JP4688392B2 - 異性化及び／又は光学的反転したタンパク質及びタンパク質断片の測定法 - Google Patents
異性化及び／又は光学的反転したタンパク質及びタンパク質断片の測定法 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、体液などの生物学的試料中における非コラーゲン軟骨タンパク質及び素の断片のイムノアッセイに係わる。
かかるタンパク質及びタンパク質断片は、関節疾患のインデックスとして役立つ。
【０００２】
【従来の技術】
リューマチ性関節炎（ＲＡ）は、工業国及び開発途上国の如何を問わずその人口のほぼ１％が罹患する、重篤な慢性の且つ進行性の疾患である(Harris 1993)。ＲＡの病因には環境、遺伝及び成長にかかわる要因が関与しているのであるが、現在はＲＡは自己免疫疾患であることが広く受け入れられている。骨関節炎（ＯＡ）は、工業国の人口の８％以上が罹患している慢性疾患であり、この疾病はまた、種々の関節部の関節軟骨を侵し、ある免疫成分がこの疾病の病態病理学の一部として観察されているものの、ＯＡは、自己免疫疾患とは見なされていない。
【０００３】
ＲＡ及びＯＡの主要な臨床症状は、軟骨の異常と分解である。しかしながら、関節炎患者で進行する軟骨分解を直接的に評価することは、かかるプロセスの特異的マーカーが臨床の実際において利用不能であったため今までは困難であった(Moeller 1998)。ＲＡの臨床診断においては、患者は、痛みなどの疾病症状及び機能障害並びに関節破壊により惹起される移動性に関連した諸問題に応じて点数表示により評価されている。多くの標準化評価システムが導入されてきたものの、かかるパラメータを定量化することは困難である(Stucki et al. 1997)。ＲＡ患者の評価を行うために使用されるその他のマーカー、例えばＣ−反応性タンパク質やリューマチ因子などは、本疾患に関与する炎症プロセスに対しては特異的であるが、軟骨破壊の程度に直接的に関連するわけではなく、ＲＡに特異的であるわけではない(Wollheim 1996)。目下のところ、関節炎患者の種々の（個別の）関節の状態に関する情報を取得するための最善の方法の一つは、放射線医学的検査である。
【０００４】
例えばこの疾病に罹患した関節の破壊に起因するヒアルロン酸塩類やアグリカン断片などの代謝物を測定したことが報告されている(Moeller 1998, Wollheim 1996)。しかしながら、これらのマーカーが持つ臨床上の有用性は、まだ証明されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、軟骨破壊の種々のマーカーを同定し且つ関節疾患をモニターする、診断及び予後に関連したアッセイ法を開発するための新しいアプローチに基くものである。本発明者らは、関節軟骨の特異的な成分は、異性化及び／又は光学的反転を受け易いことを証明し（図１）、またいくつかの軟骨タンパク質において特異的な異性化及び／又は光学的反転を受け易い部位を同定したのである。本発明者らはまた、異性化及び／又は光学的反転した軟骨タンパク質の断片は、循環していること及びかかる断片の測定が関節軟骨破壊の指標となることを証明したのである。
【０００６】
アスパラギン酸及びアスパラギン（Ａｓｘ）並びにグルタミン酸及びグルタミン（Ｇｌｘ）残基は、いくつかの影響を受け易いタンパク質においては自発的転移を受けて、ＡｓｘとＧｌｘとの間の通常のペプチド結合が、直鎖のα―カルボキシル基から側鎖のβ―カルボキシル基（Ｇｌｘ残基の場合についてはγ―カルボキシル基）に転移されるのである(Clarke 1987)。この異性化反応は、イミド中間体を経由して進行するが、このイミド中間体は、自発的な加水分解を受けると異化の四つの型のうちの一つになる：すなわち、アスパラギン酸―グリシンについて下記する反応式において該述するように、通常存在するαＬ、イソ型であるβＬ，又は二種類の光学的反転した型であるαＤとβＤである（この反応は、他の反応を受け易いＡｓｘとＧｌｘを含む配列についても同様に生起する）：
【０００７】
【式１】
【０００８】
このペプチド主鎖の窒素が隣接するアスパルチル（アスパラギン酸）残基の側鎖カルボニル基を攻撃する結果、イミド環が形成される可能性がある（Ａ→Ｂ）。このイミド環は、加水分解及び光学的反転を受けて、Ｄ及びＬ構造のペプチドとイソペプチドを生成し易いのである。光学的反転は、直接プロトン引き抜き（ＡＤＧ又はＣＦＩ）によるか又はイミド経路（ＢＥＨ）を経由してカルバニオン中間体（Ｄ，Ｅ及びＦ）を経て進行する。上記式においては、ペプチド主鎖は、太線で示してある。
しかしながら、環状イミド形成（及び異性化／光学的反転）が生起するためには、当該ＡｓｘとＧｌｘ残基を取り囲む三次元構造は、最適のコンフォーメンションと充分な柔軟性を有していなければならない（Geiger and Clarke 1987）。
【０００９】
多くの研究の結果、ペプチド及びタンパク質の内部におけるＡｓｘ残基の光学的反転は、イミド経路を経由して主として進行することが明らかになっている（ＢＥＨ）（Geiger and Clarke 1987, Radkiewics et al. 1996）。しかしながら、例えば直接プロトン引き抜き又はイミノーδ―ラクトン形成など他の経路もまた光学的反転に寄与している可能性がある（Radkiewics et al., 1996）。しかしながら、これらの経路は、重要性は低いと想定される（Geiger and Clarke 1987, Radkiewics et al. 1996）。
【００１０】
上記にて該述したようにイミド中間体を経由した異性化及び光学的反転は、生理学的条件下においては遅い速度で生起する自発的反応である（Geiger and Clarke 1987, Felius et al. 1997）。すべての化学反応について、反応速度は、温度の上昇によって加速させることが出来る。
【００１１】
タンパク質又はペプチド内においてかかる構造的変化を導入することは、機能、安定性や物理的・化学的特性に深甚な影響を与える。中でも、異性化ペプチド結合及び／又は光学的反転アミノ酸を含有したタンパク質やペプチドのタンパク分解酵素による分解は、αＬアミノ酸からのみ構成されたタンパク質やペプチドと比較して有意に低減する(Rafferty et al., 1988)。即ち、このような変成を含むタンパク質断片は、通常の組織代謝変動・回転の過程において同一程度の分解されず(Van Regenmortel & Mueller 1998)、むしろ測定可能な濃度で循環する可能性がはるかに高い。更には、異性化及び／又は光学的反転したペプチド結合を含むペプチド又はタンパク質断片を測定しても、新たに合成された分子がかかる測定値には寄与することはなく、従って進行する分解プロセスを反映しないであろう。
【００１２】
ＷＯ／９６／３０７６５において、本発明者らは、Ｉ型コラーゲンの異性化した断片は、骨吸収の優れた指標を与えることを開示した。更には、ＩＩ型コラーゲン（軟骨中に認められる）も潜在的な異性化部位を含むことも開示した。
【００１３】
本発明者らは、関節軟骨は、代謝速度が極めて遅い組織の一つであって、異性化及び光学的反転を受ける非コラーゲン性タンパク質を含有していることを証明し、またかかるタンパク質又はその断片の測定値は、例えばＲＡやＯＡなどの関節疾患を評価し且つモニターするための診断上の可能性を有する関節軟骨分解の指標となることを証明した。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、例えば体液や組織試料などの生物学的試料中において、異性化したか又は光学的反転した、軟骨に由来する非コラーゲンタンパク質又はかかるタンパク質に由来する異性化した又は光学的に反転した断片の一種以上の量を測定することから成る測定法を提供するものである。
【００１５】
特定の興味に対象となるタンパク質としては、アグリカン（aggrecan）及び軟骨結合タンパク質が含まれる。
【００１６】
アグリカンは、関節性軟骨の主要な構造的成分の一つであり、関節疾患を評価するためのバイオマーカーとしての潜在的可能性並びにＲＡ及び当該疾患の動物モデルにおける自己抗原としての推定上の役割についてこれまでに研究されてきた（Poole & Dieppe 1994, Glant et al. 1998）。
【００１７】
このタンパク質は、２０００以上のアミノ酸残基から成る高度に糖化された巨大タンパク質である。アグリカンは、構造的に三つの異なる領域に分けられる：即ち、Ｇ１，Ｇ２及びＧ３である。Ｇ１領域は、通常はアグリカンにおける一次免疫原性領域と証明されている（Glant et al. 1998）。球状領域は、ヒアルロン酸ポリマーへのリンカーとして機能し、また軟骨結合タンパク質（ＣＬＰ）と接触している。関節炎の動物モデルにおける免疫システムの標的として同定されまたかかるＧ１領域におけるアグリカナーゼ(aggrecanase)即ちストロメリシン(stromelysin)の特異的開裂部位として同定された特性的エピトープは、次のようである：即ち、．．Ｎ(368)ＩＴＥＧＥ（Ｎ−結合糖化のためのコンセンサス配列を含む）；374ＡＲＧＳＶＩ．．；．．ＶＤＩＰＥＮ341（Dudhia et al. 1996）である。更には、アグリカン内におけるアスパラギン酸はラセミ化を受け易いことが既に報告されている（Maroudas et al. 1998）。
【００１８】
本発明者らは、アグリカンのＧ１領域に由来したエピトープＧＲＶＲＶＮＳＡＹ内におけるアスパラギン酸残基を、異性化／光学的反転を受け易い部位として同定したのである。下記する実施例において、本発明者らは、ＲＡをモニターする上で異性化及び／又は光学的反転したＡＧ１−１の測定値が有する臨床上の価値を明示する実験データ及び臨床データを提示することとする。
【００１９】
軟骨結合タンパク質（ＣＬＰ）は、ヒアルロナン（hyaluronan）及びアグリカンと関連性を有し、アグリカンをヒアルロナンに強固にアンカー固定するうえで重要な役割を恐らくは果たしているのであろう。この分子は、アグリカンのＧ１領域に結合し、またこのタンパク質と構造上いくつか類似性を有する(Poole & Dieppe 1994)。軟骨結合タンパク質は、軟骨破壊の潜在的なマーカーとしてはほとんど注目を受けたことはなかったのであるが、かかる軟骨タンパク質に対する自己抗原性が、かかる疾病の動物モデルにおいてＲＡを誘発することが明らかにされている（Zhang et al. 1998）。しかしながら、当該タンパク質は、アグリカンがこの結合タンパク質（及びＧ１領域）に接触するに十分な程度に分解された場合に生起する遅発性破壊の良好なマーカーとなる可能性がある。この結合タンパク質はまた、げっ歯類において自己免疫性関節炎を誘発する能力を有しており、また免疫優性エピトープは、ヒアルロナン結合のための推定上のコンセンサス配列を含んでいる、当該タンパク質のＮ末端及びアグリカンが共有する二つの領域（及び例えばニューロカン（neurocan）やブレビカン（brevican）などの中枢神経系（ＣＮＳ）のヒアルロナン）に局在されている。これらの配列のうちから一つの配列を選択して、本明細書における例証を行うために使用している。潜在的な異性化部位には、下線を付してある。アグリカンのＧ２領域からのアミノ酸差異（保存的置換）は、太字で示してある：即ち
【００２０】
ＡＧＷＬＡＤＧＳＶＲＹＰＩ
【００２１】
軟骨のオリゴマー状マトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）は、非コラーゲン性のグリコプロテインである（Neidhart et al. 1997）。その生理学的役割は、明確ではない。ＣＯＭＰ濃度が高くなることは、初期ＱＡ及び関節破壊が初期には急速に進行するが、その後は緩徐となるＲＡ患者において既に認められている。
【００２２】
軟骨の中間層タンパク質（ＣＩＬＰ）は、Ｎ−結合オリゴサッカロイドを含む、分子量が９１．５ｋＤａである単一ポリペプチド鎖から成る非コラーゲン性軟骨タンパク質である（Lorenzo et al. 1998a and 1998b）。
このタンパク質は、軟骨細胞によって合成され、領域間軟骨に局在している。間接性軟骨の表面領域にもまた最深領域にも認められていない。ＣＩＬＰは、加齢と共に増加すると報告されており、初期ＱＡのマーカーであると示唆されている。
【００２３】
【発明の実施の形態】
好ましくは、本発明の方法は、当該生物学的試料中の*Ａｓｘ又は*Ｇｌｘを含む少なくとも一種のタンパク質又はタンパク質断片の量を測定するものであって、*Ａｓｘは、αＤ Ａｓｐ若しくはＡｓｎであり又はβＬ若しくはβＤ Ａｓｐであり、また*Ｇｌｘは、αＤ Ｇｌｕ若しくはＧｌｎ又はγＬ若しくはγＤ Ｇｌｕである。
【００２４】
好ましくは、天然のタンパク質においてはＡｓｘ／Ｇｌｘに隣接してグリシン又はセリンが存在する。その理由は、異性化又は光学的反転を容易にするからである。
【００２５】
前記タンパク質は、好ましくはアグリカン、ＣＬＰ，ＣＯＭＰ，又はＣＩＬＰであり、又前記断片は、アグリカン、ＣＬＰ，ＣＯＭＰ又はＣＩＬＰの断片である。
【００２６】
好ましくは、本方法は、下記するアグリカン誘導アミノ酸配列：
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−*Ａｓｘ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒを含む、少なくとも一種のタンパク質又はタンパク質断片の量、又は下記するアグリカン誘導アミノ酸配列：
Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−*Ａｓｘ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐを含む、少なくとも一種のタンパク質又はタンパク質断片の量、又は下記するＣＬＰ誘導アミノ酸配列：
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇを含む、少なくとも一種のタンパク質又はタンパク質断片の量、を測定するものである。
【００２７】
前記測定法は好ましくは、非コラーゲン性軟骨タンパク質のアミノ酸残基により囲繞される*Ａｓｘ又は*Ｇｌｘを含んで成るアミノ酸配列に特異的に結合する免疫学的結合パートナーを用いて実施される。この免疫学的結合パートナーは、*Ａｓｘ又は*Ｇｌｘを含む配列とαＬ Ａｓｘ又はαＬ Ｇｌｘを含む相当する配列とを有用な測定法となる程十分な程度に判別するべきものである。測定法／抗体が当該抗体／エピトープの相当するαＬ型に対して有する交差反応性が２５％以下、好ましくは５％以下である。
【００２８】
好適には、かかる免疫学的結合パートナーは、非コラーゲン性軟骨タンパク質のアミノ酸残基により囲繞される*Ａｓｘ又は*Ｇｌｘを含んで成るアミノ酸配列を有する合成ペプチドに対して産生された抗体、又は前記ペプチドに対して免疫学的結合特異性を示す、かかる抗体の断片である。
【００２９】
