PT1757619E

PT1757619E - Osteoprotegerina no leite

Info

Publication number: PT1757619E
Application number: PT06124157T
Authority: PT
Inventors: Anne Donnet-Hughes; Karine Vidal; Elizabeth Offord-Cavin; Peter Van Den Broek
Original assignee: Nestle Sa
Priority date: 2001-04-03
Filing date: 2002-03-15
Publication date: 2010-03-25
Also published as: EP1757619A3; WO2002081521A3; MXPA03008895A; BR0208554A; EP1377610A2; JP4921687B2; EP1757619A2; JP2004537980A; UA84831C2; US7749960B2; WO2002081521A2; CA2442694A1; AU2002253133B2; DE60235418D1; CA2442694C; US20040137074A1; ZA200308490B; RU2003132059A; ATE458004T1; US20050288219A1

Description

DESCRIÇÃO "OSTEOPROTEGERINA NO LEITE" A presente invenção refere-se a osteoprotegerina obtida de fontes lácteas, em particular de leite bovino. A presente invenção refere-se, também, à sua utilização para preparação de uma preparação para ingestão e/ou uma composição farmacêutica, em particular à utilização de uma destas preparações/composição para evitar ou tratar distúrbios associados com metabolismo do osso e função imunitária.

Em mamíferos, os ossos proporcionam suporte para o corpo e consistem em minerais, uma matriz de proteínas colagenosas e não colagenosas e um componente celular. 0 seu crescimento e manutenção são controlados por uma variedade de diferentes factores envolvendo a regulação e interacção dos vários tipos de componentes celulares, í. e., os condrócitos que formam a cartilagem, os osteoblastos que sintetizam e depositam a matriz óssea e os osteoclastos responsáveis para a reabsorção de material ósseo.

Os condrócitos são derivados de células de mesênquima e produzem um molde inicial de cartilagem necessário para a formação óssea endocondral. Os osteoblastos, que promovem a formação de tecido ósseo, são derivados de células osteoprogenitoras de mesênquima e estão localizados à superfície dos ossos onde estes sintetizam, transportam e arranjam as proteínas da matriz. Por outro lado, os osteoclastos, que são 1 responsáveis pela reabsorção óssea, são derivados de precursores granulócitos-monócitos presentes na medula hematopoiética. As acções de osteoclastos e osteoblastos estão estritamente ligados, e. g., durante o processo de reabsorção mediada por osteoclastos, os factores de proteína que são elaborados actuam como moléculas de sinalização para iniciar a renovação óssea pelos osteoblastos. Os osteoblastos, por sua vez, podem influenciar a função dos osteoclastos através da expressão de reguladores solúveis ou ligados à membrana. A remodelação óssea normal é, deste modo, dependente de um equilíbrio definitivo entre as funções oponentes de formação óssea e reabsorção óssea como conduzido por cada um dos respectivos tipos de células.

Os factores de crescimento, tais como o factor de crescimento de fibroblastos (FGF) e o factor de crescimento de transformação (TGF)^, são armazenados na matriz extracelular óssea e, quando segregados, estimulam a libertação local das células progenitoras do osso. Depois disto, os factores, tais como as proteínas morfogenéticas do osso (BMP) e hormona paratiróide (PTH), influenciam o desenvolvimento destes progenitores em osteoblastos, as células formadoras de osso, cuja diferenciação final e função são reguladas pela interacção da célula com as proteínas da matriz óssea.

Durante o envelhecimento, um indivíduo é sujeito a uma perda gradual de massa óssea, um fenómeno denominado desacoplamento, que é suposta resultar da actividade de osteoclastos exceder a dos osteoblastos. Em casos em que este desacoplamento persiste durante um período de tempo mais longo, mais e mais do material ósseo fica destruído/reabsorvido e surge um estado denominado osteoporose. 2

Além do fenómeno dependente da idade, a perda óssea pode também acontecer devido a deficiência de cálcio ou hormonal, ou por estados que resultam numa variedade de diferentes doenças, tais como osteoporose, hipercalcemia, doença Paget's do osso, perda óssea devido a osteoartrite ou artrite reumatóide ou osteomielite, e semelhantes. A densidade óssea reduzida leva geralmente a uma força mecânica diminuída e aumento da probabilidade de fracturas.

As abordagens correntes para o tratamento de osteoporose e/ou distúrbios ósseos relacionados incluem a utilização de cálcio administrado ao indivíduo que dele necessite. Recentemente, os agentes envolvidos na estimulação e/ou inibição de células do osso, tais como hormonas, calcitonina, factor de crescimento do tipo insulina ou osteoprotegerina (OPG), foram, também, visados para serem utilizáveis no tratamento dos estados de doença acima. Os referidos agentes são, geralmente, preparados através de meios recombinantes e têm de ser formulados/preparados numa forma galénica de modo a que a substância respectiva possa atingir o alvo, o osso, numa forma activa. 0 documento WO 00/24771 divulga ácidos nucleicos que codificam proteínas do tipo osteoprotegerina e sua utilização em e. g.r o tratamento de osteoporose. O polipéptido é sintetizado através de meios recombinantes e, depois, formulado de modo a ser compatível com a via de administração pretendida. São propostas como tais as vias de administração intravenosas, intradérmicas, subcutâneas, orais (e. g. inalação), transdérmica (tópica), transmucosas e rectais. 3

Em geral, é bastante demorado e enfadonho encontrar uma forma galénica adequada para uma dada substância, uma vez que os ingredientes utilizados para este propósito devem ser compatíveis com a substância activa e devem, também, proporcionar protecção suficiente contra os diferentes estados no corpo. Contudo, uma vez que os agentes estimuladores do crescimento ósseo são sintetizados localmente - em/no tecido ósseo - é difícil administrar tal substância. Normalmente, as cápsulas têm de ser concebidas de modo a auxiliar na passagem da substância através do tracto gastrointestinal sem serem destruídas pelas condições ambientais adversas que ai prevalecem. Contudo, esta via de administração tem, também, alguns problemas, uma vez que a substância tem de passar o figado e ser transportado nos fluidos corporais antes de atingir o osso. Além disso, leva frequentemente a que uma quantidade reduzida de material biológico activo atinja o tecido alvo.

