JP2013539027A - Ｉｉ型コラーゲンバイオマーカーのアッセイ - Google Patents

Abstract

血清、血漿または滑液中のＩＩ型コラーゲン断片のアッセイにより、アミノ酸配列ＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧ中に存在するＣ末端エピトープとの特異的反応性を有し、かつ、アミノ酸配列ＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧＶを含むアミノ酸配列との特異的反応性を欠く抗体または免疫反応性抗体断片と反応性である、血清、血漿または滑液サンプル中の全てのタンパク質断片濃度の定量的測定が得られ、前記抗体は、ＨＰＡ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｌｏｇｉｓｔｉｃｓ Ｏｆｆｉｃｅに受託番号１００９１４０２で寄託されている細胞株によって産生されるＭａｂ ＮＢ４４−３Ｃ１であり得る。

Description

本発明は、変形性関節症（ＯＡ）および／または関節リウマチ（ＲＡ）における軟骨破壊の尺度としての意義を有する、血清および他の体液中のＩＩ型コラーゲンの断片の測定に関する。

ＩＩ型コラーゲンは、関節軟骨中の主要なマトリックスタンパク質である。変形性関節症（ＯＡ）および関節リウマチ（ＲＡ）などの関節変性疾患において、コラーゲンはマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）によって分解され、このタンパク質の断片は循環中に放出される。

国際公開第２０１０／０５５０６２号において、本発明者らは、ＭＭＰに生成された、配列ＧＳＰＧＡＤＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧ↓中のＣ末端エピトープを生じさせるＩＩ型コラーゲンの切断産物を記載した。本発明者らは、異性化アミノ酸残基とこのようなプロテアーゼが生成したネオエピトープとを含有する断片を測定する、サンドイッチアッセイを提案した。

国際公開第２０１０／０５５０６４号において、本発明者らは、ＩＩ型コラーゲンからＭＭＰにより生成された２種のネオエピトープを組み合わせたバイオマーカー断片についてのアッセイを記載し、エピトープＬＴＧＰＡＧ．．．および．．．ＲＤＧＡＡＧに対する抗体を用いた、配列ＬＴＧＰＡＧＥＰＧＲＥＧＳＰＧＡＤＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧに対するサンドイッチアッセイを提案した。測定は、同化培養条件下および異化培養条件下でヒト軟骨から放出された反応性断片で行った。測定は、ＯＡ患者および対照患者由来のヒト尿サンプルでも行われ、ＯＡにおける関連断片の増加を示した。

本発明者らは現在までに、第二抗体を使用する必要性なしに、Ｃ末端配列．．．ＲＤＧＡＡＧに対して生じたモノクローナル抗体と反応性の血清中のＩＩ型コラーゲン断片のアッセイから良好な結果が取得可能であることを見出した。

国際公開第２０１０／０５５０６４号に開示されているように、本発明者らは、以下の手順によって、ＩＩ型コラーゲン中のＭＭＰ切断部位を突きとめた。ヒトＩＩ型コラーゲン（ＢＩＯＣＯＬ ＢＣ−３００１）を、１０ｍＭ酢酸に溶解させた（１ｍｇのＩＩ型コラーゲンに４００μｌを添加）。１０μｇのプロカテプシンＫ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ３４２００１）を、１０ｍＭのＤＴＴおよび５ｍＭのＥＤＴＡを含有する１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ３．９）２００μｌを室温で４０分間添加することによって活性化した。１０μｇのＭＭＰ９（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ ４４４２３１）を、ＤＭＳＯ中１ｍＭのＡＰＭＡを２００μｌ、３７℃で２時間添加することによって活性化した。カテプシンＫ切断のために、６０μｌのＩＩ型コラーゲンに、２０ｍＭのＬ−システインを含有する５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）１２０μｌおよび２４μｌの活性化カテプシンＫを、３７℃で４時間添加した。ＭＭＰ９切断のために、６０μｌのＩＩ型コラーゲンに、１２０μｌの１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ＭＭ塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシウム、２ｍＭ塩化亜鉛（ｐＨ８．０）および２０μｌのＭＭＰ９を、３７℃で３日間添加した。得られたタンパク質分解性切断断片を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）−タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）解析によって特徴付けた。ＭＳ／ＭＳスペクトルを、ＳｅｑｕｅｓｔおよびＸ！ Ｔａｎｄｅｍデータベース検索アルゴリズムを使用して、タンパク質データベースに対して検索した。

