JP2003512599A - 異性化／光学的反転したエピトープに対する特異的免疫反応：自己免疫病診断への応用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン又はグルタミン酸残基において異性化したタンパク質と反応性を示す抗体及びＴリンパ球が、ＩｇＧ（リューマチ性関節炎）及びミエリン塩基性タンパク質（多発性硬化症）に対する自己反応性を含む自己免疫症状に関連性をゆすることが見出された。異性化したタンパク質配列に対する自己免疫反応性を診断する測定法が記載される。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】

本発明は、例えば自己抗体や自己反応性Ｔ細胞などの免疫系成分を測定する方
法及び当初診断を行い且つ自己免疫病をモニターするための診断的免疫測定方法
を開発する操作手順に係わる。

【０００２】

【従来の技術】

自己免疫病は、生物の自己構成成分が免疫系によって認識される結果、異常な
免疫応答が開始されることになるという、共通の指標を有した複雑な一群の症状
を含んで成る。自己免疫反応が生起するためには、通常は良好に維持され、健常
な個人にあっては終生維持される免疫学的寛容が、“破断・破壊”される必要が
ある（Cooke 1988）（下記する“参考文献”を参照のこと）。かかる現象の原因
は、一般的には評価し難いものである。その理由は、自己免疫反応の開始は、当
該疾病の臨床診断が行われる数年前に生起しており、しかもかかる開始事象は、
疾病が異なれば大幅に変動する可能性があるからである。ヒトの身体における潜
在的な自己抗原の数は膨大であるとはいえ、自己免疫病は、僅かに幾つかの組織
と抗原に限定されることに注目すべきである。生物体内において標的抗原及び自
己免疫反応が局在化していると仮定すれば、自己免疫病は、器官特異的又は非器
官特異的（全身的）疾患のいずれかに分類することが出来る。何れの場合にも、
当該免疫反応は、当該免疫系の内の体液性（即ち、抗体合成性）部分と細胞性部
分とを包含するものである（Cooke 1988）。

【０００３】 本発明は、例えば自己抗体や自己反応性Ｔ―細胞又はＢ−細胞などの免疫系成
分及び例えば自己抗原などこれらと相互反応性を有する分子を特性化して、かか
る免疫系成分及び自己抗原を検出するための操作手順に係わる。かかる操作手順
の適用及び本発明の使用に関する実施例において、全身性自己免疫病であるリュ
ーマチ性関節炎（ＲＡ）又は多発性硬化症（ＭＳ）に関連した自己免疫現象を記
載してある。しかしながら、このことは、本発明の具体的な説明の一つとして了
解されるに過ぎず、本発明の範囲をＲＡ又はＭＳにのみ限定するものとは決して
意図されることはない。

【０００４】 本発明の根底となる仮説 本発明は、種々のタンパク質において感受性の高い残基の異性化及び光学的反
転が、自己免疫病における自己免疫応答の生成にとって重要である、という仮説
に基くものである。アスパラギン酸とアスパラギン（Aｓｘ）及びグルタミン酸
とグルタミン（Ｇｌｘ）残基が、幾つかの感受性の高いタンパク質において自発
的転移を受けて、かくしてＡｓｘ又はＧｌｘ残基と隣接残基との間における正常
なペプチド結合が、直鎖のα―カルボキシル基から側鎖のβ―カルボキシル基（
Ｇｌｘ残基についてはγ―カルボキシル基）に転移されるのである（Clarke 198
7）。この異性化反応は、スクシンイミドを経由して進行するが、自発的加水分
解が生起すると直ちに下記する四つの式のうちの一つに変わる：即ち、以下の化
学反応スキームでアスパラギン酸について概略示すように通常存在するαＬ、イ
ソ型であるβＬ、又は二つの光学的反転型であるαＤ及びβＤである。

【０００５】

【図】

【０００６】 ペプチド主鎖窒素原子が隣接アスパラギン残基の側鎖カルボニル基を攻撃した
結果、スクシンイミド環が形成される可能性がある（Ａ→Ｂ）。このスクシンイ
ミド環は、加水分解及び光学的反転を受けて、Ｄ及びＬ双方の立体配座であるぺ
プチドとイソぺプチドを生成しやすい。光学的反転は、直接的プロトン引き抜き
（Ａ←→Ｄ←→Ｇ又はＣ←→Ｆ←→Ｉ）かスクシンイミド経路（Ｂ←→Ｅ←→Ｈ
）のいずれかを介したカルバニオン中間体を経由して（Ｄ，Ｅ及びＦ）進行する
。上記図においては、当該ペプチド主鎖は、太字の直線で表す。この図は、Ａｓ
ｐ−Ｇｌｙ配列において生起する異性化／光学的反転反応を示すものであるが、
当該反応は、感受性のあるＡｓｘ又はＧｌｘ含有エピトープの何れにおいても生
起する可能性がある。

【０００７】 しかしながら、環状イミド生成（及び異性化／光学的反転）が起きるためには
、このＡｓｘとＧｌｘ残基を取り巻く三次元構造は、最適構造と充分な柔軟性と
を有していなければならない(Clarke 1987)。

【０００８】 種々の研究の結果、ペプチド及びタンパク質内におけるＡｓｘの光学的反転は
、主としてスクシンイミド経路（Ｂ←→Ｅ←→Ｈ）を経由して進行することが判
っている（Geiger and Clarke 1987, Radkiewics et al 1996）。しかしながら
、例えば直接的プロトン引き抜き又はイミノーδ―ラクトン形成などその他の経
路も、光学的反転に寄与する可能性がある（Radkiewics et al 1996）。しかし
ながら、これらの経路は、重要性としては低いものと推定される（Geiger and C
larke 1987, Radkiewics et al 1996）。

【０００９】 タンパク質又はペプチド内にこのような構造的変化を導入することは、その機
能、安定性及び物理的化学的特性に甚大な影響を及ぼす。本発明は、かかる構造
的変化が当該分子の免疫原性について有する役割を記載・報告するものである。

【００１０】 あるタンパク質又はペプチド内にかかる異性化した及び/又は光学的反転した
残基を導入した結果、当該タンパク質が免疫応答を発揮する能力において重要な
役割を有する新規なβＬ、αＤ及びβＤ型が生じるのである。特に自己免疫病に
おいては、患者自らの組織又は器官の自己成分が突然抗原として免疫系の対象に
なるため、異性化及び/又は光学的反転が重要な役割を果たすのである。

【００１１】 異性化及び/又は光学的反転は、自発的に極めて低い速度で生起するため、免
疫学的寛容の対象とはなりにくい分子に新規なエピトープを導入する可能性があ
る。このような新規のエピトープは、免疫系の抗原提示細胞によって認識され、
その結果免疫応答を発揮することになる。

【００１２】 Ａｓｘに関連した“タンパク質疲労”が免疫原性を含むタンパク質特性に及ぼ
す影響は、研究検討に価する可能性がある（Galletti et al 1995）。

【００１３】 短鎖のペプチドの持つ免疫学的特性は、アスパルチル残基の光学的反転によっ
て左右される可能性があることが既に報告されている（Benkirane et al 1993）
。

【００１４】 更には、インビトロで脱アミド化した血清アルブミンが、抗原特性を変化させ
、かくして生体内で免疫原性を有するものになり又インビボでの同様のプロセス
が、加齢した生体内での種々の自己免疫プロセスの生成において役割を果たして
いることが報告されている（Lukash et al, 1987）。

【００１５】 アスパラギンの脱アミド化は、当該ペプチド結合の異性化の結果である可能性
があるが、脱アミド化については多くのプロセスが存在する（Mor et al, 1992
）。脱アミド化それ自体では、上記反応スキームにおいて示した態様においてス
クシンイミドを経由した異性化／光学的反転により生起した種類のタンパク質主
鎖の構造的変化は惹起されることはない。脱アミド化は例えば、当該アミドのう
ちのアミンーＮＨ₂基を脱離するのに特異的であって且つ当該ペプチド結合を変
化させないか又は光学活性の変化を伴わない酵素の作用の結果である可能性もあ
る。

【００１６】 Ｄ−アミノ酸を含むペプチドに対する免疫応答は、Ｌ−アミノ酸からのみ構成
される相当するペプチドに対する応答とは異なることが報告されている（Sela &
Zisman 1997, Maillere et al 1995, Todome et al 1992, Sela & Fuchs 1965
）。Ｔｏｄｏｍｅら (１９９２)は、Ｄ―アラニン残基を含有するバクテリア性
タンパク質断片は、ヒトにおいて免疫応答を惹起することを証明している。Ｍａ
ｉｌｌｅｒｅら（１９９５）は、蛇毒に由来する、Ｔ−細胞エピトープ中の通常
型のＬ−アミノ酸は、Ｔ−細胞レセプターとの結合及びその反応性を変化させる
ことを示している。Ｓｅｌａ及びＦｕｕｃｈｓ（1964年プラハで開催された会合
での会議講演要旨）は、Ｄ−アミノ酸をエピトープ／抗原に含有させると、Ｄ―
チロシンを含む合成オリゴペプチドを用いた実験結果から判定しているようにそ
の抗原性を増加させる可能性があることを記述している。これらや類似の観察結
果は、Ｍｏｒら（１９９２）やＳｅｌａ及びＺｉｓｍａｎ（１９９７）による総
説においてさらに検討されている。

【００１７】 これらの報告書の何れにおいても、自己抗原又は自己抗原性エピトープがＤ−
アミノ酸を含有しているとか又はかかるＤ−アミノ酸が自己免疫応答を誘発する
可能性があることを議論してはいない。更には、上記において引用した研究報告
の何れも、本特許明細書において記載するスクシンイミド経路を介した自発的光
学的反転について言及していない。寧ろこれら報告書には、^*Ｇｌｘ及び^*Ａｓｘ
以外のＤ−アミノ酸を用いて作成した合成ペプチドを使用して行った研究を記載
しているのである。

【００１８】リューマチ性関節炎 リューマチ性関節炎（ＲＡ）は、重篤な慢性で且つ進行性の疾患であり、工業
国及び発展途上国の何れにおいても人口のほぼ１％が罹患している。環境、遺伝
子及び発育の諸因子がＲＡの病因に関与しているものの、現在ではＲＡは、自己
免疫病のひとつであることが確立されている（Williams 1996）。

【００１９】 ＲＡの主要な臨床像としては、軟骨及び滑膜組織の異常と退化であり、その結
果関節の潤滑機能が重度に低下するため、ＲＡ患者の運動能力に係わる問題が幾
つか生じる。罹患した関節は、多形核好中球、マクロファージ、Ｔ−細胞やその
他の免疫系細胞を含んだ浸潤（滑膜炎）を示す。これらの細胞は、ある能動的免
疫学的プロセスに関与していて、この場合これら細胞及びその分泌生成物の作用
が関節破壊のメディエータとなる（Munthe & Natvig 1972; Harris 1993）。そ
の代わりに、活性滑膜炎が、新たな毛細血管（血管新生）と滑膜内膜細胞の関節
内部への過大成長を促す結果、関節の正常な機能を更に障害することになる。

