KR100547395B1

KR100547395B1 - 골대사이상증의 진단방법

Info

Publication number: KR100547395B1
Application number: KR1019997003996A
Authority: KR
Inventors: 야노카주키; 코바야시푸미에; 고토마사아키; 와시다나오히로; 쯔다에이수케; 히가시오칸지; 야마다요시지
Original assignee: 산쿄 가부시키가이샤
Priority date: 1997-09-24
Filing date: 1998-07-31
Publication date: 2006-02-01
Also published as: RU2203497C2; ATE328281T1; US20040033533A1; AU8461798A; ZA986974B; WO1999015691A1; EP0974671B1; EP0974671A8; KR20000068916A; US6998242B2; CN1239515A; US6693175B2; NO992472L; DE69834719D1; IL129535A0; NO992472D0; IL129535A; JP4268684B2; HUP0002062A2; EP0974671A1

Abstract

골대사이상증의 진단방법의 제공.

체액중의 파골세포형성억제인자(OCIF) 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 골대사이상증, 특히 골조송증 및 관절질환의 진단방법, 모노머형 및 다이머형 OCIF를 동등하게 인식하는 모노크로날항체, 다이머형 OCIF만을 선택적으로 인식하는 모노크로날항체, 및 OCIF의 다른 에피토프를 인식하고, 항원과의 해리정수가 2×10^-7M 이하인 고친화성을 가지는 상기 2종의 모노크로날항체를 구성에 포함하는 OCIF 측정용 키트의 제공.

골대사이상증, 특히 골조송증 및 관절질환의 진단방법, 혹은 연구용 분석시약등에 유용하다.

Description

골대사이상증의 진단방법{METHOD FOR DIAGNOSING BONE DYSBOLISM}

본 발명은 골대사이상증, 특히 골조송증 및 관절질환의 진단방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 이의 진단에 사용하는 모노크로날항체 및 그 항체를 사용한 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명은 골대사이상증, 특히 골조송증 및 관절질환의 진단방법 혹은 연구용 분석시약으로서 유용하다.

골대사는 골형성을 담당하는 골아세포(osteoblast)와 골흡수를 담당하는 파골세포(osteoclast)의 총칭된 활성에 의존하고 있다. 통상의 건강한 성인에서는 골흡수와 골형성의 균형이 유지되고, 골량은 일정으로 유지된다. 골대사이상은 이 균형이 붕괴되므로서 발생한다고 생각되고 있다. 골대사이상증으로서는 골조송증(osteoporosis), 고칼슘혈증, 골파제트(paget)병, 신성골이영양증, 만성관절류마티즘 및 변형성 관절증등이 알려져 있다. 이들 골대사이상증의 대표로서는 골조송증이 열거된다. 골조송증은 골량의 감소와 그가 원인으로 되어 일어난 골절이나 요배통(Bone pain)등의 임상증상을 나타내는 병태(病態)로 생각되고 있다. 골량감소는 성장기 이후의 나이를 먹음이나 암의 골전위 및 갑상선 기능 항진등의 질병에 수반하여 생기는 등 그 원인은 다양하다. 현재 행하여지는 골조송증의 진 단방법으로서는 골의 X선 촬영(MD법), DPA(Dual Photon Absorptiometry), DEXA(Dual Energy X-ray Absortiometry), CXD(Computed X-ray Densitometry) 및 저주파 초음파등에 의해 물리학적 골량측정장치에 의해 골염량, 골밀도등이 측정된다. 현재, 이러한 진단방법을 사용한 골조송증의 진단기준은 기술혁신에 수반하여 항상 개정이 진행되고 있다.

확실히, 골염량, 골밀도의 저하는 장래의 골절 위험성을 예측시킨다. 그렇지만, 골염량, 골밀도의 저하가 일으킬 수 있는 모든 골절 위험인자에서는 없고, 대부분은 나이먹음에 따른 현상, 예컨데 콜라겐 섬유의 탄성저하, 골구조의 질적열화, 근력저하등에 의해서도 골절의 위험성은 증대한다고 생각되고 있다. 현시점에서는 근력저하이외의 이들 인자를 비침투적으로 계측할 수 없고, 장래 해결되어야 할 중요한 과제로 되고 있다. 더구나, 골염량, 골밀도의 저하는 골대사의 균형붕괴의 결과를 관찰하고 있음에 지나지 않고, 그 원인 또는 금후 병태의 동향을 나타내는 것은 아닌가 라고 일컬어지고 있다. 이러한, 골밀도 측정의 결점을 보완하는 것으로서 골대사 조절인자{부갑상선 호르몬(PTH), 활성형 비타민 D₃, 및 칼시토닌등}, 또는 골대사 회전에 수반하여 골조직에서 유리하여 오는 각종의 인자(골형 알카린 포스파타제, 산성 포스파타제, 피리디놀린, 데옥시피리디놀린, 타입 1 프로콜라겐 펩티드, 오스테오칼신등)의 혈중농도 혹은 뇨중 배설량을 측정하는 것으로 병태를 파악해 버리는 시험이 되고 있다. 이들 인자는 측정시점에서의 골대사 동태를 나타내는 것이고, 골량감소의 유무 및 그 정도를 조기에 예측되는 것이 기대된다. 그러나, 이러한 골대사 마커에도 국소적인 골대사의 변동이 표시되지 않기도 하고, 식사등의 영향이나 하루내 변동이 크기도 하고, 상기 제인자가 반드시 골대사를 반영하여 특이적으로 변동한다고 해석되지 않는 것등의 각종 문제가 여전히 잔존한다. 이러한 현상에서 이들 문제의 해결에 그치지 않고 예민하고도 특이성이 높은 새로운 골대사 마커와 그 측정법의 개발이 골조송증을 치료하는 여러가지 골대사 질환의 적확한 진단법이나 예방·치료법의 확립을 위하여 추구되고 있다.

본 발명자들은 사람 태아 폐섬유아세포, IMR-90(ATCC CCL186)의 배양액중에 파골세포형성억제인자(osteoclastogenesis inhibitory factor, OCIF)가 존재하는 것을 찾아내고, 그 단리에 성공했다. 더구나, 이 단백질을 코드하는 cDNA의 크로닝에도 성공하고, 유전자 조환 OCIF(rOCIF)를 이용한 생체외 및 생체내 약효평가를 통하여 골대사 개선약으로서 그 유용성을 확인했다(WO 96/26217호 공보). 이어서, 본 발명자들은 rOCIF의 투여는 각종 골대사이상질환 동물에 있어서, 골밀도 및 골강도를 현저히 개선하는 것, 또 정상동물로의 rOCIF의 대량투여에 있어서도 용량의존적으로 골밀도 및 강도를 현저히 증강하고, 골조직이외의 각종 장기, 혈액생화학검사, 혈구계 세포의 어느 것인가에 있어서도 전혀 부작용을 발현하지 않는 것을 확인했다. 이들의 생체내 시험을 통하여 OCIF는 골조직에만 작용하는 극히 조직특이성이 높은 사이토카인인 것이 판명되었다. 더구나, 본 발명자들은 동물세포에 서, OCIF는 분자량 약 120kDa의 호모다이머형 OCIF로서 분비 생산되어 프로테아제등의 프로세싱을 받어 분자량 약 60kDa의 모노머형 OCIF로 되는 것을 확인했다. 더구나, 사람세포배양액에는 이 양타입의 OCIF의 존재가 확인되어 있는 바와같이 {Tsuda et al. : Biochem. Biophys. Res. Commun. 234. 137-142(1997)}, 사람을 포 함하는 포유동물 체액등에는 이 양타입 OCIF의 존재가 예상된다.

