CN1425136A - 异构化和/或旋光转化的蛋白的测定 - Google Patents

Abstract

一种免疫测定方法，包括对生物样品中源于软骨的异构化或旋光转化的非胶原蛋白或该蛋白的一个或多个异构化或旋光转化片段的数量进行免疫学测定。该方法可以测定所述生物学样品中含至少一个＊Asx或＊Glx的蛋白或蛋白片段的数量，其中＊Asx是αD Asp或Asn，或是βL或βD Asp，而＊Glx是αD Glu或Gln，或是γL或γD Glu。所述蛋白可以是聚集蛋白聚糖、CLP、COMP或CILP，或所述片段是聚集蛋白聚糖、CLP、COMP或CILP的片段。

Description

异构化和/或旋光转化的蛋白的测定

本发明涉及对生物学样品如体液中的非胶原软骨蛋白及其片段的免疫测定。这些蛋白和蛋白片段可以作为关节疾病的指标。

类风湿性关节炎(RA)是一种严重的慢性和进行性疾病，它影响了发达和发展中国家约1％的人口(Harris，1993)。虽然类风湿性关节炎的病因牵涉环境、遗传和发育因素，但现在普遍认为RA是一种自身免疫疾病。骨关节炎(OA)是一种影响了发达世界中8％以上人口的慢性病。这种病同样影响了关节的软骨，而尽管已经发现了作为该病病理生理学一部分的一种免疫成分，但并未将OA视为一种自身免疫病。

RA和OA的主要临床症状是软骨的异常和退化。然而直到现在还难以对关节炎病人正在损伤的软骨进行直接评定，这是因为在临床实践应用中还无法得到用于这个过程的特异性指标(Mller，1998)。在RA的临床诊断时，主要根据疾病症状、功能性损伤如疼痛和由关节损伤引起的活动能力问题来对病人下结论。虽然已引入了一系列标准化的评价体系，但难以定量这些参数(Stucki等，1997)。其它用于诊断RA病人的指标，如C-反应蛋白和类风湿性因子是在涉及疾病的炎症过程中的特异性指标，但并不直接涉及软骨损伤程度，因而它们对RA是非特异性的(Wollheim，1996)。目前，获得关节炎病人(个体)关节状况信息的最好方法是采用放射线性检查。

对由疾病引起的关节损伤而出现的代谢物如透明质酸盐和聚集蛋白聚糖(aggrecan)片段的检测已有报道(Mller，1998；Wollheim，1996)。但，这些指标在临床上的有效性仍有待证实。

本发明是基于一种新方法，用于鉴别软骨退化指标，和建立诊断和预测化验来监测关节疾病。我们已表明关节软骨的特异性成分倾向于异构化和/或旋光转化(图1)，并且我们已经鉴别出几种软骨蛋白中的特异性异构化/旋光转化的倾向位点。我们还证实了软骨蛋白的异构化和/或旋光转化片段存在于循环中，并且对这些片段的检测提供了关节软骨退化的一种指标。

一些敏感蛋白中的天冬氨酸和天冬酰胺(Asx)以及谷氨酸和谷氨酰胺(Glx)残基将会发生自发性重排，其中Asx和Glx残基及相邻残基之间正常的肽键从侧链的正常的α-羧基基团转移到β-羧基基团(对于Glx残基为γ-羧基基团)(Clarke，1987)。异构化反应通过酰亚胺中间体进行，其在自发性水解时可以形成以下四种形式之一：普遍存在为αL，异构型βL，或是如在下面的天冬氨酸-甘氨酸的反应方案中所概述的两种旋光转化型αD和βD。(该反应类似地发生于其它包含Asx和Glx的敏感性序列。)

相邻天冬氨酰残基的侧链羰基被肽主链上的氮攻击后可导致形成酰亚胺环，(A→B)。该酰亚胺环倾向于水解和旋光转化，产生D和L两构型的肽和异肽。旋光转化经由一种负碳离子中间体(D、E和F)进行，既可以通过直接去质子(ADG或CFI)也可经由酰亚胺途径(BEH)。所有图中的肽主链用粗线表示。

然而，为了形成环酰亚胺(和异构化/旋光转化)，Asx或Glx残基周围的三维结构必须具有最适的构象和足够的柔性(Geiger和Clarke，1987)。

研究表明，肽和蛋白中的Asx残基的旋光转化主要经由酰亚胺途径(BEH)(Geiger和Clarke，1987；Radkiewics等，1996)。然而，其它途径如直接去质子或亚氨基-δ-内酯结构的形成也有助于旋光转化(Radkiewics等，1996)，但一般认为这些途径较不重要(Geiger和Clarke，1987；Radkiewics等，1996)。

上述的经由酰亚胺中间体的异构化和旋光转化是一个自发的反应，该反应在生理条件下缓慢地进行(Geiger和Clarke，1987；Fledelius等，1997)。如所有的化学反应一样，可以通过提高温度来加快该反应的速度。

在蛋白或肽中引入这种结构变化对其功能、稳定性、和理化特性具有显著的影响。在其它特性中，相对于只由αL氨基酸组成的蛋白和肽，含有异构化肽键和/或旋光转化的氨基酸的蛋白和肽的蛋白水解降解显著减少(Rafferty等，1988)。因此，含有这种修饰的蛋白片段在正常组织更新时不会降解至相同程度(Van Regenmortel & Muller，1998)，而且其更倾向于以可检测的浓度存在于循环中。此外，在检测含有异构化和/或旋光转化的肽键的蛋白或蛋白片段时，新合成的分子将不对这种检测作出贡献，因此它将反映正在进行的降解过程。

