０℃まで貯蔵した。
の絶食の後に午前８と１０時の間にて採集した。試料は
分析するまで−２０℃まで貯蔵した。
【０１４０】測定法は前記したごとくに行った（実施例
６）。測定内および測定間変動係数は、各々、６％およ
び８％以下であり、検出限界は０. ２ｇ／ｍｌであっ
た。
６）。測定内および測定間変動係数は、各々、６％およ
び８％以下であり、検出限界は０. ２ｇ／ｍｌであっ
た。
【０１４１】ピリジノリン（Ｐｙｒ）およびデオキシピ
リジノリン（Ｄ−Ｐｙｒ）の尿中濃度をＨＰＬＣ法によ
って、これら試料から無作為に選択したサブセット、即
ち合成した８１の試料で測定した（２９人の閉経前およ
び５２人の閉経後試料）。略言すれば、架橋物は、セル
ロースクロマトグラフィーによって加水分解した尿試料
から抽出し、逆相ＨＰＬＣによって分離し、分光光度法
によって同定した。蛍光ピークの領域は、ヒト骨皮質か
ら精製した、補正済のＰｙｒおよびＤ−Ｐｙｒ外部標準
と比較することによって定量した、測定内および測定間
変動はＰｙｒについては１０％以下であり、Ｄ−Ｐｙｒ
については１５％以下であった。ヒドロキシプロリン
（Ｈｐｒ）の尿中含有量は、分光光度法によって測定
し、オステオカルチンの血清中含有量はラジオイムノ測
定（ＲＩＡ）によって測定した。 クレアチニンは自動
分析器で測定し、得られた値を用いて尿中パラメーター
を補正した（CrossLaps, Pyr, D-Pyr, Hpr)。遠位前腕
の骨ミネラル含量（ＢＭＣ）は、骨デンシトメーターを
用いて単一ホトン吸収法によってベースラインにて３カ
月毎に測定した。とう骨と尺骨の間の距離が８ｍｍとな
ったところで走査を開始した。長期in vivo精度は１％
未満である。腰椎脊髄の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）は二
重エネルギーホトンまたはＸ−線吸収法いずれかによっ
て測定した。
リジノリン（Ｄ−Ｐｙｒ）の尿中濃度をＨＰＬＣ法によ
って、これら試料から無作為に選択したサブセット、即
ち合成した８１の試料で測定した（２９人の閉経前およ
び５２人の閉経後試料）。略言すれば、架橋物は、セル
ロースクロマトグラフィーによって加水分解した尿試料
から抽出し、逆相ＨＰＬＣによって分離し、分光光度法
によって同定した。蛍光ピークの領域は、ヒト骨皮質か
ら精製した、補正済のＰｙｒおよびＤ−Ｐｙｒ外部標準
と比較することによって定量した、測定内および測定間
変動はＰｙｒについては１０％以下であり、Ｄ−Ｐｙｒ
については１５％以下であった。ヒドロキシプロリン
（Ｈｐｒ）の尿中含有量は、分光光度法によって測定
し、オステオカルチンの血清中含有量はラジオイムノ測
定（ＲＩＡ）によって測定した。 クレアチニンは自動
分析器で測定し、得られた値を用いて尿中パラメーター
を補正した（CrossLaps, Pyr, D-Pyr, Hpr)。遠位前腕
の骨ミネラル含量（ＢＭＣ）は、骨デンシトメーターを
用いて単一ホトン吸収法によってベースラインにて３カ
月毎に測定した。とう骨と尺骨の間の距離が８ｍｍとな
ったところで走査を開始した。長期in vivo精度は１％
未満である。腰椎脊髄の骨ミネラル密度（ＢＭＤ）は二
重エネルギーホトンまたはＸ−線吸収法いずれかによっ
て測定した。
【０１４２】統計的解析
CrossLapsおよびＰｙｒのベースライン値は直線回帰分
析によって補正した。両軸にクレアチニンを導入するの
を回避するために、用いた値はクレアチニンについて補
正しなかった。閉経前および閉経後グループ間の差異
は、対となっていないデータにつき、スチューデントｔ
−検定によって評価した。Ｔ−スコアは、閉経前標準偏
差における閉経前平均値からの閉経後偏差として計算し
た。Ｔ−スコアは、偏差分析によって比較した。１２カ
月のホルモン療法の間の異なるマーカーおよび骨におけ
るベースラインからの減少は、対のデータについて、ス
チューデントｔ−検定によって評価した。プラセボおよ
びホルモングループにおける変化は、パーセント尺度で
評価した。個々のベースライン値は１００％と定義し、
その後の値は全てベースライン値のパーセントとして計
算した。各グループの平均値は、対になっていないデー
タについてスチューデントｔ−検定によって比較した