切断部位は、以下のＩＩ型コラーゲンの注釈付配列に示されるように位置していた。この配列中、カテプシンＫが生成した部位には矢印を付し、ＭＭＰ９が生成した部位には星印を付している。

特に、本発明者らは、ＭＭＰ誘導性のＩＩ型コラーゲンのＭＭＰ切断断片（ＣＩＩＭ）、即ち、遊離Ｃ末端グリシン残基を有するＲＤＧＡＡＧ^１０５３として特定されたネオエピトープを同定した。この断片は太字で示す。さらに、本発明者らは、このネオエピトープ配列との特異的反応性を有する特に有利なモノクローナル抗体（ＮＢ４４−３Ｃ１）を開発した。本出願人は、このモノクローナル抗体を発現する細胞株を、ＨＰＡ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｌｏｇｉｓｔｉｃｓ Ｏｆｆｉｃｅ、Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ、Ｃｅｎｔｒｅ Ｆｏｒ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ ａｎｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＳＰ４ ０ＪＧ、ＵＫに受託番号１００９１４０２としてブダペスト条約寄託の対象とした。

この細胞株の特徴について本出願人が入手可能な現在入手可能な情報は以下のとおりである。この細胞株は、本発明者らがＮＢ４４−３Ｃ１と命名したモノクローナル抗体を分泌する。

現在、ＩＩ型コラーゲン由来のアミノ酸配列ＰＰＧＲＤＧＡＡＧを有するペプチドに対するモノクローナル抗体ＮＢ４４−３Ｃ１の強い反応性を証明する証拠は入手できるが（上に示したとおり）、アミノ酸配列ＰＰＧＲＤＧＡＡＧＶを有する伸長ペプチド（即ち、Ｃ末端が１アミノ酸分伸長したもの）に対する反応性は（あったとしても）ごくわずかである。アミノ酸配列ＰＰＧＲＤＧＡＡＧを含まない一連のペプチド断片に対するモノクローナル抗体ＮＢ４４−３Ｃ１の結合は検出できなかった。これらの非反応性ペプチドには、ＥＴＧＥＲＧＡＡＧ、ＧＦＧＬＰＧＡＡＧ、ＤＱＧＶＰＧＥＡＧ、ＲＥＧＳＰＧＡＳＧ、ＬＡＧＰＫＧＡＮＧ、ＤＤＧＥＡＧＫＰＧ、ＡＴＧＰＬＧＰＫＧ、ＬＴＧＰＡＧＥＰＧおよびＧＡＤＧＰＰＧＲＤが含まれていた。さらに、モノクローナル抗体ＮＢ４４−３Ｃ１は、マトリックスメタロプロテイナーゼで予め処理したＩＩ型コラーゲンに対して強く結合するが、ＭＭＰで予め処理していないＩＩ型コラーゲンに対する反応性は３％未満であった。ＭＭＰでの予めの処理あり、または、処理なしのＩＩＩ型コラーゲンに対する結合は検出できなかった。最後に、モノクローナル抗体ＮＢ４４−３Ｃ１は、ヒトの血清、血漿および滑液中に存在する抗原に強く結合する。

驚くべきことに、ネオエピトープＲＤＧＡＡＧ^１０５３を認識するモノクローナル抗体ＮＢ４４−３Ｃ１が、ヒト循環中の抗原に結合することが見出され、これは、定量により、優れた臨床上の有用性（例えば、健康な個体から関節疾患患者の群を識別する能力）を提供する。