在WO96/30765中，我们公开的I型胶原的异构化片段提供了一种改进的骨再吸收的指标，还进一步公开了II型胶原(如在软骨中发现的)也含有潜在的异构化位点。

我们已经证实了关节软骨是一种代谢非常缓慢的组织，它含有可以产生异构化和旋光转化的非胶原蛋白；而且我们已经证实，对这些蛋白或其片段的检测，可以提供一种潜在的用于评定和监测关节病如RA或OA的关节软骨退化的诊断指标。

本发明提供了一种检测方法，包括测定生物学样品如体液或组织样品中源于软骨的异构化或旋光转化的非胶原蛋白的量，或是来自这种蛋白的一个或多个异构化或旋光转化的片段的量。

特别重要的蛋白包括聚集蛋白聚糖和软骨连接蛋白。

聚集蛋白聚糖是软骨关节的一种主要结构成分，而且已经被研究用于作为诊断关节病的潜在生物指标，同时被推定为是RA和该疾病动物模型中的一种自身抗原(Poole & Dieppe，1994；Glant等，1998)。

所述蛋白是一种含有多于2000个氨基酸残基的高糖基化的大蛋白。聚集蛋白聚糖的结构表现为三个显著的结构域：G1、G2和G3。G1结构域一般被作为在聚集蛋白聚糖中产生最初免疫原性的结构域(Glant等，1998)。这个球状结构域作为与透明质酸多聚体的“连接体”，且与软骨链接蛋白(CLP)相接触。在关节炎动物模型中被鉴定为免疫系统靶、而且还作为G1结构域软骨聚集蛋白聚糖酶或基质溶素的特异性剪切位点的特征性抗原决定部位是：..N(₃₆₈)ITEGE(含有一个N-链接糖基化的共有序列)；₃₇₄ARGSVI..；..VDIPEN₃₄₁(Dudhia等，1996)。而且，已有文献指出了聚集蛋白聚糖中的天冬氨酸易发生外消旋(Maroudas等，1998)。

我们已经确定了聚集蛋白聚糖的G1结构域(称为AG1-1)的抗原决定部位GRVRVNSAY中的天冬酰胺残基是异构化/旋光转化的易感位点。在下述实例中，我们列举的试验和临床数据支持了测定异构化和/或旋光转化的AG1-1对监测RA具有临床价值的观点。

软骨链接蛋白(CLP)与透明质酸和聚集蛋白聚糖相结合，对于将聚集蛋白聚糖稳固地锚定于透明质酸多聚体可能起着重要作用。该分子结合聚集蛋白聚糖的G1结构域，且与这个蛋白具有结构类似处(Poole & Dieppe，1994)。作为软骨损伤的一种潜在指标，软骨链接蛋白几乎未受关注，但对该软骨蛋白的自身免疫性表明，在该疾病动物模型中诱发RA(Zhang等，1998)。然而，该蛋白可以是后期损伤的一种良好指标，该损伤发生于聚集蛋白聚糖降解至足以与链接蛋白(和G1结构域)接触的程度。该链接蛋白还能诱发啮齿类动物自身免疫性关节炎，而免疫显性抗原决定部位则位于蛋白的N-端以及由聚集蛋白聚糖(和中枢神经系统(CNS)的透明质酸结合蛋白，如神经蛋白聚糖和短蛋白聚糖/BEHAB)占有的两个区域，这些区域包含推定的用于透明质酸结合的共有序列。这里，选择一种这样的序列作为范例。潜在的异构化位点下边画线。用黑体字指出了与聚集蛋白聚糖的G2结构域的一个氨基酸差异(保守取代)。

                     AGWLA DGSVRYPI

软骨寡聚间质蛋白(COMP)是非胶原糖蛋白(Neidhart等，1997)，它的生理功能还未确定。在早期OA和RA的病人中发现，随着早期迅速的累积性关节损伤，COMP的水平增高，稍后则减少。

软骨中间层蛋白(CILP)是非胶原软骨蛋白，由单独一条分子量为91.5KDa的肽链组成，包括N-链接的寡聚糖(Lorenzo等，1998a和1998b)。

所述蛋白由软骨细胞合成，位于软骨之间。在关节软骨的表面和最深层均没有发现该蛋白。据报道CILP会随着年龄的增长而增加，并被提出可作为早期OA的一个指标。

优选地，本方法确定所述生物样品中含有至少一种*Asx或*Glx的蛋白或蛋白片段的数量，其中，*Asx是αD Asp或Asn，或是βL或βDAsp，而*Glx是αD Glu或Gln，或是γL或γD Glu。

优选地，天然蛋白的Asx/Glx邻近有甘氨酸或丝氨酸，因为这能促进异构化或旋光转化。

所述蛋白优选是聚集蛋白聚糖、CLP、COMP或CILP，或所述片段是聚集蛋白聚糖、CLP、COMP或CILP的片段。

优选地，所述方法测定含有源自以下氨基酸序列：Gly-Arg-Val-Arg-Val-*Asx-Ser-Ala-Tyr的聚集蛋白聚糖的至少一种蛋白或蛋白片段的数量；或是测定含有源自以下氨基酸序列：Tyr-Leu-Ala-Trp-Gln-Ala-Gly-Met-*Asx-Met-Cys-Ser-Ala-Gly-Trp的聚集蛋白聚糖的至少一种蛋白或蛋白片段的数量；或是测定含有源自以下氨基酸序列：Ala-Gly-Trp-Leu-Ala-*Asx-Gly-Ser-Val-Arg的CLP的至少一种蛋白或蛋白片段的数量。

所述的测定优选使用一种免疫结合配体进行，该配体特异性地结合含有侧面是非胶原软骨蛋白氨基酸残基的*Asx或*Glx的氨基酸序列。该免疫结合配体应在一定程度上能区别含有*Asx或*Glx的序列和含有αL Asx或αL Glx的相应序列，从而足以提供一个有用的检测。检测/抗体对相应的抗原/抗原决定部位的αL构型的交叉反应性应小于25％，优选小于5％。