従って、かかるペプチドのアミノ酸配列は、前記タンパク質においてαＬ Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ又はＧｌｕの代わりに*Ａｓｘ又は*Ｇｌｘとした、前記タンパク質の特性的配列、即ち当該タンパク質に本質的に一意的な配列に相当するものである。好適には、該ペプチドは、長さが６乃至５０のアミノ酸であり、例えば長さが６から１５のアミノ酸である。
【００３０】
該測定値は、関節疾患の指標とするべく使用することが出来る。これによって、当初の診断若しくは重篤度の判定又は治療処置の効果をモニターするための一助とすることが出来る。
【００３１】
本発明は、上記した方法において、更に関節疾患の第二の指標となる測定を行い、ついで前記に主の指標を数学的に合算したパラメータの数値を決定することから成る方法を包含するのである。この第二の指標もまた、本発明に従った方法によって誘導させることが出来る。
【００３２】
本発明は軟骨由来の、異性化又は光学的反転した非コラーゲン性軟骨タンパク質又はかかるタンパク質から誘導された異性化又は光学的反転した断片の一種以上を測定法に使用する用途・方法を包含するのである。本発明はまた、非コラーゲン性軟骨タンパク質のアミノ酸残基により囲繞される*Ａｓｘ又は*Ｇｌｘを含んで成るアミノ酸配列に結合する免疫学的結合パートナーをＯＡ又はＲＡを診断するか又はその重篤度を判定するためのインビトロの方法に使用する用途・方法をも包含するのである。
【００３３】
本発明は更には、非コラーゲン性軟骨タンパク質のアミノ酸残基により囲繞される*Ａｓｘ又は*Ｇｌｘを含んで成るアミノ酸配列に特異的に結合する免疫学的結合パートナーを提供するのである。本発明は更には、かかる免疫学的結合パートナーであるモノクローナル抗体を産生する細胞系をも包含する。
【００３４】
非コラーゲン性タンパク質のアミノ酸残基により囲繞される*Ａｓｘ又は*Ｇｌｘを含むペプチドであって、長さが好ましくは５０までのアミノ酸残基、更に好ましくは２０まで、例えば６乃至５０又は更に好ましくは６乃至１５のアミノ酸から成るペプチド、及びかかるペプチドをタンパク質又はｔｐ断片の測定法に使用する用途・方法を提供するものである。
【００３５】
本発明は、イムノアッセイの方法であって、生物学的試料を免疫学的結合剤への結合競争剤として機能する、かかるペプチドの存在下に於いて免疫学的結合剤と接触させる前記方法を提供するものである。
【００３６】
本発明は、（ａ）上記した免疫学的結合パートナー又は（ｂ）上記したペプチド、（ａ）又は（ｂ）の一方と、好ましくはイムノアッセイを実行する一つ以上の装置と組み合わせて、抗体―酵素複合体、抗体―酵素接合体の酵素成分の基質、酵素―基質反応停止組成物、洗浄液、前記結合パートナーに結合させた担体又は前記結合パートナーに結合させた検出可能な標識とを含んで成る試験キットを包含する。
【００３７】
本発明は、酵素―イムノアッセイに限定されることはなく、当該技術分野で公知であるイムノアッセイ方法の如何なるものをも包含する。
かかる免疫学的結合パートナーは、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であればよい。
【００３８】
適当な免疫学的結合パートナーはまた、Ｆａｂ，Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）2を含む同一の抗原性決定基に結合する能力を有する抗体の断片をも含む。
【００３９】
本測定法は、ＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ又はＩＲＭＡを含む多くの形態を取り得るのであって、これらの方法についてはあまりにも公知であり、本命最初において記述することを必要としない。本測定法は、均質形式又は異質方式であってもよい。
【００４０】
競争測定法においては、上記したペプチドを免疫学的結合パートナーを対象として、試料中に存在する一種以上の異性化又は光学的反転したタンパク質又はペプチドと競争させるのに使用すればよい。この形式のＥＬＩＳＡにおいては、異性化又は光学的反転したペプチドを固体支持体に固定すればよい。固体支持体に接触した合成ペプチドと反応性を示すモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体と共に試料を培養し、洗浄後、パーオキシダーゼ接合（顕示）抗体を添加すればよい。更に培養した後、パーオキシダーゼ基質溶液を添加する。競争により、当該抗体と反応性を示す、試料中に存在する異性化又は光学的反転したタンパク質又はペプチドは、パーオキシダーゼ反応を阻害する。
【００４１】
又はその代わりに、かかる合成ペプチドを使用して、モノクローナル免疫学的結合パートナーを産生させてもよい。そうした場合は、かかる合成ペプチドは、本測定法においては競争剤とする必要はなくなる。例えば、酵素により部員会した軟骨断片は（例えばアグリカンなど）精製し、前記支持体に固定化し、ＥＬＩＳＡをモノクローナル抗体を用いて実行すればよい。
【００４２】
本発明は、ヒト及び動物の双方に適用することが可能である。
【００４３】
適当な体液としては、ヒト又は動物の尿、血液、血清、血漿や滑液がある。本方法はまた、例えば唾液や汗についても使用可能であることが意図される。かかる体液は、そのまま使用してもよく、また接触工程の前に精製してもよい。このような精製工程は、以下に限定されないが、カートリッジ吸着と溶出、分子篩クロマトグラフィー、透析、イオン交換、アルミナクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーやこれらの組み合わせなど多数の標準手法を用いて行えばよい。
【００４４】
異性化及び／又は光学的反転したアミノ酸を含む合成ペプチドの製造は、当該技術分野において公知である方法に従って、例えば一般に“Ｍｅｒｉｆｉｅｌｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”と称される固相ペプチド合成によって実施することが出来る。従来公知のペプチド合成方法によれば、種々のペプチドのアイソフォーム（αL,βL, αD,βD、γL,γD）の混合物が生成される。一般的にこのような混合物は、通常のペプチドが本測定法において不活性であるように、満足すべきものであろう。しかしながら、αL型の純粋な生成物を加熱することによって、異性化し、光学的反転したアイソフォームが生成する。
【００４５】
モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の産生させる方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ １９８６を参照のこと。合成の異性化及び／又は光学的反転したペプチドに対する抗体を免疫化することによって産生させることも可能である。しかしながら、これらの化合物は分子量が比較的小さいため、ハプテンを担体分子に接合することが好ましい。適当な担体としては、いかに限定されないが、ウシ血清、アルブミン、サイログロブリン、オバルブミン、破傷風トキソイド、やキーホールリンペットヘモシアニンなどが挙げられる。好ましい担体は、ウシ血清アルブミン又はサイログロブリンである。ハプテンをその最も免疫原性の高い形態で免疫化動物の抗体産生細胞系に提示するには、多数の代替可能な結合プロトコールが使用できる。適当な手法としては、いかに限定されないが、グルタルアルデヒド、カルボジイミド及び過ヨウ素酸塩が挙げられる。好ましい結合剤は、グルタルアルデヒド及びカルボジイミドである。
【００４６】
抗体の産生は、天然の異性化及び／又は光学的反転を含むタンパク質断片又は合成ペプチドを担体に接合したものを用いて免疫化することを含む従来公知の手法によって実行すればよい。当該免疫原性を増大させるためには、免疫原を注射する前にアジュバントと混合することが好ましい。アジュバントの例としては、以下に限定されないが、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバント及び免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭｓ）が挙げられる。ＩＳＣＯＭｓは、Ｍｏｒｅｉｎ １９９４によって記載された方法に従って作成することが出来る。
【００４７】
かかるハプテン担体分子に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の何れも、産生させることが出来る。モノクローナル抗体を産生させるためには、マウスを免疫化することが好ましい。免疫化した動物の脾臓細胞を採取し、均質化し、その後ポリエチレングルコールの存在下でガン細胞と融合させ、異性化及び／又は光学的反転したペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体を産生する細胞ハイブリッドを生成させる。適当なガン細胞は、以下に限定されないが、骨髄腫、肝腫瘍、固形ガン及び肉腫などの細胞が挙げられる。モノクローナル抗体の産生に関する詳細な記述は、Ｇｏｄｉｎｇ １９８６においてなされいる。好ましい予備的スクリーニングプロトコールの一つは、合成の異性化及び／又は光学的反転したペプチドを担体に接合し、次いでμタイタープレートに塗布したものを使用することを含んで成る。
【００４８】
異性化及び／又は光学的反転したペプチド断片に対して反応性を有するポリクローナル抗体を産生させるためには、種々の動物種を免疫化することが出来る。適当な動物種としては、以下に限定されないが、ニワトリ、ウサギ及びヤギが挙げられる。 ニワトリ及びウサギが好ましい。
【００４９】
このようにして産生させた抗体は、異性化及び／又は光学的反転した、適当な配列を有する合成ペプチド断片に対する反応性に対する反応性を試験することによって本発明に従った用途・方法に適合しているか否かを検索する。
【００５０】
抗体断片は、当該技術分野において公知である方法によって産生させることができる(Ishikawa 1983)。
【００５１】
従って、上記にて産生せしめた抗体を用いたイムノアッセイを利用することによって、例えば体液などの生物学的試料を事前の分別マウス胎仔加水分解を行うことなく測定することが可能となる。かかる生物学的な液中における所望とする断片に対する特異性は、当該測定法構築において異性化及び／又は光学的反転した合成ペプチド（当該抗体を産生させる際に目標とした又は何れにしろ当該抗体が免疫化学的な反応性を示す）を使用することと組み合わせて、当該抗体によって得られる。
【００５２】
又はその代替案一つとしては、当該イムノアッセイをモノクローナル抗体を用いて実施してもよい。かかる測定法の設計は、当該アッセイの特異性を抗原（当該タンパク質の合成のペプチド異性体）から抗体へ変位させるのである（ウサギ抗血清からモノクローナル抗体へ）。かかる構築法を使用した場合、当該測定法は、最早や合成ペプチド異性体を利用する必要は無くなる。かかるイムノアッセイの変法は好適には、精製タンパク質、タンパク質断片、合成ペプチド又はその接合体で予めコート処理したマイクロタイタープレートにおいてパーオキシダーゼ接合抗体溶液と共に患者の試料又は標準溶液を培養することによって実施する。洗浄した後、プレートの壁面を基質溶液と共に暗所で培養する。発色反応を停止溶液を添加することによって停止し。最後に吸光度を測定する。又はその代わりに、一種以上の抗体をサンドイッチアッセイ法において使用してもよい。
【００５３】
かかるイムノアッセイ自体は、当該技術分野で一般に公知である種々様々な標準測定プロトコールから選択した方法であれば如何なる方法を用いても実施することが出来る。一般的に理解されているように、かかる測定法は、特異的免疫学的結合パートナーと所望の分析物との間における相互作用を利用してその特性を決定し、該分析物と免疫学的結合パートナーとにより形成された複合物を検出するための何らかの手段を利用するような構成とする。かかる免疫学的結合パートナーは、固体担体と複合化させ、分析物のための捕捉用免疫学的結合パートナーとして使用することも出来る。このプロトコールは、直接的な方式で行っても良く、その際分析物／免疫学的結合パートナー複合物を例えば蛍光、放射性又は酵素学的標識物によって検出出来るのであり、また競争的形式で行っても良く、その際は標識化した標準物が、免疫学的結合パートナーを目指して分析物と競合するのである。この方式はまた、凝集測定法として構築してもよい。即ち、当該複合物を反応混合物に適当な沈殿剤を添加することによって沈殿させればよいのである。このようなイムノアッセイプロトコールの特異的な設計は、多様な選択に供するｋとおが可能であり、当該技術分野で利用可能な臨床試験装置やプロトコールの数は、膨大である。かかるプロトコールの多様性については、ＵＳ特許第５００１２２５号を参照のこと。
【００５４】
例えば放射性同位体標識化、蛍光標識化又はＥＬＩＳＡなどの標準的検出プロトコールを直接的又は競争的形式で使用することによって医務のアッセイを実行するために使用する抗体及び顕示試薬は好都合には、当該測定法に必要な成分及び使用方法を含んで成るキットとして提供することが可能である。本発明の一つの実施態様にもおいては、かかるキットは、該当する合成の異性化及び／又は光学的反転したペプチドでコート所折下マイクロタイタープレート、標準曲線を作成するための標準溶液、試験操作の品質検査のための体液コントロール（例えば尿）上記した合成ペプチド異性体と反応性を示すウサギ抗体、パーオキシダーゼに接合した抗ウサギイムノグロブリン、基質溶液、定位し溶液、洗浄緩衝液及び取扱い説明書とを含んで成る。
【００５５】
イムノアッセイは、抗体及び特異的、異性化合成ペプチドを用いて実施するため、適当な生物学的液体中の相当するタンパク質断片配列の比率並びにそれぞれの濃度及びそれらの合計濃度を測定／決定することが出来る。即ち、かかる測定法は、抗体を数種類含めるように設計することが出来るのであって、その結果幾つかの異性化及び／又は光学的反転したペプチド類及び選択的には天然のペプチド配列の測定が可能となり、または単一の異性化及び／又は光学的反転したペプチド配列若しくはこれらの組合せの如何なる所望のものをも測定することが出来る。
【００５６】
本発明を下記する制限を付さない実施例によって、添付図面に言及して更に記載し、説明することとする。
【００５７】
実施例１：合成ＡＧ１−１ペプチド類の異性化：
ＡＧ１−１ペプチドＧＲＶＲＶＮＳＡＹを合成し、リン酸緩衝生理食塩水に１ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。このペプチド溶液を９０℃に４時間加熱して、異性化／光学的反転を促進させた。逆相ＨＰＬＣを行って、加熱前後のペプチド調製物を分析した。
【００５８】
図１は、９０℃にて４時間加熱する前（下方測定曲線）と後（上方測定曲線）における１ｍｇ／ｍｌＡＧ１−１ペプチド調製物のＲＰ−ＨＰＬＣの測定結果を示す。
【００５９】
このことから、加熱によってＲＰ−ＨＰＬＣの保持時間と共に3種類の新しいペプチド型がβＬ、αＤ及びβＤ型の順序で誘導されることが明らかとなった。
【００６０】
実施例２：アグリカンのＧ１領域に由来するエピトープのβＬ型に対して特異的なモノクローナル抗体の産生と特異性の分析