（損失速度）。CrossLapsのベースライン値は、直線回
帰分析によって損失速度に対して相関つけた。
析によって補正した。両軸にクレアチニンを導入するの
を回避するために、用いた値はクレアチニンについて補
正しなかった。閉経前および閉経後グループ間の差異
は、対となっていないデータにつき、スチューデントｔ
−検定によって評価した。Ｔ−スコアは、閉経前標準偏
差における閉経前平均値からの閉経後偏差として計算し
た。Ｔ−スコアは、偏差分析によって比較した。１２カ
月のホルモン療法の間の異なるマーカーおよび骨におけ
るベースラインからの減少は、対のデータについて、ス
チューデントｔ−検定によって評価した。プラセボおよ
びホルモングループにおける変化は、パーセント尺度で
評価した。個々のベースライン値は１００％と定義し、
その後の値は全てベースライン値のパーセントとして計
算した。各グループの平均値は、対になっていないデー
タについてスチューデントｔ−検定によって比較した
（損失速度）。CrossLapsのベースライン値は、直線回
帰分析によって損失速度に対して相関つけた。
【０１４３】結果
図１８において、CrossLapsとＰｙｒとの間の相関関係
が可視化されている（ｎ＝８１）。ｒ−値は０.８３で
ある。
が可視化されている（ｎ＝８１）。ｒ−値は０.８３で
ある。
【０１４４】図１９は、閉経前（ｎ＝１０４）および閉
経後（ｎ＝１８０）婦人におけるCrossLaps／Ｃｒ、Ｈ
ｐｒ／Ｃｒおよびオステオカルチンの個別の数値を示
す。閉経後婦人は、これら３種のマーカーの全ての数値
が７１％（CrossLaps）、２３％（Ｈｐｒ）および５２
％（オステオカルチン）となり数値が有意に増加した。
閉経に対する応答がＴ−スコアで表される場合、CrossL
apsはＴ−スコアが１．６であり、Ｈｐｒは０.７であ
り、オステオカルチンについては１.０であった（Ｐ＜
０.００１）。試料から無作為に選択したサブセットに
おいて（閉経前ｎ＝２９および閉経後ｎ＝２８）、パー
セントでの増加は、Ｐｙｒについて３１％、Ｄ−Ｐｙｒ
については５０％であった。対応するＴ−スコアは、Ｐ
ｙｒならびにＤ−Ｐｙｒについては１.３であり、これ
はCrossLapsのＴ−スコアと有意に異ならなかった（Cro
ssLapsについてのＴ−スコアは同一サブグループで１.
５であった）。ベースラインで測定した１８０人の閉経
後婦人のうち、４１％は閉経前平均値の２倍標準偏差以
上のCrossLaps値を有していた。Ｈｐｒおよびオステオ
カルチンについて対応する値は、各々１２％および２３
％であった。 図２０は、ベースライン値のパーセント
で表した、１２カ月のホルモン代替療法（ｎ＝８０）ま
たはプラセボ（ｎ＝３５）療法後のCrossLaps／Ｃｒ、
オステオカルチンおよび前腕骨質量を示す。すべてのマ
ーカーにおいて、プラセボグループと比較すると、ホル
モングループにおいては統計的に有意に減少した。Cros
sLapsは６０.７％減少し、Ｈｐｒは３０.５％減少し、
オステオカルチンは５５.４％減少した。試料のランダ
ムに選択したサブセットにおいて（ホルモン置換ｎ＝１
２およびプラセボｎ＝１２）、パーセント減少はＰｙｒ
について２２％、Ｄ−Ｐｙｒについて２９％であった。
１年につき前腕骨質量は３.１％減少し、脊髄骨質量は
３.１％であった、
経後（ｎ＝１８０）婦人におけるCrossLaps／Ｃｒ、Ｈ
ｐｒ／Ｃｒおよびオステオカルチンの個別の数値を示
す。閉経後婦人は、これら３種のマーカーの全ての数値
が７１％（CrossLaps）、２３％（Ｈｐｒ）および５２
％（オステオカルチン）となり数値が有意に増加した。
閉経に対する応答がＴ−スコアで表される場合、CrossL
apsはＴ−スコアが１．６であり、Ｈｐｒは０.７であ
り、オステオカルチンについては１.０であった（Ｐ＜
０.００１）。試料から無作為に選択したサブセットに
おいて（閉経前ｎ＝２９および閉経後ｎ＝２８）、パー
セントでの増加は、Ｐｙｒについて３１％、Ｄ−Ｐｙｒ
については５０％であった。対応するＴ−スコアは、Ｐ
ｙｒならびにＤ−Ｐｙｒについては１.３であり、これ
はCrossLapsのＴ−スコアと有意に異ならなかった（Cro
ssLapsについてのＴ−スコアは同一サブグループで１.