Consequentemente, um problema da presente invenção é proporcionar um meio de administração de uma substância activa a um indivíduo, pelo qual a substância actua num tecido alvo específico num indivíduo.

Deste modo, o problema acima foi resolvido proporcionando osteoprotegerina de acordo com a reivindicação 1.

Nas figuras, A Fig. 1 apresenta a concentração de osteoprotegerina em leite humano, durante vários estágios de lactação; A Fig. 2 apresenta uma análise de transferência de Western de fracções de leite humano sob condições de redução, 4 utilizando um gel de SDS a 10%. As bandas para a OPG foram reveladas utilizando o anticorpo monoclonal biotinilado anti-OPG, BAF805 de R&D Systems e esptreptavidina-fosfatase alcalina (SAPP); A Fig. 3 apresenta o mapa de restrição do plasmídeo que foi integrado no ADN genómico dos transformantes de Yarrowia; A Fig. 4 apresenta uma análise de RT-PCR de células de leite humano e células epiteliais da glândula mamária humana, MCF-7; Pistas 1 e 2 :p-actina (tamanho de banda esperado: 460 pb) ; Pistas 3 e 4: OPG (tamanho de banda esperado: 603 pb); 1. Células de leite do peito humano; 2. MCF-7; 3. Células de leite do peito humano; 4. MCF-7; A Fig. 5 apresenta os resultados de uma experiência, em que a OPG da presente invenção inibe a apoptose induzida por TRAIL de células Jurkat. A osteoprotegerina (OPG), também conhecida como factor inibidor da osteoclastogénese (OCIF) e molécula do tipo receptor de TNF 1 (TRl), é um membro recentemente descrito da família de receptores do factor de necrose de tumor (TNFR). Inibe o desenvolvimento de osteoclastos in vitro e in vivo e aumenta a densidade óssea (osteopetrose). Em embriões de murganhos normais, a OPG foi localizada dentro dos rudimentos de cartilagem dos ossos em desenvolvimento, assim como no intestino delgado.

Contudo, ao contrário de outros membros da família de receptores de TNF, a OPG não possui um domínio transmembranar.

Além disso, pode ser mostrado que a OPG é também um receptor 5 para o ligando citotóxico TRAIL (ligando relacionado com TNF que induz apoptose) e é idêntico ao receptor-1 derivado das células dendríticas foliculares. Como tal, presume-se que regula a morte celular, assim como desempenha um papel importante na formação de tecidos linfáticos e a regulação de respostas imunitárias. De facto, os animais sem OPG exibiram tecidos linfóides subdesenvolvidos.

Nos estudos que levam à presente invenção foi surpreendentemente observado que, em adição à sua presença em e. g., tecidos ósseos, a osteoprotegerina pode, também, ser encontrada no leite humano. Em consequência, durante o aleitamento a mão é obviamente a fornecedora do recém-nascido com a referida substância bio-activa numa forma, capaz de sobreviver no tracto gastrointestinal. A partir daqui, segue-se que a OPG produzida pelas células da glândula mamária difere obviamente da OPG isolada de outras fontes, no que respeita à sua estabilidade e/ou resistência a degradação.

Sem desejar estar ligado a qualquer teoria, crê-se presentemente que o padrão de glicosilação especifico inerente à proteína nas células da glândula mamária torna o polipéptido mais estável na presença do fluido gástrico acídico e/ou o ambiente básico encontrado no intestino, de modo que, após absorção intestinal e transporte para o tecido ósseo, o domínio activo permanece intacto e é capaz de exercer a sua actividade biológica. A OPG da presente invenção, i. e., numa forma obtida de fonte láctea, possui uma sequência de polipéptido como identificado por SEQ ID. N° 1 e exibe tamanhos de cerca de 80, 6 130 e 200 kDa, respectivamente, que diferem da obtida através de meios recombinantes (55 kDa). A OPG da presente invenção pode ser incluída numa preparação para ingestão, que pode ser um material alimentar, tal como, e. g., leite, iogurte, coalhada, queijo, leites fermentados, produtos fermentados à base de leite, gelados, produtos com base em cereais fermentados, pós à base de leite, fórmulas infantis e, também, ração para animais de estimação. Do mesmo modo, a OPG da presente invenção pode também ser incluída numa composição entérica ou farmacêutica e. g., seleccionada do grupo consistindo em soluções, suplemento oral seco, suplemento oral líquido, alimentação seca por tubo ou alimentação líquida por tubo.

De facto, uma vez que a OPG de acordo com a presente invenção é estável, não existe a necessidade de trazer o composto activo para uma forma galénica específica de modo a protegê-lo de condições diferentes e potencialmente degradadoras que prevalecem no tracto gastrointestinal e fluidos corporais.