合适的是，该免疫结合配体是对含侧面是非胶原软骨蛋白氨基酸残基的*Asx或*Glx的合成肽出现的抗体，或是对所述肽具有免疫结合特异性的所述抗体的片段。

因此上述肽的氨基酸序列优选相应于所述蛋白的特征序列，在该蛋白序列中由*Asx或*Glx替代αL Asp、Asn、Gln或Glu，即相应于对所讨论的蛋白基本独特的序列。合适的是，所述肽长度为6-50个氨基酸，例如长度为6-15个氨基酸。

所述测定可用于提供关节病的一种指标。这可以有助于对严重性进行初步诊断或评估或监测治疗效果。

本发明包括的上述方法还包括对关节病的第二指标进行测定和对数学结合的所述两个指标的参数值进行确定。所述第二指标也可以根据本发明的方法导出。

本发明包括源于软骨的异构化或旋光转化的非胶原蛋白或一个或多个这种蛋白的异构化或旋光转化片段在检测中的应用。本发明还包括利用能特异性结合含有*Asx或*Glx的氨基酸序列的免疫结合配体在体外诊断或鉴定OA或RA的严重性，其中*Asx或*Glx侧面是非胶原软骨蛋白的氨基酸残基。

本发明进一步提供免疫结合配体，该配体特异性地结合含有侧面是非胶原软骨蛋白的氨基酸残基的*Asx或*Glx的氨基酸序列。本发明还包括产生这种免疫结合配体的单克隆抗体的细胞系。

本发明还提供一种肽，优选不超过50个氨基酸残基，更优选是不超过20个氨基酸残基，如6-50个氨基酸残基或更优选是6-15个氨基酸残基，这些氨基酸的长度包含侧面是非胶原软骨蛋白的氨基酸残基的*Asx或*Glx，并用这种肽来检验蛋白或蛋白片段。

本发明包括一种免疫测定方法，其中生物学样品与一种免疫结合剂在作为与该免疫结合剂结合的一种竞争试剂的肽存在下进行接触。

本发明包括一种检测试剂盒，包括(a)如上定义的免疫结合配体或(b)如上描述的肽，并结合(a)或(b)中的另一个，及任选地结合一个或多个用于免疫测定的装置、结合的抗体—酶，抗体—酶结合物中酶成分的底物，酶—底物反应终止组合物，洗液，结合到所述结合配体上的载体或结合到所述结合配体上的可检测指标。

本发明并不局限于酶的免疫测定，还包括任何现有技术中已知的免疫测定方法。

所述免疫结合配体可以是单克隆或多克隆抗体。

适合的免疫结合配体还包括能结合相同抗原决定素的抗体片段，包括Fab、Fab′和F(ab′)₂片段。

测定可以采用多种形式，包括ELISA、RIA或IRMA，这些方法是本领域公知的，所以不需要进一步说明。测定可以是以均一或不均一的形式。

在竞争性检测中，上述肽可以用于和样品中一种或多种异构化或光学转化蛋白或肽竞争一种免疫结合配体。在这种类型的ELISA中，异构化和/或光学转化的合成肽可以被固定在固体支持物上。将样品和与固体支持物中的合成肽反应的一种单克隆或多克隆抗体一起温育，经漂洗后，可加入过氧化物酶偶联的(指示性的)抗体。在进一步温育后，加入过氧化物酶底物溶液。通过竞争性作用，与抗体反应的样品中的异构化或光学转化的蛋白或肽抑制了过氧化物酶反应。

作为选择，合成肽可以用于产生单克隆免疫结合配体。这样，在检测中该合成肽不必成为竞争性试剂，例如，被酶裂解的软骨蛋白片段(如聚集蛋白聚糖)可以被纯化并固定在固体支持物上，且利用单克隆抗体便可以进行ELASA检测。

本发明可以应用于人类和动物。

适合的体液包括人或动物的尿、血液、血清、血浆和滑液。预期该方法还可以用于如唾液和汗。体液可以直接使用或在接触步骤之前加以纯化。纯化可以通过许多标准程序来完成，包括但不局限于软骨吸收和洗脱、分子筛层析法、透析、离子交换、矾土层析、羟磷灰石层析法和它们的组合。

可以根据公知的已有技术制备含有异构化肽键和/或旋光转化氨基酸残基的合成肽，如通过通常被称为“梅里菲尔德合成法”的固相肽合成技术。经典的溶液相技术也可以使用。常规的肽合成方法可以产生各种肽异构型(αL、βL、αD、βD、γL、γD)的混合物。一般说来，这种混合物将是满意的，因为正常肽在检测中将是不起作用的。然而，加热纯的αL-构型制备物将会产生异构化、旋光倒置的异构型。

制备单克隆和多克隆抗体的方法是众所周知的。如参见Campbell(1986)。通过免疫法可产生合成的异构化和/或旋光转化肽的抗体。然而，由于这些化合物的分子量相对小，因此优选与载体分子偶联的半抗原。适合的载体分子包括但不局限于牛血清白蛋白、甲状腺球蛋白、卵清蛋白、破伤风类毒素和锁眼帽贝血蓝蛋白。优选牛血清白蛋白或甲状腺球蛋白作为载体。为了呈现对产生免疫动物细胞的抗体具有最大免疫原性形式的半抗原，可以使用许多替换偶联方案。适合的方法包括但不局限于戊二醛、碳化二亚胺和高碘酸盐。优选的结合试剂是戊二醛和碳化二亚胺。

抗体的制备可以使用常规技术，包括与含有天然异构化和/或旋光转化的蛋白片段或偶联到载体上的合成肽进行免疫反应。为了提高免疫原性，优选在注射前将免疫原与佐剂混合。佐剂的例子包括但不局限于氢氧化铝、佛洛因德佐剂和免疫刺激复合体(ISCOMs)，ISOMs可以根据Morein(1984)描述的方法制备。