ＡＧ１−１ペプチドのＣＤＩ接合体を実質的にＨｅｒｍａｎｓｏｎ １９９６に従って調製した。手短に言えば、ＣＤＩ接合体は、以下のように調製する：即ち、１００ｍｇのサイログロビンを１０ｍｌに溶解して、０．０５Ｍ ＭＥＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ６．０中１０ｍｇ／ｍｌの濃度とする。１００μｌの下記二種の試薬を添加し（最終濃度として４ｍＭ ＣＤＩーこれは、サイログロビンに対するＣＤＩがほぼ１００倍モル過剰に相当するー及び１０ｍＭ ＮＨＳとする）、次いで得られた溶液を室温（１８−２２℃）にて１５分間放置して混合する。ＣＤＩ：０．４Ｍ ＣＤＩストック：７６．７ｍｇを１ｍｌの水に加えて使用直前に調製する。ＮＨＳ：１ＭスルフォーＮＨＳストック：２１１７．１ｍｇを１ｍｌの水に加えて使用直前に調製する。
【００６１】
過剰の架橋反応物を４本のＮＡＰ２５脱塩カラム（Pharmacia, Sweden）を用いたゲル濾過によって１０ｍＭ リン酸ナトリウム液 ｐＨ９．０中に除去し、かくして脱塩処理した活性化サイログロビンをプールして２ｍｌずつに分ける。ゲル濾過の直後に、ペプチド溶液（０．１Ｍリン酸ナトリウム液 ｐＨ９．０中４ｍｇ／ｍｌの液を２ｍｌ）をそれぞれのバイアルに添加する。コントロールの接合化を該当しないペプチドを用いて実施し、またカップリング反応を室温で２時間進行させる。
【００６２】
それぞれの接合体をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５（Pharmacia, Sweden）のカラムを用いたゲル濾過でＰＢＳに移し、濃度をＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌに調節する。
【００６３】
ウサギ（ＳＳＣ：ＣＰＨ種）を５０％フロイントインコンプリートアジュバントを含む、リン酸塩緩衝食塩水に溶かした０．２５ｍｇ／ｍｌワクチンの１ｍｌを用いて皮下免疫化する。ウサギを当初の免疫化を行った後二週間の間隔で追加抗原刺激する。三回の最初の追加刺激を行った後、引き続いて追加抗原刺激を一ヶ月の間隔で行う。免疫血液を免疫化前に採取し、また試験血液を２回目の免疫化の一週間後に採取して、血清中の抗体濃度をモニターする。その後５回目及び６回目の免疫化の一週間後に血液を採取する。
【００６４】
これらウサギの血液の特異性を１０ｎｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＢＳ3−ＡＧ１−１接合体をコートしたＭＴＰで試験する。ＢＳ3の接合は、以下のように行う：
【００６５】
ＡＧ１−１βペプチド（ＧＲＶＲＶＤ−β―ＳＡＹ）を濾過したばかりのＰＢＳに２ｍｇ／ｍｌとなるように溶解する。担体タンパク質（ＢＳＡ，ウシ血清アルブミン）をＰＢＳ中３ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、次いで２００μｌの担体タンパク質を１．５ｍｌのポリプロピレンチューブ（Eppendorf, Germany）中で２００μｌのペプチド溶液と混合する。これは、担体タンパク質に対してペプチドがほぼ５０倍モル過剰であることに対応する。ＢＳ３（Bis(sulfosuccinimidyl)suberate）ｗｏ５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０の６ｍｇ／ｍｌ溶液中で新たに調製し、５０μｌの架橋剤をこの担体とペプチド溶液に加え、これを撹拌し、室温で混合装置に放置する（これは、担体タンパク質と比較して架橋剤がほぼ２５倍モル過剰であることに対応する）。３０分間培養した後、５０μｌの０．２５ＭグリシンｐＨ７．５をこれらの溶液に添加する。培養を１５分間継続し、その後接合体をＮＡＰＳカラム（Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden）で脱塩し、タンパク質濃度を測定する。
【００６６】
ウサギ抗血清を１％ＢＳＡと０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで適当な希釈率で希釈し、適当なＥＬＩＳＡ信号を得る。このような」脅威層的測定方法方式での結合した抗体は、二次パーオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギ抗体及び発色性パーオキシダーゼ基質を用いて検出する。
【００６７】
血清測定法は、ＡＧ１−１抗血清を用いて開発した。この測定法は、１０ｎｇ／μｌ ＢＳＡ−ＢＳ３−ＡＧ１−１を塗布したプレート上で競争的測定法として実施した。２０μｌの試料又は校正用試料をウエル内にピペットで移し、次いで３００ｍＭのＴｒｉｓ；０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；１％ＢＳＡ，ｐＨ８．０（ＴＢＴ）中に適当に希釈した、１００μｌのＡＧ１−１特異抗体を添加する。プレートを２０℃において６０分間培養し、５回（ＴＢＴ）で洗浄し、次いで１００ｍＮＴｒｉｓ ｐＨ７．４、０．４ｇ／ｌの４−アミノアンチピリン、０．０１２％Ｂｒｏｎｉｄｏｘ（静菌剤）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０と２０％ウシ胎仔血清（ＫＳ緩衝液）に適当に希釈した二次パーオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギ抗血清の１００μｌを各ウエルに添加する。このプレートを２０℃において６０分間培養し、ＴＢＴで５回洗浄し、結合した抗体の量を発色性パーオキシダーゼ基質を用いて定量する。
【００６８】
図２は、ＢＳＡ−ＢＳ3−ＡＧ１−１コート処理プレート、ポリクロナ―ルＡＧ１−１特異的ウサギ抗血清及び“沸騰”処理しない又は９０℃にて４時間の過熱処理に供したＡＧ１−１ペプチド調製物を用いて行ったａｇ１−１特異的ＥＬＩＳＡにおける結合の競争を示す。ＡＧ１−１−ＥＬＩＳＡは、“沸騰処理しない“ものと比較して”沸騰処理した“ペプチドセ調製物に対して７倍も高い反応性を示す。
【００６９】
ＡＧ１−１特異的抗血清がペプチドの“沸騰処理”型に対して有する優先性は、異性化及び光学的反転した型（βｌ，αＤ又はβＤ）の一つ以上を優先的に認識することを示唆している。
【００７０】
実施例３：アグリカンのＧ１領域に由来するエピトープに対する抗血清の産生と特異性の分析
ＡＧ１−１ペプチドのＣＤＩ接合体を実質的にＨｅｒｍａｎｓｏｎ １９９６に従って調製した。手短かに言えば、ＣＤＩ接合体は、以下のように調製する：即ち、１００ｍｇのサイログロビンを１０ｍｌに溶解して、０．０５Ｍ ＭＥＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ６．０中１０ｍｇ／ｍｌの濃度とする。１００μｌの下記二種の試薬を添加し（最終濃度として４ｍＭ ＣＤＩーこれは、サイログロビンに対するＣＤＩがほぼ１００倍モル過剰に相当するー及び１０ｍＭ ＮＨＳとする）、次いで得られた溶液を室温（１８−２２℃）にて１５分間放置して混合する。ＣＤＩ：０．４Ｍ ＣＤＩストック：７６．７ｍｇを１ｍｌの水に加えて使用直前に調製する。ＮＨＳ：１ＭスルフォーＮＨＳストック：２１１７．１ｍｇを１ｍｌの水に加えて使用直前に調製する。
【００７１】
過剰の架橋反応物を４本のＮＡＰ２５脱塩カラム（Pharmacia, Sweden）を用いたゲル濾過によって１０ｍＭ リン酸ナトリウム液 ｐＨ９．０中に除去し、かくして脱塩処理した活性化サイログロビンをプールして、２ｍｌずつに分ける。ゲル濾過の直後に、ペプチド溶液：０．１Ｍリン酸ナトリウム液 ｐＨ９．０中４ｍｇ／ｍｌの液を２ｍｌをそれぞれのバイアルに添加する。コントロールの接合化を該当しないペプチドを用いて実施し、またカップリング反応を室温で２時間進行させる。
【００７２】
それぞれの接合体をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５（Pharmacia, Sweden）のカラムを用いたゲル濾過でＰＢＳに移し、濃度をＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌに調節する。
【００７３】
マウス（メス、BalbC x CF1種）を５０％フロイントインコンプリートアジュバントを含む、リン酸塩緩衝食塩水に溶かした０．１２５ｍｇ／ｍｌワクチンの２００μｌを用いて皮下免疫化する。マウスを当初の免疫化を行った後二週間の間隔で合計８週間追加抗原刺激する。免疫前血液を２回目の免疫化の一週間後に採取して、血清中の抗体濃度をモニターする。その後５回目及び６回目の免疫化の一週間後に血液を採取する。
【００７４】
これらマウスの血液の特異性を１０ｎｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＢＳ3−ＡＧ１−１接合体をコートしたＭＴＰで試験する。
【００７５】
マウス抗血清を１％ＢＳＡと０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで適当な希釈率で希釈し、適当なＥＬＩＳＡ信号を得る。このような競争的測定方法方式での結合した抗体は、二次パーオキシダーゼ接合ウサギ抗マウス抗体及び発色性パーオキシダーゼ基質を用いて検出する。
【００７６】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを実質的にＫｏｅｊｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（２２）が報告したように、但し以前報告された修正法（７，２３）を加えて調製した。マウスの脾臓細胞を４７％ポリエチレングルコール（ＰＥＧ）及び７．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下ほぼ２：１（脾臓：骨髄腫）の比率でＡｇ８Ｘ ６３．６５３骨髄腫細胞（２４）と融合させた。脾臓細胞人内皮細胞培養の上済み液（ＨＡＣＳ，Ｃｏｓｔａｒ，Ｆ１，ＵＳＡ）中で平板培養した。ヒポキサンーアミノプテリンーチミジン（ＨＡＴ）含有培地中で選別した後、培養上澄み液を実質的に（７）において報告されたように、間接ＥＬＩＳＡによってスクリーンして、抗体認識コラゲナーゼで消化したＩＩ型コラーゲンを検索した。選別した細胞系を少なくとも三回クローンし、２％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させた。モノクローナル抗体は、メーカーの指示（Pharmacia, Uppsala, Sweden）に従って実施したプロテインＡクロマトグラフィーを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって培養上澄み液から単離した。簡略すれば、プロテインＡセファロース４Ｂの１０ｘ１ ｃｍ（１０ ｍｌ）カラムをパックし、０．１ＭＴｒｉｓ ｐＨ８．８で平衡化した。２リットルの培養上澄み液をＮａｌｇｅｎｅ０．４５μｎフィルターでろ過し、２００ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８を添加した。培養上澄み液を１ｍｌ／ｍｉｎの速度でカラムに加え、次いで１００−１５０ｍｌの０．１Ｍ ＴｒｉｓｐＨ８．８でカラムを洗浄した。結合したイムノグロブリンを０．１ＭグリシンｐＨ３．０で５０μｌの１Ｍ ＴｒｉｓｐＨ８．８を含むバイアル中に溶出した。モノクローナル抗体のサブクラスをＩｓｏＳｔｒｉｐTM イソタイプ決定キット（Boehringer Mannheim GmbH, Munichi, Germany）を用いて決定した。
【００７７】
血清測定法は、ＡＧ１−１モノクローナル抗体を用いて開発した。この測定法は、ストレプタビジンを塗布したマイクロタイタープレート（Exiqon, Troeroed, Denmark）上で競争的測定法として実施した。プレートを洗浄緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，５１ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）で三回洗浄し、１００μｌ／ｗｅｌｌのビオチニル化ＡＧ１−１βＬペプチド（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＲＶＲＶＤ−β―ＳＡＹ）を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳに１．２５ｎｇ／ｍｌなる濃度に希釈したものと共に培養した。振とう台（３００ＲＰＭ）の上で２０℃にて３０分間培養した後、５０μｌの試料マウス胎仔校正用試料をピペットでウエル内にとり、次いで１００μｌのＡＧ１−１特異的モノクローナル抗体Ｆ４９を１００ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭＭＥＳ，５０ｍＭＣａＣｌ2、１％ＢＳＡ，０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０，０．４ｇ／ｌ４−アミノーアンチピリン、０．０１２％Ｂｒｏｎｉｄｏｘ（静菌剤）、ｐＨ６．０（測定用緩衝液）に希釈したものを添加した。このプレートを４℃において一夜（１８−２４時間）培養し、洗浄緩衝液で５回洗浄し、適当に測定用緩衝液で希釈した二次パーオキシダーゼ接合ウサギ抗マウス抗血清を１００μｌ各ウエルに添加した。このプレートを２０℃において６０分間培養し、ＴＢＴで５回洗浄し、結合した抗体の量を発色性パーオキシダーゼ基質を用いて定量した。
【００７８】
図３は、ＡＧ１−１ペプチド（ＧＲＶＲＶＮＳＡＹ）の非異性化（αＬ）型と異性化（βＬ）型の調製物又はＩ型コラーゲンのＣ−テロペプチド（ＥＫＡＨＤＧＧＲ、ＣＴｘ）由来コントロールペプチドを用いて、上記したように行ったＡＧ１−１特異的モノクローナル抗体ＥＬＩＳＡにおける結合の競争を示す。このＡＧ１−１−ＥＬＩＳＡは、“αＬ型と比較して異性化したβＬペプチド調製物に対して５００倍以上もの高い反応性を示す。
【００７９】
実施例４：軟骨結合タンパク質（ＣＬＰ）に由来するエピトープに対して特異的な抗血清の産生
ＣＬＰ由来ペプチドのＣＤＩ接合体：即ち、サイログロブリンに結合したＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｘ＊−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇを実施例２において記載したように調製した。このＣＬＰペプチドは、異性化及び／又は光学的反転を促進するために、接合処理する前に９０℃にて４時間加熱した。Ｔｈｙ−ＣＤＩ−ＣＬＰ接合体を用いて実施例２に記載したようにウサギを免疫化した。
【００８０】
別の接合体を幾つか、ウサギの血液を一次的にスクリーニングするために調製した。このオ調製は、担体タンパク質としてＢＳ３スクシンイミド共有結合か教材とＢＳＡを用いて行った（Greg T. Hermannson, "Conjugate Technique" 1996, Academic Press, San Diego, USAに従った）。
【００８１】