【００２０】 ＲＡの最も特徴的な血清学的特長は、自己ＩｇＧに対して配向した抗体が循環
することである（Bernstein 1990）。これらの抗ＩｇＧ自己抗体は、リューマ
チ性因子（ＲＦｓ）と称される。ＲＦｓは、ＩｇＭ，ＩｇＧ，ＩｇＡ及びＩｇＥ
であってもよいが、ＩｇＭ及びＩｇＧのＲＦｓが、ＲＡ患者の間では臨床上の重
要性と蔓延性は大きいように思われる（Jonsson & Validimarsson）。多くの免
疫グロブリンクラスがＲＦ応答に関与しているとの知見が得られた結果、ＲＦ形
成は、抗原に駆動され且つＴ細胞依存性であって、単なるモノクローナル増殖又
は免疫系の全般的な刺激の結果ではないことが強く示唆されることになった(Har
ris 1993; Bernstein 1990)。

【００２１】 ＲＦｓは、ＲＡに特異的なものではなく、割合は異なるが、急性炎症患者、自
己免疫病などの患者また一見健常と見える若干の人の血清中にも見出される(Che
n et al 1987, Carson et al 1993, Bernstein 1990)。滑膜組織中で局所的に自
己関連ＲＦ複合体が形成されることは、ＲＡやその他の全身性自己免疫病、例え
ばシェーグレン症候群、全身性紅斑性狼瘡や強皮症などにおいてしか認められな
い(Natvig & Munthe 1975, Winchester 1975)ことから、何らかの異常因子又は
免疫学的応答がこれらの疾患においてＩｇＧ−ＲＦ複合体の凝集を加速している
ことが示唆されている。

【００２２】 ＲＡに関するこのような誘発原因因子は、未だ特定されておらず、大半の自己
免疫病について言えるように、自己免疫攻撃が疾患の臨床的発症に数年も先だっ
て誘発開始される可能性があるため、このような研究は実行が困難である。ＲＡ
に対する高い感受性は、幾つかのＭＨＣ遺伝子の対立遺伝子、即ちＤＲ−１位置
のＤｗ４とＤｗ１４遺伝子に関連していることが、既に充分確立されている(Nep
om 1990)。

【００２３】 本疾患の誘発開始と病因におけるＲＦの役割は、未だ知られていないが、ＲＦ
がかかる疾患における中心的事象であるか、それともＲＡにおける二次的現象と
して単に発生しているのかの疑問には、依然として回答がなされていない。ＲＡ
におけるＲＦ形成の誘発開始は、ＩｇＧのＦｃ領域における立体構造変化の結果
である可能性がある（Johnson et al 1975）。

【００２４】 ＲＡ患者から単離されたＩｇＧにはＦｃフラグメントにおけるオリゴサッカロ
イドのガラクトシル化に欠陥があるとの観察が、Ｐａｒｅｋｈら(1985)によって
なされ、大きな興奮を巻き起こしたが、ＩｇＧのガラクトシル化状態の持つ臨床
上の意義について更なる研究がなされたが、矛盾する結果が得られている（Pare
kh et al. 1988, Tomana et al. 1988）。寧ろ、ＩｇＧのガラクトシル化の欠陥
は、自己免疫病を発症するための一般的なリスクファクターである可能性がある
(Harris 1993; Pilkington et al 1995)。

【００２５】 ＲＡ患者から採取した関節について行った免疫組織化学的研究の結果、リュー
マチ性滑膜中にはＲＦ活性を示すプラズマ細胞を含んだ相当数のＩｇＧが存在す
ることが明らかとなり(Munthe & Natvig 1972)、その結果、ＲＦｓが自己ＩｇＧ
と反応して、巨大な自己凝集性複合体を形成し、これが次に貪食されるため、引
き続いてリソソーム酵素の放出・遊離が生起することになることが提案されてい
る。幾つかの観察結果が、ＲＡにおいて免疫学的に誘発された組織損傷の機構を
支持している(Williams 1996; Carson 1993)。

【００２６】 幾つかの免疫グロブリン型を有し、従って関与するＩｇＧ分子上に多重エピト
ープを有するRFｓの異種性もまた、本疾患において果たす役割を正確に判断・評
価するのを妨げている(Kalsi & Isenberg 1993)。ＲＡに関連したＲＦｓは、別
の状況下にあるＲＦｓとは異なっている可能性があり、ＩｇＧのＦｃ領域のＣ_H
２及びＣ_H３範囲におけるエピトープに対して配向されているように思われる(Bo
nagura et al 1993)。

【００２７】 ＩｇＧは、多数のアスパラギン及びアスパラギン酸残基を含み、これらは理論
的に環状イミド（異性化/光学的反転）を形成するのに用いられる可能性がある
。ＩｇＧの三次元構造は公知であり、ヒトタンパク質内におけるＡｓｘ異性化の
潜在的部位に関する理論的研究にも含まれていた（Clarke, 1987）。標準結合の
長さと幾何学とを想定して、Ｃｌａｒｋｅは、バックボーン窒素原子からＡｓｘ
又はＧｌｘの側鎖ガンマカルボニル炭素までの距離をヒトＩｇＧを含む種々のタ
ンパク質の場合について二面角ファイ（φ）、プサイ（ψ）、カイ（χ）及びカ
イ２（χ２）に基いて計算・算出している。これらの理論的な考察の結果、ヒト
ＩｇＧ ＦＣ_H３領域におけるＡｓｎ−３８４は、イミド形成のためには最小の
立体構造変化しか必要としないことが判明し、従って、この部位は異性化し易い
傾向を有するものと予想される(Clarke (1987))。更には、Ｓｖａｓｔｉ及びＭ
ｉｌｓｔｅｉｎ(1972)による研究の結果、マウスＩｇＧは、Ｆｃフラグメント内
のＡｓｎ−Ｇｌｙ配列において異性化することが明らかとなっている（Svasti及
びMilstein 1972）。Ａｓｎ−３８４の周辺領域は、表面が暴露され、特にイミ
ド形成を促進する環境影響に対して感受性が高く、敏感である可能性がある。

【００２８】自己免疫反応と多発性硬化症 多発性硬化症（ＭＳ）は、中枢神経（ＣＮＳ）白質の炎症性疾患であり、その
結果神経機能の混乱・破壊を伴なう脱髄領域の発生に到る。ＭＳの病因・病理発
生は未だ解明されていないが、自己免疫機構に起因し、ミエリン破壊に到るもの
と信じられている。

【００２９】 ＭＳの誘発・開始原因因子は、未だ特定されておらず、大半の自己免疫病の場
合と同様に、自己免疫攻撃が、当該疾患の臨床的発症に先立つ数年前に開始して
いる可能性があるため、かかる研究は実行が困難である。ＭＳの疾患プロセスが
一定の病理学的レベルに到達する前に幾つかの事象が生起するはずである。これ
ら事象の一つとして、血液脳関門が通常は充分に維持されて、ＣＮＳの諸成分と
免疫系との間における接触が防止されるのであるが、ミエリンタンパク質とかか
る脳血液関門における欠陥に対する健常な免疫学的寛容の破断・破壊が挙げられ
る（de Vries et al 1997）。

【００３０】 本疾患の発病と病因・病理発生における自己抗原の役割は未知であり、自己抗
原の生成が本疾患の中心的事象であるか又はＭＳにおける副次的現象として生起
するに過ぎないのかに係わる疑問は、依然として回答はなされていない。ＭＳに
おける自己抗原生成の開始は、ミエリンタンパク質の立体配座の変化の結果であ
るのかもしれない。

【００３１】 幾つかのミエリンタンパク質が、自己抗体及び自己反応性Ｔ細胞の標的として
関与しており、例えばミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリン希突起神
経膠細胞（ＭＯＧ）及びαβ―クリスタリンなどがある（Martin 1997、Bettada
pura et al. 1998、Van Noort et al, 1998）。

【００３２】 ＭＢＰは、ＭＳにおいては自己抗体及び自己反応性Ｔ−細胞の標的である。Ｍ
ＢＰの三次元構造は公知であり（Beniac 1997）、この分子は、多くのアスパラ
ギンとアスパラギン酸とを含み、これらは理論的には環状イミド形成（異性化／
光学的反転）に用いられる可能性がある。異性化／光学的反転が、このタンパク
質の抗原性に影響を与えることはありそうである。

【００３３】 ＭＯＧは、ミエリン鞘の外表面に局在化した膜貫通型グリコプロテインである
(Linington et al. 1984)。ミエリン鞘の外表面上に限定して局在化しているた
め、ＭＯＧは、特にＣＮＳ内の抗ＭＯＧ抗体がインビボ及びインビトロの双方に
おいて広範な脱髄を起こすため、ＭＳにおいて自己免疫攻撃に対する理想的な一
次標的抗原となる(Adelman et al 1995)。

【００３４】 ＭＯＧは、ＥＡＥモデルにおいて脱髄性抗体を開始出来且つまた脳炎発生性Ｔ
−細胞エピトープを含む、これまでに報告された唯一のミエリン自己抗原である
(Linington et al. 1993)。更に抗―ＭＯＧ抗体の存在が、ＭＳ患者の血液中及
びＣＳＦ中において証明されている(Sun et al. 1991)。そのうえ、Ｋｅｒｌｅ
ｒｏ ｄｅ Ｒｏｓｂｏと共同研究者は、ＭＳｋｊのある母集団において圧倒的
なＭＯＧに対するＴ−細胞の応答を証明している(Kerlero de Rosbo et al. 199
3)。ＭＯＧは、光学的反転/異性化の潜在的部位をただ一つしか含んでいないが
、この部位は、ＭＯＧの残基５４−５５から成り、分子の表面暴露部分に位置す
る。更には、この部位は、極めて脳炎発生性が高く且つＢ−細胞とＴ−細胞応答
の強力な（最も強力な）誘発因子であることが証明されている配列ＭＯＧ_35-55
の一部である(Ichikawa et al 1006)。

【００３５】 従って我々は、ＭＢＰ、αβ―クリスタリン又はＭＯＧの感受性のある部位にお
ける異性化が、ＭＳ病因・病理発生にある役割を果たしていることを提案する：
異性化／光学的反転は、体液性及び細胞性免疫系の標的となるであろう新規な免
疫原性エピトープを提供することによってＭＳの初期相に直接的に関与する可能
性がある。

【００３６】その他の免疫病 本発明の基礎となる理論（即ち、自己タンパク質の異性化／光学的反転によっ
て、自己免疫応答を生起させる新規の非寛容化エピトープが生成する）も同様に
、他の自己免疫病にも適用可能であろう。これらのうち幾つかを下記する。

【００３７】インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ） ランゲルハンス島にある膵臓のβ細胞は、自己免疫反応の結果破壊され、その
結果インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）を惹起する可能性がある。この破壊は
、長期間にわたって進行し、その後初めて臨床症状が発現・発症する（Gorsuch
et al. 1981）。多数の自己タンパク質が、ＩＤＤＭにおける自己抗原として同
定されている。

【００３８】 神経内分泌酵素であるグルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）は、ＩＤＤ
Ｍにおける主要な自己抗原である(Baekkeskov et al. 1990)。ＧＡＤには二種の
イソ型、即ちＧＡＤ６５及びＧＡＤ６７が存在し、これらは、大半はＮ末端の最
初の１００個のアミノ酸が異なる。ＩＤＤＭ血清は、ＧＡＤ６５に対して圧倒的
に反応性を示すが、自己エピトープは主として、ＧＡＤ６７と相同性が高いＧＡ
Ｄ６５の幾つかの領域に局在している。