したがって、本発明は、血清、血漿または滑液中のＩＩ型コラーゲン断片のアッセイ方法であって、アミノ酸配列ＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧ中に存在するＣ末端エピトープとの特異的反応性を有し、かつ、アミノ酸配列ＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧＶを含むアミノ酸配列との特異的反応性を欠く抗体または免疫反応性抗体断片と反応性である、血清、血漿または滑液サンプル中のタンパク質断片濃度の定量的測度を得るステップを含む、方法を提供する。

好ましくは、アミノ酸配列ＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧ中に存在するＣ末端エピトープとの特異的反応性を有しかつアミノ酸配列ＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧＶを含むアミノ酸配列との特異的反応性を欠く前記抗体または免疫反応性抗体断片と反応性であるタンパク質断片のサブセットは、前記測度から排除されない。この要件は、例えば、Ｃ末端配列ＲＤＧＡＡＧを有するが第二抗体と反応性の任意の配列を欠く形式の断片が測定から排除されるようなサンドイッチ形式におけるさらなる抗体の使用とは調和しない。

したがって、より特定すれば、このアッセイは、サンドイッチ形式で実施しないことが好ましい。

好ましくは、この方法は、前記血清サンプル中に存在するタンパク質断片を前記抗体または免疫反応性抗体断片と接触させるステップ、および前記抗体または免疫反応性抗体断片への前記断片の結合量を測定するステップを含む。

血清、血漿または滑液サンプルは、関連するタンパク質断片が測定のためになおも存在することを条件として、所望の場合、分析前にある種の処理に供されてもよい。

好ましくは、前記抗体または免疫反応性抗体断片を、前記タンパク質断片と、前記抗体または免疫反応性抗体断片が特異的結合親和性を有する競合剤との両方に、接触させる。

好ましくは、この抗体は、ＨＰＡ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｌｏｇｉｓｔｉｃｓ Ｏｆｆｉｃｅ、Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ、Ｃｅｎｔｒｅ Ｆｏｒ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ ａｎｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＳＰ４ ０ＪＧ、ＵＫに受託番号１００９１４０２で寄託されているＮＢ４４−３Ｃ１である。

本発明は、ペルオキシダーゼ酵素標識（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ）などの検出可能な標識で標識されていてもよい前記抗体を含む。

本発明は、較正曲線を生成するための標準試料、前記抗体に対して免疫学的に反応性のペプチド、発色反応に関与可能な発色性基質（例えばＴＭＢ）、発色反応の停止溶液、およびマルチウェルアッセイプレートのうちの１つまたは複数と一緒に、上記抗体ＮＢ４４−３Ｃ１を含む、イムノアッセイを実施するための試験キットをさらに含む。

このアッセイキットは、競合形式で抗体を使用するイムノアッセイ（ＥＬＩＳＡまたはＲＩＡであり得る）の実施のために好ましい。

特に、抗体に対して反応性でありかつ競合剤として機能するペプチドは、固体表面に結合されてもよく、例えば、ビオチンにコンジュゲートされ、ストレプトアビジン被覆されたマルチウェルプレートに結合されてもよい。

代替的形式において、抗体が固体表面に結合されてもよく、例えば、ビオチンにコンジュゲートされてもよく、ストレプトアビジン被覆されたマルチウェルプレートに結合されてもよい。

本発明は、添付の図面を参照して、以下の実施例によってさらに説明および例示される。

パネルＡ〜Ｆにおいて、ＯＡ軟骨中のＣＩＩＭ断片の局在を示す、ヒト軟骨の免疫染色を示す写真である。 ヒト血清中のＣＩＩＭ断片を測定する実施例４で得られた結果を示すグラフである。 ＫＬスコアと相関するＣＩＩＭ反応性の血清レベルを示すグラフである（実施例５）。 種々のペプチドに対する、本発明の抗体の反応性の比較を示すグラフ図である。

＜抗体ＮＢ４４−３Ｃ１の開発＞
免疫原性ペプチド
を、標準的な操作手順に従って、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）にコンジュゲートした。簡潔に述べると、５ｍｇ／ｍｌのシステイン含有ペプチドＣ−ＧＧＧＲＤＧＡＡＧおよびマレイミド活性化ＫＬＨを、コンジュゲート緩衝液中で混合し、室温で２時間インキュベートした。コンジュゲートした抗原を脱塩および透析によって精製し、ＥＤＴＡおよびアジ化ナトリウムを除去した。