따라서, OCIF가 새로운 골대사 마커로 될 수 있는가 아닌가를 명확하게 하기 위해 각종 골대사이상질환 환자의 체액중 각종 타입의 OCIF 농도 혹은 양타입의 총농도와 각 질환의 관계를 정밀 조사하는 것이 필요하다. 이를 위해서는, 양타입의 OCIF를 동등하게 인식할 수 있는 항체 및 호모다이머만을 특이적으로 인식하는 항체가 필요하다. 그렇지만, 이러한 특징을 가지는 항 OCIF 모노크로날항체는 아직도 얻어지지 않았다.

본 발명자들은 이러한 상황을 감안하여 세심히 검색한 결과 OCIF는 극히 높은 친화성(해리정수가 10^-9M 이하)을 가지고 모노머 및 호모다이머형 OCIF를 동등하게 인식하는 모노크로날항체 및 호모다이머형 OCIF만을 특이적으로 인식하는 모노크로날항체를 찾아냈다. 더욱이, 이들 항체를 이용하여 고감도의 효소면역측정 키트(샌드위치 ELISA)를 구축했다. 이 샌드위치 ELISA를 이용하여 젊은 성인이나 고령자의 혈청 및 골조송증, 갑상선기능 항진증, 암을 포함하는 각종 질환환자의 혈청중 OCIF 농도를 측정한 결과, 혈청 OCIF 농도와 골밀도간의 높은 역상관이 발견되었다. 또한, 만성관절류마티스, 변형성 관절증, 외상, 통풍발작이라고 하는 각종 관절질환 환자의 관절액중의 OCIF 농도를 측정한 결과, 관절파괴에 따라 진행된 환자의 관절액중 OCIF 농도가 낮은 것이 발견되었다. 이상의 결과로부터, 이 샌드위치 ELISA는 혈청 OCIF 농도를 측정하는 것에 의해 골밀도의 동태를, 또 관절액중의 OCIF 농도를 측정하는 것에 의해 관절파괴의 진행을, 각각 적확하게 파악할 수 있어 OCIF는 골량의 감소와 관절파괴를 조기에 예측할 수 있는 새로운 골대사이상증 진단 마커로서 유용하다는 것을 찾아내었다. 따라서, 본 발명은 사람 파골세포형성억제인자(OCIF) 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 골대사이상증, 특히, 골조송증 및 류마티스등에 의한 관절파괴의 진단방법, 이에 이용하는 모노크로날항체, 및 항체를 이용한 OCIF 측정용 키트를 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명은 채취한 체액중의 파골세포형성억제인자(OCIF)의 농도를 측정하고, 그 농도에 의해 골대사이상을 진단함에 의해 이루어지는 골대사이상증의 진단방법에 관한 것이다.

본 발명의 진단은 특히, 골조송증, 관절질환의 진단에 유용하다. 체액으로서는, 혈청, 관절액등이 이용된다. 골조송증의 진단은 주로 혈청 OCIF 농도를 측정함에 의해 행해진다. 관절질환의 진단은 주로 관절액중의 OCIF 농도를 측정함에 의해 행해진다.

본 발명의 진단은 특히, 골조송증의 진단에 유용하다. 체액으로서는 혈청, 관절액등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 이들 진단에 이용되는 모노크로날항체에 관한 것이다.

이러한 모노크로날항체로서는 모노머형 및 다이머형 OCIF를 동등하게 인식하는 모노크로날항체, 다이머형의 OCIF만을 선택적으로 인식하는 모노크로날항체등이 있다. 더구나, 모노크로날항체에는 OCIF와 다른 에피토프를 인식하고, 항원과의 해리정수가 2×10^-7M 이하의 고친화성을 가지는 모노크로날항체가 있다.

더욱이, 본 발명은 이들 모노크로날항체를 구성에 포함하는 OCIF 측정용 키 트에 관한 것이다.

본 발명에 따른 진단방법은 진단 대상자로부터 혈액(혈청), 관절액등의 체액을 채취하고, 이를 상기 모노크로날항체를 이용한 OCIF 측정용 키트로 평가함에 의해 행해진다.

본 발명의 모노크로날항체는 이하의 방법에 따라 얻을 수 있다. 즉, 항 OCIF 모노크로날항체의 제작에 필요한 면역용 항원인 사람 OCIF로서는 WO 96/26217호 공보 기재의 방법에 따라, 사람 태아 폐섬유아세포, IMR-90의 배양액에서 단리된 것이 이용된다. 또, 면역용 항원으로서 유전자 조환 사람 OCIF를 이용할 수도 있다. 유전자 조환 사람 OCIF는 사람 OCIF의 cDNA를 통상의 방법에 따라 발현 벡타에 끼워넣고, CHO세포, BHK세포, Namalwa세포등의 동물세포 혹은 곤충세포에서 발현시켜 정제함에 의해 얻을 수 있다. 모노머 및 다이머형 OCIF는 Tsuda등의 방법{Biochem. Biophys. Res. Commun. 234, 137-142(1997)}에 따르고, 역상크로마토그라피에 의해 각각 정제할 수 있었다. 또, 역상크로마토그라피 대신에 SP세파로즈, 항산화 셀룰로파인, 및 리소스 S 칼럼크로마토그라피를 조합시킴에 의해 양타입의 OCIF를 각각 정제할 수 있었다. 이 항원으로 포유동물을 면역하고 조제한 비장세포던가 혹은 생체외의 방법에 의해 면역한 임파구세포를 골수종세포주(미에로머)등과 융합시켜 하이브리도마를 제작할 수 있었고, 이 하이브리도마 배양액에 대해서 고도로 정제된 모노머형 OCIF 혹은 호모다이머형 OCIF를 각각 항원으로 이용하여 평가함에 의해 모노머형 및 호모다이머형 OCIF를 동등하게 인식하는 모노크로날항체, 혹은 호모다이머형 OCIF만을 특이적으로 인식하는 모노크로날항체를 생산 하는 하이브리도마를 선택, 크로닝하여 수립할 수 있었다. 또한, 수립한 안정한 하이브리도마를 각각 배양함에 의해 목적하는 항체를 얻을 수 있었다.

하이브리도마의 제작에 있어서, 포유동물을 사용하는 경우는 특히 한정되지 않지만, 마우스와 랏트등의 작은 동물을 이용한 것이 일반적이다. 면역은 항원인 OCIF를 생리식염수등으로 적당한 농도로 희석하고, 이 용액을 정맥내와 복강내에 투여하고, 이에 필요에 따라 프로인트 완전 아죠밴트(Freund's complete ajuvant)를 병용 투여하고, 동물에 1∼2주간의 간격으로 3∼4회 정도 투여하는 방법이 일반적이다. 본 발명에서 OCIF에 고친화성(해리정수가 2×10^-7M 이하)의 항 OCIF 모노크로날항체의 제작에 있어서는 목적하는 모노크로날항체가 얻어지기 쉽도록 1주간 간격으로 3회 면역하고, 게다가, 항원과 프로인트 불완전 아죠밴트를 병용하여 1주간 간격으로 4회 추가 면역하고, 가능한 혈중 항 OCIF 타이터(titer)를 높인다. 이리하여, 면역된 동물을 최종 면역후 3일째에 해부하여 비장을 적출하고, 비장세포를 면역세포로서 사용함이 좋다. 면역세포와 세포융합하는 마우스 유래의 미에로머로서는 예컨데, p3/x63-Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP-2/0, FO, P3x63 Ag8. 653 및 S194 등이 예시될 수 있다. 또한, 랏트 유래의 세포로서는 R-210등의 세포주가 있다. 사람형의 항체를 생산하는 경우에는, 사람 B임파구를 세포외에서 면역하고, 사람 미에로머 세포와 EB바이러스에 의해 형질전환한 세포주와 세포융합시킴에 의해 사람형의 항체를 생산할 수 있었다.