【００３９】 二種の緊密に関連したタンパク質であるＩＡ２及びＩＡ２ｂｅｔａは、膜貫通
型チロシンホスファターゼファミリーに属し（Banifcio et al. 1995, Lu et a
l. 1996）、同様にＩＤＤＭにおける自己抗原であることが判っている。ＩＤＤ
Ｍ患者は、しばしばこれらのタンパク質に対する自己抗体を示す（Li et al. 19
97）。

【００４０】 Ｇｌｉｍａ３８は、３８ｋＤａのランゲルハンス島細胞の膜グリコプロテイン
であって、やはりＩＤＤＭにおける自己抗原であることが示されている(Baekkes
kov et al. 1982、Aanstoot et al. 1996)。

【００４１】 さらには、インスリン自己抗体（ＩＡＡ）は、新たに診断されたＩＤＤＭ患者
の内の少なくとも半数において検出されているが(Palmer et al. 1883)、ＩＡＡ
の有する予見能は劣っている(Dean 1986)。

【００４２】重症筋無力症 重症筋無力症（ＭＧ）は、骨格筋アセチルコリンリセプター(ＡＣｈＲ)を標的
とする器官特異的自己免疫病である(Berrin-Aknin 1995)。即ち、大半のＭＧ患
者は、神経筋伝達を妨害する、ＡＣｈＲ配向自己抗体を有する。ＡｃｈＲは胸腺
に存在するものの、このタンパク質に対する寛容は、ＭＧ患者には欠落している
。かかる観察結果に対する一つの説明は、ＭＧ患者は、ＡＣｈＲが“変化した”
（異性化又は光学的反転した）結果新規なエピトープとなり,従って寛容されな
くなったＡＣｈＲに対する免疫学的応答を起こす、ということである。ＡＣｈＲ
上の幾つかのＴ細胞エピトープが既に報告されている(Zisman et al. 1996、Yos
hikawa et al. 1997、 Atassi & Oshima 1997)が、中でも幾つかのＡｓｘとＧｌ
ｘ残基を含むＡＣｈＲ^129-145は、潜在的に異性化／光学的反転を受けやすい可
能性がある。最近、この疾患におけるもう一つの可能性のある自己抗原が同定さ
れている：即ち、グラビン（Ｇｒａｖｉｎ）であって、２５０ｋＤａのキナーゼ
スカホールドプロテイン（kinase scaffold protein）(Nauert et al. 1997)で
ある。従ってこのタンパク質におけるＡｓｘ及びＧｌｘ残基は、異性化／光学的
反転受けて、自己免疫応答を誘発し易い可能性がある。

【００４３】ツェリアカ（腹部内臓病） ツェリアカ病（ＣＩＤ）は、食事中のグルテンに対する筋内膜及びＴ−細胞媒
介過敏反応に対するＩｇＡ自己抗体によって特徴ずけられる。グリアディン（Ｇ
ｌｉａｄｉｎ）が、グルテンの免疫原性部分であって、ＣＩＤ患者由来のＴ−細
胞クローンに反応することが明らかにされている。ＣＩＤにおける腸内炎症は、
食事中の小麦グリアディンに対する暴露によって促進され、組織トランスグルタ
ミナーゼ（ＴＧａｓｅ）なる酵素の粘膜活性が増大することに関連している。こ
の酵素（ＴＧａｓｅ）が、かかる症状の自己抗原であると同定されている（Diet
erich et al. 1997）。即ち、患者の９８％が、ＴＧａｓｅに対するＩｇＡ力価
が上昇しており、一方健常な対照者の９５％は陰性である（Dietrich et al. 19
98）。

【００４４】チャガス病（ＤＣ） 寄生原生動物であるＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ ｃｒｕｚｉに感染した結果、チ
ャガス病（ＣＤ）と称される慢性の心臓及び内臓に関連した自己免疫病に罹患す
る。この慢性疾患は、心筋及び神経組織における濃厚な炎症性浸潤によって特徴
ずけられる。多数の自己タンパク質が、ＣＤにおける自己抗原として同定されて
いるが、中でも、心臓ミオシン（Abel et al. 1997）、ムスカリン様アセチルコ
リンレセプター（mAChR）(Goin et al. 1997)、及び核内低分子ＲＮＡ(UsnRNP)(
Bach-Elias et al. 1998)などが挙げられる。

【００４５】乾癬（Ｐｓ） 乾癬（Ｐｓ）は、表皮の増殖性慢性疾患であって、自己免疫の性格を有するよ
うに思われる。この疾患の典型的な臨床的発症は、銀白色の鱗屑で被覆され、炎
症を起こし腫脹した皮膚病変である。しかしながら、この疾患は、多くの異なる
変型や重篤度で発症する。Ｐｓ患者の5乃至１０％は、関節の炎症と糜爛・侵食
を起こす乾癬性関節炎を発症する。本疾患の病因・発症病理は、なお議論の多い
ところであるが、その自己免疫性格は、免疫抑制治療及びＩＬ−２（活性化Ｔ−
細胞の増殖を選択的に防止する薬剤）による良く知られた成功によって裏ずけら
れている(Gottlieb et al. 1995)。幾つかの研究も同様に、本疾患へのＴ―細胞
病因の関与を示唆している(Schon et al. 1997)。推定された、２００ＫＤａの
透明板Ｐ(lamina lucida Ps)―自己抗原が最近同定されている(Chen e al. 1996
)。

【００４６】クローン病（ＣｒＤ） クローン病（ＣｒＤ）は腸の慢性炎症性疾患であり、頻繁に小腸及び大腸に局
在化して、潰瘍を生起せしめるが、ＣｒＤは、消化系全般に影響を与える可能性
がある。ＣｒＤの原因は、目下のところ不明であるが、本質は自己免疫系である
ように思われる。尤も、現在のところ自己抗原又はＴ−細胞エピトープは一切同
定されていない。

【００４７】

【課題を解決するための手段】

そこで本発明は、（ａ）異性化したペプチド結合及び/又は光学的に反転した
アミノ酸を含むエピトープを特異的に認識する自己反応性免疫系成分及び/又は
（ｂ）前記エピトープを含む自己抗原若しくはその断片及び/又は（ｃ）前記エ
ピトープを含む且つ自己免疫応答を誘発する能力を有する非自己抗原若しくはそ
の断片の試料中での存在を定量的又は定性的に測定する操作に試料を供すること
から成る測定方法を提供するものである。

【００４８】 該異性化は、アスパラギン酸若しくはアスパラギンなるアミノ酸残基又はグルタ
ミン酸若しくはグルタミンなるアミノ酸残基におければよい。

【００４９】 前記免疫系成分は、細胞性免疫系成分、例えばT―リンパ球であればよい。又
はその代わりに、前記免疫系成分は、例えば抗体などの体液性免疫系成分であれ
ばよい。かかる抗体は、公知の抗体型のものであれば何れでもよく、特にＩｇＧ
であればよい。

【００５０】 前記エピトープは、本質的に如何なるタンパク質のアミノ酸配列を一つ含んで
成っていてもよいが、幾つかの自己免疫症状に関連して、異性化したペプチド結
合及び/又は光学的に反転した、IｇＧ、ＭＯＧ、ＭＢＰ又はαβ―クリスタリン
であってもよい。他の自己免疫症状に関連して、該エピトープは、当該疾患の進
行の過程において攻撃されたタンパク質の一部を形成していてもよい。

【００５１】 前記自己抗体の検出が好ましくは、例えばリューマチ性関節炎、多発性硬化症
、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、ツェリアカ（腹部内臓病）、チャガ
ス病、乾癬又はクローン病などの自己免疫病を示すものである。

【００５２】 前記免疫系成分が、下記する配列の何れか一つに含まれる特定の又は一つのア
ミノ酸である^*Ａｓｘを含んで成るエピトープに配向させた自己抗体であっても
よい： Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ； Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ； Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−^*Ａｓｘ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒ
ｏ； Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ； Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−^*Ａｓｘ−Ｓｅｒ−Ｖａ
ｌ−Ｉｌｅ； Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅ
ｒ−Ｇｌｙ−^*Ａｓｘ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ； Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ
−^*Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ―Ｌｙｓ−^*Ａｓｘ−Ｉｌｅ−Ｖａ
ｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒ
ｇ；又は Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−^*Ａｓｘ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｙ
ｒ： なお上式において、^*Ａｓｘは、αD Ａｓｐ若しくはＡｓｎ、又はβＬＡｓｐ若
しくは原初の配列における残基Ａｓｐ若しくはＡｓｎの異性化／光学的反転によ
り生成するβＤ Ａｓｐである。

【００５３】 前記免疫系成分は、下記する配列の何れか一つに含まれるアミノ酸^*Ｇｌｘを
含んで成るエピトープに配向させた自己抗体であってもよい： Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−^*Ｇｌｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ； Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−^*Ｇｌｘ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ；又は Ａｓｐ−Ａｌａ−^*Ｇｌｘ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ： なお上式において、^*Ｇｌｘは、αD Ｇｌｕ若しくはＧｌｎ、又はγＬＧｌｕ若
しくは原初の配列における残基Ｇｌｕ若しくはＧｌｎの異性化／光学的反転によ
り生成するγＤ Ｇｌｕである。

【００５４】 問題となるエピトープは、Ｔ−細胞又はＢ−細胞エピトープであればよい。

【００５５】 本発明は、前記自己抗原又はその断片と前記自己抗原内における異性化したペ
プチド結合又は光学的に反転したアミノ酸の存在に対して特異的である免疫学的
結合パートナーとの反応性を検出することから成る自己抗原又はその断片を検出
する方法を含む。

【００５６】 好ましくは、前記自己抗原は、自己免疫病に関連するものである。

【００５７】 本発明は、異性化した又は光学的に反転したアミノ酸を含む自己エピトープと
交差反応性を有する免疫学的応答を産出する非自己抗原を検出する方法を含む。
即ち、自己タンパク質配列を擬態する非自己起源に暴露することによって、免疫
応答を産出せしめてもよく、この応答が次に疾患発症態様で該自己タンパク質に
対して配向するに到るのである。又はその代わりに、非自己抗原が、免疫系関与
に対する応答、例えば炎症性応答などを産出してもよく、その結果自己寛容の破
壊又従って誘発原因となった非自己抗原上に存在しない他のエピトープ類に対す
る自己免疫応答を産出するに到るのである（エピトープ拡大）。本発明のかかる
局面に従えば、自己免疫症状を生じさせる非自己抗原又はその断片を検出する方
法において、前記抗原又はその断片と異性化したペプチド結合又は光学的に反転
したアミノ酸の該抗原中での存在に対して特異的である免疫学的結合パートナー
との間における反応性を検出することから成る前記方法が、提供されるのである
。

【００５８】 かかる複数の方法は、前記自己反応性免疫系成分又は検出される自己抗原若し
くはその断片の量に関する情報を提供するものであってもよいか又は純粋に定性
的なものであってもよい。