De acordo com outro aspecto, a presente invenção também proporciona a utilização de osteoprotegerina da presente invenção para preparar uma preparação para ingestão, tal como um material alimentar ou uma composição entérica, ou uma composição farmacêutica. A osteoprotegerina da presente invenção e a preparação para ingestão, como pormenorizado acima, pode ser utilizada para o tratamento e/ou profilaxia de distúrbios de remodelação do osso. 7 0 distúrbio ósseo mais comum é a osteopenia, um estado relacionado, em geral, com qualquer decréscimo de massa óssea abaixo dos valores normais. Um tal estado pode derivar de um decréscimo na taxa de síntese do osso, de um aumento na taxa de destruição do osso ou de ambos. A forma mais comum de osteopenia é a osteoporose primária, também referida como pós-menopáusica e osteoporose senil. Esta forma de osteoporose é uma consequência de uma perda universal de osso com a idade e é, normalmente, um resultado do aumento de reabsorção de osso com uma taxa normal de formação de osso. Ainda, outras formas de osteoporose incluem osteoporose endócrina (hipertiroidismo, hiperparatiroidismo, síndroma de Cushing e acromegalia), formas hereditárias e congénitas de osteoporose (osteogénese imperfeita, homocistinúria, síndroma de Menkes e síndroma de Riley-Day) e osteoporose devido a imobilização de extremidades.

Recentemente, foi conhecido que a osteoporose em populações humanas foi também associada com uma incidência elevada de calcificação arterial, uma componente de muitas lesões ateroscleróticas.

Consequentemente, um produto alimentar, como ilustrado acima, pode bem ser utilizado para prevenir o início ou para aliviar os sintomas e/ou alterações estruturais nos ossos, associados com osteopenia ou osteoporose, respectivamente. Deve ser entendido que a substância activa será incluída no material alimentar numa quantidade suficiente para produzir a resposta biológica desejada. Uma vez que se verificou que a OPG era, ela própria, um constituinte do leite materno, os produtos à base de leite são inerentemente bem adaptados para distribuir a substância para um indivíduo.

Por outro lado, para tratar casos graves de osteopenia ou osteoporose, respectivamente, o regime preferido pode ser uma composição farmacêutica, que contém a osteoprotegerina de acordo com a presente invenção em quantidades elevadas, ou seja, em quantidades suficientes para interromper ou mesmo reverter o processo de doença. Estas composições podem conter a OPG da presente invenção como a única substância activa. Isto tem a vantagem de que não tem de ser concebida uma formulação extra da substância. Está, deste modo, bem enquadrada na presente invenção simplesmente pressionar um comprimido consistindo de "pó de OPG" opcionalmente suplementado com veículos ou agentes aromatizantes. Contudo, no caso em que a OPG da presente invenção deve ser formulada em conjunto com outras substâncias activas, a natureza e fiabilidade da degradação destas substâncias adicionais no tracto gastrointestinal devem ser considerados. A OPG da presente invenção, formulada em unidades de dosagem, permitirá ao médico assistente controlar mais cuidadosamente a dose diária ou semanal do composto activo. A osteoprotegerina da presente invenção pode, também, ser utilizada para prevenir o início de e/ou tratamento da doença óssea de Paget, osteomielite, lesões infecciosas no osso que levam a perda óssea, hipercalcemia, osteonecrose, perda óssea devido a osteoartrite ou artrite reumatóide, perda óssea periodontal e/ou metástases osteolíticas.

Foi também verificado que a OPG era um receptor para o ligando relacionado com o factor de necrose de tumor (TRAIL) que induz apoptose após ligação aos seus receptores contendo os domínios de morte. É presumido regular a morte celular, assim como desempenhar um papel importante na formação de tecidos linfóides e a regulação de respostas imunitárias. Além disso, a 9 OPG é um receptor isco para RANKL (ligando para o receptor activador de NF-kB) que foi reportado como um produto das células T activadas. A ligação do receptor de RANKL em células dendriticas maduras, melhora a sobrevivência das células dendriticas. Além disso, a ligação de RANKL com o seu receptor melhora o crescimento de células T e a função de células dendriticas.

Deste modo, a presente invenção proporciona a utilização de osteoprotegerina da presente invenção para a preparação de uma preparação para ingestão, tal como e. g., uma composição dietética ou uma composição entérica, ou para a preparação de um medicamento, respectivamente, para contribuir para o desenvolvimento normal de tecidos imunitários, para contribuir para a função imunitária normal e, ainda, para prevenir e/ou tratar os distúrbios do sistema imunitário.

Os distúrbios do sistema imunitário contemplados na presente invenção compreendem alergia, autoimunidade, sepsia, cancro, doenças inflamatórias do intestino, estados do sistema autoimunitário, doença cardiovascular e estados imunopatológicos da pele, a cavidade oral, os tractos gastrointestinais, urogenitais ou respiratórios.

Adicionalmente, a osteoprotegerina da presente invenção pode, do mesmo modo, ser aplicada para a regulação da proliferação celular e apoptose, para a promoção de tolerância oral, a modulação de processos de doenças infecciosas e colonização bacteriana do recém-nascido. Especialmente para recém-nascidos, os distúrbios acima mencionados podem depender e amplamente associados com prematuridade e/ou baixo peso à nascença, de modo que, nestes casos, a osteoprotegerina da 10 presente invenção pode ser simplesmente administrada ao bebé através de alimentos para bebé.

Deverá ser entendido que um indivíduo de qualquer idade pode ser o indivíduo a ser tratado, bebés e idosos são os principais sujeitos a ser considerados devido à sua necessidade inerente de osteoprotegerina exógena. Em indivíduos particulares, tal como recém-nascidos, é necessária osteoprotegerina para o desenvolvimento de material ósseo e/ou do sistema imunitário, de modo a que, nestes casos, o composto e/ou material alimentar e/ou a composição farmacêutica da presente invenção possam ser vantajosamente administrados.