６匹の８週齢Ｂａｌｂ／Ｃマウスを、等体積のフロイント不完全アジュバントおよび免疫原ＫＬＨ−Ｃ−ＧＧＧＲＤＧＡＡＧを含有するエマルジョン２００μＬで皮下免疫した。フロイント不完全アジュバントでの連続免疫は、３回の免疫については２週間毎に、その後は４週間毎に、マウス１匹当たり３０μｇの免疫原を用いて行った。２回目の免疫以降、マウスから採血した。各採血時に、血清力価を、ビオチン化した選択ペプチド（Ｂｉｏｔｉｎ−ＫＰＰＧＲＤＧＡＡＧ）または除外ペプチド（Ｂｉｏｔｉｎ−ＫＰＰＧＲＤＧＡＡＧＶ）で被覆したストレプトアビジンプレートで、選択ペプチド（ＰＰＧＲＤＧＡＡＧ）、除外ペプチド（ＰＰＧＲＤＧＡＡＧＶ）、およびネイティブ材料の自家製サンプルアレイ（データ示さず）に対して検出した。最も高い血清力価および良好なネイティブ反応性を有する２匹のマウスを、融合のために選択した。選択したマウスを１ヶ月間休息させ、その後１００μＬの０．９％塩化ナトリウム溶液中５０μｇの免疫原で静脈内追加免疫した。３日後、マウスを屠殺し、脾臓細胞を単離した。融合（ハイブリドーマ）を、標準手順に従って、ＳＰ２／０細胞（ＬＧＣ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ＡＢ、Ｂｏｒａｓ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて行った。

ハイブリドーマを、半固体培地法を使用して、３５ｍｍの細胞培養ペトリ皿中でクローニングした。皿から個々にピックアップした異なるハイブリドーマを、９６ウェルプレートのウェルに移し、ここで、細胞を限界希釈によってクローニングした。クローンをＥＬＩＳＡでスクリーニングした。簡潔に述べると、１０ｎｇ／ｍｌのビオチン標識した選択ペプチドおよび除外ペプチドを、１０ｍＭのＰＢＳ−ＢＴＢ（ＢＳＡ、Ｔｗｅｅｎ−２０およびブロニドックスを含む１０ｍＭのＰＢＳ）中で、ストレプトアビジンプレート上に２０℃で３０分間被覆した。標準的な洗浄緩衝液で５回洗浄した後、２０μｌの試験材料（即ち、置換ペプチドまたは天然材料）を、適切なウェルに添加した。洗浄せずに、１：１００で開始した２倍希釈のクローン上清１００μｌを添加し、２０℃で２時間インキュベートした。次いで、ウェルを洗浄し、マウスＩｇＧに対するペルオキシダーゼ標識二次抗体を添加し［１：３０００］（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｅｕｒｏｐｅ Ｌｔｄ、ＵＫ）、２０℃で１時間インキュベートした。洗浄後、１００μｌのテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ（３，３’，５，５”−テトラメチルベンジジン）、Ｋｅｍ−Ｅｎ−Ｔｅｃ、Ｒｏｅｄｏｖｒｅ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を添加し、その１５分後に１００μｌの停止溶液（０．１８Ｍ硫酸）を添加した。比色アッセイを、６０５ｎｍを参照として用いて、４５０ｎｍで測定した。選択ペプチドを使用して、標的配列に対する抗体の結合を確認し、一方で除外ペプチドを使用して、標的配列を保有していない断片に対する抗体の任意の反応性を決定した。次いで、選択されたクローンを２回サブクローニングし、製造業者の使用説明書に従ってＰｒｏｔｅｉｎ−Ｇカラムを使用してモノクローナル抗体を精製した。

２回のサブクローニングによって、細胞株ＮＢ４４−３Ｃ１は、選択ペプチドおよび除外ペプチドを使用した所望の反応性プロフィールと、ヒトの血清、血漿および滑液中の断片に対する強い反応性とを有することが繰り返し実証され、最終的に、高度な生存能および抗体産生能を有した。