【００５９】 異性化に応じた、これらの想像上の免疫応答は、疾患にとって一次的重要性を
有し得る。即ちこれらは、誘発・発症又は原因因子となり得るのである。又はそ
の代わりに、これらの免疫応答は、疾患の結果他の免疫プロセスや体液性プロセ
ス発生したために生じる二次的な重要性を有するものであり得る。何れの場合で
も、当該免疫系の体液性及び細胞性成分の双方が関与してもよい。即ち、本発明
の目的は、特異的抗原の異性化した（及び/又は光学的反転した）標的エピトー
プに対して配向せしめた免疫系の特異的成分（例えば抗体など）の存在を検出す
るか又は定量化することが可能である診断薬剤を開発することである。問題とな
る免疫応答が、当該疾患に関して原因的であるより寧ろ二次的である場合でも、
変化した免疫応答はなお診断上の意義を持つであろう。

【００６０】 本発明の具体的な実施態様についての更なる説明として、以下にＲＡの病因・
発生病理に特異的IｇＧ配列の異性化が関与していることを記述する。しかしな
がら、このことは、本発明の範囲を制限して、他の自己免疫病であって、重要な
高原の異性化又は光学的反転が生起し,その結果以下に記載する反応に類似した
反応を惹起する自己免疫病に対する適用を排除するものとは解されない。

【００６１】 上記にて考察したように、ＩｇＧのＡｓｎ−３８４は、異性化を受ける潜在的
な部位の一つである（Clarke 1987）。しかしながら、この残基は、ＩｇＧのＦ
ｃ領域における唯一の表面に暴露された、異性化を受ける可能性のあるアスパラ
ギン残基ではない。下記する実施例１において、Ａｓｎ−３１５は異性化を受け
やすいことの直接的な証明を示すが、この残基も又表面暴露されて、ＦＣ_H２領
域に局在化している(Bonagura et al 1993)。

【００６２】 ベータアミロイドの凝集特性がその位置に依存するもののＡｓｘ残基の光学的
反転によって左右される、というＴｏｍｉｙａｍａら（1994）の知見については
、ＩｇＧの異性化／光学的反転が、ＩｇＧの溶解性と親水性を変化させ、その結
果ＩｇＧの自己凝集を誘発するということは、考えられないことではない。さら
には、我々の知見によれば、異性化／光学的反転は、当該タンパク質の抗原性に
影響を与えないことはほぼ間違いないのである。血流からのＩｇＧのクリアラン
スが低下し及び/又はＩｇＧ濃度が増大した人は、このような現象を受け易い。
更なる付加的要因、例えば溶解性を低下させるか又は園凝集能力を低下させるそ
の他の血清タンパク質又はＩｇＧ遺伝子の対立遺伝子変異などが、このような状
況を悪化させる可能性がある。環境的因子もまた、免疫系の機能を変調させるこ
とによってかかる状況に影響を及ぼす可能性がある。

【００６３】 従って、感受性のある部位におけるＩｇＧの潜在的な異性化／光学的反転が、
下記する二つの態様で自己免疫病の病理発生に役割を果たしている可能性がある
：即ち、 Ａ）先ず、異性化／光学的反転が、新規の免疫原性エピトープを産出し、これ
が後刻体液性免疫系の標的になることによってＲＡの初期相に直接的に関与する
可能性がある。異性化した又は光学的に反転した自己ＩｇＧを認識する特異的抗
体がかくして生成し、巨大な不溶性の免疫―複合体を産生し、これが関節の滑膜
組織において凝集する結果炎症性応答を開始することによって本疾患において一
時的な役割を果たし得るのである(Inam & Day 1981)。更には、免疫系の細胞成
分もまた、かかる新規のエピトープに向けて追尾せしめられ、ＲＡを特徴ずける
滑膜組織内での破壊をある程度媒介することになり得る。

【００６４】 Ｂ）又はその代わりに、ＲＡにおけるＩｇＧの凝集は、ＩｇＧクリアランスを
低下させ、従って凝集ＩｇＧが、保持時間を函数として異性化／光学的反転する
可能性がある。特にクリアランス速度の低い滑液は、このプロセスが生起する可
能性の高い個所であろう。即ち、このような筋書きによれば、異性化／光学的反
転は、ＲＡプロセスに関連したＩｇＧ凝集の一つの徴候として生起するのである
が、最終的には上記したイソーＩｇＧ特異的自己抗体を形成するに到るのであろ
う。再度、免疫系の細胞成分が個の段階で関与している可能性がある。

【００６５】 上記にて該述した二つの仮説は、相互に排他的なものではなく、何れ場合にお
いても、異性化した又は光学的に反転したＡｓｘ又はＧｌｘ残基を認識する自己
抗体が、本疾患の特異的マーカーとなるであろう。感受性の高いアスパラギン又
はアスパラギン酸残基の異性化が、リューマチ性因子生成によって特徴ずけられ
る自己免疫反応に関与しているという、見解を支持する幾つかの観察結果とは例
えば下記の如きである：ＲＦｓは、全ての潜在的異性化部位が所在するＣ_H２又
はＣ_H３上のエピトープを認識する(Johnson and Page Faulk 1976; Nardella et
al. 1981)。幾つかの種類の証拠から、異常（通常ではない）ＩｇＧがＲＡにお
いて存在することが明らかとなっている(Rawson et al. 1969; Watkins et al.
1972; Johson et al. 1974)。最後に、ＩｇＧ１,２＆４のＣ_H２領域におけるＡ
ｓｎ₃₁₅及びＣ_H３領域におけるＡｓｎ₃₈₄の周囲における立体配座及びアミノ酸
配列とが、イミド結合形成には殆ど最適であり(Clarke 1987)また潜在的エピト
ープは、表面に暴露されている。

【００６６】 Ｇｌａｎｔらは、軟骨アグリカン(aggrecan)は、マウスにおいて生じる自己免
疫応答の対象となるエピトープを含有することを報告している。アグリカンは、
軟骨のプロテオグリカン構成成分であるが、この成分中において、本発明者等は
、アグリカンのＧ−１領域におけるアミノ酸配列Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒ
ｇ−Ｖａｌ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｙｒに含まれた潜在的異性化／光学的
反転部位を同定したのである。異性化した及び/又は光学的に反転したエピトー
プがこの配列において定義されているが、本発明においては、これに対する自己
免疫応答を標的として追求するものである。

【００６７】 軟骨結合タンパク質（ＣＬＰ）は、軟骨中においてアグリカンとヒアルロン酸
とに関連するものであるが、このタンパク質に対する自己免疫性が本疾患の動物
モデルにおいてＲＡを誘発するという意味において関連性を有することが証明さ
れている(Zhang et al 1998)。本発明者らは、自己免疫性に関与する可能性のあ
る異性化及び/又は光学的反転部位としてＡｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａ
ｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇなるアミノ酸配列を同定したの
である。

【００６８】 類推によって、例えばＭＢＰ又はＭＯＧなどその他の重要な自己抗原又はより一
般的に異性化した又は光学的に反転した抗原に対する、自己免疫病における自己
免疫応答は、当該疾患の病理発生において一つの役割を果たしている可能性があ
る。

【００６９】 本発明の又別の局面において、その他の自己免疫疾患は、異性化するか又は光
学的反転型で存在するかのいずれかに対して重要抗原が持つ感受性によって特徴
ずけられるので、かくして当該疾患に対して一次的又は二次的に重要な免疫応答
を生成する可能性がある。即ち、本発明は、ＲＡ又はＭＳの診断薬剤に限定され
るものではなく、その他の自己免疫病に対しても広く適用するものである。

【００７０】 本発明を実施する目的のために、自己免疫病の標的自己抗原における重要抗原
の異性化及び/又は光学的反転は、標的抗原が既知である場合は以下において列
挙する操作手順のうちの一つ以上によって同定することが出来るのである。

【００７１】 標的抗原の三次元構造が既知である場合は、潜在的な異性化/光学的反転部位(
例えば、Ａｓｘ−Ｇｌｙ配列)を同定することが出来る。これらの異性化/光学的
反転に対する傾向は、二面角ファイ（φ）、サイ（ψ）、カイ（χ）及びカイ₂
（χ₂）の計算結果及びβ―カルボキシル基を含むアミノ酸側鎖の柔軟度に基い
て評価することが出来る(Clarke 1987)。更には、潜在的変更残基が表面暴露さ
れ、かくして自己抗体に接触可能であるか否かを評価することも出来る。一つの
重要なパラメーターは、当該タンパク質の半減期であるが、その理由は、相対的
に長い半減期（例えば10日以上）のタンパク質は、相当程度に異性化／光学的反
転を受けることが期待できるからである。

【００７２】 仮に当該変更タンパク質が問題となる疾患の原因ではなくまた自己反応性免疫
系成分の産生が原因ではなく寧ろ症候的なものであったとしても、^*Ａｓｘ又は^* Ｇｌｘ含有エピトープに対する特異性を有する免疫系成分を検出するために本発
明を有益に実施することが理解されるであろう。このような場合、自己反応性成
分の認識は、当初の診断及び治療のモニターに関して価値ある診断意義を有する
可能性が高い。

【００７３】 本発明に包含されるのはまた、自己抗原中の単一又は複数のエピトープの位置
を決定する方法において、L―イソアスパルチル（Ｄ―アスパルチル）メチルー
トランスフェラーゼ（ＩＡＭＴ）及び標識化メチル基供給源とを用いて前記自己
抗原内の異性化したペプチド結合及び/又は光学的に反転したアミノ酸の一つ以
上に前記標識化メチル基を導入すること、及び前記標識化メチル基が導入された
前記自己抗原内の位置を決定すること、前記位置を包含する領域内における前記
自己抗原のアミノ酸配列を決定すること、及び前記位置において前記異性化した
又は光学的に反転したアミノ酸を組み込んだ前記アミノ酸配列のペプチドを検査
して自己反応性免疫系成分、例えば自己抗体との反応性を測定することとから成
る、前記位置決定方法である。

【００７４】 即ち、対象とする標的抗原（例えばＩ型糖尿病におけるグルタミン酸デカルボ
キシラーゼ、多発性硬化症におけるミエリン塩基性タンパク質、即ちＭＯＧ又は
リューマチ性関節炎におけるＩｇＧ）を酵素ＩＡＭＴによって分析することが出
来るのである。この酵素は、αＤ及びβＬＡｓｘ、即ち幾つかの異性化した又は
光学的に反転したアスパラギン酸及びアスパラギン残基を認識する（但し、βＤ
Ａｓｐ及び変化していないＧｌｘは認識しない）のであり、α―カルボキシル
基をメチル化する。放射能で標識化したメチル供与体を使用することによって、
異性化したタンパク質又はペプチドをこの酵素と共に培養して、これらを放射能
で標識化し、また当該タンパク質の標識化を導入した放射能を測定することによ
って検出することが出来る。

【００７５】 対象となる抗原を化学的又はタンパク分解酵素による加水分解によって断片化
し,次いで生成した断片を公知のクロマトグラフィーによる方法で精製し、その
後ＩＡＭＴ分析法で当該断片を分析することによって、異性化した部位の位置を
決定することが出来る。ＩＡＭＴ分析法で異性化した配列を含むものと同定され
た断片は、アミノ酸配列分析及びアミノ酸解析に供して、標的抗原内における正
確な位置決めを正確に指摘することが出来る。

