CN1183159C - 破骨细胞形成抑制因子单克隆抗体、其用途和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
提供了骨代谢异常症的诊断方法。提供了以测定体液中破骨细胞形成抑制因子(OCIF)浓度为特征的骨代谢异常症,特别是骨质疏松症及关节病的方法。提供了可同样识别单体型及二聚体型OCIF的单克隆抗体,以及可特异性识别二聚体型OCIF的单克隆抗体。还提供了构成中包含可识别OCIF分子上不同(部位)的抗原决定簇、与抗原具有解离常数在2×10-7M以下的高亲和性的前述2种单克隆抗体的OCIF测定用试剂盒。对骨代谢异常症,特别是骨质疏松症及关节病的诊断及用于研究的分析试剂等有用。
Description
技术领域
本发明涉及骨代谢异常症,特别是骨质疏松症及关节疾病的诊断方法。
另外,本发明还涉及用于上述诊断的单克隆抗体以及用该抗体的诊断试剂盒。
本发明对骨代谢异常症,特别是骨质疏松症以及关节疾病的诊断、或用于研究的分析试剂等有用。
背景技术
骨代谢依赖于生成骨的成骨细胞和进行骨吸收的破骨细胞的综合活性。健康成人的骨吸收和骨生成保持均衡,骨量被维持在一定程度。骨代谢异常是由于上述平衡被破坏而导致的。骨代谢异常症包括骨质疏松症、高钙血症、佩吉特骨病、肾性骨发育不良、慢性关节风湿病及变形性关节炎等。这些骨代谢异常症中最具代表性的是骨质疏松症。骨质疏松症的临床症状是骨量减少和由此引起的骨折或腰背疼痛等。骨量减少的原因有多种,主要随着生长期以后的年龄增长、癌症的骨转移及甲状腺亢进等疾病而产生。目前对骨质疏松症的诊断方法包括利用骨的X射线投影(MD法)、DPA(Dual photon absorptiometry)、DEXA(Dual Energy X-rayAbsorptiometry)、CXD(Computed X-ray Densitometry)以及低频超声波等物理学骨量测定装置对骨盐量、骨密度等进行测定。目前使用了上述诊断方法后临床上对骨质疏松症的诊断标准随着技术革新的进展而经常有所改进。
确切地说,骨盐量和骨密度的减少能够预测以后的骨折危险性。但是,并不一定所有会引起骨盐量和骨密度减少的原因都会引起骨折,大多数情况是随着年龄的增长而出现的现象,如胶原纤维弹性的降低、骨结构质量的劣化、肌力减小等都会增加骨折出现的机率。目前,还不能够没有任何损伤地对除了肌力减小以外的上述因子进行检测,这将是以后要解决的课题。而且,骨盐量和骨密度的降低,只不过使我们知道了骨代谢失衡(的结果),但并不能显示出失衡的原因及病情的进程。作为对骨密度测定的补充,还可检测骨代谢调节因子(甲状旁腺激素(PTH)、活性维生素D3和降钙素),以及随着骨代谢进行从骨组织游离出的各种因子(骨型碱性磷酸酯酶、酸性磷酸酯酶、吡啶啉、脱氧吡啶啉、1型溶胶原肽、骨钙素等)在血中的浓度或尿中的排泄量来掌握病情的发展。上述因子表示测定时的骨代谢动态,可以早期预测骨量是否减少或其减少程度。但是,上述骨代谢标记物浓度还受局部骨代谢的变化,饮食及日间变化等因素的影响,因此上述各因子不一定能反映体内骨代谢全貌,也不具备特异性。从目前的情况看,还不能够解决上述问题,因此,要寻求一种灵敏且具备高特异性的新的骨代谢标记物,并对其测定方法进行开发,以确立以骨质疏松症为代表的各种骨代谢疾病的正确诊断方法和预防·治疗方法。
本发明者们发现,人胎儿肺纤维胚细胞IMR-90(ATCC CCL186)的培养液中存在破骨细胞形成抑制因子(osteoclastogenesis inhibitory factor,OCIF),并成功地将其分离出来。而且,编码该蛋白质的cDNA的克隆也获得成功。用基因重组OCIF(rOCIF)所做的体外和体内药效评估,确认了其作为骨代谢改善药物的有用性(WO96/26217号公报)。接着,本发明者们发现服用了rOCIF的患有各种骨代谢异常症的动物的骨密度和骨强度有了显著增强,即使让正常动物大量服用rOCIF,其骨密度和骨强度也会随着用量的增加而明显增强,同时对除了骨组织以外的各种脏器、血液生化学检测、血细胞都没有任何副作用。通过上述体内试验,可以明确OCIF是只对骨组织产生作用的具有极高组织特异性的细胞因子。此外,本发明者们还确认动物细胞中的OCIF是以分子量约为120kDa的同源二聚体型OCIF的形式分泌产生的,经过蛋白酶等的加工处理后,转变为分子量约为60kDa的单体型OCIF。已证实了人细胞培养液中存在两种类型的OCIF,则我们可以推测包括人类在内的哺乳动物体液等中都存在有这两种类型的OCIF(Tsudaet al.:Biochem.Biophys.Res.Commun.234,137-142(1997))。为了搞清楚OCIF是否可以作为新的骨代谢标记物,因此有必要精确检测各种骨代谢异常症患者体液中各类型OCIF的浓度或两种类型的总浓度和各种疾病的关系。因此,需要能识别两种类型的OCIF的抗体以及只能特异性识别同源二聚体的抗体。但是,在此之前还没有具备上述特性的抗OCIF单克隆抗体。