＜競合ＣＩＩＭ ＥＬＩＳＡの実施＞
ＣＩＩＭ競合ＥＬＩＳＡ手順は以下のとおりであった：９６ウェルのストレプトアビジン被覆プレートを、４ｎｇ／ｍｌの
で、２０℃、３００ｒｐｍで３０分間被覆した。次いで、ウェルを標準的な洗浄緩衝液で５回洗浄した。標準試料の列を、１０ｍＭのＰＢＳ−ＢＴＢでの特異的ペプチド
の事前希釈［２．５倍］によって準備した。サンプル（即ち、ペプチド、ヒトの血清、血漿または滑液）を同様に希釈した。標準試料およびサンプルを添加し［２０μｌ／ウェル］、その後、２０ｎｇ／ｍｌのペルオキシダーゼ標識したＮＢ４４−３Ｃ１抗体を１００μｌ／ウェル添加した。次いで、ウェルに覆いをし、４℃、３００ｒｐｍで一晩（１８±１時間）インキュベートした。次いで、ウェルを５回洗浄し、１００μｌのＴＭＢと共に２０℃、３００ｒｐｍで１５分間インキュベートし、その後、各ウェル中１００μｌ／ウェルの停止溶液１００μｌを添加した。比色反応を、標準的な実験室プレートリーダーで、６５０ｎｍの参照を用いて、４５０ｎｍで測定した。データは、ＳｏｆｔＭａｘ Ｐｒｏ ｖ５．０プログラムで取得した。

ＣＩＩＭ ＥＬＩＳＡにより、良好な技術的性能が示された；０．２〜１４．９ｎｇ／ｍｌの定量範囲、＜１５％のアッセイ間およびアッセイ内変動、およびほぼ１００％の希釈回復（ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｒｅｃｏｖｅｒｙ）。

＜ヒトＯＡ軟骨におけるＣＩＩＭ断片の免疫局在＞
ヒトＯＡ軟骨におけるＣＩＩＭ断片の免疫局在を、異なる部位の関節軟骨でＮＢ４４−３Ｃ１モノクローナル抗体を使用して調査した。結果を図１および以下に示す。
（Ａ）陰性対照、上部領域から軟骨下骨まで、免疫原と予めインキュベートしたＮＢ４４−３Ｃ１（倍率１３．２×）。
（Ｂ）概観写真、上部領域から軟骨下骨までのＮＢ４４−３Ｃ１染色（倍率１３．２×）。
（Ｃ）領域表面が変則的な関節軟骨の上部領域（倍率３３×）。
（Ｄ）表面にびらんおよび線維化（ｆｉｂｒｉｌｌａｔｉｏｎ）のある上部領域（倍率３３×）。
（Ｅ）深い亀裂損傷のある中間領域（倍率３３×）。
（Ｆ）深部領域、石灰化した軟骨および軟骨下骨（倍率３３×）。

図１Ｂでは、ＮＢ４４−３Ｃ１による強い染色（単色で赤色〜暗色）が、組織切片の上部領域（軟骨表面近傍）および下部区画（軟骨下骨近傍）で観察される。図１Ｃは、より高倍率での上部領域での強い染色を実証している。図１Ｄおよび図１Ｅでは、強い染色が、上部領域および特に軟骨損傷の領域において観察される。最後に、図１Ｆは、軟骨下骨に対して近位の石灰化した軟骨中のＮＢ４４−３Ｃ１による強い染色を実証している。

このように、ＣＩＩＭは、ＯＡ軟骨における典型的な関節炎の特徴に免疫局在していることが示された。

＜関節リウマチ患者から得た血清サンプルにおける反応性ＩＩ型コラーゲン断片の測定＞
実施例２に記載したモノクローナル抗体ＮＢ４４−３Ｃ１を用いた競合ＣＩＩＭ ＥＬＩＳＡを使用して、ＣＩＩＭを血清中で測定した。結果を図２に示す。血清サンプルは、抗炎症治療（実線）またはプラセボ（破線）による治療の前および４週間後に、関節リウマチ患者から得た。ＣＩＩＭ競合ＥＬＩＳＡによるＣＩＩＭ断片の分析まで、サンプルを−２０℃で保存した。４週間目に、プラセボ群と治療群との間の差異は、非常に有意であった（ｐ＜０．０５）。