면역된 세포와 미에로머세포주의 융합은 공지의 방법, 예컨데 코흘러와 밀스테인의 방법(Koehler et al., Nature, 256, 495-497, 1975)이 일반적으로 사용되지 만, 전기 펄스를 이용한 전기 펄스법등도 사용가능하다. 면역임파구와 미에로머세포주는 통상 행해지고 있는 세포수의 비율에 혼합하고, 일반적으로 사용되는 세포배양용 배지(소태아혈청, FCS 불포함)에 폴리에틸렌글리콜을 첨가하여 융합처리를 행하고, FCS첨가 HAT선택 배지로 배양을 행하고, 융합세포(하이브리도마)를 선별한다.

모노머형 및 호모다이머형 OCIF를 동등하게 인식하는 항체, 및 호모다이머형 OCIF만을 특이적으로 인식하는 항체를 각각 생산하는 하이브리도마를 ELISA, 플랙법(plaque assay), 옥탈로닉법(ouchterlony method), 응지법(agglutination method)등 통상 항체의 검출에 사용되고 있는 방법을 이용하여 선택할 수 있다. 정제 모노머형 및 호모다이머형 OCIF를 이용한 ELISA로 가장 간편하고도 정밀도도 좋게 목적하는 항체를 검정할 수 있다. 특히, 본 발명에 의한 고친화성 항체(해리정수가 2×10^-7M 이하)를 얻기에는 통상의 솔릿드 페이즈 ELISA에서는 곤란하였다. 즉, 통상의 솔릿드 페이즈 ELISA에서는 항원을 고상화한 96웰 이뮤노플레이트(Nunc사)에 하이브리도마 배양액(50-100㎕)을 가해 일차반응을 행하고, 이어서, 효소표지, 예컨데 퍼옥시다아제(POD)표지한 항 마우스 IgG 항체를 가하여 2차반응을 행하고, 효소기질용액(50-100㎕)을 가하여 효소반응후, 각 웰의 흡광도를 측정한다. 이때, 높은 흡광도를 나타내는 하이브리도마 배양액은 그 하이브리도마가 항원 친화성이 낮은 항체를 대량으로 생산하고 있는 경우와, 그 생산성이 낮아도 극히 항원 친화성이 높은 항체를 생산하고 있는 경우의 양쪽이 존재하는 것을 나타내고 있고, 그 어느 쪽인가를 용이하게 판별할 수 없다. 그래서, 본 발명에서는 후자인 항원 친화성이 높은 항체 생산 하이브리도마를 비교적 용이하게 식별할 수 있도록 아래와 같이 솔릿드 페이즈 ELISA를 개량했다. 즉, 항원을 고상화한 96웰 이뮤노플레이트의 각 웰에 사람 혈청 혹은 소혈청을 첨가하고, 이어서, 하이브리도마 배양액을 소량 각 웰에 첨가하고, 제1차 반응을 약 80∼90% 혈청 존재하에서 실시함에 의해 생산성이 양호하지만, 항원 친화성이 낮은 항체 생산 하이브리도마를 배재할 수 있어 항원 친화성이 높은 항체 생산 하이브리도마를 선택적으로 스크리닝함이 가능하게 되었다. 이 개량 솔릿드 페이즈 ELISA에 있어서, 모노머형 OCIF 및 호모다이머형 OCIF를 항원으로써 양타입의 OCIF를 동등하게 인식하는 항체를 생산하는 하이브리도마 및 호모다이머형 OCIF만을 특이적으로 인식하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 각각 선택하고, 한계희석법에 의해 3∼5회 크로닝하고, 안정한 항체 생산주로써 수립한다. 이리하여 수립된 하이브리도마는 통상의 배양방법에 의해 계대배양 가능하고, 필요에 따라 동결보존할 수 있다. 하이브리도마는 통상법에 의해 배양하여 그 배양액에서 흡수할 수 있다. 또한, 하이브리도마를 포유동물의 복강내에 이식함에 의해 얻어지는 복수에서 항체를 회수할 수도 있다. 배양액 혹은 복수중의 항체는 염석법, 이온교환 및 겔여과크로마토그라피, 프로테인 A 또는 G를 이용하는 아피니티 크로마토그라피등 항체의 정제에 통상 이용되는 방법에 의해 정제할 수 있다. 얻어진 항체는 모노머형 및 호모다이머형 OCIF를 동등하게 인식하는 항체 및 호모다이머형 OCIF만을 특이적으로 인식할 수 있는 항체로서 각각 OCIF량(모노머형 OCIF + 호모다이머형 OCIF) 및 호모다이머형 OCIF만의 측정에 이용할 수 있다. 이들 항체를 방사성 아이소토프(isotope)와 효소라벨함에 의 해 라디오이뮤노엇세이(RIA)와 엔자임이뮤노엇세이(ELISA)로써 알려져 있는 측정계에 이용할 수 있고, OCIF량(모노머형 + 호모다이머형 OCIF량)과 호모다이머형 OCIF만의 량을 측정할 수 있다. 특히, 본 발명에 의한 호모다이머형 OCIF를 특이적으로 인식하는 항체의 존재는 모노머형 OCIF와 호모다이머형 OCIF에는 다른 에피토프가 존재함을 명확하게 할 뿐만 아니라, 이 항체는 모노머형 OCIF 에는 존재하지 않는 호모다이머형 OCIF만에 존재하는 에피토프를 인식하는 항체인 것을 나타내고 있다. 본 발명에 의해 얻어지는 모노머형 OCIF 및 호모다이머형 OCIF를 동등하게 인식하는 항체를 고상화항체로 하여 또 방사성 아이소토프 혹은 효소표지한 제2차 항체로써 각각 다른 공통에피토프로 모노머형 OCIF 및 호모다이머형 OCIF를 동등하게 인식하는 항체 및 호모다이머형 OCIF만을 특이적으로 인식하는 항체를 이용하면, OCIF량 및 호모다이머형 OCIF량을 각각 측정할 수 있다는 특징을 가진다. 더욱이, 호모다이머형 OCIF만을 측정하고 싶은 경우, 고상화 항체로써 아래 실시예 6(제1표)에 개시하는 호모다이머형 OCIF만을 특이적으로 인식하는 OI-26 항체, 표지항체로써 모노머형 OCIF 및 호모다이머형 OCIF를 동등하게 인식하는 OI-19 혹은 OI-4 항체를 사용할 수도 있다. 이들 측정계를 이용함에 의해 혈액, 뇨 및 관절액등의 생체시료와 세포배양액중 OCIF량 및 호모다이머형 OCIF량만을 용이하고도 고감도로 측정할 수 있다.