发明的揭示
本发明者们对上述情况进行认真研究后,开发了对OCIF具有极高的亲和性(解离常数在10-9M以下)、可同样识别单体及同源二聚体的单克隆抗体,和只能特异性识别同源二聚体型OCIF的单克隆抗体。进而用这些抗体构筑了高灵敏度的酶免疫测定试剂盒(夹心ELISA)。利用该夹心ELISA对年轻人和老人的血清,以及包括骨质疏松症、甲状腺功能亢进、癌症等在内的各种疾病患者的血清中的OCIF进行测定后发现,血清OCIF和骨密度间存在较高的逆相关性。此外,对慢性关节风湿病、变形性关节病、外伤、痛风发作等各种关节病患者的关节液中的OCIF浓度进行测定后发现,关节损伤越严重的患者的关节液中的OCIF浓度越低。从上述结果可看出,利用夹心ELISA测定血清OCIF浓度和关节液中的OCIF浓度,能够充分了解骨密度的情况和关节受损程度,这就证明OCIF是一种能够早期预测骨量减少和关节受损的新颖的骨代谢异常症诊断标记物。因此,本发明提供了以测定人破骨细胞形成抑制因子(OCIF)浓度为特征的骨代谢异常症,特别是骨质疏松症及风湿病等关节病的诊断方法,用于该方法的单克隆抗体,以及使用该种抗体的OCIF测定用试剂盒。
本发明涉及测定采取的体液中破骨细胞形成抑制因子(OCIF)的浓度,并根据所测得的浓度对骨代谢异常进行诊断的骨代谢异常症的诊断方法。
本发明的诊断对骨质疏松症、关节病的诊断特别有用。作为待测样品的体液,可使用血清、关节液等。诊断骨质疏松症时,主要对血清OCIF浓度进行测定。诊断关节病时,主要对关节液中的OCIF浓度进行测定。
本发明的诊断对骨质疏松症特别有用。作为体液可使用血清、关节液等。
本发明涉及用于上述诊断的单克隆抗体。
这些单克隆抗体为可同样识别单体型及二聚体型OCIF的单克隆抗体,以及只能特异性识别二聚体型OCIF的单克隆抗体等。在这些单克隆抗体中尚有可识别OCIF分子上不同(部位)的抗原决定簇、与抗原的解离常数在2×10-7M以下的高亲和性的单克隆抗体。
本发明还涉及包含用上述单克隆抗体构成的OCIF测定用试剂盒。
本发明的诊断方法是从诊断对象采取血液(血清)和关节液等体液,用前述单克隆抗体构成的OCIF测定用试剂盒对体液进行检测。
用以下方法可获得本发明的单克隆抗体。即,作为抗OCIF单克隆抗体的制备所必须的免疫用抗原OCIF,按照WO96/26217号记载的方法,可使用从人胎儿肺纤维胚细胞IMR-90培养液中分出的抗原。作为免疫用抗原,也可使用基因重组人OCIF。按照常用方法将人OCIFcDNA重组入表达载体中,通过CHO细胞、BHK细胞、Namalwa细胞等动物细胞或昆虫细胞等表达,再精制就可获得基因重组人OCIF。利用Tsuda等的方法(Biochem.Biophys.Res.Commun.234,137-142(1997)),通过反相层析法可分别精制单体及二聚体型OCIF。此外,组合使用SP琼脂糖、硫酸纤维素及来源性(resource)S柱层析法来代替反相层析法也可对上述两种OCIF进行精制。用以上述抗原免疫哺乳动物而得到的脾脏细胞或用体外法免疫的淋巴细胞与骨髓瘤细胞(骨髓瘤)等融合,能够制得杂交瘤细胞。分别以精制纯化的单体型OCIF和同源二聚体型OCIF为抗原,对该杂交瘤细胞培养液进行筛选,能够选出可产生同样识别单体型和同源二聚体型OCIF的单克隆抗体,或只能特异性识别同源二聚体型OCIF的单克隆抗体的杂交瘤细胞,进而进行克隆化,建立细胞株。此外,分别培养建株了的、稳定的杂交瘤细胞,这样就能够获得所需的目的抗体。
如果制备杂交瘤细胞时使用的是哺乳动物,则对该动物种类没有特别的限定,一般可使用小鼠或大鼠等小动物。免疫一般是用生理盐水将作为抗原的OCIF稀释至适当浓度,再将该溶液注入静脉内或腹腔内,根据需要还可并用福氏完全佐剂,通常,对动物每间隔1~2周免疫一次,共3~4次。在制备本发明的对OCIF具有高亲和性(解离常数在2×10-7M以下)的抗OCIF单克隆抗体时,为了容易地获得作为目的产物的单克隆抗体,最好是每隔一周免疫一次,共3次,然后再并用抗原与福氏不完全佐剂,每隔一周免疫一次,共加强免疫4次,以尽可能提高血中抗OCIF的效价。最终免疫后第3天对上述经过免疫的动物进行解剖,摘取脾脏,将脾脏细胞作为免疫细胞使用。与免疫细胞进行细胞融合的来自小鼠的骨髓瘤细胞包括p3/×63-Ag8、p3-U1、MPC-11、SP-2/0、FO、P3×63 Ag8.653及S194等,来自大鼠的细胞包括R-210等细胞株。制备人源型抗体时,在体外使人B淋巴细胞免疫,使其与经过人骨髓瘤细胞和EB病毒转化的细胞株进行细胞融合,就能够产生人源型抗体。
免疫细胞和骨髓瘤细胞的融合一般采用公知的方法,例如,Koehler和Milstein等的方法(Koehler et aI.,Nature,256,495-497,1975),也可采用电脉冲法。免疫淋巴细胞和骨髓瘤细胞按照常用的细胞数比例混合,在常用的细胞培养用培养基(不含胎牛血清、FCS)中添加聚乙二醇,进行融合处理,然后在添加了FCS的HAT选择培养基中培养,筛选出融合细胞(杂交瘤细胞)。