５であった）。ベースラインで測定した１８０人の閉経
後婦人のうち、４１％は閉経前平均値の２倍標準偏差以
上のCrossLaps値を有していた。Ｈｐｒおよびオステオ
カルチンについて対応する値は、各々１２％および２３
％であった。 図２０は、ベースライン値のパーセント
で表した、１２カ月のホルモン代替療法（ｎ＝８０）ま
たはプラセボ（ｎ＝３５）療法後のCrossLaps／Ｃｒ、
オステオカルチンおよび前腕骨質量を示す。すべてのマ
ーカーにおいて、プラセボグループと比較すると、ホル
モングループにおいては統計的に有意に減少した。Cros
sLapsは６０.７％減少し、Ｈｐｒは３０.５％減少し、
オステオカルチンは５５.４％減少した。試料のランダ
ムに選択したサブセットにおいて（ホルモン置換ｎ＝１
２およびプラセボｎ＝１２）、パーセント減少はＰｙｒ
について２２％、Ｄ−Ｐｙｒについて２９％であった。
１年につき前腕骨質量は３.１％減少し、脊髄骨質量は
３.１％であった、
【０１４５】図２１は、２４カ月にわたる前腕骨質量測
定によって測定したCrossLaps／Ｃｒのベースライン値
および損失の速度（％／年）の間の相関関係を示す。こ
の相関関係から、ｔ−値として−０．６１が得られた
（Ｐ＜０.００１）。Ｈｐｒおよびオステオカルチンに
ついての対応する相関関係から、−０.４６および−０.
４４がｒ−値として得られた。 前記したことから、Cro
ssLapsは、骨吸収の感受性マーカーであることが示され
ているピリジノリンに対して高度に有意に相関関係を有
することが証明される。このことは、CrossLapsが骨吸
収の感受性マーカーであり得ることを示している。本試
験における試料は、婦人の均質な群を代表するものであ
り、従って数値の範囲は比較的狭い。もしパジェット病
および極端に高い骨代謝回転を持つ患者が含まれていた
ならば、相関関係はより高くなったと予測される。Cros
sLapsにおける閉経時の増加は顕著であり（７０％を超
える）、このことから、閉経時に起こる代謝変化の感受
性マーカーであることが判る。Ｔ−値は試験母集団が異
なると大幅に異なり得るので、注意深く解釈されるべき
である。しかしながら、異なるマーカーを比較する場合
には、Ｔ−値は、注目するマーカーの感度の指標を与え
る価値ある手段である。かくして本試験のデータは、Cr
ossLapsがカルシウム代謝に及ぼす閉経の影響に対して
感受性であることを示す。閉経前婦人は閉経後婦人と年
齢が一致しなかった。しかしながら、彼女らは平均して
４０歳であり、かくして、年齢のインパクトはもしあっ
たとしても、些細のものに違いない。さらにこのような
比較試験において、マーカーは同様の方法で影響を最も
受け易いであろう。
定によって測定したCrossLaps／Ｃｒのベースライン値
および損失の速度（％／年）の間の相関関係を示す。こ
の相関関係から、ｔ−値として−０．６１が得られた
（Ｐ＜０.００１）。Ｈｐｒおよびオステオカルチンに
ついての対応する相関関係から、−０.４６および−０.
４４がｒ−値として得られた。 前記したことから、Cro
ssLapsは、骨吸収の感受性マーカーであることが示され
ているピリジノリンに対して高度に有意に相関関係を有
することが証明される。このことは、CrossLapsが骨吸
収の感受性マーカーであり得ることを示している。本試
験における試料は、婦人の均質な群を代表するものであ
り、従って数値の範囲は比較的狭い。もしパジェット病
および極端に高い骨代謝回転を持つ患者が含まれていた
ならば、相関関係はより高くなったと予測される。Cros
sLapsにおける閉経時の増加は顕著であり（７０％を超
える）、このことから、閉経時に起こる代謝変化の感受
性マーカーであることが判る。Ｔ−値は試験母集団が異
なると大幅に異なり得るので、注意深く解釈されるべき
である。しかしながら、異なるマーカーを比較する場合
には、Ｔ−値は、注目するマーカーの感度の指標を与え
る価値ある手段である。かくして本試験のデータは、Cr
ossLapsがカルシウム代謝に及ぼす閉経の影響に対して
感受性であることを示す。閉経前婦人は閉経後婦人と年
齢が一致しなかった。しかしながら、彼女らは平均して
４０歳であり、かくして、年齢のインパクトはもしあっ
たとしても、些細のものに違いない。さらにこのような
比較試験において、マーカーは同様の方法で影響を最も
受け易いであろう。
【０１４６】CrossLaps値は、ホルモン代替療法に応答
して実質的に減少し、このことから、治療効果を追跡す
るための有用なマーカーとなる可能性が開ける。ホルモ
ン代替療法（オステオカルチン、Ｈｐｒ、Ｐｙｒおよび
Ｄ−Ｐｙｒ）を追跡するのに通常使用されるマーカーと
比較して、CrossLapsはテストした他の吸収マーカーよ
りも良好に機能した。しかしながら、ＰｙｒおよびＤ−
Ｐｙｒ実験で使用した試料は比較的少数であったため、
これ以上の確固たる結論を得る可能性が制限されてい
る。また、Ｘ−スコアは、標準偏差においてプラセボグ
ループからの活性グループの偏差として算出されるもの
であるが、他のマーカーについてよりもCrossLapsにつ
いて高くなる（CrossLaps TMにつき１.５、Ｈｐｒにつ
き０.７、およびオステオカルチンにつき１.１；Ｐ＜
０.００１）。