본 발명의 OCIF를 측정하기 위한 키트는 (i)제1차 항원 또는 제2차 항원 어느 것인가 한쪽의 항체가 OI-19 혹은 OI-26 항체이고, 또 (ii)다른 항체가 OI-4 항체인 것을 제하여 통상의 샌드위치법에서 시약(reagent)의 조합에 기하여 키트가 구성된다. 즉, 본 발명의 면역학적 측정 키트는 (1)불용성 담체에 고정화된 제1차 항체, (2)표지화된 제1차 항체, (3)용해제, (4)세정제 및 (5)표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정하기 위한 기질 및 반응정지제를 포함하고 있다. 불용성 담체로써는 예컨데 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소수지, 가교덱트스란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속등을 도금한 자성미립자등의 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합등을 예시할 수 있다. 또, 불용성 담체의 형상으로써는 쟁반상, 구상, 섬유상, 봉상, 판상, 용기상, 셀, 시험관, 다공성 필터등의 여러가지 형상으로 할 수 있다. 또한, 표지화 항체의 표지물질로써는 효소, 형광물질, 발광물질 및 방사성물질등을 사용하는 것이 유리하다. 효소로써는 퍼옥시다아제, 알카린포스파다아제, β-D-갈락토시다아제, 글리코스 옥시다아제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제등을, 형광물질로써는 플루오르씬 이소티옥시아네이트, 피코빌리프로테인등을, 발광물질로써는 이소루시놀, 루시제닌등을, 그리고, 방사성 물질로써는 I¹²⁵, I¹³¹, C¹⁴, H³등을 이용할 수 있지만, 이들은 예시한 것에 한하지 않고 면역학적 측정법에 사용할 수 있는 것이라면 어떤 것이라도 사용할 수 있다.

표지물질이 효소일 때, 그 활성을 측정하기 위해 기질, 필요에 의해 발색제가 이용된다. 효소로써 퍼옥시다아제를 이용하는 경우에는, 기질로써 H₂O₂를 이용하고, 발색제로써 2, 2'-아지노디-[3-에틸벤즈티아졸린 술폰산] 암모늄염(ABTS), 5-아미노살리실산, o-페닐렌디아민, 4-아미노안티피린, 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘, 호모세바딜린산, 티라민등을, 효소에 알카리포스파타아제를 이용하는 경우에는 기질로써 o-니트로페닐포스페이트, 4-메틸움벨리페릴인산을, 효소로 β-D-갈락토시다아제를 이용하는 경우는 기질로써 플루오르신-디-(β-D-갈락토피라노시드), 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토피라노시드등을 이용할 수 있다. 상기 면역학적 측정 키트에서 (3)용해제로써는 면역학적 측정에 통상 사용되는 것이라면 좋고, 예컨데 인산완충액, 트리스염산완충액, 초산완충액등을 포함한 pH가 6.0∼8.0의 범위의 것이 적합한 예로써 제시된다. 더욱이, (4)세정제로써는 동일한 면역학적 측정에 일반적으로 사용되고 있는 것이 그대로 사용된다. 그 예로써는 생리식염수, 인산완충액, 트리스염산완충액 및 이들의 혼합액이 열거된다. 이들 세정제에는 더구나 트리톤(Triton) X-100, 트윈(Tween) 20 또는 브리(Bri) j35의 어떠한 비이온계 계면활성제, 도데실황산나트륨, 찹스(CHAPS)의 어떠한 이용계 계면활성제를 가해도 좋다.

도 1은 실시예 7의 OI-19 항체와 OI-4 항체에 의한 ELISA의 검량선을 나타낸다.

[부호의 설명]

○ : 호모다이머형 OCIF

● : 모노머형 OCIF

도 2는 실시예 7의 OI-26 항체와 OI-4 항체에 의한 ELISA의 검량선을 나타낸 다.

[부호의 설명]

○ : 호모다이머형 OCIF

● : 모노머형 OCIF

도 3은 실시예 8의 골조송증 환자 및 건강한 정상인의 혈중 OCIF 농도를 나타낸다.

도 4는 실시예 8의 뇨중 피리디놀린과 혈중 OCIF 농도의 관계를 나타낸다.

도 5는 실시예 8의 뇨중 데옥시피리디놀린과 혈중 OCIF 농도의 관계를 나타낸다.

도 6은 실시예 9의 관절종장(關節腫張)을 가진 환자의 관절액중의 OCIF 농도를 나타낸다.

[부호의 설명]

RA : 만성관절류마티스

OA : 변형성 관절증

Tr : 외상

G : 통풍발작

이하 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명하지만, 이들은 단순히 예시하는 것만이고, 본 발명은 이들에 의해 어떻게 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

항원용 모노머형 OCIF 및 호모다이머형 OCIF의 정제

WO 96/26217호 공보 기재의 OCIF생산 CHO세포를 EX-CE11 301 배지(JRH 바이오사이언스사)에 1×10⁵ cells/㎖ 로 되도록 파종하고, 세포배양용 자(jar; 2ℓ용량)를 이용하여 37℃에서 7일간 배양했다. 얻은 배양액에 0.1%로 되도록 CHAPS{3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1]propanesulfonate, 시그마사}를 가해 초산으로 pH 6.0으로 조정한 후, 0.22㎛의 필터(밀리디스크, 밀리포화사)로 여과했다. 배양액을 미리 0.1% CHAPS를 포함하는 50mM 비스트리스-염산완충액, pH 6.0으로 미리 평형화한 SP세파로스 HP컬럼(2.6×10㎝, 팔마시아사)에 부하하고, 동 완충액으로 세정한 후, 유속 4㎖/분, 100분간으로 NaCl 농도가 1M로 되는 직선구배로 용출을 행하고, 8㎖씩 플렉셔네이션(fractionation)했다. WO 96/26217호 기재의 방법에 따라, 각 플렉션의 OCIF 활성을 측정하고, OCIF 분획분을 얻었다. 이 OCIF 분획분을 0.1% CHAPS를 포함하는 50mM 비스트리스-염산완충액, pH 6.0으로 10배 희석한 후, 미리 50mM 비스트리스-염산완충액, pH 6.0으로 평형화한 황산화셀룰로파인컬럼(2.6×10㎝, 세이가까구코쿄사)에 부하했다. 이 컬럼을 0.1% CHAPS를 포함하는 50mM 비스트리스-염산완충액, pH 6.0으로 세정한 후, 유속 4㎖/분, 100분간으로 NaCl 농도가 1.5M로 되는 직선구배로 용출을 행하고, 8㎖씩 플렉셔네이션했다. 각 플렉션의 OCIF 활성을 상기와 동일한 방법으로 측정했다. 또한, 각 플렉션의 일부를 비환원 조건하에서 SDS-PAGE에 걸어 OCIF 활성을 가지고, 그 분자량이 약 60kDa를 나타내는 분획분을 모아 분획분 1로 했다. 또, OCIF 활성을 가지고 비환원 조건하에서 SDS-PAGE로 약 120kDa의 분자량을 나타내는 분획을 모아서 분획분 2 로 했다. 분획분 1 및 2를 각각 0.1% CHAPS를 포함하는 50mM 비스트리스-염산완충액, pH 7.0으로 10배로 희석했다. 희석하여 얻은 양분획분을 각각 미리 0.1% CHAPS를 포함하는 50mM 비스트리스-염산완충액, pH 7.0으로 미리 평형화한 리소스 S 컬럼(0.64×3㎝, 팔마시아사)에 부하하고, 0.01% 폴리소르베이트(polysorbate) 80을 포함하는 10mM 인산나트륨완충액, pH 7.0으로 세정한 후, 유속 1㎖/분, 15분간으로 NaCl 농도가 0.6M로 되는 직선구배로 용출을 행하고, 0.5㎖씩 플렉셔네이션했다. 분획분 1 및 2를 각각 부하함에 의해 얻은 각 플렉션의 OCIF 활성을 상기와 동일하게 측정하고, OCIF 활성을 가지는 플렉션을 모아서 분획분 1에서 모노머형 OCIF, 분획분 2에서 호모다이머형 OCIF를 얻었다.