【００７６】 ＩＡＭＴ又は他の方法を用いて同定することが出来る該当関連異性化配列とし
ては、例えば下記が挙げられる： ＩｇＧ由来： （ＲＡ） Ａｓｎ−１３５：Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙ
ｒ、Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ、Ｈｉｓ−Ｇ
ｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ． Ａｓｎ−３８４：Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｕ、Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ、Ｖ
ａｌ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ―Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−
Ｇｌｕ． ＭＢＰ由来： （ＭＳ） Ａｓｎ−９２：Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−ｌｙｓ−^*Ａｓｘ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ
−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ Ｇｌｎ−１０３：Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−^*Ｇｌｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒ
ｇ Ｇｌｎ−１１９：Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−^*Ｇｌｘ−Ｇｌ
ｙ−Ａｒｇ Ｇｌｎ−１４３：Ａｓｐ−Ａｌａ−^*Ｇｌｘ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅ
ｒ−Ｌｙｓ ＭＯＧ由来： （ＭＳ） Ａｓｎ−５３：Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−
Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−
Ｔｙｒ−Ａｒｇ−＊Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ ＧＡＤ₆₅由来： （Ｉ型糖尿病） Ａｓｐ−２９７：Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−^*Ａｓｘ
−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｉｌｅ Ａｓｐ−１５ & １９：Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−^* Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−^*Ａｓｘ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ なお上式において、^*Ａｓｘは、αD Ａｓｐ若しくはＡｓｎ、又はβＤ Ａｓ
ｐ若しくは原初の配列における残基Ａｓｐ若しくはＡｓｎの異性化／光学的反転
により生成するβＬ Ａｓｐであり、また^*Ｇｌｘは、αD Ｇｌｕ若しくはＧｌ
ｎ、又はγＤ Ｇｌｕ若しくは原初の配列における残基Ｇｌｕ若しくはＧｌｎの
異性化／光学的反転により生成するγＬ Ｇｌｕである。

【００７７】 本発明の範囲に包含されるものは、これらアミノ酸配列の内の何れか一つに存
在するエピトープを一種含むペプチドである。又同様に包含されるのは、Ｌ−イ
ソーアスパルチル（Ｄ−アスパルチル）メチルートランスフェラーゼ（ＩＡＭＴ
）を用いて位置決めされたエピトープを複数含む異性化した又は光学的に反転し
たアミノ酸を含むその他のペプチド類である。

【００７８】 自己抗原が対象とする自己免疫病において同定されなかった場合は、当該免疫
破壊の標的組織又は器官を分析してもよい。上記したように当該組織の可溶化及
びタンパク質分解酵素による分解を行った後、クロマトグラフィー又はその他の
技法によって生成したペプチドを精製し、次いでＩＡＭＴ分析法を使用して異性
化／光学的反転した断片を同定すればよい。次いで、これら断片をアミノ酸配列
決定法、質量分光測定法やその他の該当する方法によって同定すればよい。

【００７９】 異性化した又は光学的に反転したエピトープに対する自己抗体の検出 ヒト患者又は動物から得られた、重要自己抗原の主要エピトープにおける異性
化／光学的反転した配列を認識する自己抗体は、下記する分析法によって検出す
ることが出来る。

【００８０】 一般的に、広範な種類の公知免疫測定法の構成及び操作手順、例えばＥＬＩＳ
Ａ、ＲＩＡ，不均一及び均一測定操作法などを用いることが出来る。例として、
合成した異性化／光学的反転したペプチド、即ち対象とするエピトープを含む真
性抗原からタンパク質分解酵素で生成させた断片を、キャリヤータンパク質（例
えばチログロビン又は血清アルブミンなど）に複合化させるか又はビオチニル化
させて、かくしてストレプタビジンコート処理したマイクロタイタープレート（
ＭＴＰ）表面に結合する能力を持たせることによってマイクロタイタープレート
（ＭＴＰ）の固体層にコートすればよい。かくして、血清試料を測定緩衝液に適
当に希釈したものを当該ＭＴＰのウエルに加えて固定化したエピトープを含む資
材に結合させることによって、反応性自己抗体を同定することが出来る。結合し
た抗体の量は、二次的酵素結合抗ヒト抗体、次に発色性酵素基質を使用すること
によって定量することが出来る。この測定系においては、ＩｇＧ又は他の血清成
分がＭＴＰ表面に吸着するために起因する非特異的反応を最小限にするように注
意しなければならない。

【００８１】 又はその代わりに、問題となっているエピトープに対していくつかの抗体を産
生させ、これらをＭＴＰ表面に固定化してもよい。問題となっている異性化エピ
トープを含む合成ペプチド、即ち標的エピトープを含む真性抗原からタンパク質
分解酵素で生成させた断片を、次に例えばペルオキシダーゼやアルカリ性ホスフ
ァタ―ゼなどの酵素に結合させるか、又はビオチン又はジゴキシゲニンなどのリ
ガンドで標識化すればよい。この反応試薬を適当に希釈して次に、血清試料と共
にウエルに添加するのである。ＭＴＰ表面にコートした標的エピトープと反応性
を示す、この血清試料中の自己抗体は、当該エピトープがＭＴＰ表面にコートし
た抗体に結合するのを防止するはずであり、その結果その後に発色性酵素基質、
即ちストレプタビジン結合検出剤を添加することによって生成させることが出来
るシグナルが減少することになる。このシグナルは定量することが可能であり、
検討試料中の自己抗原の量を評価・査定するために使用することが出来る。

【００８２】 上記した問題となるエピトープに対して産生させた非ヒト抗体を使用するもう
一つ別の競争的測定法は、問題となっているエピトープを含む合成若しくは真性
ペプチド又はその断片でコートしたＭＴＰプレートを使用して実施することが出
来る。該ペプチドは、直接そのままＭＴＰ表面コートするか又はキャリヤータン
パク質（例えばチログロブリン又は血清アルブミン）に結合させればよく、又は
ビオチニル化して、ストレプタビジンをコートした表面に結合さあせる能力を持
たせるようにしてもよい。ヒト血清試料は、測定用緩衝液に適当に希釈して、Ｍ
ＴＰで培養させるが、その後又は同時に問題となっているエピトープに対して産
生させた抗体を加える。問題となっているエピトープに反応性を示す自己抗体を
含む血清試料をＭＴＰ表面に設けたエピトープと反応し、かくして他の抗体の結
合を置換するはずである。問題となっているエピトープに対して産生させた非ヒ
ト交代に特異的な、酵素標識化した二次的抗体を用いることによって、結合した
ヒト抗体の量を、発色性酵素基質と共に培養した後定量することができる。染料
の量は、結合したヒト自己抗体の量には反比例するであろう。

【００８３】 同質測定法の一つの構成は、適当に希釈したヒト血清試料を問題となっている
エピトープを含むビオチニル化ペプチド及び適当な酵素又は例えば¹²⁵Ｉなどの
放射性分子で共有結合により標識化したストレプタビジンと共に培養することに
よって実行することが出来る。ヒト血清試料中に含まれる自己抗体は、ストレプ
タビジン分子上の標的エピトープに結合し、次にプロテインＡセファロース又は
ヒトＩｇＧに特異的な他の沈降剤若しくは固体層によって沈降させることが出来
る。結合抗体の量は、次に、酵素標識化ストレプタビジンの場合は発色性酵素基
質を用いて、又はラジオアイソトープで標識化したストレプタビジンの場合はシ
ンチレーションカウンティングによって定量することが出来る。

【００８４】 異性化／光学的反転した自己抗原に対する細胞性免疫反応性の検出 新たに診断されたばかりの自己免疫病罹患患者からの自己応答に関するインビ
トロ研究は、当該疾患を診断し、治療法選択を促進・補助し且つここの患者につ
いての予後をモニターしまた算定するのを援助するために極めて望ましい。自己
免疫応答に関連した免疫系の分子成分の相互作用を決定することは、当該疾患を
特性化し且つ当該疾患を発症するための抗原と分子応答の持つ重要性を評価する
ために必要である。前記した文節においては、Ａｓｘ残基についてβＬ αＤ又
はβＤ（及びＧｌｘについてのγＬ又はγＤ型）の何れかの型に含まれる標的エ
ピトープに対する体液性反応性についての解析・分析を記述したのであるが、変
化した自己タンパク質ニ対する細胞性免疫応答は、当該疾患のモニターを行う上
で同等又はそれ以上の重要性を持つ可能性がある。免疫系の細胞性分画部分が、
ＲＡやＭＳなどＴ―細胞が組織破壊の一次メディエータとして挙げられている自
己免疫病の大半に関与している。免疫系の細胞分画部分の標的を決定することが
、当該免疫応答が重要性として一次的であるか又は二次的であるかを決定する上
で必須であり得る。

【００８５】 Ｔ−細胞媒介自己免疫の検出は、例えばＴ−細胞増殖測定法、ＥＬＩＳＰＯＴ
測定法、限定希釈測定法又は５１Ｃｒ放出測定法などのいくつかの方法によって
行うことが出来る（当該方法の全般的概観については、C.A. Janeway & P. Trav
ers (1997)を参照）。異性化／光学的反転した抗体に対する細胞性免疫反応性を
検討するために使用することが出来るこのような方法のいくつかの概要を下記に
記載する。

【００８６】 Ｔ−細胞増殖測定法 自己免疫病において抹消血液又は罹患標的器官（例えばＲＡ患者又はＣＮＳ若
しくはＭＳ患者の滑液／滑膜組織）又は当該疾患の動物モデルから単離したＴ−
細胞の抗原特異的反応性は、リンパ球増殖測定法によって測定することが出来る
。即ち、リンパ球をβＬ、αＤ又はβＤの何れかの存在下に、又は関連性のない
比較対照抗原と共に又は抗原を全く用いることなく適当な細胞培地での培養に供
するのである。³Ｈ−ｌチミジンを培地に添加し、抗原の共存により刺激された
活発に分裂するリンパ球は、標識化したチミジンをＤＮＡに取り込ませるであろ
う。ＤＮＡに取り込まれた³Ｈ−チミジンを定量することによって、当該自己抗
原又は抗原から誘導されたエピトープの種々に異なる型・種類に対する増殖性応
答を評価することが出来る（Weir 1996）。抗原特異的な増殖は、特異的ＣＤ４
＋Ｔ−細胞反応性が持つ顕著な特徴である。

【００８７】 限定希釈測定法 βＬ、αＤ又はβＤ（又はγＬ又はγＤ）型における一定の抗原又はそのエピ
トープに対して配向させた細胞性免疫反応性の“力価”に関する情報を取得する
ために、限定希釈測定法を行うことが出来る。この測定法は、異なる数のリンパ
球（即ち抹消血液から得た）をそれぞれの培養ウエルに添加し、次いで抗原及び
抗原提示細胞又は特異的成長増殖因子を刺激することによって行うことが出来る
。数日後に、これらのウエルを抗原に対する特異的応答、例えば標的細胞の細胞
毒性による殺戮又は特異的な増殖などについて試験する。特異的Ｔ細胞を含むウ
エルはそれぞれ、その標的に対する応答を行うはずであり、ポワッソン分布から
、一定のＴ細胞希釈率のウエルの３７％が陰性である場合は、各ウエルは、培養
の開始時において平均して一つの特異的Ｔ細胞を含んでいたものと決定すること
が出来る。異性化し及び/又はラセミ化した抗原（即ち、ＲＡ又はＭＳ患者）に
対し自己免疫反応性を示す個人と比較対照個人とにおける応答を比較することに
よって、二つの母集団間におけるＴ−細胞力価の差異を評価することが出来るの
であって、自己免疫病に罹患した個人において生起した自己反応性細胞の抗原特
異的増殖の目安として使用することが出来る。