采用ELISA、空斑法、双扩散法、凝集法等常用的抗体检测方法能够筛选出可分别产生能够同样识别单体型和同源二聚体型OCIF的抗体,以及只能特异性识别同源二聚体型OCIF的抗体的杂交瘤细胞。用精制纯化了的单体型及同源二聚体型OCIF为抗原的ELISA,能够最简便地精确度较高地检测出目的抗体。如果使用一般的固相ELISA,则要获得本发明的高亲和性抗体(解离常数在2×10-7M以下)就比较困难。即,利用一般的固相ELISA,在抗原固化的96孔免疫板(Nunc株式会社)中加入杂交瘤细胞培养液(50~100μl),进行一级反应,然后,添加酶标记的,如用过氧化物酶(POD)标记的抗小鼠IgG抗体,进行二级反应,再加入酶基质溶液(50~100μl),酶反应后,测定各孔的吸光度。此时,显现出高吸光度的杂交瘤细胞培养液中存在两种情况,其一是杂交瘤细胞能分泌大量抗原亲和性较低的抗体,其二是抗体量虽少、但其与抗原的亲和性极高的抗体,这两种情况不太容易区别。因此,为了比较容易地识别后一种情况,即可选得能产生极高抗原亲和性的抗体的杂交瘤细胞,本发明按照以下方法对固相ELISA进行了改进。即,在抗原固化的96孔免疫板的各孔中加入人血清或牛血清,然后,在各孔中添加少量杂交瘤细胞培养液,在约80~90%的血清存在下进行一级反应,这样就能排除分泌抗体量虽大,但产生的抗体与抗原亲和性较低的杂交瘤细胞,筛选出可产生抗原亲和性较高的抗体的杂交瘤细胞。这种经过改良的固相ELISA以单体型OCIF和同源二聚体型OCIF为抗原,能够分别筛选出能产生可同样识别上述两种OCIF的抗体的杂交瘤细胞,以及产生只能特异性识别同源二聚体型OCIF的抗体的杂交瘤细胞。利用临界稀释法克隆化3~5次后,能够获得稳定的抗体生产株。通过常用的培养方法可对该杂交瘤细胞进行继代培养,还可根据需要冷冻保存。用一般方法进行培养,能够从培养液中回收到杂交瘤细胞。而且,将杂交瘤细胞移植入哺乳动物的腹腔内,可从获得的腹水中回收到抗体。通过盐析法、离子交换及凝胶过滤层析法、用A蛋白或G蛋白的亲和层析谱法等常用的抗体精制方法可对培养液或腹水中的抗体进行精制。所得抗体是可同样识别单体型及同源二聚体型OCIF的抗体,以及只能特异性识别同源二聚体型OCIF的抗体,能够分别对OCIF量(单体型OCIF+同源二聚体型OCIF)及同源二聚体型OCIF量进行测定。该抗体可用于放射性同位素和酶标放射免疫测定(PIA)以及酶联免疫测定(ELISA)等常用的测定体系,对OCIF(单体型OCIF+同源二聚体型OCIF)及同源二聚体型OCIF进行定量测定。特别是本发明的可特异性识别同源二聚体型OCIF的抗体的存在,表明了单体型OCIF和同源二聚体型OCIF上,存在有不同的抗原决定簇,同时,也表明该抗体是可识别不存在于单体型OCIF,而是仅存在于同源二聚体型OCIF的抗原决定簇的抗体。本发明尚有如是特征,即如果用本发明的可同样识别单体型OCI及同源二聚体型OCIF的抗体作为固相化抗体,或者用作放射性同位素或酶标记了的二级抗体,则如在另一些共同的抗原决定簇上,再分别使用可同样识别单体型OCIF及同源二聚体型OCIF的抗体和只能特异性识别同源二聚体型OCIF的抗体的话,就可分别定量测定OCIF及同源二聚体型OCIF。只测定同源二聚体型OCIF时,作为固相化抗体,可使用以下实施例(表1)所示的只能特异性识别同源二聚体型OCIF的OI-26抗体,作为标记抗体,可使用能够同样识别单体型OCIF及同源二聚体型OCIF的OI-19或OI-4抗体。利用上述测定体系,能够容易地以高灵敏度对血液、尿及关节液等生物体试样或细胞培养液中的OCIF量及同源二聚体型OCIF量进行测定。
除了(i)一级抗体或二级抗体中的任一方为OI-19或OI-26抗体,且(ii)其他抗体为OI-4抗体之外,配合使用一般夹心法所用试剂(reagent)为基础构成的试剂盒可作为本发明的测定人OCIF的试剂盒使用。即,本发明的免疫学测定试剂盒在(1)固定于不溶载体的一级抗体、(2)经过标记的二级抗体、(3)溶剂、(4)洗涤剂及(5)标记物为酶时,包含用于测定酶活性的基质和反应终止剂。作为不溶性载体可使用聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚丙烯腈、含氟树脂、交联葡聚糖、聚糖、乳胶、乳胶上镀了金属等的磁性微粒等高分子、纸、玻璃、金属、琼脂糖及它们的组合物等。不溶性载体的形状有塔盘状、球状、纤维状、棒状、盘状、容器状、槽状、试管、多孔性滤膜等各种形状。作为标记抗体的标记物,较理想的是使用酶、荧光物、发光物质及放射性物质等。作为酶,可使用过氧化物酶、碱性磷酸酯酶、β-D-半乳糖苷酶、葡糖氧化酶、苹果酸脱氢酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、蔗糖酶等,作为荧光物,可使用荧光素异硫氰酸酯、藻胆蛋白体等,作为发光物质,可使用吡啶啉、光泽精等,作为放射性物质,可使用I125、I131、C14、H3等。但是,并不仅限于上述例子,只要是可用于免疫学测定法的物质即可。