[실시예 2]

마우스의 면역 및 하이브리도마의 제작

실시예 1 기재의 방법으로 정제된 모노머형 OCIF 및 호모다이머형 OCIF를 각각 100㎍/㎖로 되도록 생리식염수에 용해했다. 이렇게하여, 조제한 타입의 OCIF를 등량포함하는 혼합액에 같은 용량의 프로인트 완전 아죠벤트를 가해 잘 유화한 후, Balb/c 마우스 한마리당 복강내에 200㎕씩 1주간 간격으로 3회 투여하고, 마우스를 면역했다. 이어서, 양타입의 OCIF를 각각 25㎍/㎖ 포함하는 혼합액에 같은 용량의 프로인트 완전 아죠벤트를 첨가하여 충분히 유화한 것을 상기 Balb/c 마우스 한마리당 복강내에 200㎕씩, 1주간 간격으로 4회 추가 면역했다. 4회째 추가 면역의 1주간후, 양타입의 OCIF를 각각 100㎍/㎖ 포함하는 혼합액을 Balb/c 마우스 한마리당 복강내에 100㎕씩 정맥내에 투여했다. 최종 면역후 3일째에 비장을 적출·비장 세포를 분리하고, 마우스 미에로마세포 P3x63-AG8. 653(ATCC CRL-1580)와 공지방법{Koehler, G. and Milstein, C., Nature, 256, 495 (1975)}에 따라 세포융합했다. 융합종료후, 세포현탁액을 하이포크산틴아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 HAT 배지중에서 10일간 배양했다. 미에로마세포가 사멸하고, 하이브리도마가 출현한 후, HAT 배지에서 아미노프테린을 제외한 HAT 배지에 배지교환하고 배양을 계속했다.

[실시예 3]

하이브리도마의 선택 및 크로닝

융합 10일 후에 하이브리도마의 출현을 확인했으므로 상기에 기재한 개량 솔릿트 페이즈 ELISA에 의해 모노머형 OCIF 및 호모다이머형 OCIF를 동등하게 인식하는 고친화성 항체 및 모노머형 OCIF 만을 특이적으로 인식하는 고친화성 항체 생산 하이브리도마의 선택을 행했다. 즉, 미리 모노머형 및 호모다이머형 OCIF를 각각 5㎍/㎖로 되도록 0.1M 탄산수소나트륨용액(pH 9.6)으로 용해하고, 각각의 항원용액을 50㎕씩 96웰 이뮤노플레이트(Nunc사)의 각 웰에 가해 4℃에서 하룻밤 방치하여 각각의 항원을 고상화했다. 각 웰중의 항원용액을 버려 0.1% 폴리소르베이트 20을 포함하는 인산염완충 생리식염수(PBS-P)로 세정하고, 각 웰에 40㎕의 소태자(胎仔)혈청(하이크론사)을 가했다. 이어서, 각 웰에 10㎕의 하이브리도마 배양상청을 가해 80% 혈청농도하에서 실온으로 2시간 반응시켰다. 반응후, 플레이트를 PBS-P로 세정하고, 25% 블럭에이스를 포함하는 생리식염수로 5000분의 1로 희석한 파옥시다아제표지 항마우스 IgG(KPL사)를 각 웰에 50㎕ 가해 실온에서 2시간 반응시켰다. 플레이트를 PBS-P로 세정한 후, 각 웰에 50㎕의 효소기질용액(TNB, ScyTek사)을 가하여 발색시킨 후, 반응정지액(stopping reagent, ScyTek사) 50㎕를 가하여 효소반응을 정지했다. 각 웰의 450㎚에서의 흡광도를 마이크로플레이트리더(이뮤노리더 NJ2000, 니폰인터멧드사)를 사용하여 측정하고, 항체생산하이브리도마를 선택했다. 특히, 높은 흡광도를 나타내고, 게다가, 모노머형 및 호모다이머형 OCIF를 동등하게 인식하는 항체 혹은 모노머형 OCIF를 인식하지 않고 호모다이머형 OCIF만을 특이적으로 인식하는 항체 생산 하이브리도마를 선택하고, 각각의 하이브리도마에서 한계희석법에 의해 3∼5회 크로닝을 반복함에 의해 안정한 항체 생산 하이브리도마를 수립했다. 얻은 항체 생산주중에서 더욱 목적항체의 생산성이 높은 하이브리도마주를 선별했다.

이렇게하여, 모노머형 OCIF 및 호모다이머형 OCIF를 동등하게 인식하는 OI-19 항체 혹은 OI-4 항체를 생산하는 하이브리도마 OI-19 및 OI-4를 얻었다. 또한, 호모다이머형 OCIF만을 특이적으로 인식하는 OI-26 항체를 생산하는 하이브리도마 OI-26을 얻었다. 이들을 일본 공업기술원 생명공학공업 기술연구소에 기탁하고, OI-4에는 수탁번호 FERM BP-6419, OI-19에는 수탁번호 FERM BP-6420, OI-26에는 수탁번호 FERM BP-6421이 각각 부여되어 있다.

[실시예 4]

모노크로날항체의 생산 및 정제

실시예 3에서 얻은 목적의 항체, 즉 고친화성으로 모노머형 및 호모다이머형 OCIF를 동등하게 인식하는 항체 및 호모다이머형 OCIF만을 특이적으로 인식하는 항 체 생산 하이브리도마를 각각 배양하고, 마우스 한마리당 각각의 하이브리도마를 1×10⁶ 세포씩 미리 프리스틴(pristine; 알드리치케미칼사)을 투여해 둔 Balb/c계 마우스의 복강내에 이식했다. 2주간후, 축적한 복수를 채취하고, 본 발명의 모노크로날항체를 포함하는 복수를 얻었다. 프로테인 A 컬럼(팔마시아사) 크로마토그라피에 의해 복수에서 정제항체를 얻었다.

[실시예 5]

모노크로날항체의 해리정수(K _d 값)의 측정

베트랜드 프리게스트(Betrand Frigust)들의 방법(Journal of Immunological Methods, 77, 305-319, 1986)에 따라 모노크로날항체의 해리정수를 측정했다. 즉, 실시예 4에서 얻은 정제항체를 5ng/㎖로 40% 블럭에이스(Block Ace; 雪印乳業社), 0.1% 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.2M 트리스-HCl pH 7.4(1차 버퍼)로 희석하고, 이에 실시예 1 기재의 정제 모노머형 혹은 호모다이머형의 유전자 조환형 OCIF(rOCIF)를 6.25ng/㎖∼10㎕/㎖로 되도록 1차 버퍼로 희석한 것을 등용량 섞어 4℃에서 15시간 정치함에 의해 OCIF와 모노크로날항체를 결합시켰다. 15시간후, OCIF와 미결합의 항체를 모노머형 혹은 다이머형의 rOCIF(10㎕/㎖, 100㎕/웰)를 고상화한 솔릿트 페이즈 ELISA에서 측정함에 의해 모노크로날항체의 모노머형 및 호모다이머형 OCIF에 대한 해리정수를 계산했다.

[실시예 6]

모노크로날항체의 클래스 및 서브클래스의 검정

본 발명의 모노크로날항체의 클래스 및 서브클래스를 이뮤노글로브린 클래스 및 서브클래스 분석키트(아마샴사)를 이용하여 검정했다. 검정은 키트에 지시되어 있는 프로토콜에 따라 실시했다. 실시예 5 및 6으로 얻은 결과를 표 1에 나타낸다.