半抗原载体分子的单克隆或多克隆抗体均可以制备。制备单克隆抗体时优选免疫的小鼠，收集免疫小鼠的脾细胞并匀浆之，然后在聚乙二醇存在的情况下与癌细胞融合产生一个细胞杂种，该杂种产生对异构化和/或旋光转化的肽片段具有特异性的单克隆抗体。适合的癌细胞包括但不局限于骨髓癌、肝癌、恶性肿瘤和肉瘤细胞。Goding(1996)详细描述了关于单克隆抗体的生产方法。优选的初步筛选方法包括使用与载体偶联的并涂覆在微量滴定板的固体表面上的、合成的异构化和/或旋光转化肽。

为了制备与异构化和/或旋光转化的肽片段反应的多克隆抗体，可以对不同的动物品种进行免疫。适宜的品种包括但不局限于鸡、兔和山羊。优选鸡和兔。

为了适用于本发明方法，通过检测适当序列的异构化和/或旋光转化的合成肽的反应性，可以对这样制备出的抗体进行筛选。

抗体片段可以根据本领域的已知方法来制备(Ishikawa，1993)。

通过对上述制备的抗体进行免疫测定，可以检测生物学样品如没有经过预先分级或水解的体液。可通过下述方式提供对生物体液中所需片段的专一性：在检测方案中将抗体与异构化和/或旋光转化的合成肽(对它出现抗体或无论如何抗体与它是免疫化学活性的)结合使用。

另外，可以使用单克隆抗体完成免疫测定。这种检测手段将检测的特异性从抗原(蛋白的合成肽异构体)移至抗体(从兔抗血清到单克隆抗体)上。使用这种测定分析不需要进一步使用合成肽异构体。这种免疫测定的模式适宜于采用以下的方式来完成：将病人样品或一种标准溶液与微量滴定板中的与过氧化物酶偶联的抗体溶液一起温育，该滴定板预先涂有纯化的蛋白、蛋白片段、合成肽或其偶联物。漂洗后，平板上的孔与一种底物溶液在暗处温育。通过外加一种终止溶液停止显色反应，最后测定吸光率。或者可以在三明治(夹层)式的检验模式中使用一个或多个单克隆抗体。

免疫测定本身可以采用选自现有各种常规标准检测手段的任何步骤。众所周知，检测的建立是基于特异性的免疫结合配体与感兴趣的特异性分析物之间的相互作用，和利用某些方法来测定由分析物与免疫结合配体形成的复合体。免疫结合配体可以与一种固体支持物复合，作为一种能捕获分析物的免疫结合配体。这种方案可以直接进行，其中，例如通过荧光、放射性或酶的标记对形成的分析物-免疫结合配体复合体进行检测，或是通过一种竞争的形式进行，其中，被标记的标准物与分析物竞争免疫结合配体。这种形式还可以用作一种凝集测定，或是向反应混合物中加入一种合适的沉淀剂使得复合体形成沉淀。特别设计的免疫测定方案可以有多种不同的选择，且大量的临床检测设备和现有领域中可以获知的手段是多种多样的，关于这些程序的种类参见美国专利US 5001225。

抗体和用标准检测手段进行免疫测定的指示剂，如放射性同位素标记、荧光标记或ELISA，可以采用直接或竞争性形式，并可便利地以包括检测所必需的成分和用法说明的试剂盒形式提供。在本发明的一个实施方案中，这种试剂盒包括一个微量滴定板，上面涂有一层相应的异构化或旋光转化合成肽，制作标准曲线的标准溶液，用于进行定性检测分析的体液(如尿液)对照，与上述提及的合成肽异构体反应的兔抗体，与过氧化物酶偶联的抗兔免疫球蛋白，底物溶液，终止液，漂洗缓冲液和指导手册。

由于可以使用抗体和特异性合成的异构化肽进行免疫测定，可以确定适宜生物流体中相应蛋白片段序列的比率，以及它们的个体水平和它们的总量。因此，检测可被设计成包括抗体，这将导致确定几种异构化和/或旋光转化肽和任意的天然肽序列，或是确定单一异构化和/或旋光转化的肽序列，或其任何所需的组合。

下面的非限制性的实施例将参照附图对本发明作进一步的描述和说明，在附图中：

图1显示的HPLC图谱表明加热合成肽在产生异构化和旋光转化肽中的作用。

图2显示了ELISA(AG1-1 ELISA)检测结果，表明了多克隆兔抗血清的异构化和旋光转化肽的特异性；

图3显示了ELISA(AG1-1 ELISA)检测结果，表明了单克隆兔抗血清的异构化和旋光转化肽的特异性；

图4显示了将图2的ELISA应用于血清和滑液流体样品的结果；

图5显示了将AG1-1 ELISA检测应用于青少年风湿性关节炎患者和对照的结果(实施例6)；

图6显示了将AG1-1 ELISA检测应用于骨关节炎患者和对照的结果(实施例7)；

图7显示了将AG1-1 ELISA检测应用于骨关节炎患者和对照的结果(实施例8)；

图8显示了将实施例4的CLP检测应用于来自于RA患者的血清、对照和滑液流体样品的结果(实施例9)；

图9显示了将CLP ELISA检测应用于来自于OA患者的血清样品和对照体的结果(实施例10)；和

图10显示了检测OA患者和对照体的AG1-1 ELISA结果与CLPELISA结果的比率(实施例11)。

实施例1：合成AG1-1肽的异构化

合成AG1-1肽GRVRVNSAY，并以终浓度1mg/ml溶于磷酸盐缓冲液。将该肽加热到90℃4个小时，以促进异构化/旋光转化。用反相HLPC分析加热前后的肽制品。