ウサギの血液の特異性を１０ｎｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＢＳ3−ＡＧ１−１接合体をコートしたＭＴＰで試験する。ウサギ抗血清を１％ＢＳＡと０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで適当な希釈率で希釈し、適当なＥＬＩＳＡ信号を得る。このような競争的測定方法方式での結合した抗体は、二次パーオキシダーゼ接合ウサギ抗マウス抗体及び発色性パーオキシダーゼ基質を用いて検出する。
【００８２】
最も応答性に優れたウサギ抗血清を選択してＣＬＰ特異的測定法を開発した。この測定法は１０ｎｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＢＳ３−ＣＬＰでコートしたプレートを用いて競争的測定法として実施した。２０μｌの試料又は校正用試料をピペットでウエルにとり、３００ｍＭ Ｔｒｉｓ；０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；１５ＢＳＡ、ｐＨ８．０（ＴＢＴ）に適当に希釈した１００μｌのＣＬＰ特異的抗体を添加した。このプレートを２０℃において６０分間培養し、５回ＴＢＴで洗浄し、ＫＳ緩衝液に適当に希釈した、１００μｌの二次パーオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギ抗血清を各ウエルに添加した。このプレートを２０℃において６０フ印鑑培養し、ＴＢＴで５回洗浄し、結合抗体の量を発色性パーオキシダーゼ基質を用いて定量した。
【００８３】
実施例５：エピトープの異性化及び／又は光学的反転型を優先的に認識するＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡによる測定値が、ＲＡ罹患患者をモニターするうえで有する臨床的価値
ＲＡ患者及び年齢適合対照者から採取した血清試料を上記した測定法で測定した。さらには、滑液を実施例２において記載したＡＧ1−1 ＥＬＩＳＡで測定した。
【００８４】
図４は、ＲＡ患者及び対照から得た血清試料をＡＧ1−1特異的測定法で測定した結果を示す。グラフの右側には、４種の滑液試料の測定で得た結果を示す。この測定法が、滑液試料については満足に機能を発揮することは、注目するべきである。通常、滑液は、軟骨タンパク質断片を対象としたＥＬＩＳＡから得られる結果については、共存する他のタンパク質殻のマトリックス効果が原因でバックグラウンド値が余りにも高くなり過ぎるのである。
【００８５】
このデータから、循環するＡＧ１−１ペプチド断片の異性化及び／又は光学的反転型のものに着いての測定は、ＲＡ患者について、その診断、モニターリング及び治療処置の管理を行い且つ又間接疾患患者において進行する軟骨破壊を評価判定するうえで臨床上の価値を有することが、明らかとなった。
【００８６】
実施例６：エピトープの異性化及び／又は光学的反転型を優先的に認識するＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡによる測定値が、ＪＲＡ（若年性リューナチ性関節炎）罹患患者をモニターするうえで有する臨床的価値
実施例２において記載したＡＧ１−１血清ＥＬＩＳＡについて更に別の臨床的評価を実施した。この作業は、若年性リューマチ性関節炎（ＪＲＡ）に罹患した患者及び年齢適合対照者から得た血清試料について行ったものである。図５は、３０人のＪＲＡ患者及び３２人の年齢適合対照者から得られた結果を示す図である。ノンーパラメトリックＴ−検定（Mann―Whitney, two―tailed）の結果から、対照者と比較してＡＧ１−１平均濃度が高度に有意に上昇したことが明らかとなった（Ｐ＜０．０００１）。またこの実験において、関節疾患の患者群において有意の上昇が認められた。注目すべきことは、血清ＣｒｏｓｓＬａｐｓ測定値との相関関係が完全に欠落していたことである（ｒ＝０．０５；データはここでは示さない）。血清ＣｒｏｓｓＬａｐｓによる一段階ＥＬＩＳＡは、異性化したＩ型コラーゲン断片に対する特異的な測定法であり（Rosenquist et al. 1998）、この測定法による測定値は、特異的に骨吸収を反映するものである。即ち、ＡＧ１−１測定法と血清ＣｒｏｓｓＬａｐｓ測定法と間に相関関係が欠落していることから、このＡＧ１−１測定法は、骨粗しょう症による骨吸収の過程で遊離されるＩ型コラーゲンの代謝物によって左右されないことが明らかとなった。ＪＲＡ診断後の経過時間に対する相関関係は認められており（ｒ＝０．４４）、ＡＧ１−１濃度が、関節軟骨の破壊が最も高い速度で生起している、新たに診断され、治療処置を受けていない患者において最も上昇していることが明らかとなった。
【００８７】
実施例７：エピトープの異性化及び／又は光学的反転型を優先的に認識するＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡによる測定値が、ＯＡ罹患患者をモニターするうえで有する臨床的価値
ＯＡにおいて増大した軟骨代謝を評価するため実施例２において記載したＡＧ１−１測定法が有する臨床的価値を評価／判定するために、ＯＡ患者及び年齢適合対照者から得た血清を上記した側テ法で測定した。４０人の新たに診断された患者から得たＯＡ試料及び年齢適合対照群から得た４０の試料を測定値の中に含めた。図６は、ＯＡ患者及び対照者から得た血清試料をＡＧ１−１特異的測定法で測定した結果を示す。ＯＡ試料は全て、対照よりも測定結果が高かった（ｐ＜０．０００１, Two−Tailed Non―Parametric T―Test, Mannn-Whitney）。
【００８８】
図６において示したデータから、循環するＡＧ１−１ペプチド断片の異性化及び／又は光学的反転型が、ＯＡ患者の診断／モニターリング及び関節疾患患者において進行する軟骨破壊の臨床判断を行ううえで臨床的価値を有することが、明らかとなった。
【００８９】
実施例８：エピトープの異性化及び／又は光学的反転型を優先的に認識するＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡによる測定値が、ＯＡとＲＡに罹患した患者をモニターするうえで有する臨床的価値
ＯＡ患者から得た血清試料及び関節炎又は関節若しくは軟骨代謝に影響するその他の疾患に罹患していない健常な人から成る年齢適合対照試料を実施例３において記載したモノクローナルＡＧ１−１β測定法で測定した。３９人の新たに診断されたＯＡ患者、１６人のＲＡ患者及び年齢適合対照群の１８人から得た血清試料を当該測定値に含めた。図７は、ＯＡ患者及び対照者から得た血清試料をＡＧ１−１特異的測定法で測定した結果を示すものである。これらＯＡ及びＲＡ試料は、対照よりも高い測定結果を示した（ｐ＜０．０００１, Two−Tailed Non―Parametric T―Test, Mannn-Whitney）。
【００９０】
図７に示したデータから、循環するＡＧ１−１ペプチド断片のβ―Ａｓｐ異性化型の測定は、ＯＡ患者の診断／モニターリング及び関節疾患患者において進行する軟骨破壊の臨床判断を行ううえで臨床的価値を有することが、明らかとなった。
【００９１】
実施例９：ＲＡ患者から得た試料のＣＬＰ特異的測定法による測定が有する臨床 的価値
実施例４において記載したＣＬＰ測定法の持つ臨床的価値をＲＡ患者及び年齢適合対照者から得た試料について測定することによって判定した。ＡＧ１−１測定値を付して図４に示した同一試料パネルをＣＬＰ ＥＬＩＳＡで測定した。図８は、ＲＡ患者、対照者から得た血清試料及び滑液試料についてＣＬＰ血清ＥＬＩＳＡで測定した結果を示す。ＲＡ群における平均濃度は、１１１．５ｎｇ／ｍｌであり、また対照群におけるそれは、４８．９４ｎｇ／ｍｌであった。この差異は、ノンパラメトリックＴ検定（Mann-Whitney）（p=0.017）によって評価した結果統計的に有意であった。
【００９２】
ＣＬＰ測定法及びＡＧ１−１測定法での測定値間の相関関係は高かった（ＲＡ試料は除いてr=0.017）。
【００９３】
実施例１０：ＯＡ患者から得た試料のＣＬＰ特異的測定法による測定が有する臨床的価値
実施例４において記載したＣＬＰ測定法の持つ臨床的効能・機能を更に評価した。図６に示した、新たに診断された活性ＯＡに罹患した患者から得た同一試料パネルをＣＬＰ測定法で測定した。図９は、ＯＡ患者及び対照から得た血清試料についてウサギＩ９９０２５から得た抗血清を用いたＣＬＰ血清ＥＬＩＳＡで測定した結果の差異を示す（図４においてＡＧ１−１ＥＬＩＳＡで測定したのと同じ患者数）。ＯＡ群における平均濃度は、２０．６ｎｇ／ｍｌであり、また対照群におけるそれは、４７．３ｎｇ／ｍｌであった。この差異は、ノンパラメトリックＴ検定（Mann-Whitney）（p=0.001）によって評価した結果統計的に有意であった。これらのＯＡ患者は、対照群よりもＣＬＰ濃度の測定値が有意に低かった。
【００９４】
ＣＬＰ測定法及びＡＧ１−１測定法での測定値間の相関関係は高かった（ＲＡ試料は除いてr=0.017）。
【００９５】
実施例１１：関節疾患を評価するためＣＬＰとＡＧ１−１の測定値との比率を算定することが有する臨床的価値
ＯＡ患者と対照者とのＡＧ１−１測定値とＣＬＰ測定値（実施例７及び１０）との間の比率を算定した。図10は、図４及び６において示したＯＡと対照母集団におけるＡＧ１−１測定値とＣＬＰ測定値との比率を示す。二つの母集団の間における差異は、高度に有意であり、“病理的比率”のための絶対的カットオフ（cut-off）値の確立が可能となるはずである。この差異は、ｐ＜０．０００１において高度に有意である（two−tiled non―parametric T―test）。Ｔ−スコアは２２．４であった。
【００９６】
二つの群の間における高度に有意な差異に基けば、関節代謝が通常であるか又は異常である個別の患者を識別する、この比率の絶対的カットオフ値を決定することが出来るように思われる。かかる比率は、“病理学的”関節疾患の評価を行ううえで極めて関連性が高い可能性があり、全身性の関節疾患に係わる測定法を規格化するための便法となるものである。
【００９７】
以上本発明を実施例に言及して説明したが、多くの変法が本発明の範囲において可能である。
【００９８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】異性化及び光学的反転したペプチド型を精製させるに際して合成ペプチドを加熱処理する効果を示すＨＰＬＣによる測定曲線を示す；
【図２】異性化又は光学的反転したペプチドに対してポリクローナルウサギ抗体が有する特異性を示すＥＬＩＳＡ（ＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡ）の結果を示す；
【図３】異性化又は光学的反転したペプチドに対してモノクローナルウサギ抗体が有する特異性を示すＥＬＩＳＡ（ＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡ）の結果を示す；
【図４】図2のＥＬＩＳＡを血清及び滑液試料に対して適用した結果を示す；
【図５】ＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡを若年性リューマチ性関節炎の患者及びコントロールに対して適用した結果を示す；
【図６】ＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡを骨関節症の患者及びコントロールに対して適用した結果を示す（実施例７）；
【図７】ＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡを骨関節症の患者及びコントロールに対して適用した結果を示す（実施例８）；
【図８】実施例４のＣＬＰ試験法をＲＡ患者から得た血清とコントロール及び滑液試料に対して適用した結果を示す（実施例９）；
【図９】ＣＬＰ ＥＬＩＳＡをＯＡ患者から得た血清とコントロールに対して適用した結果を示す（実施例１０）；及び
【図１０】ＯＡ患者及びコントロールに対して得られたＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡ：ＣＬＰ ＥＬＩＳＡ結果の比率を示す。
【発明の属する技術分野】
本発明は、体液などの生物学的試料中における非コラーゲン軟骨タンパク質及び素の断片のイムノアッセイに係わる。
かかるタンパク質及びタンパク質断片は、関節疾患のインデックスとして役立つ。
【０００２】
【従来の技術】
リューマチ性関節炎（ＲＡ）は、工業国及び開発途上国の如何を問わずその人口のほぼ１％が罹患する、重篤な慢性の且つ進行性の疾患である(Harris 1993)。ＲＡの病因には環境、遺伝及び成長にかかわる要因が関与しているのであるが、現在はＲＡは自己免疫疾患であることが広く受け入れられている。骨関節炎（ＯＡ）は、工業国の人口の８％以上が罹患している慢性疾患であり、この疾病はまた、種々の関節部の関節軟骨を侵し、ある免疫成分がこの疾病の病態病理学の一部として観察されているものの、ＯＡは、自己免疫疾患とは見なされていない。
【０００３】
ＲＡ及びＯＡの主要な臨床症状は、軟骨の異常と分解である。しかしながら、関節炎患者で進行する軟骨分解を直接的に評価することは、かかるプロセスの特異的マーカーが臨床の実際において利用不能であったため今までは困難であった(Moeller 1998)。ＲＡの臨床診断においては、患者は、痛みなどの疾病症状及び機能障害並びに関節破壊により惹起される移動性に関連した諸問題に応じて点数表示により評価されている。多くの標準化評価システムが導入されてきたものの、かかるパラメータを定量化することは困難である(Stucki et al. 1997)。ＲＡ患者の評価を行うために使用されるその他のマーカー、例えばＣ−反応性タンパク質やリューマチ因子などは、本疾患に関与する炎症プロセスに対しては特異的であるが、軟骨破壊の程度に直接的に関連するわけではなく、ＲＡに特異的であるわけではない(Wollheim 1996)。目下のところ、関節炎患者の種々の（個別の）関節の状態に関する情報を取得するための最善の方法の一つは、放射線医学的検査である。
【０００４】
例えばこの疾病に罹患した関節の破壊に起因するヒアルロン酸塩類やアグリカン断片などの代謝物を測定したことが報告されている(Moeller 1998, Wollheim 1996)。しかしながら、これらのマーカーが持つ臨床上の有用性は、まだ証明されていない。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、軟骨破壊の種々のマーカーを同定し且つ関節疾患をモニターする、診断及び予後に関連したアッセイ法を開発するための新しいアプローチに基くものである。本発明者らは、関節軟骨の特異的な成分は、異性化及び／又は光学的反転を受け易いことを証明し（図１）、またいくつかの軟骨タンパク質において特異的な異性化及び／又は光学的反転を受け易い部位を同定したのである。本発明者らはまた、異性化及び／又は光学的反転した軟骨タンパク質の断片は、循環していること及びかかる断片の測定が関節軟骨破壊の指標となることを証明したのである。
【０００６】