표 1

항체명	서브클래스	해리정수(대 모노머)	해리정수(대 다이머)
OI-4	IgG₁(κ)	7.3×10^-10	9.9×10^-12
OI-19	IgG₁(κ)	7.0×10^-10	1.2×10^-11
OI-26	IgG₁(κ)	-	1.5×10^-7

이들의 결과로부터, 항체 OI-4 및 OI-19는 모노머형 및 호모다이머형 OCIF를 거의 동등하게 인식하는 항체이고, 항체 OI-26은 호모다이머형 OCIF만을 특이적으로 인식하는 항체인 것이 확인되었다. 또한, 모든 항체는 IgG₁에 속하고, 모노머형 혹은 호모다이머형 OCIF에 대한 해리정수는 2×10^-7M 이하의 극히 친화성이 높은 항체인 것이 명확하게 되었다.

[실시예 7]

OCIF의 ELISA에 의한 측정

상기 방법에 의해 얻은 3종의 항체 OI-4, OI-26 및 OI-19를 각각 고상항체와 표지항체로 하여 샌드위치 ELISA를 구축했다. 항체의 표지는 말레이미드 활성화 퍼옥시다아제 키트(피아스사)를 이용하여 행했다. 모노머형 및 호모다이머형 OCIF를 동등하게 측정하는 ELISA에는 OI-19 항체를 1차 항체로 하여, 혹은 호모다이머형 OCIF를 특이적으로 측정하는 ELISA에는 OI-26 항체를 1차 항체로 하여, 각각 10 ㎍/㎖로 되도록 0.1M 탄산수소나트륨용액(pH 9.6)에 용해하고, 100㎕씩 96웰 이뮤노플레이트(Nunc사)의 각 웰에 가해 4℃에서 하룻밤 정치하여 고상화했다. 각 웰의 용액을 버리고 50% 농도의 블럭에이스(雪印乳業社) 300㎕를 가해 실온에서 2시간 정치하여 블럭킹했다. 블럭킹후, 플레이트를 0.1% 폴리소르베이트 20을 포함하는 인산염완충생리식염수(PBS-P)로 세정했다. 모노머형 OCIF 및 호모다이머형 OCIF를 각각 40% 블럭에이스(雪印乳業社) 및 0.1% 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.2M 트리스-HCl(pH 7.4)(1차 버퍼)에 용해·희석하고, 여러가지 농도의 양타입 OCIF 용액을 조제했다. 여러가지 농도로 조제한 모노머형 및 호모다이머형 OCIF 용액 각각을 100㎕씩 각 웰에 가해 실온에서 2시간 반응시켰다. 2시간후, 플레이트를 PBS-S로 세정하고, 25% 블럭에이스(雪印乳業社) 및 0.1% 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.1M 트리스-HCl(pH 7.4)(2차 버퍼)로 희석한 POD 표지 OI-4 항체를 모노머형 및 호모다이머형 OCIF를 동등하게 인식하는 항체로써 각 웰에 100㎕ 가해 실온에서 2시간 반응시켰다. 플레이트를 PBS-P로 세정한 후, 각 웰에 100㎕의 효소기질용액(TMB, ScyTek사)을 가하여 발색시킨 후, 반응정지액(stopping reagent, ScyTek사)를 100㎕씩 각 웰에 가하여 효소반응을 정지시켰다. 각 웰의 450㎚에서 흡광도를 마이크로플레이트리더를 사용하여 측정했다. 제 1차 항체로써 모노머형 및 호모다이머형 OCIF를 거의 동등하게 인식한 항체, OI-19를 사용한 때의 결과를 도 1에, 또, 호모다이머형 OCIF만을 특이적으로 인식하는 항체 OI-26을 이용한 때의 결과를 도 2에, 각각 도시한다. 이 결과, 도 1에 도시한 바와같이, 모노머형 및 호모다이머형 OCIF를 거의 동등하게 인식하는 항체, OI-19를 고상항체로 하고, 양타입의 OCIF를 동등하게 인식하는 항체, OI-4를 POD 표지항체로 한 때의 샌드위치 ELISA의 측정감도는 약 25pg/㎖로 극히 미량의 OCIF를 측정할 수 있는 것이 명확하게 되었다. 또한, 도 2에 도시한 바와같이, 호모다이머형 OCIF만을 특이적으로 인식하는 항체 OI-26을 고상항체로 하고, 모노머형 및 호모다이머형 OCIF를 동등하게 인식하는 항체 OI-4를 POD 표지항체로 한 샌드위치 ELISA의 측정감도는 50pg/㎖로 고감도로 호모다이머형 OCIF만을 측정할 수 있음을 확인했다.

[실시예 8]

건강한 정상인 및 골조송증 환자의 혈청중 OCIF의 측정

건강한 정상인 및 골조송증 환자(일본 골대사학회의 진단기준에 기함)의 혈청중 OCIF 농도를 실시예 7 기재의 OCIF의 ELISA계(모노머형 OCIF + 호모다이머형 OCIF)를 일부 개량하여 측정했다. 즉, OCIF 농도(모노머형 OCIF + 호모다이머형 OCIF)의 측정에는, 양타입의 OCIF를 동등하게 인식하는 항체 OI-19를 실시예 7과 동일하게 96웰 이뮤노플레이트에 고상화하고, 각 웰에 정제 마우스 IgG(카펠사)를 20㎍/㎖로 되도록 가한 1차 버퍼(40% 블럭에이스 및 0.1% 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.2M 트리스-HCl, pH 7.4)를 50㎕ 가하고, 이어서 1차 버퍼로 4배 희석한 각 사람혈청을 50㎕ 가해 실온에서 2시간 정치했다. 0.1% 폴리소르베이트 20을 포함하는 인산염완충생리식염수(PBS-P)로 6회 세정한 후, 양타입의 OCIF를 동등하게 인식하는 항체 OI-4의 POD 표지체를 정제 마우스 IgG를 10㎍/㎖로 되도록 가한 2차 버퍼(25% 블럭에이스 및 0.1% 폴리소르베이트 20을 포함하는 0.1M 트리스-HCl, pH 7.4)로 3000배로 희석한 용액을 100㎕씩 각 웰에 가하여 실온에서 2시간 정치했다. PBS-P로 6회 세정후, 효소기질용액(TMB, ScyTek사)을 100㎕씩 각 웰에 가해 실온에서 20분간 반응시킨 후, 반응정지액(stopping reagent, ScyTek사)를 100㎕씩 각 웰에 첨가하여 반응을 정지했다. 각 웰의 450㎚의 흡광도를 마이크로플레이트리더를 사용하여 측정했다. 이미 아는 량의 OCIF를 포함하는 1차 버퍼에 대해서 동일하게 조작하고, 도 1과 동일하게 OCIF의 검량선을 제작하고, 혈청검사의 흡광도에서 혈청중의 OCIF 농도를 구했다.

골조송증 환자 및 건강한 정상인의 혈청중의 OCIF(모노머형 OCIF + 호모다이머형 OCIF) 농도의 시험결과를 도 3에 나타낸다. 도 3∼5에 나타낸 결과의 유의할 차이점 검정은, Student's non-paired t 검정으로 행했다. 이 결과, 골조송증 환자와 건강한 정상인과의 사이에는, 혈청 OCIF(모노머형 OCIF + 호모다이머형 OCIF) 농도에 유의한 차이가 확인되고, 골조송증 환자의 혈청 OCIF 농도는 건강한 정상인의 그것보다도 유의할 정도로 높았다. 따라서, 혈청 OCIF 농도를 측정함에 의해 골조송증 환자의 병태를 파악할 수 있기 때문에 OCIF는 골조송증을 판정하는 새로운 골대사 마커로 될 수 있는 것이 명확하게 되었다.