图1显示了在90℃加热4个小时前(下面的曲线)和加热后(上面的曲线)1mg/ml AG1-1肽制品的RP-HLPC结果。

这表明，加热诱导出三种新形式的肽，它们在RP-HPLC中的持留时间与βL，αD和βD型相一致。

实施例2：源于聚集蛋白聚糖G1结构域抗原决定基的βL构型抗血 清的制备和特异性分析。

主要依据Hermanson(1996)所述方法来制备AG1-1肽的CDI偶联物。简言之，CDI偶联物的制备过程如下：将100mg的甲状腺球蛋白溶于10ml pH值为6.0的0.05M MES、0.5M NaCl中至浓度为10mg/ml。加入100μl以下两种试剂(终浓度为4mM CDI，相对于甲状腺球蛋白对CDI约100倍摩尔过量，和10mM NHS)，且将此溶液在室温(18-22℃)混合15分钟。CDI：0.4M CDI贮存液：在使用前立即制备76.7mg混于1ml水的溶液，NHS：1M硫代-NHS贮存液：在使用前立即制备217.1mg混于1ml水的溶液。

通过在四个NAP25脱盐柱(Pharmacia，Sweden)上的凝胶过滤，过量的交联反应物被移进10mM pH9.0的磷酸钠溶液中。合并经脱盐激活的甲状腺球蛋白，分成2ml的6份。凝胶过滤后，立即把肽溶液(在pH9.0的磷酸钠溶液中浓度为4mg/ml，取2ml)，加到每个小瓶中，同时用一种不相关的肽进行对照偶联实验，在室温下进行偶联反应两个小时。

通过在Sephadex G25柱(Pharmacia，Sweden)上进行凝胶过滤，把每种偶联物转移到PBS(pH7.4)中，将在PBS中的浓度调至2mg/ml。

在磷酸盐缓冲液(PBS)中用1ml 0.25mg/ml的疫苗对兔子(SSC：CPH系)进行皮下免疫，该缓冲液中含有50％的甫洛因德不完全佐剂。在初次免疫后每间隔两个星期后给予兔子促升剂量。三次促升后，每隔一个月给予随后的促升免疫。在免疫前收集前一次免疫后的血样，在第二次免疫后一个星期收集检测用的血样来监测血清抗体的水平。接着在第5次和第6次免疫后一个星期收集血样。

在一个涂有10ng/ml BSA-BS³-AG1-1偶联物的MTP上检测兔血的特异性，BS³偶联物按以下方式制备：

AG1-1β肽(GRVRVD-β-SAY)溶于新鲜滤过的PBS至2mg/ml，载体蛋白(BSA，牛血清白蛋白)制备成在PBS中3mg/ml的浓度。在1.5ml聚丙烯管(Eppendorf，德国)中将200μl载体蛋白与200μl肽溶液混合。这相应于肽对载体蛋白约50倍摩尔过量。用5mM pH5.0的柠檬酸钠新鲜制备成6mg/ml的BS³(双琥珀酰亚胺辛二酸盐)溶液。向载体和肽溶液中加入50μl的交联剂，并在室温条件下将之置于混合器上进行涡旋(与载体蛋白相比，这相应于25倍摩尔过量的交联剂)。30分钟温育后，向溶液中加入50μl 0.25M pH7.5的甘氨酸。再继续温育15分钟，随后将偶联物在NAP5柱(Amersham Pharmacia，Uppsala，瑞典)上脱盐，并测定蛋白浓度。

为了获得适当的ELISA信号，采用合适的稀释法用含有1％BSA和0.1％Tween的PBS溶液稀释兔抗血清。这种竞争检测模式中结合的抗体可以通过使用第二过氧化物酶来测定，其中该酶与山羊抗兔抗体和生色过氧化物酶底物偶联。

使用一种AG1-1抗血清建立起一种血清检测，这种检测是在一个涂有10ng/ml BSA-BS³-AG1-1的板上以一种竞争性测定来进行的。在孔里移液20μl样品或标准物，然后加入在300mMTris、0.1％Tween 20和pH8.0(TBT)的1％BSA中适当稀释的100μl AG1-1特异性抗体。将板在20℃温育60分钟，在(TBT)中漂洗5次，将适当稀释于100mMpH7.4的Tris、0.4g/1 4-氨基安替比林(4-Amino-anti-pyrine)、0.012％Bronidox(细菌抑制剂)、0.1％Tween 20和20％胎牛血清(K5缓冲液)的100μl第二过氧化物酶偶联的山羊抗兔抗血清加入每个孔。所述板在20℃温育60分钟，在(TBT)中漂洗5次，通过使用生色的过氧化物酶底物将结合抗体定量。

图2表明用涂有BSA-BS³-AG1-1的板进行的竞争结合AG1-1的特异性ELISA。多克隆的AG1-1特异性兔抗血清和AG1-1肽制品以没有“沸腾的”(三角形)或在90℃加热4个小时(正方形)表示。AG1-1ELISA表明与未沸腾的形式比较，“煮沸的”肽制品的反应性高了7倍。

AG1-1特异性抗血清对“煮沸”型肽的优先表明它可以优先识别一个或多个异构化和/或旋光转化型(βL、αD或βD)。

实施例3：特异于源于聚集蛋白聚糖G1结构域抗原决定基的βL构 型的单克隆抗体的制备及其特异性分析

主要依据Hermanson(1996)所述方法来制备与AG1-1肽偶联的CDI，CDI偶联物的制备简要描述如下：把100mg甲状腺球蛋白溶于10ml pH值为6.0的0.05M MES、0.5M NaCl中至浓度为10mg/ml，再加入100μl以下两种试剂(至终浓度为4mM CDI，CDI比甲状腺球蛋白超出约100倍摩尔，和10mM NHS)，且将溶液在室温(18-22℃)混合15分钟。在使用前制备新鲜的0.4M CDI贮存液：将76.7mg混于1ml水的溶液，同样在使用前新制备NHS：1M硫代-NHS贮存液：将217.1mg混于1ml水的溶液。