して実質的に減少し、このことから、治療効果を追跡す
るための有用なマーカーとなる可能性が開ける。ホルモ
ン代替療法（オステオカルチン、Ｈｐｒ、Ｐｙｒおよび
Ｄ−Ｐｙｒ）を追跡するのに通常使用されるマーカーと
比較して、CrossLapsはテストした他の吸収マーカーよ
りも良好に機能した。しかしながら、ＰｙｒおよびＤ−
Ｐｙｒ実験で使用した試料は比較的少数であったため、
これ以上の確固たる結論を得る可能性が制限されてい
る。また、Ｘ−スコアは、標準偏差においてプラセボグ
ループからの活性グループの偏差として算出されるもの
であるが、他のマーカーについてよりもCrossLapsにつ
いて高くなる（CrossLaps TMにつき１.５、Ｈｐｒにつ
き０.７、およびオステオカルチンにつき１.１；Ｐ＜
０.００１）。
【０１４７】閉経後骨質量損失の速度は、骨代謝回転の
生化学的マーカーのパネルによって評価できることが示
された。損失速度は、骨粗鬆症の危険の第１の指針とな
り、骨質量測定に付託する件数を減少できるであろう。
CrossLapsと単一ホトン吸収法マーカーによって測定さ
れた損失速度との間の相関関係は、−０.６１であるこ
とが判明したが（図２１）、これは、骨代謝回転の他の
マーカーを用いて従前に見い出されているものよりも高
い。かくして、尿中CrossLaps濃度は、損失速度を予測
するのに使用されるであろう。もし３.０％／年を超え
る骨損失が危険因子であると定義されるならば、この母
集団における６００μｇ／ｍｍｏｌＣｒなるCrossLaps
カットオフ限界を使用すると、診断感度は７３％となり
また特異性は７９％となる。３％／年の骨質量損失のレ
ベルを用いて「速い」および「遅い」骨損失者を区別し
た。何故ならば、損失のこの速度は２つのモードがある
骨損失分布において適当な分離を与えることが以前に見
い出されているからである。
生化学的マーカーのパネルによって評価できることが示
された。損失速度は、骨粗鬆症の危険の第１の指針とな
り、骨質量測定に付託する件数を減少できるであろう。
CrossLapsと単一ホトン吸収法マーカーによって測定さ
れた損失速度との間の相関関係は、−０.６１であるこ
とが判明したが（図２１）、これは、骨代謝回転の他の
マーカーを用いて従前に見い出されているものよりも高
い。かくして、尿中CrossLaps濃度は、損失速度を予測
するのに使用されるであろう。もし３.０％／年を超え
る骨損失が危険因子であると定義されるならば、この母
集団における６００μｇ／ｍｍｏｌＣｒなるCrossLaps
カットオフ限界を使用すると、診断感度は７３％となり
また特異性は７９％となる。３％／年の骨質量損失のレ
ベルを用いて「速い」および「遅い」骨損失者を区別し
た。何故ならば、損失のこの速度は２つのモードがある
骨損失分布において適当な分離を与えることが以前に見
い出されているからである。
【０１４８】本実施例において、脊髄骨損失の速度は必
要な精度で測定されなかった。というのも、測定の多く
はＤＰＡで行われたからである。従ってベースラインCr
ossLapsに対する相関関係は算出されない。
要な精度で測定されなかった。というのも、測定の多く
はＤＰＡで行われたからである。従ってベースラインCr
ossLapsに対する相関関係は算出されない。
【０１４９】健康な閉経後のグループの１５年の追跡に
おいて、損失の速度は骨折の後期発生に有意に関係し、
損失速度はそれ自体危険因子であることが判った。一般
に、たとえ同一の結果が得られるとしても、急速な変化
は遅い変化よりも身体によって充分に許容されないこと
が広く受け入れられている。この事実によって、骨代謝
回転が大きい人を同定することが一層重要となってく
る。この意味で、ほとんど８０％の特異性および７０％
を超える感度であることから、本発明の方法は、閉経後
骨粗鬆症の危険評価における潜在的に有用なスクリーニ
ングパラメーターとなる。
おいて、損失の速度は骨折の後期発生に有意に関係し、
損失速度はそれ自体危険因子であることが判った。一般
に、たとえ同一の結果が得られるとしても、急速な変化
は遅い変化よりも身体によって充分に許容されないこと
が広く受け入れられている。この事実によって、骨代謝
回転が大きい人を同定することが一層重要となってく
る。この意味で、ほとんど８０％の特異性および７０％
を超える感度であることから、本発明の方法は、閉経後
骨粗鬆症の危険評価における潜在的に有用なスクリーニ
ングパラメーターとなる。
【０１５０】すべての引用した特許、特許出願および文
献はその全体を出典明示して本明細書の一部とみなす。
しかしながら、矛盾する場合は、本開示が優先、支配す
る。
献はその全体を出典明示して本明細書の一部とみなす。
しかしながら、矛盾する場合は、本開示が優先、支配す
る。
【０１５１】上記においては、具体的な実施例を述べて
本発明を記載してきた。しかしながら、以下にて特許請
求する本発明の精神を逸脱することなく、多くの追加、
削除および修正が可能であることは当業者に明らかであ
ろう。
本発明を記載してきた。しかしながら、以下にて特許請
求する本発明の精神を逸脱することなく、多くの追加、
削除および修正が可能であることは当業者に明らかであ
ろう。
【０１５２】附属書類 Ａ
コラーゲンアルファ１（Ｉ）鎖の前駆体−ヒト（断片）