＜血清ＣＩＩＭレベルとＯＡ重篤度スコアとの相関＞
より広いＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ地域の、２１歳以上の合計１５９人の成人被験者を、以前に記載したように、ＣＣＢＲ調査に参加するよう勧誘した。この集団は、症状なしから一方または両方の膝の自己申告の疼痛までの範囲の、種々の程度のＯＡ症状を有した。炎症性関節炎、磁気共鳴画像化（ＭＲＩ）検査に対する何らかの禁忌、または以前の膝関節置換術がある被験者は、本調査から排除した。両方の膝のデジタルＸ線写真を、Ｓｙｎａｒｃ製のＳｙｎａＦｌｅｘを使用して、全ての被験者から後側−前側の位置で同時に取得した。Ｋｅｌｌｇｒｅｎ−Ｌａｗｒｅｎｃｅ（ＫＬ）指数を、それぞれ外側および内側の脛−大腿部関節について決定した。スコア０は膝ＯＡの徴候がほとんど無いかまたは全く無いことを示し、最大スコア４は、進行性の膝ＯＡを示す。被験者の膝の悪化のスコアを使用して、被験者を３つの下位群に分けた：ＯＡなし（ＫＬ ０）、中等度のＯＡ（ＫＬ １〜２）および重度のＯＡ（３〜４）。１５６人の被験者の血清サンプルを、−８０℃の保存から解凍し、ＣＩＩＭレベルを測定した。他の３人の被験者の血清サンプルは、バイオバンクから欠落しているか空かのいずれかであった。本調査は、Ｈｅｌｓｉｎｋｉ Ｄｅｃｌａｒａｔｉｏｎ ＩＩおよびＥｕｒｏｐｅａｎ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ｆｏｒ Ｇｏｏｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅに従って実施した。プロトコルは、Ｄａｎｉｓｈ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓにより承認された（承認番号ＫＡ ２００６−００５４、Ｄａｎｉｓｈ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｉｏｒ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ）。全ての参加者は、承認されたインフォームドコンセントの用紙にサインした。

ＣＩＩＭを、上記全ての血清サンプルで測定した。女性（０．７７８ｎｇ／ｍｌ［ＣＩ９５％；０．６９３〜０．９０７］、ｎ＝７５）と男性（０．８５９ｎｇ／ｍｌ［ＣＩ９５％；０．７５７〜０．９３９］、ｎ＝８１）との間に、血清ＣＩＩＭレベルの有意な（ｐ＝０．３２３）差異は存在しなかった。被験者を、膝ＯＡの程度に応じて、３つの群に下位分割した；ＯＡなし、中等度のＯＡおよび重度のＯＡ。「ＯＡなし」群は有意に若く、いずれのＯＡ群よりも有意に低いＢＭＩを有していた。中等度のＯＡ群と重度のＯＡ群との間には、年齢およびＢＭＩには有意な差異は存在しなかった。平均血清ＣＩＩＭは、ＯＡなしの個体（０．７１２ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝７５）と比較すると、中等度のＯＡを有する個体（０．８９５ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝６２）および重度のＯＡを有する個体（１．０３９ｎｇ／ｍｌ、ｎ＝１９）において、有意に高かった（図３）。中等度のＯＡを有する個体と重度のＯＡを有する個体との間に有意な差異は存在しなかったが、重度のＯＡを有する個体では、血清ＣＩＩＭレベルが上昇する傾向があった。

＜滑液中のＣＩＩＭレベル＞
ＣＩＩＭ ＥＬＩＳＡを使用して、滑液中のＩＩ型コラーゲン断片を検出した。５１人のＯＡ患者由来の滑液中で測定されたＣＩＩＭの平均レベルは０．８５０ｎｇ／ｍｌであり、０．１４７から４．１３ｎｇ／ｍｌの範囲であった。