通过在四个NAP25脱盐柱(Pharmacia，Sweden)上的凝胶过滤(用10mM pH9.0的磷酸钠溶液进行)，除去过量的交联反应物。合并经脱盐激活的甲状腺球蛋白，分成2ml的6份。立即把下列凝胶过滤后的肽溶液加到每个小瓶中：溶于pH9.0的磷酸钠溶液中浓度为4mg/ml，取2ml，同时用一种不相关的肽进行对照的偶联实验。该偶联反应在室温下进行两个小时。

通过在Sephadex G25柱(Pharmacia，Sweden)上进行凝胶过滤，把每种偶联物变到PBS(pH7.4)中，并将在PBS中的浓度调至2mg/ml。

用200μl 0.125mg/ml的置于磷酸盐缓冲液(PBS)中的疫苗对小鼠(Balbc×CF1雌性系)进行皮下免疫，该缓冲液中含有50％的甫洛因德不完全佐剂。在初次免疫后每隔两星期免疫一次，共8个星期以增强小鼠(的免疫性)。在免疫前收集前一次免疫后的血样，在第二次免疫后一个星期收集检测用的血样来监测血清抗体的水平。接着在第5次和第6次免疫后一个星期收集血样。

在一个涂有10ng/ml BSA-BS³-AG1-1偶联物的MTP上检测小鼠血清样品的特异性，为了获得适当的ELISA信号，采用合适的稀释法用含有1％BSA和0.1％Tween的PBS溶液稀释小鼠血清。这种竞争检测模式中的结合抗体可以通过使用第二过氧化物酶来测定，其中该酶与兔抗小鼠抗体和一种生色过氧化物酶底物偶联。

产生单克隆抗体的杂交瘤主要按Khler和Milstein (22)的描述来制备，并加以如前所述 (7，23)的改进。在47％聚乙二醇(PEG)和7.5％的二甲基亚枫(DMSO)存在下，将小鼠的脾细胞与Ag8x 63.653骨髓瘤细胞 (24)以约2∶1的比例融合。脾细胞置于人内皮细胞培养上清夜(HACS，Costar，F1，USA)。接着在含有次黄嘌呤-氨嘌呤-胸苷(HAT)的介质中进行选择，在主要如 (7)描述的进行的间接ELISA检测中，可以通过培养上清夜来筛选能识别消化II胶原的胶原酶的抗体。选择的细胞系至少克隆三次，并在含有2％胎牛血清的RPMI-1640培养基中增殖。根据厂商的用法说明书(Pharmacia，Uppsala，瑞典)，使用蛋白A经过亲和层析从培养上清液分离出单克隆抗体。其简要描述了一个装填了蛋白A琼脂糖4B的10×1cm(10ml)柱，并用0.1MpH8.8的Tris溶液平衡。2升培养上清液经过一个Nalgene 0.45μn的过滤器过滤，再加入200ml 1M pH8.8的Tris溶液。培养上清液以1ml/min的速度加于柱上，接着用100-150ml 0.1M pH8.8的Tris溶液冲洗柱子。用0.1M pH3.0的氨基乙酸将结合的免疫球蛋白从柱子上洗脱下来，置于装有50μl 1M pH8.8的Tris溶液的小管中。使用IsoStrip^TM同形像试剂盒(Boehringer Mannheim GmbH，Munich，Germany)鉴定亚类的单克隆抗体。

使用一种AG1-1单克隆抗体(称为MabF49)建立起一种血清检测方法，这种检测是作为一种竞争性检测在涂有链霉抗生素蛋白微量滴定板(Exiqon，Trrd，丹麦)上进行的。平板用漂洗缓冲液(25mMTris，51mM Nacl，0.1％Tween 20，pH7.2)漂洗三次，与每孔100μl的以含0.1％Tween 20的PBS稀释成1.25ng/ml生物素化的AG1-1βL肽(生物素-GRVRVD-β-SAY)一起温育，在摇床(300RPM)于20℃温育30分钟后，把50μl样品或校准物移入孔中，接着加入100μl AG1-1特异性单克隆抗体F49，该抗体稀释于：

pH6.0，100mM Tris，50mM MES，50mM CaCl₂，5％山梨醇，1％BSA，0.02％Tween 20，0.4g/l 4-氨基安替比林，0.012％Bronidox(细菌抑制剂)(检测缓冲液)。平板于4℃过夜温育(18-24小时)，用漂洗缓冲液漂洗5次，在每个孔内加入100μl适当稀释于检测缓冲液的与兔抗小鼠抗血清偶联的第二过氧化物酶。平板在20℃温育60分钟，在TBT中漂洗5次，通过使用生色过氧化物酶底物将结合的抗体定量。

图3表明按如上所述进行的AG1-1特异性单克隆ELISA检测中结合的竞争性，AG1-1肽(GRVRVNSAY)的非异构化(αL)和异构化(βL)构型或源于I型胶原C-端肽(EKAHDGGR，CTx)的对照肽的制备。AG1-1ELISA表明异构化βL肽制品的反应性高于αL型500以上。

实施例4：特异于源于抗原决定基的软骨连接蛋白(CLP)的抗血 清的制备

源于与甲状腺球蛋白配对的肽：Ala-Gly-Trp-Leu-Ala-Asx^*-Gly-Ser-Val-Arg的CLP与CDI的偶联物按实施例2中描述的方法准备。为了促进异构化和/或旋光转化，在偶联之前将CLP肽在90℃加热4个小时。Thy-CDI-CLP偶联物用于对兔子进行免疫，如实施例2中所描述的一样。