ホモサピエンス（人） 残基の数＝１３４１
ホモサピエンス（人） 残基の数＝１３４１
【０１５３】コラーゲンアルファ１（Ｉ）鎖の前駆体の
配列は以下から調製： Chu, M.L., de Wet, W., Bernard, M., Ding, J.F., Mo
rabito, M., Myers, J., Williams, C., and Ramirez,
F., Nature 310, 337-340, 1984 （ヒト、残基1-181の
配列、ＤＮＡ配列から翻訳） Click, E.M., and Bornstein, P., Biochemistry 9, 4
699-4706, 1970 (ヒト皮膚、 CNBr0-1, CNBr2, CNBr4,
CNBr5, 残基162-301 の部分配列） Morgan, P.H., Jacob, H.G., Segrest, J.P., and Cunn
ingham, L.W., J. Biol. Chem. 245, 5042-5048, 1970
(ヒト皮膚残基263-268 の配列） Bernard, M.P., Chu, M.L., Myers, J.C., Ramirez,
F., Eikenberry, E.F.,and Prockop, D.J., Biochemist
ry 22, 5213-5223, 1983 (mRN配列から翻訳した残基302
-1341の配列）
配列は以下から調製： Chu, M.L., de Wet, W., Bernard, M., Ding, J.F., Mo
rabito, M., Myers, J., Williams, C., and Ramirez,
F., Nature 310, 337-340, 1984 （ヒト、残基1-181の
配列、ＤＮＡ配列から翻訳） Click, E.M., and Bornstein, P., Biochemistry 9, 4
699-4706, 1970 (ヒト皮膚、 CNBr0-1, CNBr2, CNBr4,
CNBr5, 残基162-301 の部分配列） Morgan, P.H., Jacob, H.G., Segrest, J.P., and Cunn
ingham, L.W., J. Biol. Chem. 245, 5042-5048, 1970
(ヒト皮膚残基263-268 の配列） Bernard, M.P., Chu, M.L., Myers, J.C., Ramirez,
F., Eikenberry, E.F.,and Prockop, D.J., Biochemist
ry 22, 5213-5223, 1983 (mRN配列から翻訳した残基302
-1341の配列）
【０１５４】コラーゲンアルファ２（Ｉ）鎖の前駆体
ホモサピエンス（人） 残基の数＝１３６８
ホモサピエンス（人） 残基の数＝１３６８
【０１５５】コラーゲンアルファ２（Ｉ）鎖の前駆体の
配列は以下から調製： de Wet, W., Bernard, M.,Benson-Chanda, V., Chu, M.
L., Dickson, L., Weil, D., and Ramirez, F., J. Bio
l. Chem. 262, 16032-16036, 1987(mRNA配列から翻訳し
た配列） 表題：ヒトプロ−アルフア−２（Ｉ）コラーゲン遺伝子
の構成
配列は以下から調製： de Wet, W., Bernard, M.,Benson-Chanda, V., Chu, M.
L., Dickson, L., Weil, D., and Ramirez, F., J. Bio
l. Chem. 262, 16032-16036, 1987(mRNA配列から翻訳し
た配列） 表題：ヒトプロ−アルフア−２（Ｉ）コラーゲン遺伝子
の構成
【０１５６】コラーゲンアルファ１（ＩＩ）鎖の前駆体
ホモサピエンス（人） 残基の数＝１４１８
ホモサピエンス（人） 残基の数＝１４１８
【０１５７】コラーゲンアルファ１（ＩＩ）鎖前駆体の
配列は、以下から調製 Su, M.W., Lee, B., Ramirez, F., Manchdo, M. and Ho
rton, W., Nucleic Acids, Res, 17, 9473, 1989 ヒトＩＩ型プロコラーゲンをコードする全ｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列 Baldwin, C.T., Reginato, A.M.,Smith, C., Jimenez,
S.A., and Prockop, D.J., Biochem. J. 262, 521-528,
1989 ヒトＩＩ型プロコラーゲンをコードするｃＤＮＡクロー
ンの構造。アルファ−１（ＩＩ）鎖はフィブリル状コラ
ーゲンの２つの他のアルファ鎖よりもアルフア−１
（Ｉ）鎖により類似する。 Ala-Kokko, L., Baldwin, C.T., Moskowitz, R.W., and
Prockop, D.J. Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A.87, 656
5-6568, 1990 中度軟骨形成不全症に伴う原発性変形性関節症の原因と