【００８８】 ＥＬＩＳＰＯＴ測定法 ＥＬＩＳＰＯＴ測定法は、特異的抗体（Ｂ−細胞）又はサイトカイン特徴的刺
激抗原特異的Ｔ−細胞を産生させるために抹消血液から得た単一リンパ球細胞を
定量するための感度の高い方法として使用することが出来る。ＥＬＩＳＰＯＴ測
定法は、自己免疫病（即ち、ＲＡ患者又はＣＮＳ若しくはＭＳ患者の滑液／滑膜
組織）における抹消血液又は罹患標的器官又自己免疫病の動物モデルから単離し
たリンパ球を培養することによって行うことが出来る。このＥＬＩＳＰＯＴ測定
法は、リンパ球が分泌したタンパク質又はペプチドを保持することが出来るニト
ロセルロース又は他の固体表面上において適当な培地にて当該リンパ球を培養す
ることによって行うことが出来る(Ronnelid & Klareskog, 1997)。ある特定の抗
原が当該培地に添加されると、この抗原又はそのエピトープに特異的なリンパ球
が刺激され、特徴的なリンホカインを分泌する（即ち、γ―インターフェロン、
インターロイキンー２又はインターロイキンー４）(Weir 1996、Okamoto et al
1998)。一定期間培養した後、細胞を当該膜から洗い落とし特異的作用物質（即
ち抗体）を使用して当該細胞が産生したリンホカイン類を検出することが出来る
。特定のリンホカインを産生する細胞の数を定量すること及びリンホカイン産生
のパターンを数量化することによって、刺激のために使用した抗原に対する応答
を評価し且つ特性化することが出来る。

【００８９】

【実施例】

本発明を下記する実施例に言及し、添付した図面を参照することによって更に
記述し且つ詳細に説明する。

【００９０】実施例１：ＩｇＧのＦｃ領域におけるＡｓｎ−３１５を異性化感受性部位として 同定すること ヒトＩｇＧ（Sigma cat No. I-4506）を下記するプロトコールに従ってペプシ
ンで消化した：即ち、消化は、固定化ぺプシン（Pierce Cat. No. 20343）を用
いて実質的にメーカー（Pierce）により記載された操作手順に従って実施する。
要するに、０．１２５ｍｌの固定化ペプシンを試験管に加え、０．１５ｍｌの消
化緩衝液（20mMの酢酸ナトリウム緩衝液、pH4.5）で平衡化した。１０ｍｇの純
粋の凍結乾燥ＩｇＧを１．０ｍｌの消化緩衝液中に加え、この混合物を3７℃に
て４時間培養する。消化は、１．５ｍｌの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ,ｐＨ７
．５を培養混合物に添加することによって停止する。次いで、ＩｇＧ断片を遠心
分離（1000gにて５分間）し、次に当該断片を含む上済み液を除去することによ
って固定化ペプシンゲルから分離する。

【００９１】 得られたＩｇＧ断片をＳｕｐｅｒｄｅｘ７５ＨＲ１０／３０カラム（Pharmaci
a, Sweden）によるゲル濾過によって未消化ＩｇＧから分離する。このカラム（2
.6 x 72 cm (全容量は360 mL)）を２８ｍｌ／ｈにおいて０．２ＭＮＨ₄ＨＣＯ₃
，ｐＨ８．０中で平衡化する。２．７５ｍｌの試料をロードして、０．２５ｍＬ
のフラクションを集める。このカラムは、下記するＭｗマーカーの混合物で補正
済みであり、その結果溶出断片のサイズ決定を行うことが出来る：即ち、アルブ
ミン（６７ｋＤａ）、オボアルブミン（４３ｋＤａ）、キモトリプシノーゲンＡ
（２５ｋＤａ），リボヌクレアーゼＡ（１３．７ｋＤａ）及びアプロチニン（６
．５ｋＤａ）である。ＩｇＧのＦｃ部位から誘導されたＩｇＧの低分子量（分子
量が１０ｋＤａ以下）断片は、溶出容量２２−２８ｍｌ（フラクション４４−５
６、図１参照）に現れる。

【００９２】 これのフラクションのアリコートは、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に再
度溶解し、Ｌ−イソーアスパルチル（Ｄ−アスパルチル）メチルトランスフェラ
ーゼ（ＩＡＭＴ）を用いた酵素測定法によって分析し、異性化又は光学的反転し
たＡｓｘ残基の有無を調べる。簡潔に述べれば、この測定法は、ＩＡＭＴ酵素に
より放射性（トリチル化）メチオニンで標識化することによって異性化残基を検
出することに基くものである。

【００９３】 ６００μｌのエッペンドルフ試験管に、下記する試薬を加える：即ち、ＩＡＭ
Ｔ活性を含む１５μｌのウシ赤血球溶菌液（Murrray and Clarke 1984に従って
調製）、１０μｌの測定緩衝液（0.25 M NaH₂PO₄/NaOH pH 7.02）、１５μｌの
試料（又は既知濃度の合成異性化ペプチドからなる検量物）及び１０μｌのＳＡ
Ｍトレーサー（以下のように調製：３ｍｌの冷ＳＡＭを２６．１ｍｌの調製した
ばかりの１０ｍＭ ＨＣｌに加え、次いでこの溶液の２０ｍｌに１００μｌの“
ホットＳＡＭ”（Amersham TRA 236, 1000 μmol/L）を加えて、得られた溶液を
１ｍｌのアリコートとして−１８℃にて貯蔵する）。バイアルを回しながら混合
した後、３７℃において６０±１分間培養する（水浴上にて）。個の反応は、５
０μｌのクエンチング溶液（0.2M NaOH, 1%ドデシル硫酸ナトリウム）を加えて
、次いで混合することによって停止する。７５μｌの溶液をろ紙（予めアコーデ
オンプリーツに折った0.75 x 5.5 cm のもの）上にスポットする。このろ紙を２
．５ｍｌのエコシントHシンチレーション液を含む６ｍｌのシンチレーション管
に入れる（当該管中にほぼ１．５ｃｍ沈める）。管は、ほぼ18時間(一夜)室温に
放置し、放射性メタノールをシンチレーション液に拡散させる。フィルター片を
取り外し、バイアルを下記する停止条件でβ―カウンターでカウントする：即ち
、９００秒、又は最大6400 ＣＰＭ。未知の試料中の濃度を、濃度が既知である
合成イソペプチドから成る検量物質の測定値から作成した標準曲線に基いて算出
する。

【００９４】 これらの測定値から、ＩｇＧのペプシン分解で得られた低分子量フラクション
は、ＩＡＭＴ活性が高く、分解しないＩｇＧ分子の異性化部位の大半を明らかに
含有することが明らかとなった（フラクション４４−５６、図１を参照）。これ
らのフラクションは、さらに逆相高性能液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬ
Ｃ）で精製する。

【００９５】 ＩＡＭＴ反応性ペプチドを含むサイズ排除クロマトグラフィーから得られたフ
ラクション（フラクション４４乃至５６）をプールし、その容量を９．５ｍｌに
調節して、２０μｌのＴＦＡを添加する。Ｓｅｐ−ＰａｋＣ１８カートリッジ（
３ｃｃ，５００ｍｇ，Waters）を１０ｍｌの８０％メタノールで調整し、１０ｍ
ｌの０．２％ＴＦＡで平衡化する。試料はこのコラムに適用し、次いで個のコラ
ムを１０ｍｌの１％ＴＦＡで溶出した。最後に、結合したペプチドを１０ｍｌの
４０％アセトニトリル、０．１％ＴＦＡ、で溶出した。溶出液を集め、凍結し次
いで凍結乾燥した。溶出液を２ｍｌの２０ｍＭＴｒｉｓ−緩衝液ｐＨ７．８８に
再度溶解し、得られた溶液の１００μｌをＩＡＭＴ活性測定のため保存し、残り
は（1900μｌ）、イオン交換クロマトグラフィーに使用した。

【００９６】 アニオン交換クロマトグラフィーを１ｍｌのｍｏｎｏ−ＱＨＲ５／５カラム（
Pharmacia 62-1622-00）を用いて行った。カラムは、２０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７
．８８により流速を１ｍｌ／ｍｉｎとして平衡化した。試料を手動式注入装置ル
ープを用いてロードし、カラムは、線状ＮａＣｌグラジエント（０．０−０．３
Ｍ、30分間で適用）を用いて溶出する。次いで０．３乃至１ＭＮａＣｌの線状グ
ラジエントを1分間適用する。溶出を１ＭＮａＣｌで1分間継続し、最後に１Ｍ乃
至０ＭＮａＣｌの線状グラジエントを1分間適用した。溶出をこの緩衝液で2分間
継続し、溶出ペプチドは、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収で検出して、0．5μｌの
フラクション（３０秒）を集めた。このフラクションのアリコートをＩＡＭＴ測
定法で分析し、得られた結果を図2にプロットした。フラクション４−６を（ａ
）としてプールし、フラクション２５−２７を（ｂ）としてプールしまたフラク
ション２９−３１を（ｃ）としてプールし、更なる分画を行うために保管した。

【００９７】 これらのプールしたフラクションは、上記したＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ−１８カー
トリッジを用いてバッファー変化させ、２００μｌの０．１％ｗ／ｗ三フッ化酢
酸（ＴＦＡ）に再度溶解し、ＲＰ−ＨＰＬＣでさらに精製する。第一回目のＲＰ
−ＨＰＬＣは、Ｃ−１８カラム（Nova−PaK C―18 4μｍ 3．9 Ｘ 150ｍｍ
のＨＰＬＣカラム、Waters）にて０．１％（ｗ／ｗ）三フッ化酢酸（ＴＦＡ）中
０乃至４０％アセトニトリルの線状グラジエントで流速を１ｍｌ／ｍｉｎとして
行う。溶出したペプチドは、２１４ｎｍにおけるＵＶ吸収及び蛍光（励起のため
の２９７ｎｍの光線を使用して３８０ｎｍ（放出）における）により検出し、０
．５ｍｌフラクション（３０秒）を集めて、凍結乾燥し、ＩＡＭＴ測定法におけ
る分析に供する。

【００９８】 アニオン交換クロマトグラフィーから得たプール‘ａ‘については、大半のＩ
ＡＭＴ反応性物質は、２２と２３．5分との間において溶出する（図３を参照）
。これらのフラクションをプールし、フラクション中のペプチドは、上記したＳ
ｅｐ−Ｐａｋ Ｃ−１８カラムを使用して濃縮する。試料は、２００μlの０．
０５％へプタフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）中に再度溶解し、試料を同一のカラムに
よる二回目のＲＰ−ＨＰＬＣによってさらに精製するが、今回は０．０５％へプ
タフルオロ酪酸（ＨＦＢＡ）中５−３０％のアセトニトリルから成るグラジエン
トを８０分間実行して０．５ｍｌフラクションを集める。これらのフラクション
は、２１４ｎｍにおけるＵＶ吸収及び蛍光（励起のための２９７ｎｍの光線を使
用して３８０ｎｍ（放出）における）により検出し、凍結乾燥したフラクション
をＩＡＭＴ測定法による分析のため再度溶解する。