Contudo, deve ser entendido que a presente invenção pode também ser aplicada a adultos, de modo a prevenir o início de qualquer dos distúrbios acima. Deve também ser entendido que além dos humanos os indivíduos a ser tratados podem também ser animais, tais como animais de estimação, em que a OPG da presente invenção é incluída na ração animal. A OPG da presente invenção pode ser obtida de uma fonte láctea, a de um mamífero, em particular de leite humano ou de bovino ou colostro. A OPG do leite humano possui uma sequências de aminoácidos de 380 aa e exibe um peso molecular de, aproximadamente, 80, 130 e 200 kda quando em comparação com marcadores de proteína que foram utilizados como padrões de peso molecular (BioRad). Exibe 4 sítios para N-glicosilação e pode estar presentes numa forma monomérica e numa forma dimérica através da formaçao de uma ligaçao S-S através de Cys A OPG da presente invenção é isolada do leite bovino. 11

Os seguintes exemplos ilustram a invenção sem a limitar.

Exemplos (comparativos)

Amostras de leite humano e soro humano

As amostras de leite do peito humano (10-60 mL) de mães saudáveis foram recolhidos durante 17 dias após o parto sob condições estéreis através de sucção por bomba de peito ou ocasionalmente através de pressão manual. O leite foi recolhido em tubos de centrífuga de 50 mL e processados em 2 hrs de recolha. Após centrifugação (200 x g, 10 min), o precipitado celular foi imediatamente removido e tratado para extracção de ARN. O leite que restou foi congelado a -20 °C. As amostras de soro humano foram obtidas de dadores saudáveis e mantidas a -20 °C

Fraccionamento de leite de peito humano A nata foi extraída do leite completo através de centrifugação a alta velocidade. A camada de nata de cima foi removida, lavada em água e as lavagens da nata foram congeladas a -20 °C até serem necessárias. A separação do soro e caseína foi conseguida através de tratamento com a enzima renina ou acidificação química (com HC1) de leite desnatado induzindo a coagulação da caseína. A centrifugação do leite tratado separa, então, o soro doce da caseína renina não solúvel e o soro ácido da caseína ácida respectivamente. Finalmente, as proteínas solúveis do leite (soro ultracentrifugado) e a caseína micelar não solúvel, foram preparadas utilizando ultracentrifugação. 12

Todas as fracções de caseína e de soro foram congeladas a -20 °C até serem necessárias.

Linha de células mamárias humanas MCF-7 (American Type Culture Center (ATCC), Manassas, VA., HTB-22), uma linha de células mamárias humanas derivada da efusão pleural de um carcinoma da mama, retém várias características do epitélio mamário diferenciado. As células foram cultivadas em DMEM (Amimed Bioconcept, Allschwill, Suiça) suplementado com 10% de soro de vitela fetal (FCS, Amimed Bioconcept) e mantido a 37 °C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO2. O meio de cultura foi alterado 2 a 3 vezes por semana. Após atingir a confluência, as células foram raspadas utilizando tripsina/EDTA (GibcoBRL) a 37 °C. As células foram, então, preparadas para extracção de ARN.

Análise de transferência de Western

As amostras de leite foram diluídas de 1/25 com tampão de redução de amostra de Laemmli e fervido durante 5 min. As proteínas foram separadas por 10% de SDS-PAGE e transferidas para membranas de nitrocelulose (BioRad). As transferências foram sondadas com um anti-OPG humana policlonal biotinilado (BAF805 a 0,2 pg/mL; R&D systems) e estreptavidina-fosfatase alcalina (Pierce). A imunorreactividade foi visualizada com o substrato de fosfatase alcalina BCIP/NBT (Zymed Laboratories). Os marcadores de proteína pré-corados foram utilizados como padrões de peso molecular (BioRad). A OPG recombinante humana 13 (R&D systems) foi aplicada a 25 ng/pista serviu como um controlo positivo.

Expressão de OPG através de células de leite do peito humano e células epiteliais de glândula mamária humana A transcrição reversa seguida por PCR foi utilizada para amplificar os transcritos de OPG na total população de células de leite de peito humano a partir de uma única mãe 18 dias pós-parto e na linha de células epiteliais de glândula mamária humana, MCF-7. 0 ARN total foi extraído a partir das células utilizando o método de Trizol (Gibco-BRL). Resumidamente, o Trizol (1 mL para 5-10 x 106 células) foi adicionado ao precipitado de células, pipetando por aspiração várias vezes e transferidos num tubo Eppendorf. Foi adicionado clorofórmio (0,2 mL para 1 mL de Trizol) e os tubos foram incubados durante 5 min antes da centrifugação a 12000 x g durante 15 min, a 4 °C. O ARN foi precipitado com um volume igual de isopropanol e centrifugado a 12000 x g durante 10 min. Os precipitados foram lavados com 70% de etanol e, depois, ressuspensos em água desionizada estéril. O ARN foi armazenado a -20 °C até ser necessário.

As amostras de ARN foram tratadas com DNase I isenta de RNase para eliminar a contaminação pelo ADN genómico. O ARN foi quantificado pela absorvência a 260 nm e 280 nm de uma diluição apropriada (100-200 vezes) num espectrofotómetro. A concentração de ARN pg/mL) foi calculada como se segue: Absorvência a A26o x factor de diluição x 40 mg/mL. Uma amostra de ARN total que está essencialmente livre de proteínas deve ter uma proporção A26o/A28o de 1,8 - 2,2. 14 0 ARN foi reversamente transcrito com a trancriptase reversa do virus Moloney da leucemia de murinos (Perkin-Elmer). As amostras de ARN (0,5 pg de ARN total), 0,5 unidades de inibidor de RNase, 1 mM de cada dNTP, 0,5 nmol/mL de iniciador especifico 3', 5 mM de MgCl2 e 1,25 unidades de transcriptase reversa foram incubados num volume total de 10 pL de mistura reaccional contendo o tampão de enzima fornecido pelo fabricante. A mistura reaccional foi incubada durante 30 min, a 42 °C, e depois, aquecida durante 5 min a 95 °C. Os produtos reversamente transcritos foram então amplificados com Gold dna polymerase (Perkin Elmer) num termociclador (Biolabo, Scientific