标记物为酶时,为了测定其活性,需使用基质,还可根据需要使用显色剂。使用过氧化物酶时,以H2O2为基质,以2,2′-连氮基二-[3-乙基苯并噻唑啉磺酸]铝盐(ABTS)、5-氨基水杨酸、邻苯二胺、4-氨基安替比林、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺、吡啶啉酸、铬胺;使用碱性磷酸酯酶时,以邻硝基苯基磷酸酯、4-甲基吡啶啉磷酸等为基质;使用β-D-半乳糖苷酶时,以荧光素-二-(β-D-吡喃型半乳剂)、4-甲基吡啶啉-β-D-吡喃型半乳剂等为基质。前述免疫学测定试剂盒中的(3)溶剂的较好例子是包括Tris盐酸缓冲液、乙酸缓冲液等在内的pH值在6.0~8.0的溶液。(4)洗涤剂同样可使用一般用于免疫学测定的试剂,例如,生理盐水、磷酸缓冲液、Tris盐酸缓冲液及它们的混合溶液。还可在上述洗涤剂中添加Ttiton X-100、吐温20或Brij35等非离子性表面活性剂,十二烷基硫酸钠、CHAPS等离子性表面活性剂。
对附图的简单说明
图1表示实施例7的OI-19抗体和OI-4抗体的ELISA校正曲线。
[符号的说明]
○:同源二聚体型OCIF,●:单体型OCIF
图2表示表示实施例7的OI-26抗体和OI-4抗体的ELISA校正曲线。
[符号的说明]
○:同源二聚体型OCIF,●:单体型OCIF
图3表示实施例8的骨质疏松症患者和健康成人血中的OCIF浓度。
图4表示实施例8的尿中吡啶啉和血中OCIF浓度的关系。
图5表示实施例8的尿中脱氧吡啶啉和血中OCIF浓度的关系
图6表示实施例9的确认关节肿胀的患者的关节液中的OCIF浓度。
[符号的说明]
RA:慢性关节风湿病、OA:变形性关节病、Tr:外伤、G:痛风发作
实施发明的最佳状态
通过以下实施例对本发明进行详细说明,这些实施例仅仅是个别例子,本发明并不仅限于此。
[实施例1]
抗原用单体型OCIF及同源二聚体型OCIF的精制
按照1×105cells/ml的标准,将WO96/26217号公报记载的可产生OCIF的CHO细胞接种在EX-CELL 301培养基(JRH Bioscience公司)中,使用细胞培养用容器(2升容量)在37℃培养7天。在所得培养液中添加CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propanesulfonate,Sigma公司)使其在培养液中的浓度达到0.1%,用乙酸将pH值调整到6.0后,用0.22μm的滤膜(Milidisk,Millipore公司)过滤。将培养液注入预先用pH为6.0的含有0.1%CHAPS的50mMBistris盐酸缓冲液进行过平衡处理的SP琼脂糖HP柱(2.6×10cm,Pharmacia公司),再用同样的缓冲液洗涤,然后,以4ml/分的流速进行洗脱,历时100分钟,使洗脱液中NaCl浓度以直线梯度增加达到1M,再以8ml为1个单位进行收集。按照WO96/26217号公报记载的方法测定各组分中的OCIF活性,获得OCIF部分。所得OCIF部分用pH为6.0的含有0.1%CHAPS的50mM Bistris盐酸缓冲液稀释10倍后,注入预先用pH为6.0的50mM Bistris盐酸缓冲液进行过平衡处理的硫酸化琼脂糖柱(2.6×10cm,生化学工业株式会社)。该柱用pH为6.0的含有0.1%CHAPS的50mM Bistris盐酸缓冲液洗涤后,以4ml/分的流速进行洗脱,历时100分钟,使洗脱液中NaCl浓度以直线梯度增加达到1M,再以8ml为1个单位进行收集。用与上述同样的方法对各组分的OCIF活性进行测定。另外,收集各组分中具有OCIF活性、且在非还原条件下用SDS-PAGE测得的分子量约为60KDa的部分作为第1部分。再收集具有OCIF活性、且在非还原条件下用SDS-PAGE测得的分子量约为120KDa的部分作为第2部分。用pH为7.0的含有0.1%CHAPS的50mM Tris盐酸缓冲液分别使第1部分和第2部分稀释10倍。将经过稀释的上述2个部分分别注入预先用pH为7.0的含有0.1%CHAPS的50mMTris盐酸缓冲液进行过平衡处理的来源性(resource)S柱(0.64×3cm,Pharmacia公司),用pH为7.0的含有0.01%聚山梨酸酯的10mM磷酸钠缓冲液洗涤后,以1ml/分的流速进行洗脱,历时15分钟,使洗脱液中NaCl浓度以直线梯度增加达到0.6M,再以0.5ml为1个单位进行收集。采用与前述同样的方法对分别注入第1部分和第2部分而获得的各组分中的OCIF活性进行测定,收集具有OCIF活性的组分,获得作为第1部分的单体型OCIF和作为第2部分的同源二聚体型OCIF。
[实施例2]
小鼠的免疫及杂交瘤细胞的制备