アスパラギン酸及びアスパラギン（Ａｓｘ）並びにグルタミン酸及びグルタミン（Ｇｌｘ）残基は、いくつかの影響を受け易いタンパク質においては自発的転移を受けて、ＡｓｘとＧｌｘとの間の通常のペプチド結合が、直鎖のα―カルボキシル基から側鎖のβ―カルボキシル基（Ｇｌｘ残基の場合についてはγ―カルボキシル基）に転移されるのである(Clarke 1987)。この異性化反応は、イミド中間体を経由して進行するが、このイミド中間体は、自発的な加水分解を受けると異化の四つの型のうちの一つになる：すなわち、アスパラギン酸―グリシンについて下記する反応式において該述するように、通常存在するαＬ、イソ型であるβＬ，又は二種類の光学的反転した型であるαＤとβＤである（この反応は、他の反応を受け易いＡｓｘとＧｌｘを含む配列についても同様に生起する）：
【０００７】
【式１】
このペプチド主鎖の窒素が隣接するアスパルチル（アスパラギン酸）残基の側鎖カルボニル基を攻撃する結果、イミド環が形成される可能性がある（Ａ→Ｂ）。このイミド環は、加水分解及び光学的反転を受けて、Ｄ及びＬ構造のペプチドとイソペプチドを生成し易いのである。光学的反転は、直接プロトン引き抜き（ＡＤＧ又はＣＦＩ）によるか又はイミド経路（ＢＥＨ）を経由してカルバニオン中間体（Ｄ，Ｅ及びＦ）を経て進行する。上記式においては、ペプチド主鎖は、太線で示してある。
しかしながら、環状イミド形成（及び異性化／光学的反転）が生起するためには、当該ＡｓｘとＧｌｘ残基を取り囲む三次元構造は、最適のコンフォーメンションと充分な柔軟性を有していなければならない（Geiger and Clarke 1987）。
【０００９】
多くの研究の結果、ペプチド及びタンパク質の内部におけるＡｓｘ残基の光学的反転は、イミド経路を経由して主として進行することが明らかになっている（ＢＥＨ）（Geiger and Clarke 1987, Radkiewics et al. 1996）。しかしながら、例えば直接プロトン引き抜き又はイミノーδ―ラクトン形成など他の経路もまた光学的反転に寄与している可能性がある（Radkiewics et al., 1996）。しかしながら、これらの経路は、重要性は低いと想定される（Geiger and Clarke 1987, Radkiewics et al. 1996）。
【００１０】
上記にて該述したようにイミド中間体を経由した異性化及び光学的反転は、生理学的条件下においては遅い速度で生起する自発的反応である（Geiger and Clarke 1987, Felius et al. 1997）。すべての化学反応について、反応速度は、温度の上昇によって加速させることが出来る。
【００１１】
タンパク質又はペプチド内においてかかる構造的変化を導入することは、機能、安定性や物理的・化学的特性に深甚な影響を与える。中でも、異性化ペプチド結合及び／又は光学的反転アミノ酸を含有したタンパク質やペプチドのタンパク分解酵素による分解は、αＬアミノ酸からのみ構成されたタンパク質やペプチドと比較して有意に低減する(Rafferty et al., 1988)。即ち、このような変成を含むタンパク質断片は、通常の組織代謝変動・回転の過程において同一程度の分解されず(Van Regenmortel & Mueller 1998)、むしろ測定可能な濃度で循環する可能性がはるかに高い。更には、異性化及び／又は光学的反転したペプチド結合を含むペプチド又はタンパク質断片を測定しても、新たに合成された分子がかかる測定値には寄与することはなく、従って進行する分解プロセスを反映しないであろう。
【００１２】
ＷＯ／９６／３０７６５において、本発明者らは、Ｉ型コラーゲンの異性化した断片は、骨吸収の優れた指標を与えることを開示した。更には、ＩＩ型コラーゲン（軟骨中に認められる）も潜在的な異性化部位を含むことも開示した。
【００１３】
本発明者らは、関節軟骨は、代謝速度が極めて遅い組織の一つであって、異性化及び光学的反転を受ける非コラーゲン性タンパク質を含有していることを証明し、またかかるタンパク質又はその断片の測定値は、例えばＲＡやＯＡなどの関節疾患を評価し且つモニターするための診断上の可能性を有する関節軟骨分解の指標となることを証明した。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明は、例えば体液や組織試料などの生物学的試料中において、異性化したか又は光学的反転した、軟骨に由来する非コラーゲンタンパク質又はかかるタンパク質に由来する異性化した又は光学的に反転した断片の一種以上の量を測定することから成る測定法を提供するものである。
【００１５】
特定の興味に対象となるタンパク質としては、アグリカン（aggrecan）及び軟骨結合タンパク質が含まれる。
【００１６】
アグリカンは、関節性軟骨の主要な構造的成分の一つであり、関節疾患を評価するためのバイオマーカーとしての潜在的可能性並びにＲＡ及び当該疾患の動物モデルにおける自己抗原としての推定上の役割についてこれまでに研究されてきた（Poole & Dieppe 1994, Glant et al. 1998）。
【００１７】
このタンパク質は、２０００以上のアミノ酸残基から成る高度に糖化された巨大タンパク質である。アグリカンは、構造的に三つの異なる領域に分けられる：即ち、Ｇ１，Ｇ２及びＧ３である。Ｇ１領域は、通常はアグリカンにおける一次免疫原性領域と証明されている（Glant et al. 1998）。球状領域は、ヒアルロン酸ポリマーへのリンカーとして機能し、また軟骨結合タンパク質（ＣＬＰ）と接触している。関節炎の動物モデルにおける免疫システムの標的として同定されまたかかるＧ１領域におけるアグリカナーゼ(aggrecanase)即ちストロメリシン(stromelysin)の特異的開裂部位として同定された特性的エピトープは、次のようである：即ち、．．Ｎ(368)ＩＴＥＧＥ（Ｎ−結合糖化のためのコンセンサス配列を含む）；374ＡＲＧＳＶＩ．．；．．ＶＤＩＰＥＮ341（Dudhia et al. 1996）である。更には、アグリカン内におけるアスパラギン酸はラセミ化を受け易いことが既に報告されている（Maroudas et al. 1998）。
【００１８】
本発明者らは、アグリカンのＧ１領域に由来したエピトープＧＲＶＲＶＮＳＡＹ内におけるアスパラギン酸残基を、異性化／光学的反転を受け易い部位として同定したのである。下記する実施例において、本発明者らは、ＲＡをモニターする上で異性化及び／又は光学的反転したＡＧ１−１の測定値が有する臨床上の価値を明示する実験データ及び臨床データを提示することとする。
【００１９】
軟骨結合タンパク質（ＣＬＰ）は、ヒアルロナン（hyaluronan）及びアグリカンと関連性を有し、アグリカンをヒアルロナンに強固にアンカー固定するうえで重要な役割を恐らくは果たしているのであろう。この分子は、アグリカンのＧ１領域に結合し、またこのタンパク質と構造上いくつか類似性を有する(Poole & Dieppe 1994)。軟骨結合タンパク質は、軟骨破壊の潜在的なマーカーとしてはほとんど注目を受けたことはなかったのであるが、かかる軟骨タンパク質に対する自己抗原性が、かかる疾病の動物モデルにおいてＲＡを誘発することが明らかにされている（Zhang et al. 1998）。しかしながら、当該タンパク質は、アグリカンがこの結合タンパク質（及びＧ１領域）に接触するに十分な程度に分解された場合に生起する遅発性破壊の良好なマーカーとなる可能性がある。この結合タンパク質はまた、げっ歯類において自己免疫性関節炎を誘発する能力を有しており、また免疫優性エピトープは、ヒアルロナン結合のための推定上のコンセンサス配列を含んでいる、当該タンパク質のＮ末端及びアグリカンが共有する二つの領域（及び例えばニューロカン（neurocan）やブレビカン（brevican）などの中枢神経系（ＣＮＳ）のヒアルロナン）に局在されている。これらの配列のうちから一つの配列を選択して、本明細書における例証を行うために使用している。潜在的な異性化部位には、下線を付してある。アグリカンのＧ２領域からのアミノ酸差異（保存的置換）は、太字で示してある：即ち
【００２０】
ＡＧＷＬＡＤＧＳＶＲＹＰＩ
【００２１】
軟骨のオリゴマー状マトリックスタンパク質（ＣＯＭＰ）は、非コラーゲン性のグリコプロテインである（Neidhart et al. 1997）。その生理学的役割は、明確ではない。ＣＯＭＰ濃度が高くなることは、初期ＱＡ及び関節破壊が初期には急速に進行するが、その後は緩徐となるＲＡ患者において既に認められている。
【００２２】
軟骨の中間層タンパク質（ＣＩＬＰ）は、Ｎ−結合オリゴサッカロイドを含む、分子量が９１．５ｋＤａである単一ポリペプチド鎖から成る非コラーゲン性軟骨タンパク質である（Lorenzo et al. 1998a and 1998b）。
このタンパク質は、軟骨細胞によって合成され、領域間軟骨に局在している。間接性軟骨の表面領域にもまた最深領域にも認められていない。ＣＩＬＰは、加齢と共に増加すると報告されており、初期ＱＡのマーカーであると示唆されている。
【００２３】
【発明の実施の形態】
好ましくは、本発明の方法は、当該生物学的試料中の*Ａｓｘ又は*Ｇｌｘを含む少なくとも一種のタンパク質又はタンパク質断片の量を測定するものであって、*Ａｓｘは、αＤ Ａｓｐ若しくはＡｓｎであり又はβＬ若しくはβＤ Ａｓｐであり、また*Ｇｌｘは、αＤ Ｇｌｕ若しくはＧｌｎ又はγＬ若しくはγＤ Ｇｌｕである。
【００２４】
好ましくは、天然のタンパク質においてはＡｓｘ／Ｇｌｘに隣接してグリシン又はセリンが存在する。その理由は、異性化又は光学的反転を容易にするからである。
【００２５】
前記タンパク質は、好ましくはアグリカン、ＣＬＰ，ＣＯＭＰ，又はＣＩＬＰであり、又前記断片は、アグリカン、ＣＬＰ，ＣＯＭＰ又はＣＩＬＰの断片である。
【００２６】
好ましくは、本方法は、下記するアグリカン誘導アミノ酸配列：
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−*Ａｓｘ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒを含む、少なくとも一種のタンパク質又はタンパク質断片の量、又は下記するアグリカン誘導アミノ酸配列：
Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−*Ａｓｘ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐを含む、少なくとも一種のタンパク質又はタンパク質断片の量、又は下記するＣＬＰ誘導アミノ酸配列：
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇを含む、少なくとも一種のタンパク質又はタンパク質断片の量、を測定するものである。
【００２７】
前記測定法は好ましくは、非コラーゲン性軟骨タンパク質のアミノ酸残基により囲繞される*Ａｓｘ又は*Ｇｌｘを含んで成るアミノ酸配列に特異的に結合する免疫学的結合パートナーを用いて実施される。この免疫学的結合パートナーは、*Ａｓｘ又は*Ｇｌｘを含む配列とαＬ Ａｓｘ又はαＬ Ｇｌｘを含む相当する配列とを有用な測定法となる程十分な程度に判別するべきものである。測定法／抗体が当該抗体／エピトープの相当するαＬ型に対して有する交差反応性が２５％以下、好ましくは５％以下である。
【００２８】
好適には、かかる免疫学的結合パートナーは、非コラーゲン性軟骨タンパク質のアミノ酸残基により囲繞される*Ａｓｘ又は*Ｇｌｘを含んで成るアミノ酸配列を有する合成ペプチドに対して産生された抗体、又は前記ペプチドに対して免疫学的結合特異性を示す、かかる抗体の断片である。
【００２９】
従って、かかるペプチドのアミノ酸配列は、前記タンパク質においてαＬ Ａｓｐ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ又はＧｌｕの代わりに*Ａｓｘ又は*Ｇｌｘとした、前記タンパク質の特性的配列、即ち当該タンパク質に本質的に一意的な配列に相当するものである。好適には、該ペプチドは、長さが６乃至５０のアミノ酸であり、例えば長さが６から１５のアミノ酸である。
【００３０】
該測定値は、関節疾患の指標とするべく使用することが出来る。これによって、当初の診断若しくは重篤度の判定又は治療処置の効果をモニターするための一助とすることが出来る。
【００３１】
本発明は、上記した方法において、更に関節疾患の第二の指標となる測定を行い、ついで前記に主の指標を数学的に合算したパラメータの数値を決定することから成る方法を包含するのである。この第二の指標もまた、本発明に従った方法によって誘導させることが出来る。
【００３２】
本発明は軟骨由来の、異性化又は光学的反転した非コラーゲン性軟骨タンパク質又はかかるタンパク質から誘導された異性化又は光学的反転した断片の一種以上を測定法に使用する用途・方法を包含するのである。本発明はまた、非コラーゲン性軟骨タンパク質のアミノ酸残基により囲繞される*Ａｓｘ又は*Ｇｌｘを含んで成るアミノ酸配列に結合する免疫学的結合パートナーをＯＡ又はＲＡを診断するか又はその重篤度を判定するためのインビトロの方法に使用する用途・方法をも包含するのである。
【００３３】
本発明は更には、非コラーゲン性軟骨タンパク質のアミノ酸残基により囲繞される*Ａｓｘ又は*Ｇｌｘを含んで成るアミノ酸配列に特異的に結合する免疫学的結合パートナーを提供するのである。本発明は更には、かかる免疫学的結合パートナーであるモノクローナル抗体を産生する細胞系をも包含する。
【００３４】
非コラーゲン性タンパク質のアミノ酸残基により囲繞される*Ａｓｘ又は*Ｇｌｘを含むペプチドであって、長さが好ましくは５０までのアミノ酸残基、更に好ましくは２０まで、例えば６乃至５０又は更に好ましくは６乃至１５のアミノ酸から成るペプチド、及びかかるペプチドをタンパク質又はｔｐ断片の測定法に使用する用途・方法を提供するものである。
【００３５】
本発明は、イムノアッセイの方法であって、生物学的試料を免疫学的結合剤への結合競争剤として機能する、かかるペプチドの存在下に於いて免疫学的結合剤と接触させる前記方法を提供するものである。
【００３６】
本発明は、（ａ）上記した免疫学的結合パートナー又は（ｂ）上記したペプチド、（ａ）又は（ｂ）の一方と、好ましくはイムノアッセイを実行する一つ以上の装置と組み合わせて、抗体―酵素複合体、抗体―酵素接合体の酵素成分の基質、酵素―基質反応停止組成物、洗浄液、前記結合パートナーに結合させた担体又は前記結合パートナーに結合させた検出可能な標識とを含んで成る試験キットを包含する。
【００３７】
本発明は、酵素―イムノアッセイに限定されることはなく、当該技術分野で公知であるイムノアッセイ方法の如何なるものをも包含する。
かかる免疫学的結合パートナーは、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であればよい。
【００３８】
適当な免疫学的結合パートナーはまた、Ｆａｂ，Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）2を含む同一の抗原性決定基に結合する能力を有する抗体の断片をも含む。
【００３９】
本測定法は、ＥＬＩＳＡ，ＲＩＡ又はＩＲＭＡを含む多くの形態を取り得るのであって、これらの方法についてはあまりにも公知であり、本命最初において記述することを必要としない。本測定法は、均質形式又は異質方式であってもよい。