＜モノクローナル抗体と種々の被分析物との反応性＞
モノクローナル抗体３Ｃ１を、同じ免疫原（即ち、ＫＬＨ−Ｃ−ＧＧＧＲＤＧＡＡＧ）に対して生じた他の５種のモノクローナル抗体と比較した。全てが標的配列（即ち、ＰＰＧＲＤＡＡＧ）と反応性であったが、ＭＡｂ ３Ｃ１が、ヒト体液中に存在する被分析物に対する最良の相対的結合特性を提供した。特に、良好な反応性は、ヒト尿およびヒト血清中の被分析物に対して検出された。

本明細書では、明示的にそうでないことが示されない限り、単語「または（ｏｒ）」は、条件の一方のみが満たされることを要求する演算子「排他的なまたは（ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｏｒ）」とは異なり、提示された条件のいずれかまたは両方が満たされた場合に真の値を返す演算子の意味で使用される。単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」を意味するのではなく、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の意味で使用される。上で認識された全ての先行する教示は、本明細書により参照として組み込まれる。本明細書中の任意の先行の公開文書についての認識は、本明細書の日付においてオーストラリアまたは他の場所でその教示が共通の一般知識であったという容認または表明であると解釈すべきではない。

Claims (9)

1. 血清、血漿または滑液中のＩＩ型コラーゲン断片のアッセイ方法であって、アミノ酸配列ＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧ中に存在するＣ末端エピトープとの特異的反応性を有し、かつ、アミノ酸配列ＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧＶを含むアミノ酸配列との特異的反応性を欠く抗体または免疫反応性抗体断片と反応性である、血清、血漿または滑液サンプル中のタンパク質断片の濃度の定量的測定を得るステップを含む、方法。
2. アミノ酸配列ＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧ中に存在するＣ末端エピトープとの特異的反応性を有し、かつ、アミノ酸配列ＧＰＰＧＲＤＧＡＡＧＶを含むアミノ酸配列との特異的反応性を欠く前記抗体または免疫反応性抗体断片と反応性であるタンパク質断片のサブセットが、前記測定から排除されない、請求項１に記載の方法。
3. 前記血清サンプル中に存在するタンパク質断片を前記抗体または免疫反応性抗体断片と接触させるステップと、前記抗体または免疫反応性抗体断片への前記断片の結合量を測定するステップとを含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 前記抗体または免疫反応性抗体断片を、前記タンパク質断片と、前記抗体または免疫反応性抗体断片が特異的結合親和性を有する競合剤との両方に接触させる、請求項３に記載の方法。
5. 前記抗体が、ＨＰＡ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｌｏｇｉｓｔｉｃｓ Ｏｆｆｉｃｅ、Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ、Ｃｅｎｔｒｅ Ｆｏｒ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ ａｎｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＳＰ４ ０ＪＧ、ＵＫに受託番号１００９１４０２として寄託されているＮＢ４４−３Ｃ１である、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
6. ＨＰＡ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｌｏｇｉｓｔｉｃｓ Ｏｆｆｉｃｅ、Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ Ａｇｅｎｃｙ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ、Ｃｅｎｔｒｅ Ｆｏｒ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｙ Ｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ ａｎｄ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ、Ｐｏｒｔｏｎ Ｄｏｗｎ、Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ、ＳＰ４ ０ＪＧ、ＵＫに受託番号１００９１４０２として寄託されている細胞株により産生される、抗体ＮＢ４４−３Ｃ１。
7. 検出可能な標識で標識された、請求項６に記載の抗体。
8. 前記標識がペルオキシダーゼ酵素標識である、請求項７に記載の抗体。
9. 較正曲線を生成するための標準試料、前記抗体に対して免疫学的に反応性のペプチド、発色反応に関与可能な発色性基質、発色反応の停止溶液、またはマルチウェルアッセイプレートのうちの１つまたは複数と一緒に、請求項６から８のいずれか一項に記載の抗体ＮＢ４４−３Ｃ１を含む、イムノアッセイを実施するための試験キット。