分别用生理盐水对用实施例1的方法精制而得的单体型OCIF及同源二聚体型OCIF进行稀释,使它们的浓度都转变为100μg/ml。等量混合上述调制而得的两种类型的OCIF,添加与混合液同容量的福氏完全佐剂,使溶液很好地乳化后,注射到Balb/c小鼠的腹腔内,每只每次200μl,每隔一周注射一次,共3次,使小鼠免疫。然后,在分别含有25μg/ml上述两种类型的OCIF的混合液中添加同容量的福氏不完全佐剂,充分乳化后,将该溶液注入上述Balb/c小鼠,每只200μl,每隔一周注射一次,共4次,进行加强免疫。第4次加强免疫1周后,对Balb/c小鼠静脉注射分别含有100μg/ml上述两种类型的OCIF的混合液,每只100μl。最终免疫后第3天取出脾脏,分离出脾脏细胞,按常规方法(Koehler,G.和Milstein,C.,Nature,256,495(1975)),使其与小鼠骨髓瘤细胞P3×63-AG8.653(ATCC CRL-1580)进行细胞融合。融合结束后,使细胞悬浮液在含有6-羟基嘌呤、氨基喋呤、脱氧胸腺嘧啶核苷的HAT培养基中培养10天。杀灭骨髓瘤细胞,使杂交瘤细胞存活后,将HAT培养基换成除去了氨基喋呤的HT培养基继续培养。
[实施例3]
杂交瘤细胞的选择及克隆
融合10天后,因可确认杂交瘤细胞的存活、增殖,所以,可用上述经过改良的固相ELISA,能够筛选出可产生同样识别单体型OCIF及同源二聚体型OCIF的高亲和性抗体及只能特异性识别同源二聚体型OCIF的高亲和性抗体的杂交瘤细胞。即,预先分别将单体型及同源二聚体型OCIF溶于0.1M的碳酸氢钠溶液(pH为9.6)中,使其浓度转变为5μg/ml,然后将上述抗原溶液分别加入到96孔免疫板(Nunc公司)的各孔中,每孔50μl,于4℃静置一晚,使抗原分别固相化。舍弃各孔中的抗原溶液,用含有0.1%聚山梨酸酯20的磷酸盐缓冲生理盐水(PBS-P)洗涤后,在各孔中加入40μl胎牛血清(ハイクロ-ン公司)。然后,在各孔中加入10μl杂交瘤细胞培养上清液,在80%的血清浓度下,于室温反应2小时。反应后,用PBS-P洗涤板,再在各孔中加入50μl用含有25%BlockAce封闭剂的生理盐水稀释至1/5000的过氧化物酶标记的抗小鼠IgG(KPL公司),室温反应2小时。板用PBS-P洗涤后,在各孔中加入50μl酶基质溶液(TMB,ScyTek公司)显色,然后,加入50μl反应终止液(stopping reagent,ScyTek公司)使酶反应停止。再用微量板读数器(免疫读数器NJ2000,日本Intermed公司)对各孔在450nm时的吸光度进行测定,选出可产生抗体的杂交瘤细胞。特别选出显现出高吸光度,且可产生同样识别单体型及同源二聚体型OCIF的抗体或不能识别单体型OCIF只能特异性识别同源二聚体型OCIF的抗体的杂交瘤细胞,再用临界稀释法对上述杂交瘤细胞进行3~5次克隆,获得可产生稳定的抗体的杂交瘤细胞株。再从所得的抗体产生细胞株中筛选出目的抗体产率较高的杂交瘤细胞株。
这样就获得了可产生同样识别单体型OCIF及同源二聚体型OCIF的OI-19抗体及OI-4抗体的杂交瘤细胞OI-19及OI-4,以及可产生只能特异性识别同源二聚体型OCIF的OI-26抗体的杂交瘤细胞OI-26。OI-4、OI-19和OI-26分别以FERM BP-6419、FERM BP-6420和FERM BP-6421的保藏号保藏于国立生命科学和人体技术研究所。
[实施例4]
单克隆抗体的生产及精制
分别培养实施例3获得的目的抗体,即,可产生以高亲和性同样识别单体型及同源二聚体型OCIF的抗体及只能特异性识别同源二聚体型OCIF的抗体的杂交瘤细胞,然后,将上述两种杂交瘤细胞以1×106细胞的数量移植到预先在腹腔内注射了朴日斯烷的Balb/c系小鼠的腹腔内。2周后,取出蓄积的腹水,获得含有本发明的单克隆抗体的腹水。利用A蛋白柱(Pharmacia公司)层析法获得来自腹水的精制抗体。
[实施例5]
单克隆抗体的解离常数(Kd值)的测定
按照Betrand Friguet等的方法(Journal of Immunological Methods,77,305-319,1986)测定单克隆抗体的解离常数。即,用pH为7.4的含有40%BlockAce封闭剂(雪印乳业株式会社)、0.1%聚山梨酸酯20的0.2M的Tris-HCl(一级缓冲液)稀释实施例4获得的精制抗体,使其浓度为5ng/ml,然后,使其与经过一级缓冲液稀释过的实施例1记载的精制单体型或同源二聚体型基因重组OCIF(rOCIF,浓度为6.25ng/ml~10μg/ml)等容量混合,于4℃静置15小时使OCIF和单克隆抗体结合。15小时后,利用单体型或二聚体型rOCIF(10μg/ml,100μl/孔)固相化的固相ELISA对OCIF和未结合的抗体进行测定,算出单克隆抗体对单体型及同源二聚体型OCIF的解离常数。
[实施例6]
单克隆抗体的类别和亚类的鉴定