【００４０】
競争測定法においては、上記したペプチドを免疫学的結合パートナーを対象として、試料中に存在する一種以上の異性化又は光学的反転したタンパク質又はペプチドと競争させるのに使用すればよい。この形式のＥＬＩＳＡにおいては、異性化又は光学的反転したペプチドを固体支持体に固定すればよい。固体支持体に接触した合成ペプチドと反応性を示すモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体と共に試料を培養し、洗浄後、パーオキシダーゼ接合（顕示）抗体を添加すればよい。更に培養した後、パーオキシダーゼ基質溶液を添加する。競争により、当該抗体と反応性を示す、試料中に存在する異性化又は光学的反転したタンパク質又はペプチドは、パーオキシダーゼ反応を阻害する。
【００４１】
又はその代わりに、かかる合成ペプチドを使用して、モノクローナル免疫学的結合パートナーを産生させてもよい。そうした場合は、かかる合成ペプチドは、本測定法においては競争剤とする必要はなくなる。例えば、酵素により部員会した軟骨断片は（例えばアグリカンなど）精製し、前記支持体に固定化し、ＥＬＩＳＡをモノクローナル抗体を用いて実行すればよい。
【００４２】
本発明は、ヒト及び動物の双方に適用することが可能である。
【００４３】
適当な体液としては、ヒト又は動物の尿、血液、血清、血漿や滑液がある。本方法はまた、例えば唾液や汗についても使用可能であることが意図される。かかる体液は、そのまま使用してもよく、また接触工程の前に精製してもよい。このような精製工程は、以下に限定されないが、カートリッジ吸着と溶出、分子篩クロマトグラフィー、透析、イオン交換、アルミナクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーやこれらの組み合わせなど多数の標準手法を用いて行えばよい。
【００４４】
異性化及び／又は光学的反転したアミノ酸を含む合成ペプチドの製造は、当該技術分野において公知である方法に従って、例えば一般に“Ｍｅｒｉｆｉｅｌｄ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”と称される固相ペプチド合成によって実施することが出来る。従来公知のペプチド合成方法によれば、種々のペプチドのアイソフォーム（αL,βL, αD,βD、γL,γD）の混合物が生成される。一般的にこのような混合物は、通常のペプチドが本測定法において不活性であるように、満足すべきものであろう。しかしながら、αL型の純粋な生成物を加熱することによって、異性化し、光学的反転したアイソフォームが生成する。
【００４５】
モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体の産生させる方法は、当該技術分野において公知である。例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ １９８６を参照のこと。合成の異性化及び／又は光学的反転したペプチドに対する抗体を免疫化することによって産生させることも可能である。しかしながら、これらの化合物は分子量が比較的小さいため、ハプテンを担体分子に接合することが好ましい。適当な担体としては、いかに限定されないが、ウシ血清、アルブミン、サイログロブリン、オバルブミン、破傷風トキソイド、やキーホールリンペットヘモシアニンなどが挙げられる。好ましい担体は、ウシ血清アルブミン又はサイログロブリンである。ハプテンをその最も免疫原性の高い形態で免疫化動物の抗体産生細胞系に提示するには、多数の代替可能な結合プロトコールが使用できる。適当な手法としては、いかに限定されないが、グルタルアルデヒド、カルボジイミド及び過ヨウ素酸塩が挙げられる。好ましい結合剤は、グルタルアルデヒド及びカルボジイミドである。
【００４６】
抗体の産生は、天然の異性化及び／又は光学的反転を含むタンパク質断片又は合成ペプチドを担体に接合したものを用いて免疫化することを含む従来公知の手法によって実行すればよい。当該免疫原性を増大させるためには、免疫原を注射する前にアジュバントと混合することが好ましい。アジュバントの例としては、以下に限定されないが、水酸化アルミニウム、フロイントアジュバント及び免疫刺激性複合体（ＩＳＣＯＭｓ）が挙げられる。ＩＳＣＯＭｓは、Ｍｏｒｅｉｎ １９９４によって記載された方法に従って作成することが出来る。
【００４７】
かかるハプテン担体分子に対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体の何れも、産生させることが出来る。モノクローナル抗体を産生させるためには、マウスを免疫化することが好ましい。免疫化した動物の脾臓細胞を採取し、均質化し、その後ポリエチレングルコールの存在下でガン細胞と融合させ、異性化及び／又は光学的反転したペプチド断片に特異的なモノクローナル抗体を産生する細胞ハイブリッドを生成させる。適当なガン細胞は、以下に限定されないが、骨髄腫、肝腫瘍、固形ガン及び肉腫などの細胞が挙げられる。モノクローナル抗体の産生に関する詳細な記述は、Ｇｏｄｉｎｇ １９８６においてなされいる。好ましい予備的スクリーニングプロトコールの一つは、合成の異性化及び／又は光学的反転したペプチドを担体に接合し、次いでμタイタープレートに塗布したものを使用することを含んで成る。
【００４８】
異性化及び／又は光学的反転したペプチド断片に対して反応性を有するポリクローナル抗体を産生させるためには、種々の動物種を免疫化することが出来る。適当な動物種としては、以下に限定されないが、ニワトリ、ウサギ及びヤギが挙げられる。 ニワトリ及びウサギが好ましい。
【００４９】
このようにして産生させた抗体は、異性化及び／又は光学的反転した、適当な配列を有する合成ペプチド断片に対する反応性に対する反応性を試験することによって本発明に従った用途・方法に適合しているか否かを検索する。
【００５０】
抗体断片は、当該技術分野において公知である方法によって産生させることができる(Ishikawa 1983)。
【００５１】
従って、上記にて産生せしめた抗体を用いたイムノアッセイを利用することによって、例えば体液などの生物学的試料を事前の分別マウス胎仔加水分解を行うことなく測定することが可能となる。かかる生物学的な液中における所望とする断片に対する特異性は、当該測定法構築において異性化及び／又は光学的反転した合成ペプチド（当該抗体を産生させる際に目標とした又は何れにしろ当該抗体が免疫化学的な反応性を示す）を使用することと組み合わせて、当該抗体によって得られる。
【００５２】
又はその代替案一つとしては、当該イムノアッセイをモノクローナル抗体を用いて実施してもよい。かかる測定法の設計は、当該アッセイの特異性を抗原（当該タンパク質の合成のペプチド異性体）から抗体へ変位させるのである（ウサギ抗血清からモノクローナル抗体へ）。かかる構築法を使用した場合、当該測定法は、最早や合成ペプチド異性体を利用する必要は無くなる。かかるイムノアッセイの変法は好適には、精製タンパク質、タンパク質断片、合成ペプチド又はその接合体で予めコート処理したマイクロタイタープレートにおいてパーオキシダーゼ接合抗体溶液と共に患者の試料又は標準溶液を培養することによって実施する。洗浄した後、プレートの壁面を基質溶液と共に暗所で培養する。発色反応を停止溶液を添加することによって停止し。最後に吸光度を測定する。又はその代わりに、一種以上の抗体をサンドイッチアッセイ法において使用してもよい。
【００５３】
かかるイムノアッセイ自体は、当該技術分野で一般に公知である種々様々な標準測定プロトコールから選択した方法であれば如何なる方法を用いても実施することが出来る。一般的に理解されているように、かかる測定法は、特異的免疫学的結合パートナーと所望の分析物との間における相互作用を利用してその特性を決定し、該分析物と免疫学的結合パートナーとにより形成された複合物を検出するための何らかの手段を利用するような構成とする。かかる免疫学的結合パートナーは、固体担体と複合化させ、分析物のための捕捉用免疫学的結合パートナーとして使用することも出来る。このプロトコールは、直接的な方式で行っても良く、その際分析物／免疫学的結合パートナー複合物を例えば蛍光、放射性又は酵素学的標識物によって検出出来るのであり、また競争的形式で行っても良く、その際は標識化した標準物が、免疫学的結合パートナーを目指して分析物と競合するのである。この方式はまた、凝集測定法として構築してもよい。即ち、当該複合物を反応混合物に適当な沈殿剤を添加することによって沈殿させればよいのである。このようなイムノアッセイプロトコールの特異的な設計は、多様な選択に供するｋとおが可能であり、当該技術分野で利用可能な臨床試験装置やプロトコールの数は、膨大である。かかるプロトコールの多様性については、ＵＳ特許第５００１２２５号を参照のこと。
【００５４】
例えば放射性同位体標識化、蛍光標識化又はＥＬＩＳＡなどの標準的検出プロトコールを直接的又は競争的形式で使用することによって医務のアッセイを実行するために使用する抗体及び顕示試薬は好都合には、当該測定法に必要な成分及び使用方法を含んで成るキットとして提供することが可能である。本発明の一つの実施態様にもおいては、かかるキットは、該当する合成の異性化及び／又は光学的反転したペプチドでコート所折下マイクロタイタープレート、標準曲線を作成するための標準溶液、試験操作の品質検査のための体液コントロール（例えば尿）上記した合成ペプチド異性体と反応性を示すウサギ抗体、パーオキシダーゼに接合した抗ウサギイムノグロブリン、基質溶液、定位し溶液、洗浄緩衝液及び取扱い説明書とを含んで成る。
【００５５】
イムノアッセイは、抗体及び特異的、異性化合成ペプチドを用いて実施するため、適当な生物学的液体中の相当するタンパク質断片配列の比率並びにそれぞれの濃度及びそれらの合計濃度を測定／決定することが出来る。即ち、かかる測定法は、抗体を数種類含めるように設計することが出来るのであって、その結果幾つかの異性化及び／又は光学的反転したペプチド類及び選択的には天然のペプチド配列の測定が可能となり、または単一の異性化及び／又は光学的反転したペプチド配列若しくはこれらの組合せの如何なる所望のものをも測定することが出来る。
【００５６】
本発明を下記する制限を付さない実施例によって、添付図面に言及して更に記載し、説明することとする。
【００５７】
実施例１：合成ＡＧ１−１ペプチド類の異性化：
ＡＧ１−１ペプチドＧＲＶＲＶＮＳＡＹを合成し、リン酸緩衝生理食塩水に１ｍｇ／ｍｌとなるように溶解した。このペプチド溶液を９０℃に４時間加熱して、異性化／光学的反転を促進させた。逆相ＨＰＬＣを行って、加熱前後のペプチド調製物を分析した。
【００５８】
図１は、９０℃にて４時間加熱する前（下方測定曲線）と後（上方測定曲線）における１ｍｇ／ｍｌＡＧ１−１ペプチド調製物のＲＰ−ＨＰＬＣの測定結果を示す。
【００５９】
このことから、加熱によってＲＰ−ＨＰＬＣの保持時間と共に3種類の新しいペプチド型がβＬ、αＤ及びβＤ型の順序で誘導されることが明らかとなった。
【００６０】
実施例２：アグリカンのＧ１領域に由来するエピトープのβＬ型に対して特異的なモノクローナル抗体の産生と特異性の分析
ＡＧ１−１ペプチドのＣＤＩ接合体を実質的にＨｅｒｍａｎｓｏｎ １９９６に従って調製した。手短に言えば、ＣＤＩ接合体は、以下のように調製する：即ち、１００ｍｇのサイログロビンを１０ｍｌに溶解して、０．０５Ｍ ＭＥＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ６．０中１０ｍｇ／ｍｌの濃度とする。１００μｌの下記二種の試薬を添加し（最終濃度として４ｍＭ ＣＤＩーこれは、サイログロビンに対するＣＤＩがほぼ１００倍モル過剰に相当するー及び１０ｍＭ ＮＨＳとする）、次いで得られた溶液を室温（１８−２２℃）にて１５分間放置して混合する。ＣＤＩ：０．４Ｍ ＣＤＩストック：７６．７ｍｇを１ｍｌの水に加えて使用直前に調製する。ＮＨＳ：１ＭスルフォーＮＨＳストック：２１１７．１ｍｇを１ｍｌの水に加えて使用直前に調製する。
【００６１】
過剰の架橋反応物を４本のＮＡＰ２５脱塩カラム（Pharmacia, Sweden）を用いたゲル濾過によって１０ｍＭ リン酸ナトリウム液 ｐＨ９．０中に除去し、かくして脱塩処理した活性化サイログロビンをプールして２ｍｌずつに分ける。ゲル濾過の直後に、ペプチド溶液（０．１Ｍリン酸ナトリウム液 ｐＨ９．０中４ｍｇ／ｍｌの液を２ｍｌ）をそれぞれのバイアルに添加する。コントロールの接合化を該当しないペプチドを用いて実施し、またカップリング反応を室温で２時間進行させる。
【００６２】
それぞれの接合体をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５（Pharmacia, Sweden）のカラムを用いたゲル濾過でＰＢＳに移し、濃度をＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌに調節する。
【００６３】
ウサギ（ＳＳＣ：ＣＰＨ種）を５０％フロイントインコンプリートアジュバントを含む、リン酸塩緩衝食塩水に溶かした０．２５ｍｇ／ｍｌワクチンの１ｍｌを用いて皮下免疫化する。ウサギを当初の免疫化を行った後二週間の間隔で追加抗原刺激する。三回の最初の追加刺激を行った後、引き続いて追加抗原刺激を一ヶ月の間隔で行う。免疫血液を免疫化前に採取し、また試験血液を２回目の免疫化の一週間後に採取して、血清中の抗体濃度をモニターする。その後５回目及び６回目の免疫化の一週間後に血液を採取する。
【００６４】
これらウサギの血液の特異性を１０ｎｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＢＳ3−ＡＧ１−１接合体をコートしたＭＴＰで試験する。ＢＳ3の接合は、以下のように行う：
【００６５】
ＡＧ１−１βペプチド（ＧＲＶＲＶＤ−β―ＳＡＹ）を濾過したばかりのＰＢＳに２ｍｇ／ｍｌとなるように溶解する。担体タンパク質（ＢＳＡ，ウシ血清アルブミン）をＰＢＳ中３ｍｇ／ｍｌの濃度で調製し、次いで２００μｌの担体タンパク質を１．５ｍｌのポリプロピレンチューブ（Eppendorf, Germany）中で２００μｌのペプチド溶液と混合する。これは、担体タンパク質に対してペプチドがほぼ５０倍モル過剰であることに対応する。ＢＳ３（Bis(sulfosuccinimidyl)suberate）ｗｏ５ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０の６ｍｇ／ｍｌ溶液中で新たに調製し、５０μｌの架橋剤をこの担体とペプチド溶液に加え、これを撹拌し、室温で混合装置に放置する（これは、担体タンパク質と比較して架橋剤がほぼ２５倍モル過剰であることに対応する）。３０分間培養した後、５０μｌの０．２５ＭグリシンｐＨ７．５をこれらの溶液に添加する。培養を１５分間継続し、その後接合体をＮＡＰＳカラム（Amersham Pharmacia, Uppsala, Sweden）で脱塩し、タンパク質濃度を測定する。
【００６６】