Instruments, Chatel St Denis, Suiça). A reacção de polimerase em cadeia (PCR) foi efectuada num volume total de 50 pL utilizando 10 pL de produtos reversamente transcritos em tampão de PCR, 2 mM de MgCl2, 5 pM de cada dNTP, 0,2 nmol/mL de iniciadores específicos de OPG anti-sentido ACTAGTTATAAGCAGCTTATTTTTACTG, e de sentido

GGAGGCATTCTTCAGGTTTGCTG e 1,25 unidades de DNA polimerase. Após um passo de desnaturação inicial de 10 min, a 95 °C, as amostras foram amplificadas por 35 ciclos de desnaturação, a 94 °C, durante 45 seg,

emparelhamento a 60 °C durante 1 min e extensão a 72 °C durante 1 min 30 s, seguido por um passo de extensão de 7 min. a 72 °C. Todas as amostras foram sujeitas a RT-PCR com β-actina como um controlo positivo. As amostras de produtos de RT-PCR foram aplicados em géis de agarose a 1,2% (contendo brometo de etídeo) em tampão 1 x TAE e separados por electoforese a 150 V durante 1 h. Os produtos de RT-PCR foram visualizados sob luz UV. O 15 tamanho correcto das bandas foi determinado por comparação com marcadores de tamanho de ADN (Boehringer Mannheim). ELISA para OPG Humana-(imunoensaio enzimático em sanduíche) A concentração de OPG presente no leite do peito e

diferentes fracções do leite foi medida por ELISA. Para este fim, anticorpos monoclonais contra OPG (MAB805, 1 pg/mL; R&D

Systems, RU) foram revestidas em placas de 96 poços (Nunc) através de incubação durante a noite a 4 °C. As placas foram, então, lavadas duas vezes com 0,05% de Tween-20 em PBS. A ligação não específica foi bloqueada por incubação das placas com 2% de albumina do soro bovino (BSA) em PBS durante mais 2 h à temperatura ambiente. As amostras ou concentrações padrão da OPG recombinante (0,119 a 121,5 ng/mL; R&D Systems) foram incubadas em PBS-BSA durante 3 h à temperatura ambiente. As placas foram depois lavadas quatro vezes com PBS-Tween antes da adição de anticorpo policlonal anti-OPG humana marcado com biotina (BAF805, 0,5 pg/mL; R&D Systems) por mais uma hora à temperatura ambiente. Após mais quatro lavagens, foi adicionada estreptavidina-peroxidase (SAAP, 0,5 pg/mL. Kirkegaard % Perry KPL) durante 1 h à temperatura ambiente. As placas foram, então, lavadas quatro vezes e o substrato TMB peroxidase (KPL) foi adicionado. As placas foram cobertas e incubadas no escuro durante cinco minutos. A reacção enzimática foi terminada pela adição de 1 N de HC1. A absorvência foi lida a 450 nm num leitor de ELISA (Dynex Technologies). O limite de detecção foi de, aproximadamente, 30 pg/mL. 16

Actividade biológica da OPG do leite humano A OPG é um receptor para o ligando relacionado com o factor de necrose de tumor (TRAIL) que induz apoptose após ligação aos receptores contendo os domínios de morte, DR4 e DR5. Foi desenvolvido um bioensaio em que a OPG de leite de peito humano pode ser testada quanto à sua capacidade para bloquear a apoptose destas células induzida por TRAIL.

Para tal, células Jurkat, clone E6-1 (ATCC), foram mantidas em cultura em RPMI 1640 como modificado pelo fornecedor ATCC e contendo 10% de FCS (37 °C e 5% de C02) . As células foram semeadas a uma densidade de 5 x 104 células/poço em placas de 96 poços (Nunc). A cada poço foram adicionadas várias concentrações de TRAIL solúvel recombinante humano (0 a 20 ng/mL) na presença de 2 pg/mL de proteína estimuladora, um anticorpo que reage com TRAIL solúvel recombinante humano e que, deste modo, aumenta a sua actividade (Alexis, Láufelfingen, CH) . Alguns poços também continham 50 ng/mL de OPG recombinante humana (R&D Systems), amostras de leite de peito humano (HM; 1/80 de diluição final; recolhido a ld ou 9d pós-parto) e/ou 20 pg/mL de anticorpo monoclonal anti-OPG (MAB805, R&D Systems). As placas foram incubadas a 37 °C durante 16 h. A viabilidade celular foi medida por adição de 3H-timidina (1 pCi/poço) durante as últimas 6 h de cultura.

No meio de controlo, uma inibição induzida por TRAIL da proliferação de células foi evidente a concentrações superiores a 5 ng/mL. Contudo, as amostras HM evitaram esta inibição. Este efeito foi obviamente devido à presença de OPG, uma vez que o anticorpo monoclonal at-OPG reverteu o efeito. Os resultados são apresentados na figura 5. 17

Análise de transferência de Western A OPG é sintetizada como um monómero de 55 kDa nas células mas é convertida num dimero ligado por persulfureto de, aproximadamente, 110 kDa quando segregada extracelularmente. No leite foram detectadas bandas a aproximadamente 80, 130 e 200 kDa.