分离的偶联物用于初步筛选兔血，其中使用了一种BS³琥珀酰亚胺共价的交联物和BSA作为载体蛋白(根据：Greg T.Hermanson，‘Bioconjugate techniques’(‘生物偶联技术’))，1996，AcademicPress，San Diego，USA)。

兔血特异性的检测在涂有10ng/ml BSA-BS³-CLP偶联物的MTP上进行。为了获得适宜的ELISA检测信号，将兔抗血清用含有1％BSA和0.1％Tween的PBS溶液稀释。在这种竞争性检测模式中，结合抗体的检测是通过使用了一种与山羊抗兔抗体和一种过氧化物酶生色底物偶联的第二过氧化物酶来进行的。

选择有最好反应的兔抗血清来建立CLP特异性检测。这种检测是作为一种在涂有10ng/ml BSA-BS³-CLP的平板上的竞争性检测。吸移20μl样品或校准物至平板孔内，接着加入100μl用TBT适当(300mMTris、0.1％Tween 20、1％BSA、pH8.0)稀释的CLP特异性抗体。平板在20℃温育60分钟，在TBT里漂洗5次，在每个孔中加入100μl与以K5缓冲液适当稀释的山羊抗兔抗血清偶联的第二过氧化物酶。然后平板在20℃温育60分钟，在TBT里漂洗5次，通过使用过氧化物酶生色底物来定量结合抗体的数量。

实施例5：AG1-1 ELISA中优先识别抗原决定基的异构化和/或旋 光转化构型的测量对监测RA患者的临床价值

在上述检验中要测定RA患者及相应年龄对照者的血清样品，而且要按实施例2所述那样在AG1-1 ELISA中检测滑液流体。

图4表明了来自于RA患者和对照的血清样品在AG1-1特异性检测中的测定结果。在图的右边，显示了测定的四个滑液流体样品的结果。表明这种检测用于滑液流体样品效果是显著的。通常由于其它蛋白存在的间质效应，滑液流体会产生太高的背景，从而针对一种软骨蛋白片段的ELISA检测会出现不同的结果。

数据表明循环中的AG1-1肽片段的异构化/旋光转化构型的测定产生的临床估计值可用于诊断、监控和治疗RA患者，及用于临床估计关节疾病患者的软骨损坏。

实施例6：AG1-1 ELISA中优先识别抗原决定基的异构化和/或旋 光转化构型的测量对监测JRA患者(青少年风湿性关节炎)的临床价 值

另外进行了如实施例2描述的AG1-1血清ELISA的临床估测，血清样本来自于青少年风湿性关节炎(JRA)患者及年龄相仿的对照组。图5显示了检测30个JRA患者和32个年龄相仿的正常人的结果。非参数T-检测(Mann-Whitney，双跟踪的)显示了相对于对照组，JRA患者平均的AG1-1浓度显著地提高了(P＜0.0001)。在这个实验中，还发现了关节病患者中有显著的提高。注意到完全缺乏与血清交叉重叠测定(r＝0.05，数据没有给出)的联系。血清交叉重叠的一步ELISA是一种特异于异构化软骨I型片段(Rosenquist等，1998)，这种检测中的量度特异地反应了骨的再吸收。因此在AG1-1检测和血清交叉重叠测定之间缺少相关表明AG1-1检测是不受破骨细胞再吸收过程中释放的I型胶源的代谢物影响的。通过注意JRA的诊断，一种与时间的相关(r＝0.44)表明：在最新诊断的以最高速度出现关节软骨损伤的没有治疗的患者中其AG1-1的浓度极大地提高了。

实施例7：AG1-1 ELISA中优先识别抗原决定基的异构化和/或旋 光转化构型的度量对监测OA患者的临床价值

为了提供对如实施例2描述的AG1-1检测的临床价值的评估，从而来加强对OA中软骨代谢的估计，在如上所述的检测中测定了来自于OA患者及年龄相仿的对照组的血清样品。共测定了40个最近诊断的OA患者样品和40个年龄相仿的正常人样品。图6显示了在AG1-1特异性检测中来自于OA患者和对照组的血清样本的测定结果。所有OA样品测定值高于对照样品(P＜0.0001，双跟踪非参数的T-检测，Mann-Whitney)。

图6中出现的数据表明了循环中的AG1-1肽片段的异构化/旋光转化构型的测定对于诊断/监测OA患者，及临床估计关节疾病患者的进行性软骨损坏有临床价值。

实施例8：AG1-1 ELISA中优先识别抗原决定基的异构化和/或旋 光转化构型的度量对监测OA和RA患者的临床价值

在如实施例3描述的单克隆AG1-1β检测中，测定了OA患者和来自于没有关节炎或其它影响关节或软骨代谢的疾病的健康个体的血清样品。共测定了39个最近诊断的OA患者样品、16个RA患者样品和18个年龄相仿的对照组样品。图7显示了来自于OA患者和对照组的血清样品的AG1-1β特异性检测结果。所有OA和RA样品测定值高于对照样品(P＜0.0001，双跟踪非参数的T-检测，Mann-Whitney)。

图7中出现的数据表明了循环中的AG1-1肽片段的β-Asp异构化构型的测定对于诊断/监测OA患者，及临床估计关节疾病患者的进行性软骨损坏有临床价值。

实施例9：RA患者样品的CLP特异性ELISA测定的临床价值

通过测定来自于RA患者和相应对照组的样品对实施例4描述的CLP检测的临床价值进行评定。如图4显示的带有AG1-1测定值的相同样本系列也在CLP ELISA中进行了测定。图8表明RA患者、对照组，和滑液流体样品的CLP血清ELISA测定结果。RA组的平均浓度是111.5ng/ml，对照组为48.94ng/ml，两者之间的差异通过双跟踪非参数的T-检测(Mann-Whitney)评定为统计学显著(p＝0.017)。