또한, 건강한 정상인과 골조송증 환자의 혈청 OCIF(모노머형 OCIF + 호모다이머형 OCIF) 농도와 뇨중 피리디놀린 농도의 관계를 도 4에, 뇨중 데옥시피리디놀린 농도와의 관계를 도 5에, 각각 도시한다. 여기서, 피리디놀린 농도 42p㏖/μ㏖ Cr(크레아티닌 1μ㏖당 피리디놀린 p㏖량), 데옥시피리디놀린 농도 6.2p㏖/μ㏖ Cr은 각각 일본인 정상값의 상한값이다. 그결과 피리디놀린, 데옥시피리디놀린 농도가 높은값을 나타내는 환자의 혈청 OCIF 농도는 유의할 정도로 높았다. 피리디놀 린 및 데옥시피리디놀린은 콜라겐의 가교분자이고, 콜라겐이 골기질에 취입된 후에 골기질내에서 생성되어 골흡수시의 골파괴에 의해 방출된다. 이들 분자는 골흡수 마커로써의 특이성이 높다고 되어 있고, 임상검체의 평가에 폭널리 이용되고 있는 것이다. OCIF 농도와 이 두개의 마커와의 상관이 확인된 것에 의해 혈청중 OCIF 농도는 골대사 마커로써 유용함이 명확하게 되었다.

[실시예 9]

관절종장을 확인한 환자의 관절액중 OCIF 농도의 측정

관절질환의 치료를 목적으로 하여 병원을 방문하여 진찰의 결과 명확하게 관절종장을 확인한 만성관절류마티스(RA) 환자 43예, 변형성 관절증(OA) 환자 6예, 외상(Tr) 환자 3예, 및 통풍발작(G) 환자 6예로부터 의견통지를 얻은 뒤 관절액을 채취했다. 이들 관절액중의 OCIF 농도를 실시예 8에 기재한 OCIF의 ELISA계(모노머형 OCIF + 호모다이머형 OCIF)를 일부 개선하여 측정했다. 즉, 관절액은 1차 버퍼로 16배 희석한 후, 그 50㎕를 항체 OI-19를 고상화한 96웰 이뮤노플레이트의 각 웰에 가했다. 이 조작이외 모든 조작은 실시예 8 방법과 동일하게 실시했다.

관절종장을 확인한 환자 관절액중 OCIF(모노머형 OCIF + 호모다이머형 OCIF) 농도의 시험결과를 도 6에 나타낸다. 또한, 도 6에 도시한 데이터의 통계해석에는 크루스칼-월리스 시험(Kruskal-Wallis Test) 및 만-휘트니 시험(Mann-Whitney Test)을 사용했다. 이 결과, 관절액중의 OCIF 농도는, 통풍발작(G)예에 비해 RA환자의 쪽이 유의할 정도로 낮은 값을 나타냈다(p=0.0023). 또한, 6예의 OA환자의 관절액중 OCIF 농도의 체적값은 4.79ng/㎖이었고, 한편, 관저액중 OCIF 농도가 4.0ng/㎖ 이하의 낮은 값을 나타낸 RA환자는 43예중 15예에 달했다. 이들 결과에서, 관절액중 OCIF 농도가 낮은 값을 나타낸 일부 RA환자의 관절에서 OCIF의 부족에 의해 파골세포의 형성과 활성이 억제되지 않을 가능성이 시준되었다. 또한, OCIF-ELISA가 만성관절류마티스(RA), 변형성 관절증(OA), 외상(Tr) 및 통풍발작(G) 병태의 진단에 유용한 것이 확인되었다.

[실시예 10]

만성관절류마티스(RA) 환자의 슬(膝)관절액중 OCIF 농도와 병태의 관계

관절액중의 OCIF 농도와 관절파괴의 진행과의 관계를 검토하기 위해 리트로스펙티브 코호트 연구(retrospective cohort study)를 만성관절류마티스(RA) 환자 2예에 대해 실시했다.

(병예 1, 66세, 남성)

1982년(50세 당시) 다관절통을 자각. 1983년 병원에서 초진을 받고 아메리칸 칼리지 오브 류마톨로지(American College of Rheumatology)의 RA의 분류기준을 만족하는 RA로 진단되었다. 이후, 항류마티스약(메르카프타아제)에 의해 일시 관해(寬解)로 되고, 항류마티스약의 투여를 중지했다. 1990년 RA를 재발하고, 항류마티스약의 투여를 재개했다. 1992년 3월 18일 우슬관절을 종장하고, 천자(穿刺)에 의해 관절액을 채취했다. 이때의 관절액중 OCIF 농도는 23.6ng/㎖이고 높은 값을 나타내었다(실시예 9에서 나타낸 43예의 RA환자의 관절액중 OCIF 농도의 중앙값은 약 6ng/㎖). 이때 혈장의 CRP는 5.4㎎/㎗이고 명확하게 염증반응을 나타냈다. CRP는 완전히는 음성화하지 않고, 1997년까지 3㎎/㎗ 전후를 나타내고 있었다. 슬(膝)X-p는 1983년에서 1997년까지 확인되고 있지만, 변형성 관절증(OA)의 변화가 주체이고, 수지관절 및 수관절에 있어서도 골 미란(bone erosion)은 확인되지 않았다.

(병예 2, 60세, 여성)

1987년(49세) 다관절통을 자각. 1993년 8월 17일 병원에서 초진을 받고 아메리칸 칼리지 오브 류마톨로지(American College of Rheumatology)의 RA의 분류기준을 만족하는 RA로 진단되었다. 이때, 우슬관절이 종장하고 있고, 천자에 의해 관절액을 채취했다. 이때의 관절액중 OCIF 농도는 3.0ng/㎖로 낮은 값을 나타내고, 또 혈장의 CRP는 13.7㎎/㎗로 강한 염증반응을 나타내고 있었다. 그후, 항류마티스약(메토트렉사이트)의 투여에 의해 CRP는 서서히 저하하고, 1994년 3월 18일에는 4.1㎎/㎗, 같은 해 6월 27일에는 1.1㎎/㎗까지 저하했다. 그러나, 슬X-p는 라젠분류(Laresen A. et al., Acta Radiol. Diag. 18, 481-491, 1997)에 의하면 1993년 9월 1일에는 3단계(grade III), 1994년 3월 18일에는 4단계(grade IV), 같은 해 6월 27일에는 5단계(grade V)로, 관절파괴는 확실히 진행하고, 같은 해 10월 4일에는 인공관절치환술이 시행되었다.

상기 2예, 즉 관절파괴의 진행이 온건하였던 병예 1과 관절파괴가 진행한 병예 2에서의 관절액중 OCIF 농도의 측정결과에서 류마티스에 의한 관절파괴의 위험도의 평가와 관절파괴 치료효과의 평가에 관절액중 OCIF 농도측정이 유용하다는 것이 나타났다.