してのＩＩ型プロコラーゲン遺伝子（COL2A1) における
単一塩基突然変異 Ramirez, F. EMBL Data Libraryに提出、1988年12月 参照番号：S04892 Vikkula, M. and Peltonen, L. FEBS Lett. 250, 171-174, 1989 ＩＩ型コラーゲン遺伝子における多形領域の構造分析
配列は、以下から調製 Su, M.W., Lee, B., Ramirez, F., Manchdo, M. and Ho
rton, W., Nucleic Acids, Res, 17, 9473, 1989 ヒトＩＩ型プロコラーゲンをコードする全ｃＤＮＡのヌ
クレオチド配列 Baldwin, C.T., Reginato, A.M.,Smith, C., Jimenez,
S.A., and Prockop, D.J., Biochem. J. 262, 521-528,
1989 ヒトＩＩ型プロコラーゲンをコードするｃＤＮＡクロー
ンの構造。アルファ−１（ＩＩ）鎖はフィブリル状コラ
ーゲンの２つの他のアルファ鎖よりもアルフア−１
（Ｉ）鎖により類似する。 Ala-Kokko, L., Baldwin, C.T., Moskowitz, R.W., and
Prockop, D.J. Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A.87, 656
5-6568, 1990 中度軟骨形成不全症に伴う原発性変形性関節症の原因と
してのＩＩ型プロコラーゲン遺伝子（COL2A1) における
単一塩基突然変異 Ramirez, F. EMBL Data Libraryに提出、1988年12月 参照番号：S04892 Vikkula, M. and Peltonen, L. FEBS Lett. 250, 171-174, 1989 ＩＩ型コラーゲン遺伝子における多形領域の構造分析
【０１５８】コラーゲンアルファ１（ＩＩＩ）鎖の前駆
体 ホモサピエンス（人） 残基の数＝１０７８
体 ホモサピエンス（人） 残基の数＝１０７８
【０１５９】コラーゲンアルフア−１（ＩＩＩ）鎖前駆
体の配列、以下から調製 Janeczko, R.A., and Ramirez, F., Nucleic Acids Re
s. 17, 6742, 1989 全ヒト・アルファ−１（ＩＩＩ）コラーゲンのヌクレオ
チドおよび核酸配列
体の配列、以下から調製 Janeczko, R.A., and Ramirez, F., Nucleic Acids Re
s. 17, 6742, 1989 全ヒト・アルファ−１（ＩＩＩ）コラーゲンのヌクレオ
チドおよび核酸配列
【図１】 実施例で詳細に記載するα１（Ｉ）Ｃ１免疫
測定（「CrossLaps」とも称する)についての典型的標準
曲線である。
測定（「CrossLaps」とも称する)についての典型的標準
曲線である。
【図２】 実施例で詳細に記載するα１（Ｉ）ＮＩ免疫
測定についての典型的標準曲線である。
測定についての典型的標準曲線である。
【図３】 実施例で詳細に記載するα２（Ｉ）Ｎ１免疫
測定についての典型的標準曲線である。
測定についての典型的標準曲線である。
【図４】 全ピリジノリン（HPLC) とCrossLaps免疫測
定との間の相関関係を示す。
定との間の相関関係を示す。
【図５】 全ピリジノリン（HPLC) とα１（Ｉ）免疫測
定との間の相関関係を示す。
定との間の相関関係を示す。
【図６】 抗体ＭＡｂＡ７のエピトープ特異性を示す。
【図７】 α１（Ｉ）Ｃ１ペプチド断片に基づくCrossL
aps ELISAとＭＡｂＡ７ELISAとの間の相関相関を示す。
aps ELISAとＭＡｂＡ７ELISAとの間の相関相関を示す。
【図８】 CrossLaps ELISAとα２（Ｉ）Ｎ１ペプチド
断片に基づいたＮα２EISA との間の相関相関を示す。
断片に基づいたＮα２EISA との間の相関相関を示す。
【図９】 閉経に関連した骨吸収の増加をＭＡｂＡ７EL
ISAによって検出する方法を示す。
ISAによって検出する方法を示す。
【図１０】 閉経に関連する骨吸収の増加のCrossLaps
ELISAによる検出を示す。
ELISAによる検出を示す。
【図１１】 CrossLaps ELISAおよびＭＡｂＡ７ ELISA
によって測定した、ホルモン代替療法の間に於ける生物
化学的マーカーの変化を示す。
によって測定した、ホルモン代替療法の間に於ける生物
化学的マーカーの変化を示す。
【図１２】 健常な年齢適合させた婦人からの採取した
尿試料のCrossLapsにおける測定の個々の数値を示す。
尿試料のCrossLapsにおける測定の個々の数値を示す。
【図１３】 ホルモン代替療法を受けている婦人および
CrossLaps免疫測定におけるプラセボからの尿試料の測
定の個々の値を示す。
CrossLaps免疫測定におけるプラセボからの尿試料の測
定の個々の値を示す。
【図１４】 CrossLaps免疫測定について選択された８
ＡＡペプチドの位置の模式的表示である。
ＡＡペプチドの位置の模式的表示である。
【図１５】 初期閉経後婦人（ｎ＝２４５）および後記
閉経婦人からの個々の８ＡＡ値を示す。ハッチングを施
した領域は閉経前婦人（ｎ＝１０２）の群からの平均値
±２ＳＤを示す。