Concentrações de OPG em leite humano

Os níveis de OPG nas amostras do leite de peito de 10 mães lactantes em diferentes tempos durante os primeiros 17 dias de lactação foram examinados por ELISA. As concentrações aumentaram para valores máximos durante os primeiros 1-3 dias de lactação e diminuiu depois. As concentrações no leite variaram de 50 ng/mL a praticamente 2 pg/mL (Fig. 1).

Fonte celular da OPG do leite A análise de RT-PCR revelou que a OPG da presente invenção pode ser encontrada em células do leite do peito humano e células epiteliais da glândula mamária, a expressão constitutiva de ARNm para OPG foi evidente em ambos os tipos de células não tratadas (Figura 4). 18

Clonagem da OPG do leite humano em levedura

As células foram isoladas a partir de leite de peito humano (18 dias pós-parto) por centrifugação (200 x g, 10 min) . A partir do precipitado de células, o ARN total foi extraído utilizando TRizol® (Life Technologies, Basel, Suiça), tratado com DNAsel e, depois purificado em colunas de centrifugação RNeasy (Qiagen, Basel) como recomendado pelos fabricantes. Um produto de PCR que codifica a forma madura de OPG foi amplificado a partir deste ARN total utilizando o Titan™One tube RT-PCR system seguindo o protocolo fornecido pelo fabricante (Roche Diagnostics, Rotkreuz).

Com o iniciador especifico anti-sentido de OPG CCGGCCTCTTCGGCCGCCAAGCGAGAAACGTTTCCTCCAAAGTACC, e O iniciador de sentido ACTAGTTATAAGCAGCTTATTTTTACTG, foi amplificado um fragmento de PCR de 1174 pb a partir deste ADNc. O produto de PCR foi digerido com Sfil-Spel, purificado em gel e o fragmento resultante de 1156 pb ligado a pINA1267 digerido com Sfil-Xbal e tratado com SAP, criando pNFF270. Este plasmideo pNFF270 foi, então, introduzido na levedura Yarrowia lipolytica por transformação. A Figura 3 apresenta o mapa de restrição do plasmideo que foi integrado no ADN genómico dos transformantes de Yarrowia e a SEQ ID. N° 1 da proteína codificada por este plasmideo com OPG. A sequência de um clone pGEM-T de OPG é apresentada na Figura 6. A OPG madura está em preto e traduzida. Na sequência OPG/OCIF publicada, o resíduo de aminoácido 242 da OPG madura é 19 um resíduo Ala (A), enquanto todos os clones pGEMT de OPG analisados, codificavam um resíduo Asp (D) nesta posição. 0 fragmento Sfil-Spel de OPG deste clone foi transferido para pINA1267 digerido com Sfil-Xbal. 0 plasmídeo resultante tinha o mapa de restrição apresentado na Figura 3. Uma única cópia deste plasmídeo foi integrada no adn genómico dos transformantes de Yarrowia. A proteína codificada por este plasmídeo é apresentada na Figura 4. A OPG madura é indicada a negrito na impressão. 0 plasmídeo pNFF270 foi introduzido na Yarrowia lipolytica por transformação. Os transformantes resultantes segregaram uma proteína, que reage de forma cruzada com anticorpos específicos para OPG no meio de cultura enquanto os transformantes de Y. lipolytica que são portadores do vector de expressão vazio não segregaram esta proteína. LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Société des Produits Nestlé, S. A. <120> Osteoprotegerina no leite e sua utilização na regulação do metabolismo do osso <130> 80280 <140> <141> <160> 7 <170> Patentln Ver. 2.1 20 < 210 > 1

<211> 380 <212> PRT <213> Homo sapiens sapiens <400> 1

Glu Thr Phe Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His 15 10 15

Gin Leu Leu Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gin His 20 25 30

Cys Thr Ala Lys Trp Lys Thr Vai Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr 35 40 45

Tyr Thr Asp Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro 50 55 60 vai Cys Lys Glu Leu Gin Tyr vai Lys Gin Glu Cys Asn Arg Thr His 65 70 75 80

Asn Arg Vai Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe 85 90 95

Cys Leu Lys His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Vai Vai Gin Ala 100 105 110

Gly Thr Pro Glu Arg Asn Thr Vai Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe 115 120 125

Phe Ser Asn Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn 130 135 140

Cys Ser Vai Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gin Lys Gly Asn Ala Thr His 145 150 155 160

Asp Asn Ile Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gin Lys Cys Gly Ile 165 170 175

Asp Vai Thr Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala Vai Pro Thr 180 IBS 190 21

Lys Phe Thr Pro Asn Trp Leu Ser Vai Leu Vai Asp Asn Leu Pro Gly 195 200 205

Thr Lys Vai Asn Ala Glu Ser Vai Glu Arg Ile Lys Arg Gin His Ser 210 215 220

Ser Gin Glu Gin Thr Phe Gin Leu Leu Lys Leu Trp Lys His Gin Asn 225 230 235 240

Lys Asp Gin Asp Ile Vai Lys Lys Ile Ile Gin Asp Ile Asp Leu Cys 245 250 255

Glu Asn Ser Vai Gin Arg His Ile Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu 260 265 270

Gin Leu Arg Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly Lys Lys Vai Gly Ala 275 280 285

Glu Asp Ile Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gin Ile 290 295 300

Leu Lys Leu Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gin Asp Thr 305 310 315 320

Leu Lys Gly Leu Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe 325 330 335

Pro Lys Thr Vai Thr Gin Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His 340 345 350

Ser Phe Thr Met Tyr Lys Leu Tyr Gin Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile 355 360 365