CLP检测和AG1-1检测的估计值之间有非常高的相关性(r＝0.82，剔除一个RA样品)。

实施例10：OA患者样品的CLP特异性ELISA测定的临床价值

对实施例4描述的CLP检测的临床效能进行进一步的评定。图6中描述的来自于最近诊断的活动性OA患者的样品系列也在CLP检测中进行了测定。图9显示了来自于OA患者和对照组的血清样品在使用兔I99025的抗血清的CLP血清ELISA中的差异(与在图4所示的AG1-1ELISA测定中同样的患者群)。OA组的平均浓度是20.6ng/ml，对照组为47.3ng/ml，两者之间的差异通过双跟踪非参数的T-检测(Mann-Whitney)评定为统计学显著(p＜0.0001)。对OA患者测定的CLP浓度显著低于对照组。

实施例11：CLP和AG1-1估测值之间的算术比率的对于评估关节 病的临床价值

通过计算OA患者和对照的AG1-1和CLP测定值(实施例7和10)得出两者之间的比率。图10表示了在图4和6中显示的OA患者及对照人群AG1-1和CLP测定值之间的比率。两组人群之间的差异是高度显著的，这就允许建立起一个作为“病理的比率”绝对排除值。差异高度显著，其p＜0.0001(双跟踪非参数的T-检测)，T值为22.4。

根据两组之间高度显著的差异，显然可以确定这个比率的一个绝对排除值，作为正常或非正常关节代谢的个体患者之间允许存在允许差异。这个比率很适于判断“病理的”关节代谢它为全身关节代谢检测提供了一个标准化的简便方法。

鉴于本发明是以一些具体特例来描述的，故很多变动情况也可能是在本发明的范畴之内。

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Claims (20)

1.一种免疫测定法，包括对生物学样品中源于软骨的异构化或旋光转化的非胶原蛋白的数量或该蛋白的一个或多个异构化或旋光转化的片段的数量进行免疫学测定。

2.权利要求1的方法，该方法测定所述生物学样品中含有至少一个*Asx或*Glx的蛋白或蛋白片段的数量，其中，*Asx是αD Asp或Asn，或者是βL或βD Asp，而*Glx是αD Glu或Gln，或是γL或γDGlu。

3.权利要求2的方法，其中，所述蛋白是聚集蛋白聚糖、CLP、COMP或CILP，或所述片段是聚集蛋白聚糖、CLP、COMP或CILP的片段。

4.权利要求3的方法，其中测定含有源自氨基酸序列Gly-Arg-Val-Arg-Val-*Asx-Ser-Ala-Tyr的聚集蛋白聚糖的至少一种蛋白或蛋白片段的数量。

5.权利要求3的方法，其中测定含有源自氨基酸序列Tyr-Leu-Ala-Trp-Gln-Ala-Gly-Met-*Asx-Met-Cys-Ser-Ala-Gly-Trp的聚集蛋白聚糖的至少一种蛋白或蛋白片段的数量。

6.权利要求3的方法，其中测定含有源自氨基酸序列Ala-Gly-Trp-Leu-Ala-*Asx-Gly-Ser-Val-Atg的CLP的至少一种蛋白或蛋白片段的数量。

7.上述任一项权利要求的方法，其中，使用免疫结合配体进行所述测定，该配体特异性地结合含有*Asx或*Glx的氨基酸序列，其中*Asx或*Glx的侧面是非胶原软骨蛋白的氨基酸残基。

8.权利要求7的方法，其中，所述免疫结合配体是对合成肽具有抗性的抗体，或者是具有免疫结合特异性的该抗体的片段，所述合成肽具有含*Asx或*Glx的氨基酸序列，其中*Asx或*Glx的侧面是非胶原软骨蛋白的氨基酸残基。

9.权利要求7或8的方法，其中，所述的氨基酸序列对应于所述蛋白的特征序列，在所述蛋白序列中由*Asx或*Glx替代αL Asp、Asn、Gln或Glu。

10.上述任一项权利要求的方法，其中，所述的测定提供了与影响关节组织更新的状况和疾病有关的软骨更新指标。

11.权利要求10的方法，还包括进行关节疾病第二指标的测定和确定数学结合的所述两个指标的参数值。

12.源于软骨的异构化或旋光转化的非胶原蛋白或这种蛋白的一个或多个异构化或旋光转化的片段在诊断或鉴定OA或RA严重性的体外方法中的用途。

13.免疫结合配体在诊断或鉴定OA或RA严重性的体外方法中的用途，其中所述免疫结合配体特异性地与含*Asx或*Glx的氨基酸序列结合，其中*Asx或*Glx的侧面是非胶原软骨蛋白的氨基酸残基。

14.一种免疫学结合配体，该配体特异性地与含*Asx或*Glx的氨基酸序列结合，其中*Asx或*Glx的侧面是非胶原软骨蛋白的氨基酸残基。

15.权利要求14的免疫结合配体，其特异性地结合权利要求4-6中任一项所述的序列。

16.产生单克隆抗体的细胞系，该抗体为权利要求14或15的免疫结合配体。

17.长度至多为20个氨基酸的肽，含有侧面是非胶原软骨蛋白的氨基酸残基的*Asx或*Glx。

18.权利要求17的肽在蛋白或蛋白片段检测中的用途。

19.一种免疫测定法，其中，将生物学样品在权利要求17的肽存在下与免疫结合试剂接触，其中权利要求17的肽作为与所述免疫结合试剂结合的竞争试剂。

20.一种检测试剂盒，包括(a)权利要求14的免疫结合配体或(b)如权利要求17的肽，并结合(a)或(b)中的另一个，并任选地结合一个或多个进行免疫测定的装置、抗体-酶偶联物、抗体-酶偶联物中酶成分的底物、酶-底物反应终止组分、或洗液、结合于所述结合配体的载体或结合于所述结合配体的可检测指标。

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