閉経婦人からの個々の８ＡＡ値を示す。ハッチングを施
した領域は閉経前婦人（ｎ＝１０２）の群からの平均値
±２ＳＤを示す。
【図１６】 Ｄ−Ｐｙｒおよび８ＡＡ ELISAの間の相関
を示す。２１４人の年齢が３０. ０−６５. ０歳の健康
な婦人について、８ＡＡELISA で得られた値をＤ−Ｐｙ
ｒ（HPLC) と比較した。
を示す。２１４人の年齢が３０. ０−６５. ０歳の健康
な婦人について、８ＡＡELISA で得られた値をＤ−Ｐｙ
ｒ（HPLC) と比較した。
【図１７】 Ｈｐｒおよび８ＡＡ ELISAの間の相関を示
す。４２１人の健康な年令が３０. ０−５４. ０歳の婦
人について、８ＡＡELISA で得られた値をＨｐｒと比較
した。
す。４２１人の健康な年令が３０. ０−５４. ０歳の婦
人について、８ＡＡELISA で得られた値をＨｐｒと比較
した。
【図１８】 CrossLapsTM ELISA で得られた値とHPLCで
のピリジノリン（ｎ＝８１）との相関を示す。
のピリジノリン（ｎ＝８１）との相関を示す。
【図１９】 閉経前（ｎ＝１０４）および閉経後（ｎ＝
１８０）の婦人におけるCrossLapTM、Ｈｐｒおよびオス
テオカルシン(osteocalcin) を示す。Ｔ−スコアはBott
om panelで示す。
１８０）の婦人におけるCrossLapTM、Ｈｐｒおよびオス
テオカルシン(osteocalcin) を示す。Ｔ−スコアはBott
om panelで示す。
【図２０】 ベースライン値のパーセントとして表し
た、１２カ月のホルモン代替療法（ｎ＝８０）（.）ま
たはプラセボ（ｎ＝３５）療法後における生化学的パラ
メーターならびに前腕（ｏ）および脊髄（.）の骨質量
の平均変化を示す。ハッチングを施した領域は閉経前婦
人での変動を表す。
た、１２カ月のホルモン代替療法（ｎ＝８０）（.）ま
たはプラセボ（ｎ＝３５）療法後における生化学的パラ
メーターならびに前腕（ｏ）および脊髄（.）の骨質量
の平均変化を示す。ハッチングを施した領域は閉経前婦
人での変動を表す。
【図２１】 ２４カ月の期間におけるCrossLaps TM／Ｃ
ｒのベースライン値と９回の前腕骨質量測定値から決定
した損失速度（％／年）との間の相関相関を示す。
ｒのベースライン値と９回の前腕骨質量測定値から決定
した損失速度（％／年）との間の相関相関を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ
(72)発明者 クイスト、ペル
デンマーク国、ディーケー−2930、クラム
ペンボルク、タールバク・ストランドベ
イ、103番ジー
(72)発明者 ボンデ、マルチン
デンマーク国、ディーケー−2800、リング
ビー、リストフテベイ、15番
Ｆターム(参考） 4B024 AA11 BA44 GA03 HA15
4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA13
4B065 AA91X AA91Y AB05 BA08
CA25 CA46
4H045 AA10 AA30 DA76 EA50 FA74
Claims (21)
- 【請求項１】 体液中のコラーゲン断片の測定方法であ
って、前記体液の試料をコラーゲン断片に対する少なく
とも一つの免疫学的結合性パ−トナ−と接触させるこ
と、前記結合性パ−トナ−が、実質的にコラーゲンに由
来する配列を持つ合成ペプチドと免疫反応性を示しかつ
架橋のための潜在的部位を含有する抗体であること、及
び前記該免疫学的結合性パ−トナ−の一つ又は複数を、
全抗体または免疫学的に活性なその断片のいずれかとし
て、試料中のコラーゲン断片の定量測定法に組み込むこ
ととを特徴とする、前記測定方法。 - 【請求項２】 体液中の試料を、免疫学的結合性パ−ト
ナ−の一つまたは複数と接触させることに加えて、架橋
出来る潜在的部位を含有する対応した合成ペプチドと直
接接触させる、請求項第１項に記載された方法。 - 【請求項３】 該免疫学的結合性パ−トナ−が、架橋出
来る潜在的部位を含有する対応した合成ペプチドを用い
て免疫化することによって生成されたものである、請求
項第１項または第２項に記載された方法。 - 【請求項４】 架橋出来る潜在的部位が、ペプチド配列
に一体化されたリシンまたはヒドロキシリシン残基から
成る、請求項第１項に記載された方法。 - 【請求項５】 該合成ペプチドの配列が、実質的に下記
する構造のうちの一つから成る、ヒトＩ型コラーゲンの
配列に由来するものである、請求項第１項又は第２項に
記載された方法。 Asp-Glu-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg Gly-Met-Lys-Gly-His-Arg Gly-Ile-Lys-Gly-His-Arg Gly-Phe-Lys-Gly-Ile-Arg 又は Gly-Leu-Pro-Gly-Leu-Lys-Gly-His-Asn - 【請求項６】 該合成ペプチドの配列が、実質的に下記
する構造のうちの一つから成る、ヒトII型コラーゲンの
配列に由来するものである、請求項第１項又は第２項に