利用免疫球蛋白类别及亚类分析试剂盒(Amersham公司)对本发明的单克隆抗体的类别和亚类进行鉴定。该鉴定是按照试剂盒中的说明书进行的。实施例5及6所得结果如表1所示。
表1
抗体名 | 亚类 | 解离常数(对单体) | 解离常数(对二聚体) |
OI-4 | IgG1(κ) | 7.3×10-10 | 9.9×10-12 |
OI-19 | IgG1(κ) | 7.0×10-10 | 1.2×10-11 |
OI-26 | IgG1(κ) | - | 1.5×10-7 |
从上述结果可看出,抗体OI-4和OI-19能够几乎同等识别单体型及同源二聚体型OCIF,而抗体OI-26只能特异性识别同源二聚体型OCIF。而且,所有抗体都属于IgG1,是对单体型或同源二聚体型OCIF的解离常数在2×10-7M以下的亲和性极高的抗体。
[实施例7]
OCIF的ELISA测定
将利用上述方法制得的3种抗体OI-4、OI-26及OI-19分别作为固相抗体和标记抗体,构成夹心ELISA。用马来酸酐缩亚胺活化过氧化物酶试剂盒(Pias公司)进行抗体标记。在可同样识别单体型及同源二聚体型OCIF的ELISA中将OI-19抗体作为一级抗体,或在只能特异性识别同源二聚体型OCIF的ELISA中将OI-26抗体作为一级抗体,使它们分别溶于0.1M的碳酸氢钠溶液(pH为9.6),且浓度都为10μg/ml,然后将上述抗原溶液分别加入到96孔免疫板(Nunc公司)的各孔中,每孔100μl,于4℃静置一晚,使其固相化。舍弃各孔中的溶液,在各孔中加入300μl 50%浓度的BlockAce封闭剂(雪印乳业株式会社),于室温静置2小时进行封闭。封闭后,用含有0.1%聚山梨酸酯20的磷酸缓冲生理盐水(PBS-P)洗涤板。使单体型OCIF及同源二聚体型OCIF分别溶于含有40%BlockAce封闭剂(雪印乳业株式会社)及0.1%聚山梨酸酯20的0.2M Tris-HCl(pH7.4)(一级缓冲液),稀释,获得各种浓度的上述两种类型的OCIF溶液。将各种浓度的单体型及同源二聚体型OCIF溶液分别加入到各孔中,每孔100μl,室温反应2小时。2小时后,用PBS-P洗涤板,在各孔中加入100μl经过含有25%BlockAce封闭剂(雪印乳业株式会社)及0.1%聚山梨酸酯20的0.1M Tris-HCl(pH7.4)(二级缓冲液)稀释的作为可同样识别单体型及同源二聚体型OCIF的抗体的POD标记OI-4抗体,室温反应2小时。板用PBS-P洗涤后,在各孔中加入100μl酶基质溶液(TMB,ScyTek公司)显色,然后,每孔加入100μl反应终止液(stopping reagent,ScyTek公司)使酶反应停止。再用微量板读数器对各孔在450nm时的吸光度进行测定。使用几乎可同样识别单体型及同源二聚体型OCIF的抗体OI-19作为一级抗体时的结果如图1所示,使用只能特异性识别同源二聚体型OCIF的抗体OI-26时的结果如图2所示。其结果是,如图1所示,以几乎可同样识别单体型及同源二聚体型OCIF的抗体OI-19为固相抗体,可同样识别上述两种OCIF的抗体OI-4为POD标记抗体时的夹心ELISA测定灵敏度约为25pg/ml,能够对极微量的OCIF进行测定。另外,如图2所示,以只能特异性识别同源二聚体型OCIF的抗体OI-26为固相抗体,可同样识别单体型及同源二聚体型OCIF的抗体OI-4为POD标记抗体的夹心ELISA的测定灵敏度为50pg/ml,这表明能够以高灵敏度对同源二聚体型OCIF进行测定。
[实施例8]
健康成人及骨质疏松症患者血清中的OCIF的测定
利用经过部分改良的实施例7记载的OCIF的ELISA体系(单体型OCIF+同源二聚体型OCIF)对健康成人及骨质疏松症患者(以日本骨代谢学会的诊断为基准)血清中的OCIF浓度进行测定。即,测定OCIF浓度(单体型OCIF+同源二聚体型OCIF)时,与实施例7同样,在96孔免疫板中使可同样识别上述两种OCIF的抗体OI-19固相化,在各孔中加入50μl用一级缓冲液(含有40%BlockAce封闭剂及0.1%聚山梨酸酯20的0.2M Tris-HCl,pH7.4)配制成浓度为20μg/ml的精制小鼠IgG(カペル公司),然后,加入用一级缓冲液稀释了4倍的作为待检样品的人血清50μl,室温静置2小时。用含有0.1%聚山梨酸酯20的磷酸缓冲生理盐水(PBS-P)洗涤6次后,在各孔中加入100μl经POD标记了的能同样识别两种OCIF的OI-4抗体液,(该标记抗体事先用由二级缓冲液(25%BlockAce封闭剂、0.1%聚山梨酸酯20、0.2M Tris-HCl,pH7.4)配成浓度为10μg/ml的精制小鼠IgG溶液稀释3000倍)。室温静置2小时。用PBS-P洗涤6次后,在各孔中加入100μl酶基质溶液(TMB,ScyTek公司),室温反应20小时后,在各孔中加入100μl反应终止液(stopping reagent,ScyTek公司)使反应停止。再用微量板读数器测定各孔在450nm时的吸光度。对用一级缓冲液配制的含有已知量的OCIF的标准液作同样操作,画出与图1同样的OCIF标准曲线,由血清试样的吸光度求出血清中的OCIF浓度。