ウサギ抗血清を１％ＢＳＡと０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで適当な希釈率で希釈し、適当なＥＬＩＳＡ信号を得る。このような」脅威層的測定方法方式での結合した抗体は、二次パーオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギ抗体及び発色性パーオキシダーゼ基質を用いて検出する。
【００６７】
血清測定法は、ＡＧ１−１抗血清を用いて開発した。この測定法は、１０ｎｇ／μｌ ＢＳＡ−ＢＳ３−ＡＧ１−１を塗布したプレート上で競争的測定法として実施した。２０μｌの試料又は校正用試料をウエル内にピペットで移し、次いで３００ｍＭのＴｒｉｓ；０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；１％ＢＳＡ，ｐＨ８．０（ＴＢＴ）中に適当に希釈した、１００μｌのＡＧ１−１特異抗体を添加する。プレートを２０℃において６０分間培養し、５回（ＴＢＴ）で洗浄し、次いで１００ｍＮＴｒｉｓ ｐＨ７．４、０．４ｇ／ｌの４−アミノアンチピリン、０．０１２％Ｂｒｏｎｉｄｏｘ（静菌剤）、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０と２０％ウシ胎仔血清（ＫＳ緩衝液）に適当に希釈した二次パーオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギ抗血清の１００μｌを各ウエルに添加する。このプレートを２０℃において６０分間培養し、ＴＢＴで５回洗浄し、結合した抗体の量を発色性パーオキシダーゼ基質を用いて定量する。
【００６８】
図２は、ＢＳＡ−ＢＳ3−ＡＧ１−１コート処理プレート、ポリクロナ―ルＡＧ１−１特異的ウサギ抗血清及び“沸騰”処理しない又は９０℃にて４時間の過熱処理に供したＡＧ１−１ペプチド調製物を用いて行ったａｇ１−１特異的ＥＬＩＳＡにおける結合の競争を示す。ＡＧ１−１−ＥＬＩＳＡは、“沸騰処理しない“ものと比較して”沸騰処理した“ペプチドセ調製物に対して７倍も高い反応性を示す。
【００６９】
ＡＧ１−１特異的抗血清がペプチドの“沸騰処理”型に対して有する優先性は、異性化及び光学的反転した型（βｌ，αＤ又はβＤ）の一つ以上を優先的に認識することを示唆している。
【００７０】
実施例３：アグリカンのＧ１領域に由来するエピトープに対する抗血清の産生と特異性の分析
ＡＧ１−１ペプチドのＣＤＩ接合体を実質的にＨｅｒｍａｎｓｏｎ １９９６に従って調製した。手短かに言えば、ＣＤＩ接合体は、以下のように調製する：即ち、１００ｍｇのサイログロビンを１０ｍｌに溶解して、０．０５Ｍ ＭＥＳ、０．５Ｍ ＮａＣｌ，ｐＨ６．０中１０ｍｇ／ｍｌの濃度とする。１００μｌの下記二種の試薬を添加し（最終濃度として４ｍＭ ＣＤＩーこれは、サイログロビンに対するＣＤＩがほぼ１００倍モル過剰に相当するー及び１０ｍＭ ＮＨＳとする）、次いで得られた溶液を室温（１８−２２℃）にて１５分間放置して混合する。ＣＤＩ：０．４Ｍ ＣＤＩストック：７６．７ｍｇを１ｍｌの水に加えて使用直前に調製する。ＮＨＳ：１ＭスルフォーＮＨＳストック：２１１７．１ｍｇを１ｍｌの水に加えて使用直前に調製する。
【００７１】
過剰の架橋反応物を４本のＮＡＰ２５脱塩カラム（Pharmacia, Sweden）を用いたゲル濾過によって１０ｍＭ リン酸ナトリウム液 ｐＨ９．０中に除去し、かくして脱塩処理した活性化サイログロビンをプールして、２ｍｌずつに分ける。ゲル濾過の直後に、ペプチド溶液：０．１Ｍリン酸ナトリウム液 ｐＨ９．０中４ｍｇ／ｍｌの液を２ｍｌをそれぞれのバイアルに添加する。コントロールの接合化を該当しないペプチドを用いて実施し、またカップリング反応を室温で２時間進行させる。
【００７２】
それぞれの接合体をＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５（Pharmacia, Sweden）のカラムを用いたゲル濾過でＰＢＳに移し、濃度をＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌに調節する。
【００７３】
マウス（メス、BalbC x CF1種）を５０％フロイントインコンプリートアジュバントを含む、リン酸塩緩衝食塩水に溶かした０．１２５ｍｇ／ｍｌワクチンの２００μｌを用いて皮下免疫化する。マウスを当初の免疫化を行った後二週間の間隔で合計８週間追加抗原刺激する。免疫前血液を２回目の免疫化の一週間後に採取して、血清中の抗体濃度をモニターする。その後５回目及び６回目の免疫化の一週間後に血液を採取する。
【００７４】
これらマウスの血液の特異性を１０ｎｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＢＳ3−ＡＧ１−１接合体をコートしたＭＴＰで試験する。
【００７５】
マウス抗血清を１％ＢＳＡと０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで適当な希釈率で希釈し、適当なＥＬＩＳＡ信号を得る。このような競争的測定方法方式での結合した抗体は、二次パーオキシダーゼ接合ウサギ抗マウス抗体及び発色性パーオキシダーゼ基質を用いて検出する。
【００７６】
モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを実質的にＫｏｅｊｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（２２）が報告したように、但し以前報告された修正法（７，２３）を加えて調製した。マウスの脾臓細胞を４７％ポリエチレングルコール（ＰＥＧ）及び７．５％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の存在下ほぼ２：１（脾臓：骨髄腫）の比率でＡｇ８Ｘ ６３．６５３骨髄腫細胞（２４）と融合させた。脾臓細胞人内皮細胞培養の上済み液（ＨＡＣＳ，Ｃｏｓｔａｒ，Ｆ１，ＵＳＡ）中で平板培養した。ヒポキサンーアミノプテリンーチミジン（ＨＡＴ）含有培地中で選別した後、培養上澄み液を実質的に（７）において報告されたように、間接ＥＬＩＳＡによってスクリーンして、抗体認識コラゲナーゼで消化したＩＩ型コラーゲンを検索した。選別した細胞系を少なくとも三回クローンし、２％のウシ胎仔血清を含むＲＰＭＩ−１６４０中で増殖させた。モノクローナル抗体は、メーカーの指示（Pharmacia, Uppsala, Sweden）に従って実施したプロテインＡクロマトグラフィーを用いたアフィニティクロマトグラフィーによって培養上澄み液から単離した。簡略すれば、プロテインＡセファロース４Ｂの１０ｘ１ ｃｍ（１０ ｍｌ）カラムをパックし、０．１ＭＴｒｉｓ ｐＨ８．８で平衡化した。２リットルの培養上澄み液をＮａｌｇｅｎｅ０．４５μｎフィルターでろ過し、２００ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．８を添加した。培養上澄み液を１ｍｌ／ｍｉｎの速度でカラムに加え、次いで１００−１５０ｍｌの０．１Ｍ ＴｒｉｓｐＨ８．８でカラムを洗浄した。結合したイムノグロブリンを０．１ＭグリシンｐＨ３．０で５０μｌの１Ｍ ＴｒｉｓｐＨ８．８を含むバイアル中に溶出した。モノクローナル抗体のサブクラスをＩｓｏＳｔｒｉｐTM イソタイプ決定キット（Boehringer Mannheim GmbH, Munichi, Germany）を用いて決定した。
【００７７】
血清測定法は、ＡＧ１−１モノクローナル抗体を用いて開発した。この測定法は、ストレプタビジンを塗布したマイクロタイタープレート（Exiqon, Troeroed, Denmark）上で競争的測定法として実施した。プレートを洗浄緩衝液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，５１ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．２）で三回洗浄し、１００μｌ／ｗｅｌｌのビオチニル化ＡＧ１−１βＬペプチド（ｂｉｏｔｉｎ−ＧＲＶＲＶＤ−β―ＳＡＹ）を０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳに１．２５ｎｇ／ｍｌなる濃度に希釈したものと共に培養した。振とう台（３００ＲＰＭ）の上で２０℃にて３０分間培養した後、５０μｌの試料マウス胎仔校正用試料をピペットでウエル内にとり、次いで１００μｌのＡＧ１−１特異的モノクローナル抗体Ｆ４９を１００ｍＭのＴｒｉｓ、５０ｍＭＭＥＳ，５０ｍＭＣａＣｌ2、１％ＢＳＡ，０．０２％ Ｔｗｅｅｎ ２０，０．４ｇ／ｌ４−アミノーアンチピリン、０．０１２％Ｂｒｏｎｉｄｏｘ（静菌剤）、ｐＨ６．０（測定用緩衝液）に希釈したものを添加した。このプレートを４℃において一夜（１８−２４時間）培養し、洗浄緩衝液で５回洗浄し、適当に測定用緩衝液で希釈した二次パーオキシダーゼ接合ウサギ抗マウス抗血清を１００μｌ各ウエルに添加した。このプレートを２０℃において６０分間培養し、ＴＢＴで５回洗浄し、結合した抗体の量を発色性パーオキシダーゼ基質を用いて定量した。
【００７８】
図３は、ＡＧ１−１ペプチド（ＧＲＶＲＶＮＳＡＹ）の非異性化（αＬ）型と異性化（βＬ）型の調製物又はＩ型コラーゲンのＣ−テロペプチド（ＥＫＡＨＤＧＧＲ、ＣＴｘ）由来コントロールペプチドを用いて、上記したように行ったＡＧ１−１特異的モノクローナル抗体ＥＬＩＳＡにおける結合の競争を示す。このＡＧ１−１−ＥＬＩＳＡは、“αＬ型と比較して異性化したβＬペプチド調製物に対して５００倍以上もの高い反応性を示す。
【００７９】
実施例４：軟骨結合タンパク質（ＣＬＰ）に由来するエピトープに対して特異的な抗血清の産生
ＣＬＰ由来ペプチドのＣＤＩ接合体：即ち、サイログロブリンに結合したＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ａｓｘ＊−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇを実施例２において記載したように調製した。このＣＬＰペプチドは、異性化及び／又は光学的反転を促進するために、接合処理する前に９０℃にて４時間加熱した。Ｔｈｙ−ＣＤＩ−ＣＬＰ接合体を用いて実施例２に記載したようにウサギを免疫化した。
【００８０】
別の接合体を幾つか、ウサギの血液を一次的にスクリーニングするために調製した。このオ調製は、担体タンパク質としてＢＳ３スクシンイミド共有結合か教材とＢＳＡを用いて行った（Greg T. Hermannson, "Conjugate Technique" 1996, Academic Press, San Diego, USAに従った）。
【００８１】
ウサギの血液の特異性を１０ｎｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＢＳ3−ＡＧ１−１接合体をコートしたＭＴＰで試験する。ウサギ抗血清を１％ＢＳＡと０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳで適当な希釈率で希釈し、適当なＥＬＩＳＡ信号を得る。このような競争的測定方法方式での結合した抗体は、二次パーオキシダーゼ接合ウサギ抗マウス抗体及び発色性パーオキシダーゼ基質を用いて検出する。
【００８２】
最も応答性に優れたウサギ抗血清を選択してＣＬＰ特異的測定法を開発した。この測定法は１０ｎｇ／ｍｌのＢＳＡ−ＢＳ３−ＣＬＰでコートしたプレートを用いて競争的測定法として実施した。２０μｌの試料又は校正用試料をピペットでウエルにとり、３００ｍＭ Ｔｒｉｓ；０．１％Ｔｗｅｅｎ２０；１５ＢＳＡ、ｐＨ８．０（ＴＢＴ）に適当に希釈した１００μｌのＣＬＰ特異的抗体を添加した。このプレートを２０℃において６０分間培養し、５回ＴＢＴで洗浄し、ＫＳ緩衝液に適当に希釈した、１００μｌの二次パーオキシダーゼ接合ヤギ抗ウサギ抗血清を各ウエルに添加した。このプレートを２０℃において６０フ印鑑培養し、ＴＢＴで５回洗浄し、結合抗体の量を発色性パーオキシダーゼ基質を用いて定量した。
【００８３】
実施例５：エピトープの異性化及び／又は光学的反転型を優先的に認識するＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡによる測定値が、ＲＡ罹患患者をモニターするうえで有する臨床的価値
ＲＡ患者及び年齢適合対照者から採取した血清試料を上記した測定法で測定した。さらには、滑液を実施例２において記載したＡＧ1−1 ＥＬＩＳＡで測定した。
【００８４】
図４は、ＲＡ患者及び対照から得た血清試料をＡＧ1−1特異的測定法で測定した結果を示す。グラフの右側には、４種の滑液試料の測定で得た結果を示す。この測定法が、滑液試料については満足に機能を発揮することは、注目するべきである。通常、滑液は、軟骨タンパク質断片を対象としたＥＬＩＳＡから得られる結果については、共存する他のタンパク質殻のマトリックス効果が原因でバックグラウンド値が余りにも高くなり過ぎるのである。
【００８５】
このデータから、循環するＡＧ１−１ペプチド断片の異性化及び／又は光学的反転型のものに着いての測定は、ＲＡ患者について、その診断、モニターリング及び治療処置の管理を行い且つ又間接疾患患者において進行する軟骨破壊を評価判定するうえで臨床上の価値を有することが、明らかとなった。
【００８６】
実施例６：エピトープの異性化及び／又は光学的反転型を優先的に認識するＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡによる測定値が、ＪＲＡ（若年性リューナチ性関節炎）罹患患者をモニターするうえで有する臨床的価値
実施例２において記載したＡＧ１−１血清ＥＬＩＳＡについて更に別の臨床的評価を実施した。この作業は、若年性リューマチ性関節炎（ＪＲＡ）に罹患した患者及び年齢適合対照者から得た血清試料について行ったものである。図５は、３０人のＪＲＡ患者及び３２人の年齢適合対照者から得られた結果を示す図である。ノンーパラメトリックＴ−検定（Mann―Whitney, two―tailed）の結果から、対照者と比較してＡＧ１−１平均濃度が高度に有意に上昇したことが明らかとなった（Ｐ＜０．０００１）。またこの実験において、関節疾患の患者群において有意の上昇が認められた。注目すべきことは、血清ＣｒｏｓｓＬａｐｓ測定値との相関関係が完全に欠落していたことである（ｒ＝０．０５；データはここでは示さない）。血清ＣｒｏｓｓＬａｐｓによる一段階ＥＬＩＳＡは、異性化したＩ型コラーゲン断片に対する特異的な測定法であり（Rosenquist et al. 1998）、この測定法による測定値は、特異的に骨吸収を反映するものである。即ち、ＡＧ１−１測定法と血清ＣｒｏｓｓＬａｐｓ測定法と間に相関関係が欠落していることから、このＡＧ１−１測定法は、骨粗しょう症による骨吸収の過程で遊離されるＩ型コラーゲンの代謝物によって左右されないことが明らかとなった。ＪＲＡ診断後の経過時間に対する相関関係は認められており（ｒ＝０．４４）、ＡＧ１−１濃度が、関節軟骨の破壊が最も高い速度で生起している、新たに診断され、治療処置を受けていない患者において最も上昇していることが明らかとなった。
【００８７】