記載された方法。 Glu-Lys-Gly-Pro-Asp Gly-Val-Lys Pro-Gly-Val-Lys-Gly Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Glu Gly-Gln-Lys-Gly-Glu-Pro 又は Gly-Asp-Ile-Lys-Asp-Ile-Val - 【請求項７】 該合成ペプチドの配列が、実質的に下記
する構造のうちの一つから成る、ヒトIII 型コラーゲン
の配列に由来するものである、請求項第１項又は第２項
に記載された方法。 Asp-Val-Lys-Ser-Gly-Val Glu-Lys-Ala-Gly-Gly-Phe-Ala Gly-Phe-Pro-Gly-Met-Lys-Gly-His-Arg 又は Gly-Ala-Ala-Gly-Ile-Lys-Gly-His-Arg - 【請求項８】 該体液がヒトの尿、血液、血清または滑
液・滑膜液である請求項第１項に記載された方法。 - 【請求項９】 請求項第１項ないし第８項のうちの何れ
か一項に記載された方法において使用される該合成ペプ
チドのいずれかに対して結合するモノクローナル抗体を
産生する能力を有する細胞系。 - 【請求項１０】 請求項第９項に記載された細胞系に
よって産生されるモノクローナル抗体。 - 【請求項１１】 実質的に下記する構造のうちの一つ
から成る、ヒトＩ型コラーゲンの配列に由来する配列： Asp-Glu-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Arg Gly-Met-Lys-Gly-His-Arg Gly-Ile-Lys-Gly-His-Arg Gly-Phe-Lys-Gly-Ile-Arg 又は Gly-Leu-Pro-Gly-Leu-Lys-Gly-His-Asnと 実質的に下記する構造のうちの一つから成る、ヒトII型
コラーゲンの配列に由来する配列： Glu-Lys-Gly-Pro-Asp Gly-Val-Lys Pro-Gly-Val-Lys-Gly Pro-Gly-Pro-Lys-Gly-Glu Gly-Gln-Lys-Gly-Glu-Pro 又は Gly-Asp-Ile-Lys-Asp-Ile-Val 、及び 実質的に下記する構造のうちの一つから成る、ヒトIII
型コラーゲンの配列に由来する配列: Asp-Val-Lys-Ser-Gly-Val Glu-Lys-Ala-Gly-Gly-Phe-Ala Gly-Phe-Pro-Gly-Met-Lys-Gly-His-Arg 又は Gly-Ala-Ala-Gly-Ile-Lys-Gly-His-Arg から成る群から選択される合成ペプチドを用いて免疫化
することによって生成せせめられる免疫学的結合性パ−
トナ−。 - 【請求項１２】 Glu-Lys-Ala-His-Asp-Gly-Gly-Argな
る配列を有する合成ペプチドを用いて免疫化することに
よって生成せしめられる請求項第１１項に記載された免
疫学的結合性パ−トナ−。 - 【請求項１３】 体液中のコラーゲン断片の量を数量
化するためのテストキットであって、前記キットが実質
的にコラーゲンに由来し且つ架橋出来る潜在的部位を有
する合成ペプチドと免疫反応性を示す少なくとも１つの
免疫学的結合性パ−トナ−を包含して成るものである、
前記テストキット。 - 【請求項１４】 請求項第１２項に記載された免疫学
的結合性パ−トナ−を包含して成る、請求項第１３項に
記載されたテストキット。 - 【請求項１５】 コラーゲン代謝に関連した疾患の存
在を患者において診断する方法であって、下記する三つ
の工程から成る前記診断方法： （ａ）前記患者から採取した試料をコラーゲン断片に対
する少なくとも１つの免疫学的結合性パ−トナ−と接触
させること。なお、該結合性パ−トナ−は、その配列が
コラーゲンに実質的に由来し且つ架橋出来る潜在的部位
を含有する合成ペプチドに免疫反応性を示す抗体または
その断片であるとする； （ｂ）該試料中のコラーゲン断片に結合した前記抗体の
量を検出すること；及び （ｃ）該量を、コラーゲン代謝に関連した何れの疾患に
も罹患していない対照被験者から採取した試料中におぴ
て測定した前記抗体の結合量に基づいて予め確立・作成
しておいた標準に前記量を比較対照すること。 - 【請求項１６】 該抗体が、架橋出来る潜在的部位を
含有する対応した合成ペプチドを用いて免疫化すること
によって生成せしめたものである、請求項第１３項に記
載された方法。 - 【請求項１７】 所定の疾患を診断するため、骨組
織、結合組織および他の組織の代謝の他のマーカーと組
み合わせてコラーゲン断片の測定を行うことから成る、
請求項第１３項に記載された方法。 - 【請求項１８】 請求項第１１項に記載された合成ペ
プチドを体液中におケル当該ペプチドの量を数量化する
に際しての標準として使用する方法・用途。 - 【請求項１９】 請求項第１１項に記載された合成ペ
プチドを免疫原剤の調製において使用する方法・用途。 - 【請求項２０】 診断剤として使用される、請求項第１
１項に記載された免疫学的結合性パ−トナ−。 - 【請求項２１】 請求項第１１項に記載された合成ペプ
チドから成る免疫原性組成物。
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-
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