Gly Asn Gin Vai Gin Ser Vai Lys Ile Ser Cys Leu 370 375 380

<210> 2 <211> 1182 <212> ADN <213> Homo sapiens sapiens 22 < 4 Ο Ο > 2 tccggcctct tcggccgcca agcgagaaac gtttcctcca aagtaccttc attatgacga 60 agaaacctct catcagctgt tgtgtgacaa atgtcctcct ggtacctacc taaaacaaca 120 ctgtacagca aagtggaaga ccgtgtgcgc cccttgccct gaccactact acacagacag 180 ctggcacacc agtgacgagt gtctatactg cagccccgtg tgcaaggagc tgcagtacgt 240 caagcaggag tgcaatcgca cccacaaccg cgtgtgcgaa tgcaaggaag ggcgctacct 300 tgagatagag ttctgcttga aacataggag ctgccctcct ggatttggag tggtgcaagc 360 tggaacccca gagcgaaata cagtttgcaa aagatgtcca gatgggttct tctcaaatga 420 gacgtcatct aaagcaccct gtagaaaaca cacaaattgc agtgtctttg gtctcctgct 480 aactcagaaa ggaaatgcaa cacacgacaa catatgttcc ggaaacagtg aatcaactca 540 aaaatgtgga atagatgtta ccctgtgtga ggaggcattc ttcaggtttg ctgttcctac 600 aaagtttacg cctaactggc ttagtgtctt ggtagacaat ttgcctggca ccaaagtaaa 660 cgcagagagt gtagagagga taaaacggca acacagctca caagaacaga ctttccagct 720 gctgaagtta tggaaacatc aaaacaaaga ccaagatata gccaagaaga tcatccaaga 780 tattgacctc tgtgaaaaca gcgtgcagcg gcacattgga catgctaacc tcaccttcga 840 gcagcttcgt agcttgatgg aaagcttacc gggaaagaaa gtgggagcag aagacattga 900 aaaaacaata aaggcatgca aacccagtga ccagatcctg aagctgctca gtttgtggcg 960 aataaaaaat ggcgaccaag acaccttgaa gggcctaatg cacgcactaa agcactcaaa 1020 gacgtaccac tttcccaaaa ctgtcactca gagtctaaag aagaccatca ggttccttca 1080 cagcttcaca atgtacaaat tgtatcagaa gttattttta gaaatgatag gtaaccaggt 1140 ccaatcagta aaaataagct gcttataact agtatcacta gt 1182

<210> 3 <211> 537 <212> PRT <213> Homo sapiens sapíens <400> 3

Met Lys Leu Ala Thr Ala Phe Thr Ile Leu Thr Ala Vai Leu Ala Ala 1 5 10 15 Pro Leu Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ala Pro Ala Ala Vai 20 25 30 Pro Glu Gly Pro Ala Ala Ala Ala Tyr Ser Ser Ile Leu Ser Vai Vai 35 40 45 23