実施例７：エピトープの異性化及び／又は光学的反転型を優先的に認識するＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡによる測定値が、ＯＡ罹患患者をモニターするうえで有する臨床的価値
ＯＡにおいて増大した軟骨代謝を評価するため実施例２において記載したＡＧ１−１測定法が有する臨床的価値を評価／判定するために、ＯＡ患者及び年齢適合対照者から得た血清を上記した側テ法で測定した。４０人の新たに診断された患者から得たＯＡ試料及び年齢適合対照群から得た４０の試料を測定値の中に含めた。図６は、ＯＡ患者及び対照者から得た血清試料をＡＧ１−１特異的測定法で測定した結果を示す。ＯＡ試料は全て、対照よりも測定結果が高かった（ｐ＜０．０００１, Two−Tailed Non―Parametric T―Test, Mannn-Whitney）。
【００８８】
図６において示したデータから、循環するＡＧ１−１ペプチド断片の異性化及び／又は光学的反転型が、ＯＡ患者の診断／モニターリング及び関節疾患患者において進行する軟骨破壊の臨床判断を行ううえで臨床的価値を有することが、明らかとなった。
【００８９】
実施例８：エピトープの異性化及び／又は光学的反転型を優先的に認識するＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡによる測定値が、ＯＡとＲＡに罹患した患者をモニターするうえで有する臨床的価値
ＯＡ患者から得た血清試料及び関節炎又は関節若しくは軟骨代謝に影響するその他の疾患に罹患していない健常な人から成る年齢適合対照試料を実施例３において記載したモノクローナルＡＧ１−１β測定法で測定した。３９人の新たに診断されたＯＡ患者、１６人のＲＡ患者及び年齢適合対照群の１８人から得た血清試料を当該測定値に含めた。図７は、ＯＡ患者及び対照者から得た血清試料をＡＧ１−１特異的測定法で測定した結果を示すものである。これらＯＡ及びＲＡ試料は、対照よりも高い測定結果を示した（ｐ＜０．０００１, Two−Tailed Non―Parametric T―Test, Mannn-Whitney）。
【００９０】
図７に示したデータから、循環するＡＧ１−１ペプチド断片のβ―Ａｓｐ異性化型の測定は、ＯＡ患者の診断／モニターリング及び関節疾患患者において進行する軟骨破壊の臨床判断を行ううえで臨床的価値を有することが、明らかとなった。
【００９１】
実施例９：ＲＡ患者から得た試料のＣＬＰ特異的測定法による測定が有する臨床 的価値
実施例４において記載したＣＬＰ測定法の持つ臨床的価値をＲＡ患者及び年齢適合対照者から得た試料について測定することによって判定した。ＡＧ１−１測定値を付して図４に示した同一試料パネルをＣＬＰ ＥＬＩＳＡで測定した。図８は、ＲＡ患者、対照者から得た血清試料及び滑液試料についてＣＬＰ血清ＥＬＩＳＡで測定した結果を示す。ＲＡ群における平均濃度は、１１１．５ｎｇ／ｍｌであり、また対照群におけるそれは、４８．９４ｎｇ／ｍｌであった。この差異は、ノンパラメトリックＴ検定（Mann-Whitney）（p=0.017）によって評価した結果統計的に有意であった。
【００９２】
ＣＬＰ測定法及びＡＧ１−１測定法での測定値間の相関関係は高かった（ＲＡ試料は除いてr=0.017）。
【００９３】
実施例１０：ＯＡ患者から得た試料のＣＬＰ特異的測定法による測定が有する臨床的価値
実施例４において記載したＣＬＰ測定法の持つ臨床的効能・機能を更に評価した。図６に示した、新たに診断された活性ＯＡに罹患した患者から得た同一試料パネルをＣＬＰ測定法で測定した。図９は、ＯＡ患者及び対照から得た血清試料についてウサギＩ９９０２５から得た抗血清を用いたＣＬＰ血清ＥＬＩＳＡで測定した結果の差異を示す（図４においてＡＧ１−１ＥＬＩＳＡで測定したのと同じ患者数）。ＯＡ群における平均濃度は、２０．６ｎｇ／ｍｌであり、また対照群におけるそれは、４７．３ｎｇ／ｍｌであった。この差異は、ノンパラメトリックＴ検定（Mann-Whitney）（p=0.001）によって評価した結果統計的に有意であった。これらのＯＡ患者は、対照群よりもＣＬＰ濃度の測定値が有意に低かった。
【００９４】
ＣＬＰ測定法及びＡＧ１−１測定法での測定値間の相関関係は高かった（ＲＡ試料は除いてr=0.017）。
【００９５】
実施例１１：関節疾患を評価するためＣＬＰとＡＧ１−１の測定値との比率を算定することが有する臨床的価値
ＯＡ患者と対照者とのＡＧ１−１測定値とＣＬＰ測定値（実施例７及び１０）との間の比率を算定した。図10は、図４及び６において示したＯＡと対照母集団におけるＡＧ１−１測定値とＣＬＰ測定値との比率を示す。二つの母集団の間における差異は、高度に有意であり、“病理的比率”のための絶対的カットオフ（cut-off）値の確立が可能となるはずである。この差異は、ｐ＜０．０００１において高度に有意である（two−tiled non―parametric T―test）。Ｔ−スコアは２２．４であった。
【００９６】
二つの群の間における高度に有意な差異に基けば、関節代謝が通常であるか又は異常である個別の患者を識別する、この比率の絶対的カットオフ値を決定することが出来るように思われる。かかる比率は、“病理学的”関節疾患の評価を行ううえで極めて関連性が高い可能性があり、全身性の関節疾患に係わる測定法を規格化するための便法となるものである。
【００９７】
以上本発明を実施例に言及して説明したが、多くの変法が本発明の範囲において可能である。
【００９８】
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【図面の簡単な説明】
【図１】異性化及び光学的反転したペプチド型を精製させるに際して合成ペプチドを加熱処理する効果を示すＨＰＬＣによる測定曲線を示す；
【図２】異性化又は光学的反転したペプチドに対してポリクローナルウサギ抗体が有する特異性を示すＥＬＩＳＡ（ＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡ）の結果を示す；
【図３】異性化又は光学的反転したペプチドに対してモノクローナルウサギ抗体が有する特異性を示すＥＬＩＳＡ（ＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡ）の結果を示す；
【図４】図2のＥＬＩＳＡを血清及び滑液試料に対して適用した結果を示す；
【図５】ＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡを若年性リューマチ性関節炎の患者及びコントロールに対して適用した結果を示す；
【図６】ＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡを骨関節症の患者及びコントロールに対して適用した結果を示す（実施例７）；
【図７】ＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡを骨関節症の患者及びコントロールに対して適用した結果を示す（実施例８）；
【図８】実施例４のＣＬＰ試験法をＲＡ患者から得た血清とコントロール及び滑液試料に対して適用した結果を示す（実施例９）；
【図９】ＣＬＰ ＥＬＩＳＡをＯＡ患者から得た血清とコントロールに対して適用した結果を示す（実施例１０）；及び
【図１０】ＯＡ患者及びコントロールに対して得られたＡＧ１−１ ＥＬＩＳＡ：ＣＬＰ ＥＬＩＳＡ結果の比率を示す。
Claims (11)
- 生物学的試料中において、異性化したか又は光学的反転したアグリカン又はＣＬＰの断片の量を測定するイムノアッセイ法であって、前記アグリカン又はＣＬＰの断片は、
アグリカン由来のアミノ酸配列であるＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−*Ａｓｘ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒを含む少なくとも一種のタンパク質断片、
アグリカン由来のアミノ酸配列であるＴｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−*Ａｓｘ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐを含む少なくとも一種のタンパク質断片、又は、
ＣＬＰ由来のアミノ酸配列であるＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇを含む少なくとも一種のタンパク質断片
（ここで、*Ａｓｘは、αＤ Ａｓｐ若しくはαＤ Ａｓｎであり又はβＬ Ａｓｐ若しくはβＤ Ａｓｐである）
である方法。 - 前記測定法が、*Ａｓｘを含んで成るアミノ酸配列に特異的に結合する免疫学的結合パートナーを用いて実施される、請求項１に記載された方法。
- 前記免疫学的結合パートナーが、アグリカン又はＣＬＰのアミノ酸残基により囲繞される*Ａｓｘを含んで成るアミノ酸配列を有する合成ペプチドに対して産生された抗体であって、請求項１に記載の配列のいずれかに対する免疫学的結合特異性を有する、請求項２に記載された方法。
- アグリカン由来のアミノ酸配列であるＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−*Ａｓｘ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ、
アグリカン由来のアミノ酸配列であるＴｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−*Ａｓｘ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ、又は、
ＣＬＰ由来のアミノ酸配列であるＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ
（ここで、*Ａｓｘは、αＤ Ａｓｐ若しくはαＤ Ａｓｎであり又はβＬ Ａｓｐ若しくはβＤ Ａｓｐである）
を含むアグリカン又はＣＬＰ由来の異性化又は光学的反転した断片の一種以上の、ＯＡ又はＲＡの重篤度を診断するか又は判定・評価するためのインビトロ測定法における使用。 - アグリカン由来のアミノ酸配列であるＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−*Ａｓｘ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ、
アグリカン由来のアミノ酸配列であるＴｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−*Ａｓｘ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ、又は、
ＣＬＰ由来のアミノ酸配列であるＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ
（ここで、*Ａｓｘは、αＤ Ａｓｐ若しくはαＤ Ａｓｎであり又はβＬ Ａｓｐ若しくはβＤ Ａｓｐである）
に特異的に結合する免疫学的結合パートナーの、ＯＡ又はＲＡの重篤度を診断するか又は判定・評価するためのインビトロ測定法における使用。 - アグリカン由来のアミノ酸配列であるＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−*Ａｓｘ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ、
アグリカン由来のアミノ酸配列であるＴｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−*Ａｓｘ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ、又は、
ＣＬＰ由来のアミノ酸配列であるＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ
（ここで、*Ａｓｘは、αＤ Ａｓｐ若しくはαＤ Ａｓｎであり又はβＬ Ａｓｐ若しくはβＤ Ａｓｐである）
に特異的に結合する免疫学的結合パートナー。 - 請求項６に記載された免疫学的結合パートナーであるモノクローナル抗体を産生する細胞株。
- Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−*Ａｓｘ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ、若しくは、
Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−*Ａｓｘ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ
の配列を含むアグリカンの部分配列、又は、
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ
の配列を含むＣＬＰの部分配列
からなる、長さが２０までのアミノ酸から成るペプチド。
（ここで、*Ａｓｘは、αＤ Ａｓｐ若しくはαＤ Ａｓｎであり又はβＬ Ａｓｐ若しくはβＤ Ａｓｐである。） - 請求項８に記載されたペプチドの、アグリカン又はＣＬＰの断片の測定における使用。
- 免疫学的結合剤への結合競争剤として機能する請求項８に記載のペプチドの存在下において生物学的試料を免疫学的結合剤と接触させるイムノアッセイ法。
- （ａ）以下のアミノ酸配列：
アグリカン由来であるＧｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−*Ａｓｘ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ、
アグリカン由来であるＴｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−*Ａｓｘ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ、又は、
ＣＬＰ由来であるＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ
に特異的に結合する免疫学的結合パートナー、又は、
（ｂ）Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−*Ａｓｘ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒ、若しくは、
Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−*Ａｓｘ−Ｍｅｔ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ
の配列を含むアグリカンの部分配列、又は、
Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ
の配列を含むＣＬＰの部分配列
からなる、長さが２０までのアミノ酸から成るペプチド
を含む試験キット。
（ここで、*Ａｓｘは、αＤ Ａｓｐ若しくはαＤ Ａｓｎであり又はβＬ Ａｓｐ若しくはβＤ Ａｓｐである。）
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