骨质疏松症患者和健康成人血清中的OCIF(单体型OCIF+同源二聚体型OCIF)浓度测试结果如图3所示。根据Student′s non-paired的t检验法进行图3~图5所示结果的有效差t检验。其结果是,骨质疏松症患者和健康成人的血清OCIF(单体型OCIF+同源二聚体型OCIF)浓度存在显著差异,骨质疏松症患者血清中的OCIF浓度明显高于健康成人。因此,通过测定血清OCIF的浓度,可有效掌握骨质疏松症患者的病情,从而证明OCIF是判断骨质疏松症的新的骨代谢标记物。
另外,健康成人和骨质疏松症患者的血清OCIF(单体型OCIF+同源二聚体型OCIF)浓度和尿中吡啶啉浓度的关系如图4所示,和尿中脱氧吡啶啉浓度的关系如图5所示。吡啶啉浓度为42pmol/μmol Cr(相当于1μmol肌酸酐的吡啶啉pmol量)、脱氧吡啶啉浓度为6.2pmol/μmol Cr分别是日本人正常值的上限。其结果是,吡啶啉、脱氧吡啶啉浓度较高的患者的血清OCIF浓度明显较高。吡啶啉和脱氧吡啶啉为骨胶原交联分子,骨胶原被吸收入骨基质后在骨基质中生长,再因骨吸收时的骨破坏而被放出。这些分子作为骨吸收标记的特异性很高,被广泛应用于临床检体的评估。通过确认OCIF和上述两种标记的相关性,可明确血清中的OCIF浓度作为骨代谢标记是很有用的。
[实施例9]
关节肿胀患者关节液中的OCIF浓度的测定
以治疗关节病为目的到医院进行检查,根据检查结果选出确认患有关节肿胀的慢性关节风湿病(RA)患者43例、变形性关节病(OA)患者6例、外伤(Tr)患者3例以及痛风发作(G)患者6例,在获得患者同意后抽取关节液。利用部分经过改进的实施例8记载的OCIF的ELISA系(单体型OCIF+同源二聚体型OCIF)测定患者关节液中的OCIF浓度。即,除了用一级缓冲液使关节液稀释16倍后,在抗体OI-19固相化的96孔免疫板的各孔中加入50μl上述关节液这一操作之外,其他操作与实施例8的方法相同。
确认关节肿胀的患者的关节液中的OCIF(单体型OCIF+同源二聚体型OCIF)浓度的试验结果如图6所示。此外,图6所示数据统计解析使用了Kruskal-WallisTest和Mann-Whitney Test法。其结果是,痛风发作(G)患者关节液中的OCIF浓度明显低于RA患者。6例OA患者关节液中的OCIF浓度的最低值为4.79ng/ml,而关节液中OCIF浓度在4.0ng/ml以下的RA患者在43例中只有15例。上述结果表明,关节液中OCIF浓度较低的部分RA患者的关节中由于OCIF不足,所以,破骨细胞的形成和活性可能未被抑制。此外,OCIF-ELISA对慢性关节风湿病(RA)、变形性关节病(OA)、外伤(Tr)及痛风发作(G)的病情诊断也有用。
[实施例10]
慢性关节风湿病(RA)患者膝关节液中OCIF浓度和病情的关系
为了研究关节液中OCIF浓度和关节破坏程度的相关性,对2例慢性关节风湿病(RA)患者进行了回顾性研究。
(病例1,66岁,男性)
1982年(50岁时)起,觉得有多处关节疼痛。1983年,在医院进行了首次诊断,由于符合美国风湿病学会的RA分类标准,被确诊为RA。以后,由于服用抗风湿药(Mercaptase)病情得到一定缓解,然后停止了抗风湿药的服用。1990年,RA再度发作,再次服用抗风湿药。1992年3月18日,右关节出现肿胀,穿刺抽取关节液。此时关节液中的OCIF浓度为23.6ng/ml,显现出较高值(实施例9所示43例RA患者关节液中的OCIF浓度的平均值约为6ng/ml),此时血浆中的CRP为5.4mg/dl,这明显表明出现了炎症反应。CRP未完全转变为阴性,到1997时降为3mg/dl左右。从1983年至1997年确认患有膝X-p,主要是变形性关节病(OA)的变化,手指关节和手关节未发现骨糜烂。
(病例2,60岁,女性)
1987年(49岁时)起,觉得有多处关节疼痛。1993年8月17日,在医院进行了首次诊断,由于符合美国风湿病学会的RA分类标准,被确诊为RA。此时右膝关节出现肿胀,穿刺抽取关节液。此时关节液中的OCIF浓度较低,为3.9ng/ml,血浆的CRP为13.7mg/dl,显现出较强的炎症反应。此后,由于服用抗风湿药(氨甲喋呤),CRP慢慢降低,1994年3月18日为4.1mg/dl,同年6月27日降低至1.1mg/dl。但是,根据Larsen分类(Laresen A.等,Acta Radiol.Diag.18,4810491,1977),1993年9月1日时膝X-p为III级、1994年3月18日时为IV级、同年6月27日时为V级,这说明关节被破坏,同年10月14日进行了人工关节替换手术。
从上述2个病例,即,关节被慢慢破坏的病例1和关节被破坏的病例2的关节液中OCIF浓度的测定结果可看出,关节液中的OCIF浓度测定对因风湿病而导致的关节被破坏的危险性评估和关节破坏的治疗效果的评估有用。