Ala Lys Gin Ser Lys Lys Phe Lys His HÍ3 Lys Arg Asp Leu Asp Glu 50 55 50

Lys Asp Gin Phe Ile Vai Vai Phe Asp Ser Ser Ala Thr Vai Asp Gin 65 70 75 80

Ile Ala Ser Glu Ile Gin Lys Leu Asp Ser Leu Vai Asp Glu Asp Ser 85 90 95

Ser Asn Gly Ile Thr Ser Ala Leu Asp Leu Pro Vai Tyr Thr Asp Gly 100 105 110

Ser Gly Phe Leu Gly Phe Vai Gly Lys Phe Asn Ser Thr Ile Vai Asp 115 120 125

Lys Leu Lys Glu Ser Ser Vai Leu Thr Vai Glu Pro Asp Thr Ile Vai 130 135 140

Ser Leu Pro Glu Ile Pro Ala Ser Ser Ala Ala Lys Arg Glu Thr Phe 145 150 155 160

Pro Pro Lys Tyr Leu His Tyr Asp Glu Glu Thr Ser His Gin Leu Leu 165 Π0 175

Cys Asp Lys Cys Pro Pro Gly Thr Tyr Leu Lys Gin His Cys Thr Ala 180 185 190

Lys Trp Lys Thr Vai Cys Ala Pro Cys Pro Asp His Tyr Tyr Thr Asp 195 200 205

Ser Trp His Thr Ser Asp Glu Cys Leu Tyr Cys Ser Pro Vai Cys Lys 210 215 220

Glu Leu Gin Tyr Vai Lys Gin Glu Cys Asn Arg Thr His Asn Arg Vai 225 230 235 240

Cys Glu Cys Lys Glu Gly Arg Tyr Leu Glu Ile Glu Phe Cys Leu Lys 245 250 255

His Arg Ser Cys Pro Pro Gly Phe Gly Vai Vai Gin Ala Gly Thr Pro 260 265 270

Glu Arg Asn Thr Vai Cys Lys Arg Cys Pro Asp Gly Phe Phe Ser Asn 275 280 285 24

Glu Thr Ser Ser Lys Ala Pro Cys Arg Lys His Thr Asn Cys Ser Vai 290 295 300

Phe Gly Leu Leu Leu Thr Gin Lys Gly Asn Ala Thr His Asp Asn Ile 305 310 315 320

Cys Ser Gly Asn Ser Glu Ser Thr Gin Lys Cys Gly Ile Asp Vai Thr 325 330 335

Leu Cys Glu Glu Ala Phe Phe Arg Phe Ala Vai Pro Thr Lys Phe Thr 340 345 350

Pro Asn Trp Leu Ser Vai Leu Vai Asp Asn Leu Pro Gly Thr Lys Vai 355 360 365

Asn Ala Glu Ser Vai Glu Arg Ile Lys Arg Gin His Ser Ser Gin Glu 370 375 380

Gin Thr Phe Gin Leu Leu Lys Leu Trp Lys His Gin Asn Lys Ala Gin 385 390 395 400

Asp Ile Vai Lys Lys Ile Ile Gin Asp Ile Asp Leu Cys Glu Asn Ser 405 410 415

Vai Gin Arg His Ile Gly His Ala Asn Leu Thr Phe Glu Gin Leu Arg 420 425 430

Ser Leu Met Glu Ser Leu Pro Gly Lys Lys Vai Gly Ala Glu Asp Ile 435 440 445

Glu Lys Thr Ile Lys Ala Cys Lys Pro Ser Asp Gin Ile Leu Lys Leu 450 455 460

Leu Ser Leu Trp Arg Ile Lys Asn Gly Asp Gin Asp Thr Leu Lys Gly 465 470 475 480

Leu Met His Ala Leu Lys His Ser Lys Thr Tyr His Phe Pro Lys Thr 485 490 495

Vai Thr Gin Ser Leu Lys Lys Thr Ile Arg Phe Leu His Ser Phe Thr 500 505 510 25

Met Tyr Lys Leu Tyr Gin Lys Leu Phe Leu Glu Met Ile Gly Asn Gin 515 520 525

Vai Gin Ser Vai Lys Ile Ser Cys Leu 530 535

<210> 4 <211> 28 <212> ADN <213> Homo sapiens sapiens <400> 4 actagttata agcagcttat ttttactg 28

<210> 5 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens sapiens <400> 5 ggaggcattc ttcaggtttg ctg 23

<210> 6 <211> 46 <212> ADN <213> Homo sapiens sapiens <400> 6 ccggcctctt cggccgccaa gcgagaaacg tttcctccaa agtacc 46 26 < 210 > 7

<211> 28 <212> ADN <213> Homo sapiens sapiens < 4 Ο Ο > 7 actagttata agcagcttat ttttactg 28

Lisboa, 18 de Março de 2010 27

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Osteoprotegerina, obtida pelo isolamento de osteoprotegerina do leite bovino.
2. Osteoprotegerina de acordo com reivindicação 1, em que a osteoprotegerina possui um padrão de glicosilação que dá origem a um polipéptido possuindo um peso molecular de, aproximadamente, 80, 130 e 200 kDa.
3. Osteoprotegerina de acordo com uma das reivindicações 1 ou 2, para utilização como uma composição farmacêutica.
4. Utilização de osteoprotegerina de acordo com a reivindicação 1 ou 2, para a preparação de uma preparação para ingestão.
5. Utilização de acordo com a reivindicação 4, em que uma preparação para ingestão é um material alimentar seleccionado do grupo consistindo em leite, iogurte, coalho, queijo, leites fermentados, produtos fermentados à base de leite, gelados, produtos fermentados à base de cereais, pós à base de leite, fórmulas infantis e ração para animais ou uma composição seleccionada do grupo consistindo em soluções, suplemento oral seco, suplemento oral líquido, alimentação seca por tubo ou alimentação liquida por tubo.
6. Utilização de osteoprotegerina de acordo com a reivindicação 1 ou 2 para preparar um material ou uma composição seleccionado do grupo consistindo em leite, 1 iogurte, coalho, queijo, leites fermentados, produtos fermentados à base de cereais, gelados, produtos, pós à base de leite, fórmula infantil e rações para animais, ou seleccionados do grupo consistindo em soluções, suplemento oral seco, suplemento oral liquido, alimentação seca por tubo ou alimentação liquida por tubo para o tratamento de distúrbios associados com a remodelação óssea.
7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o distúrbio é osteoporose, doença óssea de Paget, Osteomielite, lesões infecciosas no osso que levam a perda óssea, hipercalcemia, osteopenia, osteonecrose, perda óssea devido a osteoartrite ou artrite reumatóide, perda óssea periodontal e/ou metástases osteoliticas.
8. Utilização de osteoprotegerina de acordo com a reivindicação 1 ou 2 para preparar um material ou uma composição seleccionada do grupo consistindo em leite, iogurte, coalho, queijo, leites fermentados, produtos fermentados à base de leite, gelados, produtos fermentados à base de cereais, pós à base de leite, fórmulas infantis e rações para animais ou seleccionada do grupo consistindo em soluções, suplemento oral seco, suplemento oral líquido, alimentação seca por tubo ou alimentação líquida por tubo para o tratamento de e/ou profilaxia de distúrbios imunitários.
9. Utilização de acordo com a reivindicação 8, em que o distúrbio é alergia, auto-imunidade, doenças inflamatórias do intestino, estados auto-imunes sistémicos, desregulação da proliferação celular e apoptose e estados 2 imunopatológicos da pele, a cavidade oral, os tractos gastrointestinal, urogenital ou respiratório.
10. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 6 a 9, em que os distúrbios são associados com a prematuridade ou baixo peso à nascença.
11. Utilização de osteoprotegerina de acordo com a reivindicação 1 ou 2 para preparar um material ou uma composição seleccionada do grupo consistindo em leite, iogurte, coalho, queijo, leites fermentados, produtos fermentados à base de leite, gelados, produtos fermentados à base de cereais, pós à base de leite, fórmulas infantis e ração para animais ou seleccionado do grupo consistindo em soluções, suplemento oral seco, suplemento oral liquido, alimentação seca por tubo ou alimentação liquida por tubo para o desenvolvimento de material ósseo e/ou do sistema imunitário.
12. Osteoprotegerina de acordo com a reivindicação 1 ou 2, para o tratamento de distúrbios associados com a remodelação óssea, para o tratamento de e/ou profilaxia de distúrbios imunitários, distúrbios associados com prematuridade ou baixo peso à nascença e/ou para o desenvolvimento de material ósseo e/ou do sistema imunitário. Lisboa, 18 de Março de 2010 3