【００９９】 図４から明らかなように、アニオン交換クロマトグラフィーから得たプール‘
ｂ’の第二回目ＨＰＬＣによる精製の結果得られた一つの主要ピークは（図２を
参照）、異性化したＡｓｘ残基の大半を含んでいる（図４を参照）。このピーク
を含むフラクションは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓの４７７Ａ型Ｓ
ｅｑｕｅｎｃｅｒを使用して、メーカーの指示に従ってアミノ酸配列決定に供す
る。下記する配列が演繹される： ‘プールｂ’：Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ ‘プールｃ’：ＴｈＲ−Ｖｌａ（Ｌｅｕ／Ｖａｌ）Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−
Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−
Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ（Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｌｅｕ−Ｐｒｏ Ｃ_H２：ＴｈＲ−Ｖｌａ（Ｌｅｕ／Ｖａｌ）Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ
−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ
−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（Ａｌａ／Ｇｌｙ）Ｌｅｕ−Ｐｒｏ（Ａｌａ
／Ｓｅｒ）（Ｐｒｏ／Ｓｅｒ）Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ―Ｓｅ
ｒ―Ｌｙｓ（Ａｌａ／Ｔｈｒ）Ｌｙｓ 即ち、単離されたこれらの異性化ペプチドは、Ｃ_H２領域から由来するもので
あるが、ペプシン分解によって異なる鎖長に処理されている。このＣ_H２領域に
対して発表されている配列を上記に掲げているが、これから明らかなように、こ
れら三つのペプチドは、この配列と合致している。太字で表したアスパラギン残
基はＡｓｐ３１５であり、残基３０８は、ＩｇＧ₂におけるバリン又その他のＩ
ｇＧサブクラスのロイシンである。イタリックで示した‘プールｃ’のペプチド
配列は、アミノ酸解析から推定したものである（下記を参照）。この配列で残基
３１５は、アスパラギンではなくアスパラギン酸として表示されているが、これ
は、この残基に続くグリシンとのペプチド結合がα―からβ―カルボキシル基へ
と転移した結果に従ったものである。

【０１００】 単離されて全てのペプチドは、イソーアスパラギン酸特異的ＩＡＭＴ酵素によ
って認識され、Ａｓｎ−３１５残基のＮ末端のロイシン残基以降は配列決定する
ことが出来ない。この結果強く示唆されるのは、Ａｓｎ−３１５残基が異性化反
応して、ペプチド結合が、直鎖α―カルボキシル基から側鎖のβ―カルボキシル
基に転移すると同時に、またアミノ酸が加水分解により除去されることである。
残基３１５以降のペプチドの配列決定が出来ないことは、このような異性化反応
が生起した結果、通常のエドマン分解によっては感受性の高い部位以降のペプチ
ドの配列決定は出来ない、という以前に得られた結果に従うものである（Fledel
ius et al 1977）。

【０１０１】 実施例２：Ａｓｎ−３１５に反応性を示す自己抗体の検出 自己抗体がＡｓｎ−３１５由来セプタペプチドを認識するのか否か、またかか
る自己抗体がリューマチ性関節炎の特徴であるのか否かを検討した。かかる検討
を実施するために、ＩｇＧ Ｆｃ Ａｓｎ−３１５由来（βＬ）セプタペプチド
であるＴｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−β−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒを合成に
より調製した。使用したペプチドは、下記する操作によって線状（αＬ型）Ｔｒ
ｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒペプチドを加熱して異性
化を促進させた結果得られたものである。このペプチドを緩衝液中に溶解し、４
時間９０℃にて加熱し、異性化及び／又は光学的反転を促進した。得られた異性
化（βＬ）、光学的反転（αＤ及びβＤ）及び線状ペプチドの混合物を０．１％
ＴＦＡ中１５−３５％のアセトニトリルグラジエントを用い、流速を１ｍｌ／ｍ
ｉｎとしてＲＰ−ＨＰＬＣによって分析し、得られたピークの異性化状態を上記
したアミノ酸分析によって検討した。このペプチドを５ｍｇ／ｍｌの割合で０．
２Ｍリン酸ナトリウムｐＨ９．２に溶解したが、このペプチドを下記するプロト
コールを使用してグルタルアルデヒド(GA)によって（Fluka 49626 lot 43381/1
）チログロブリンに結合した。

【０１０２】 ０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ８．０に溶かした０．５ｍｌのチログ
ロブリン（３０ｍｇ／ｍｌ）を下記する溶液の０．５ｍｌに絶えず混合しながら
、滴下して加えた（２分間で）：１０％ＧＡ、４０％Ｈ₂Ｏ、５０％０．２Ｍリ
ン酸ナトリウム ｐＨ８．０。バイアルを室温で混合しながら一夜培養した。過
剰のＧＡをゲル濾過（NAP-10 カラム、Pharmacia）によって除去し、緩衝液をＰ
ＢＳに変更した。最終容量を１．５ｍｌ（10 mg/mL 各調製物当たりのキャリヤ
ータンパク質）に調節した。５００μｌのキャリヤータンパク質を５００μｌの
５ｍｇ／ｍｌペプチド溶液と共に培養し、またバイアルは、絶えず混合しながら
室温で２４時間培養した。過剰のペプチドをゲル濾過（NAP-10 カラム、Pharmac
ia）により緩衝液中に除去した。最終容量を１５００μＬに調節し、タンパク質
濃度をＢｉｏＲａｄタンパク質測定法をメーカーの指示に従って実施することに
よって測定した。

【０１０３】 Ｔｈｙ−ＧＡ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ
複合物をＰＢＳに溶解して最終濃度を10μｇ／ｍｌとし、得られた溶液の１００
μｌをピペットでマイクロタイタープレートのウエル（MTP 、flat-well polyso
rb、Nune）に移した。このプレートを報告された通りにブロックし（Bonde et a
l 1994）、次いで血清試料を１０ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ ＮａＣｌ
、０．１％トウエ―ン（Tween）−２０、１％ＢＳＡ ｐＨ７．４（測定緩衝液
）に１００倍に希釈して添加した。ＭＴＰを回転振とう器に２０℃にて１時間±
５分の間放置した。プレートを洗浄緩衝液（25mM tris, 140 nM NaCl, 0.1% ト
ウエーン−20 ｐＨ7．4）で手動式プレート洗浄装置によって５回洗浄した。ペ
ルオキシダーゼ結合ウサギ抗ヒトλ―鎖（Dako 063）及びκ―鎖（Dako 013）を
含む測定用緩衝液１００μＬを各ウエル内に添加し、このＭＴＰを再度回転振と
う器で２０℃にて１時間±５分の間培養した。５回洗浄した後、１００μＬのペ
ルオキシダーゼ基質を加え（３，３‘，５，５’テトラメチルベンジジン二塩酸
塩（ＴＭＢ）、Kirkegaard & Perry Laboratories, USA）、暗所にて室温で１５
±２分間培養した。０．１８ＭＨ₂ＳＯ₄を添加してから、吸光度を４５０ｎｍに
おいて測定した。

【０１０４】 リューマチ因子に陽性であるＲＡ血清、リューマチ因子に陰性であるＲＡ血清
及びコントロール血清を比較した場合、ＲＡ ＲＦ＋母集団においては、他の二
つの母集団と比較して有意に増大した反応性が検出された（図５を参照）。同一
の測定操作に従ってー但し、他の無関係のＴｈｙ−ＧＡ−複合物（Ｔｈｙ−ＧＡ
−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ）を用
いてー平行して実験を行った結果、これらの群に間には相異は全くなかった。こ
の結果から、ＲＦに陽性のＲＡ患者においては、ＩｇＧＦｃＡｓｎ−３１５由来
配列であるＴｒｐ−Ｌｅｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒに対す
る自己抗体反応性が増大したことが明らかとなった。

【０１０５】実施例３：異性化Ａｓｎ−３１５を認識する特異的自己抗体と合成ペプチドとの 結合の競合 上記したＴｈｙ−ＧＡ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−
ＴｙｒをコートしたプレートとＲＡ自己抗体との結合は、溶液中においてＴｒｐ
−Ｌｅｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒなるペプチドと共に当該
血清を予備培養することによって競合させることが出来た。実験は以下のように
行った。即ち、血清試料を１０ｍＭリン酸ナトリウム、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、
０．１％トウエ―ン（Tween）−２０、１％ＢＳＡ ｐＨ７．４（測定緩衝液）
に１００倍に希釈し，２００μｌｗｏ１．５ｍｌのポリプロピレンチューブに添
加し、次いで下記する試薬を測定用緩衝液に５０μｇ／ｍｌなる濃度に溶解して
５０μｌを添加した： １．Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−βーＧｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ（当該エ
ピトープのβＬ型） ２．Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ（当該エピト
ープのαＬ型） ３．Ｔｈｙ−ＧＡ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔ
ｙｒ複合物（実施例２において調製） ４．測定用緩衝液のみ これらのチューブを４℃に１７時間供し、１００μｌの混合物をＴｈｙ−ＧＡ
−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ複合物でコート
したＭＴＰに添加した。この測定法は、上記実施例２において記載したように実
施した。

【０１０６】 これらの結果を図６に示す。これから明らかなように、この異性化したペプ
チド（１）及びＴｈｙ−ＧＡ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｕ−Ｔｙｒ複合物（３）は、６種の分液したＲＡ血清と結合に競合して勝るこ
とが出来る。このことは、残基３１５を囲む７つのアミノ酸エピトープを認識す
るＲＡ患者の自己抗体は、当該エピトープの異性化型（βＬ）に対して圧倒的に
特異的であることを示唆している。

【０１０７】 実施例４：ＩｇＧ Ｆｃ Ａｓｎ−３１５に由来した異性化ペプチドに反応性 を示す自己抗体の検出を評価するための均一ラジオイムノアッセイ ＩｇＧ Ｃ_H２領域に由来したエピトープであるＴｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−
Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒの異性化型に対する反応性を有する自己抗体を
測定するための均一ＲＩＡ測定法を開発した。この測定法は、毛せい試料を１２
５ＩＴｈｙ−ＧＡ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−＊Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙ
ｒと共に一夜培養し、次いでプロテインＡセファローズとの免疫複合物を沈降さ
せることによって実施した。