[实施例11]
单体型及二聚体型OCIF测定用试剂盒1(80检体)
(1)采用实施例7的方法使OI-19抗体固相化、且预先用BlockAce封闭剂进行封闭的96孔板1块;
(2)采用实施例7的方法POD标记的OI-4抗体:10μl(1000倍浓度);
(3)基因重组型OCIF(单体型)标准品:0.5ng/ml、400μl;
(4)样品稀释液(0.01%吐温20、40%BlockAce封闭剂、0.2M Tris-HCl缓冲液,pH7.4):10ml;
(5)标记抗体的稀释液(O.01%吐温20、25%Block Ace封闭剂、0.1M Tris-HCl缓冲液,pH7.4):10ml;
(6)用于洗涤96孔板的洗涤液(0.1%吐温20PBS(-)):1升;
(7)用于测定标记酶活性的基质溶液(这里是TMB溶液)及反应终止液(TMBstop reagent):各10ml。
二聚体型OCIF测定用试剂盒2(80检体)
(1)采用实施例7的方法使OI-26抗体固相化、且预先用BlockAce封闭剂进行封闭的96孔板1块;
(2)采用实施例7的方法POD标记的OI-4抗体:10μl(1000倍浓度);
(3)基因重组型OCIF(二聚体型)标准品:0.5ng/ml、400μl;
(4)检体稀释液(0.01%吐温20、40%BlockAce封闭剂、0.2M Tris-HCl缓冲液,pH7.4):10ml;
(5)标记抗体的稀释液(0.01%吐温20、25%BlockAce封闭剂、0.1M Tris-HCl缓冲液,pH7.4):10ml;
(6)用于洗涤96孔板的洗涤液(0.1%吐温20PBS(-)):1升;
(7)用于测定标记酶活性的基质溶液(这里是TMB溶液)及反应终止液(TMBstop reagent):各10ml,
测定方法(试剂盒1和试剂盒2)
在板(1)的各孔中加入经过稀释液(4)稀释的待检样品及经过阶段稀释的人基因重组型OCIF标准品溶液各100μl,室温放置约2小时后,用300μl洗涤液(6)对板上各孔洗涤5~6次,该洗涤操作也可用自动洗板机进行,然后,在经过洗涤的板的各孔中加入100μl被稀释液(5)稀释了1000倍的POD标记OI-4抗体溶液,室温再放置约2小时,用洗涤液(6)对板上各孔洗涤5~6次,该洗涤操作也可用自动洗板机进行。然后,在各孔中加入100μl酶基质溶液(7),室温放置20~30分钟。接着,在各孔中加入100μl反应终止液(7)使酶反应停止,再用微量板读数器测定各孔在450nm时的吸光度,利用添加了经过阶段稀释的人基因重组型OCIF标准品(3)的各孔在450nm时的吸光度,画出人基因重组型OCIF浓度的标准曲线,从该标准曲线可求出各待检样品的OCIF浓度。
产业上利用的可能性
利用本发明能够对抽取的体液(血液、关节液等)中的人破骨细胞形成抑制因子(OCIF)浓度进行测定,从而简便地对骨代谢异常症,特别是骨质疏松症及关节病作出诊断。本发明的诊断使用了前述单克隆抗体,以及利用了该单克隆抗体的OCIF测定用试剂盒,所以,如前所述,能够简便且正确地对骨代谢异常症,特别是骨质疏松症及关节病作出诊断。本发明对骨代谢异常症,特别是骨质疏松症及关节病的诊断及用于研究的分析试剂有用,
关于说明书中提到的微生物的说明
这些微生物的保藏机构名称及地址
保藏机构:国立生命科学和人体技术研究所
地址:日本茨城县筑波市市东1丁目1番3号
保藏日:平成9年(1997年)10月16日
保藏号:FERM BP-6419
保藏机构:国立生命科学和人体技术研究所
地址:日本茨城县筑波市市东1丁目1番3号
保藏日:平成9年(1 997年)10月16日
保藏号:FERM BP-6420
保藏机构:国立生命科学和人体技术研究所
地址:日本茨城县筑波市市东1丁目1番3号
保藏日:平成9年(1997年)10月16日
保藏号:FERM BP-6421
Claims (7)
1.一种单克隆抗体,其特征在于,它用保藏号为FERM BP-6419、FERM-6420的杂交瘤细胞获得,该抗体同样识别单体型OCIF及二聚体型OCIF。
2.一种单克隆抗体,其特征在于,它用保藏号为FERM BP-6421的杂交瘤细胞获得,它识别二聚体OCIF但不识别单体型OCIF。
3.如权利要求1或2所述的单克隆抗体,其特征还在于,所述单克隆抗体可识别OCIF分子上不同部位的抗原决定簇,与抗原具有解离常数在2×10-7M以下的高亲和性。
4.一种OCIF测定用试剂盒,其特征在于,其包含权利要求1或2所述的单克隆抗体。
5.权利要求1或2所述的单克隆抗体在制备诊断试剂中的用途,该诊断试剂用于通过测定从对象抽取的体液中的破骨细胞形成抑制因子OCIF浓度来诊断骨代谢异常症。
6.根据权利要求5所述的用途,其中所述体液是血清或关节液。
7.根据权利要求5或6所述的用途,其中所述骨代谢异常症选自骨质疏松症、关节病和慢性关节风湿病。
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