[실시예 11]

모노머형 및 다이머형 OCIF 측정용 키트 1(80검체)

① OI-19 항체를 실시예 7의 방법으로 고상화하고, 미리 블럭에이스로 블럭킹한 96웰 플레이트 : 1매

② 실시예 7의 방법으로 POD 표지화한 OI-4 항체 : 10㎕(1000배 농도)

③ 유전자 조환형 OCIF(모노머형) 표준품 : 0.5ng/㎖ 400㎕

④ 검체의 희석액(0.01% Tween 20과 40% 블럭에이스를 포함하는 0.2M 트리스-HCl 완충액, pH 7.4) : 10㎖

⑤ 표지항체의 희석액(0.01% Tween 20과 25% 블럭에이스를 포함하는 0.1M 트리스-HCl 완충액, pH 7.4) : 10㎖

⑥ 96웰 플레이트 세정을 위한 세정액{0.1% Tween 20을 포함하는 PBS(-)} : 1리터

⑦ 표지화 효소활성을 측정하기 위한 기질용액(여기서는 TMB용액) 및 반응정지액(TMB stop reagent) : 각 10㎖

다이머형 OCIF 측정용 키트 2(80검체)

① OI-26 항체를 실시예 7의 방법으로 고상화하고, 미리 블럭에이스로 블럭킹한 96웰 플레이트 : 1매

③ 유전자 조환형 OCIF(다이머형) 표준품 : 0.5ng/㎖ 400㎕

측정방법(키트 1 및 키트 2)

플레이트 ①의 각 웰에 희석액 ④로 희석한 검체 및 사람 유전자 조환형 OCIF 표준품 ③을 단계 희석한 용액을 100㎕씩 가한다. 실온에서 약 2시간 방치한 후, 세정액 ⑥ 300㎕로 플레이트의 각 웰을 5∼6회 세정한다. 이 세정조작에는 자동플레이트워셔(automatic plate washer)를 사용해도 좋다. 세정한 플레이트의 각 웰에 POD표지한 OI-4 항체 ②를 희석액 ⑤로 1000배 희석한 용액 100㎕씩을 가해 다시 실온에서 약 2시간 방치한다. 세정액 ⑥으로 플레이트의 각 웰을 5∼6회 세정한다. 이 세정조작에는 자동플레이트워셔를 사용해도 좋다. 효소기질용액 ⑦을 각 웰에 100㎕씩 가해 실온에서 20∼30분 방치한다. 각 웰에 반응정지액 ⑦을 100㎕ 가함에 의해 효소반응을 정지한다. 각 웰의 450㎚에서 흡광도를 마이크로플레이트리더를 사용하여 측정한다. 사람 유전자 조환형 OCIF 표준품 ③을 단계희석한 것을 가한 웰의 450㎚의 흡광도로부터 사람 유전자 조환형 OCIF 농도의 검량선을 제작하고, 이 검량선에서 각 검체의 OCIF 농도를 구한다.

본 발명에 의해 채취한 체액(혈청, 관절액등)중의 사람 파골세포형성억제인자(OCIF) 농도를 측정함에 의해 골대사이상증, 특히 골조송증 및 관절질환의 진단을 간이적이면서 정확히 행할 수 있다. 본 발명의 진단에는 상기 모노크로날항체, 및 그 모노크로날항체를 이용한 OCIF 측정용 키트가 사용되므로 골대사이상, 특히 골조송증 및 관절질환의 진단을 상기와 같이 간이적이고도 정확히 행할 수 있는 것이다. 본 발명은 골대사이상증, 특히 골조송증 및 관절질환의 진단방법, 혹은 연구용 분석시약등에 유용하다.

미생물로의 언급

·당해 미생물을 기탁한 기탁기관의 명칭 및 주소성명

기탁기관 : 일본국 통상 산업성 공업기술원 생명공학공업기술연구소

주소 : 일본국 이바라키켄 쯔쿠바시 히가시 1죠메 1-3

기탁기관에 기탁한 날짜 : 평성 9년(1997) 10월 16일

기탁기관의 기탁에 대하여 부여된 기탁번호 : FERM BP-6419

기탁기관 : 일본국 통상 산업성 공업기술원 생명공학공업 기술연구소

주소 : 일본국 이바라키켄 쯔쿠바시 히가시 1죠메 1-3

기탁기관에 기탁한 날짜 : 평성 9년(1997) 10월 16일

기탁기관의 기탁에 대하여 부여된 기탁번호 : FERM BP-6420

주소 : 일본국 이바라키켄 쯔쿠바시 히가시 1죠메 1-3

기탁기관에 기탁한 날짜 : 평성 9년(1997) 10월 16일

기탁기관의 기탁에 대하여 부여된 기탁번호 : FERM BP-6421

Claims

이하의 공정을 포함하는 것으로 되는, 파골세포형성억제인자(OCIF)와의 결합에서 해리정수가 2×10^-7M 이하인 것을 특징으로 하는 고친화성 항 파골세포형성억제인자 항체의 제조방법,

공정 1) 파골세포형성억제인자를 항원으로 하여 파골세포형성억제인자 항체 생산 하이브리도마를 취득하는 공정,

공정 2) 공정 1에서 얻어진 복수의 하이브리도마의 배양상청을, 약 80 내지 90% 혈청 존재하에서 파골세포형성억제인자와 접촉시켜서, 해당 조건하에서 파골세포형성억제인자에 결합하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선택하는 공정,

공정 3) 선택된 하이브리도마가 생산하는 항체를 취득하는 공정.
청구항 1 기재의 방법에 의해 제조되는, 파골세포형성억제인자와의 결합의 해리정수가 2×10^-7M 이하인 것을 특징으로 하는 고친화성 항 파골세포형성억제인자 항체.
청구항 1의 공정 1에서, 파골세포형성억제인자로서 호모다이머형 파골세포형성억제인자를 사용하고, 게다가 이하의 공정 A를 포함하는 것으로 이루어지고, 호모다이머형 파골세포형성억제인자만으로 선택적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 고친화성 항 파골세포형성억제인자 항체의 제조방법,

공정 A) 호모다이머형 파골세포형성억제인자에 결합하고, 모노머형 파골세포형성억제인자에 결합하지 않는 항체를 선택하는 공정.
청구항 3 기재의 방법에 의해 제조되는, 호모다이머형 파골세포형성억제인자에만 선택적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 고친화성 항 파골세포형성억제인자 항체.
청구항 1의 공정 1에서, 파골세포형성억제인자로서 호모다이머형 파골세포형성억제인자를 사용하고, 게다가 이하의 공정 A를 포함하는 것으로 이루어지는, 호모다이머형 파골세포형성억제인자와 모노머형 파골세포형성억제인자에 동등하게 결합하는 것을 특징으로 하는 고친화성 항 파골세포형성억제인자 항체의 제조방법,

공정 A) 호모다이머형 파골세포형성억제인자와 모노머형 파골세포형성억제인자에 동등하게 결합하는 항체를 선택하는 공정.
청구항 5 기재의 방법에 의해 제조되는, 호모다이머형 파골세포형성억제인자와 모노머형 파골세포형성억제인자에 동등하게 결합하는 것을 특징으로 하는 고친화성 항 파골세포형성억제인자 항체.
OI-26(FERM BP-6421)에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 청구항 4 기재의 항체.
OI-4(FERM BP-6419) 또는 OI-19(FERM BP-6420)에 의해 생산되는 것을 특징으로 하는 청구항 6 기재의 항체.
하이브리도마 OI-4(FERM BP-6419).
하이브리도마 OI-19(FERM BP-6420).
하이브리도마 OI-26(FERM BP-6421).
청구항 2, 4, 6, 7 및 8 기재의 항체 중 적어도 하나를 함유하는 파골세포형성억제인자 농도 측정용 키트.
골대사이상증의 진단에 이용되는 것을 특징으로 하는 청구항 12 기재의 측정용 키트.