【０１０８】 血清試料をＩＭＰ緩衝液（ＩＭＰ緩衝液：１０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ
７．４、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ
−１００、０．１％ＢＳＡ、１０μｇ／ｍｌ大豆トリプシン阻害剤）で１：２０
０にて希釈し、Ｔｈｙ−ＧＡ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｕ−Ｔｙｒ複合物を実施例２に記載したように調製し、次いでクロラミンＴプ
ロトコールを用いて¹²⁵Ｉで沃素化する：即ち、１００μｇの複合物を０．２５
Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄で希釈して、全量を１４０μｌとする。１．５ｍＣｉのＮａ^{12 5} Ｉを添加し、次いで１０μＬのクロラミンＴ（１ｍｇ／ｍｌ，調製したてのも
の）を加える。この溶液を３０秒間撹拌し、１５０μ Ｌのメチオニン（１ｍｇ
／ｍｌ）を添加し、直ちに１２０秒間撹拌する。このトレーサ ーは、１％ＢＳ
Ａを含むＰＢＳで流速１．０ｍｌ／ｍｉｎで平衡化したサイズ排除カラム（type
: BIOSEP SEC S-2000, size:300 x 7.80mm）で精製する。５００μｌのフラクシ
ョンを集め、シンチレーションカウンター（γ―カウンター）で分析する。この
トレーサーを含むフラクションをプールし、均一ＲＩＡ測定法に使用する。

【０１０９】 この¹²⁵ＩＴｈｙ−ＧＡ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ
−ＴｙｒトレーサーをＩＭＰ緩衝液で希釈し、７５μｌの２００倍希釈血清試料
を融封したポリプロピレン製バイアル中にて２５μｌのペプチド／ストレプタビ
ジンと混合する。バイアルを４℃において一夜（１６−１８時間）培養する。プ
ロテインＡセファロース（ＰＡＳ）（２０μｌ／試料バイアル）を秤取し、１０
ｍｌのＩＭＰ洗浄緩衝液で三回洗浄し、リピータピペットを用いて１．５ｍｌエ
ッペンドルフチューブに移す。ＰＡＳを１０００ＲＰＭにて２分間遠心分離する
ことによって沈降させ、上澄み液を吸引フラスコ又はピペットを用いて吸引する
。３時間培養した後、抗体／抗原溶液をＰＡＳペレットに移し、振とう台にて室
温でさらに３０分間培養する。ＰＡＳを１００ＲＰＭで２分間遠心分離すること
によって沈降させ、得られたＰＡＳペレットを７５０μｌのＩＭＰ洗浄緩衝液で
５回洗浄する。各洗浄工程の後、ＰＡＳは１０００ＲＰＭで２分間遠心分離する
ことによって沈降させ、上澄み液は、吸引フラスコ又はピペットを用いて吸い取
る。最後に、ＰＡＳペレットをｍｉｌｌｉ−Ｑ水中のスラリー１００μＬに再度
懸濁させ、４ｍｌのポリプロピレンチューブに移して、γ―カウンターで計数す
る。上記にて非均一ＥＬＩＳＡ測定法について述べたように、コントロール実験
をナンセンスタンパク質について行うこととする。

【０１１０】 このプロトコールに従って操作を行って、高度に特異的なシグナルを血清に
ついて得た。群毎にみて、ＲＦ＋ＲＡ患者は、コントロール被験者から得た血清
よりも高い応答を示した（図7を参照）。

【０１１１】 競合実験を下記するペプチドを１００，１、０００又は１０，０００ｎｇ／
ｍｌ含む 溶液をそれぞれ２５μｌ添加することによって行った：Ｔｒｐ−Ｌｅ
ｕ−Ａｓｐ−β−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ、Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−
Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ，Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−
β―Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ及 びＧｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ―
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇペプチド並びに‘ナンセンス’コントロールペプチドで
あるＨｉｓ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ａｌ
ａ−Ｌｙｓ及びＴｈｙ−ＧＡ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇ
ｌｕ−ＴｙｒとＴｈｙ−ＧＡ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｈｉｓ−^*Ａｓｘ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｒｇの複合物である。全ての実験において認められた反応性を
集めて、その反応性を群毎に算出すると、最高濃度でのＴｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ
−β−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒペプチド（及びＴｈｙ−ＧＡ−Ｔｒｐ−
Ｌｅｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ複合物）に対する有意の反
応性（Student t−検定で、P=０．０１）が認められるが、その他のペプチド類
の何れについても認められない（図８を参照）。このことは、前記実施例におい
て記載したＥＬＩＳＡ構成において行った観察結果に類似している。

【０１１２】 実施例５：ＲＡ患者から単離した免疫親和性精製自己抗体に反応性を示す、ヒ トＩｇＧ のＡｓｎ−３１５を含む免疫反応性エピトープの遺伝子地図作成 ＩｇＭの解析は、自己抗体の分析を行う前に血清試料から内因性ＩｇＧを除
去出来る可能性を開くものである。事実、循環する異性化／光学的反転したＩｇ
Ｇが相当な量において健常個人及びＲＡ罹患個人の双方において存在することは
、既に確固として認められており、想定された抗イソーＩｇＧ自己抗体の何れも
が、これらの分子の存在によって殆ど完璧に阻害され、その結果当該測定法にお
いて固体層に結合することが妨害されるに到ることは、想到可能なことである。
下記する実施例は、ヒトＩｇＧから誘導された異性化標的エピトープと反応性を
示すヒト自己抗体を精製する方法、及び不活性なセルロース支持体上において合
成された合成ペプチドと一緒に培養することによって発現した、かかるエピトー
プに対する反応性を検出する方法を記載するものである。

【０１１３】 ＩｇＧカラムにおける免疫親和性クロマトグラフィーによるヒト血清試料から ＲＦ'ｓを精製すること 適用した実験プロトコールは以下の通りである： １．ＩｇＧをＣＮＢｒで活性化したセファロースにメーカーの指示（Pharmaci
a, Upsala, Sweden）に従って結合させる。 ２．このＩｇＧセファロースを適当なカラム（即ち、使い捨て型のＤＧ１０カ
ラム、BioRad Laboratories, Richmond, CA）に充填する。このカラムは、少な
くともカラムの１０倍容量のＰＢＳ及びカラムの１０倍容量の０．１Ｍ酢酸ナト
リウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウムｐＨ３．５で洗浄し、最後にＰＢＳで平衡化
処理する。 ３．ＲＡ患者から採取した血清をＰＢＳに１０倍に希釈し、このカラムにロー
ドする。吸光度（ＯＤ２８０ｎｍ）がベースラインに達するまでカラムをＰＢＳ
で洗浄する。 ４．結合したＲＦ'sを０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウムｐ
Ｈ３．５で洗浄する。 ５． ０．１Ｍ酢酸ナトリウム、０．１５Ｍ塩化ナトリウムｐＨ３．５を用い
たセファデックスＧ−２００カラムによるゲル濾過によりＩｇＭをＩｇＧ及びＩ
ｇＡから分離する。 ６． 溶出したＩｇＭをＰＢＳ−ＢＴで１μｇ／ｍＬにまで希釈し、下記する
ように測定する。

【０１１４】 セルロース結合ペプチドの合成 Ａｓｎ−３１５残基上を伸展する7つのアミノ酸ペプチドをＷｈａｔｍａｎ
５４０ｐａｐｅｒ（Maidestone, U.K.）を使用しまた前述した操作法（Frank.
1992, Kramer et al 1994）を用いてスポット合成法により合成した。これらの
ペプチドは、スポット合成法（Abimed, Langenfeld, FRG）を用いれば自動的に
合成される。以下のペプチドをカルボキシ末端を介して共有結合させた状態で合
成した： Ｉ．Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ^... ＩＩ．Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ^... ＩＩＩ．Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−β^... ＩＶ．Ｈｉｓ−Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−β−Ｇｌｙ^... Ｖ．Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−β−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ^... ＶＩ．Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−β−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ^... ＶＩＩ．Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−β−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ^... ＶＩＩＩ．Ｌｅｕ−Ａｓｐ−β−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ^{.. .} ＩＸ．Ａｓｐ−β−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ^... Ｘ．Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ^... Ａｓｐ−β：異性化Ａｓｐ残基を支配するが、この場合ペプチド結合は、直鎖
のα―カルボキシル基（βＬ型）ではなくβ―カルボキシル基を貫通する。 ^...：セルロース支持体との結合を支配する。

【０１１５】 これらのペプチドを含むセルロース膜は、上記したように免疫親和性精製し
たＲＡ自 己抗体と共に培養した。結合抗体の培養及び可視化は、報告されてい
る従来法によるイ ムノブロッティング法を用いて行った（Kramer et al 1994
）。

【０１１６】 この実験の結果、ペプチドＩＶ及びＶＩＩに対して強い反応性が明らかとな
った。このことから、ＲＡ患者の血清から精製した自己抗体は、当該エピトープ
の異性化（βＬ）型におけるＡｓｎ−３１５残基を取り囲む七つのアミノ酸エピ
トープを認識していることが強く示唆される。

【０１１７】 実施例６：Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−γ―Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ −Ｇｌｙに反応性を示す自己抗体の検出 多発性硬化症に罹患した患者における自己抗体が、ミエリン塩基性タンパク
質（ＭＢＰ）から誘導されたオクタペプチドであるＰｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−γ
―Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙを認識するか否かを検討した。

【０１１８】 この目的のために、ＭＢＰ誘導オクタペプチドＰｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−γ
―Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（γＬ）を標準的ＦＭＯＣ化学を使
用して合成により製造した。このペプチドをビスー［スルホスクシンイミジル］
スベレート（ＢＳ³）によってメーカー（Pierce）の指示に従ってウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）に結合させ、実施例４において記載したようにクロラミンＴプ
ロトコールを用いて¹²⁵Ｉで沃素化させた。

【０１１９】 9人のＭＳ患者及び8人の健常者から採取した血清を¹²⁵Ｉ−ＢＳＡ−ＢＳ³―
Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−γ―Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙと一夜
反応させ、次いでプロテインＡセファロースで免疫複合体を沈殿させた。血清試
料をＩＭＰ緩衝液で１：２００に希釈し、また¹²⁵Ｉ−ＢＳＡ−ＢＳ³−Ｐｒｏ−
Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−γ―Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＧｌｙトレーサーをＩ
ＭＰ緩衝液で希釈した（活性が１０００００ ＣＰＭ／２５μｌになるまで）。
希釈した血清試料の７５μｌを２５μｌのトレーサーと混合し、２５μｌのＩＭ
Ｐ緩衝液か又はフリーの（未結合／未標識化）ペプチドＰｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ
−γ―Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙペプチド（ＩＭＰ緩衝液中１０
μｇ／ｍｌの濃度で）をこの混合物に加えた。この混合物を４℃にて一夜培養し
た。試料バイアル当たり２０μｌのプロテインＡセファロースを秤取し、１０ｍ
ｌのＩＭＰ洗浄緩衝液で3回洗浄し、リピーターピペットを用いてエッペンドル
フ１．５ｍｌチューブに移した。ＰＡＳ２０００ＲＰＭで2分間遠心分離するこ
とによって沈降させ、上澄み液を吸引装置（又はピペット）を用いて吸引した。
一夜培養した後、抗体／抗原溶液をＰＡＳペレットに移し、振とう台にて室温で
3時間培養した。ＰＡＳを２０００ＲＰＭにて2分間遠心分離することによって沈
降させ、ＰＡＳペレットを７５０μｌのＩＭＰ洗浄緩衝液で５回洗浄した。各洗
浄工程終了後、上澄み液を吸引し、最後にＰＡＳ−ペレットをｍｉｌｌｉ−Ｑ水
に再度懸濁させて、１００μｌのスラリーにし、４ｍｌのプロピレンチューブに
移して、γ―カウンターで計数した。このプロトコールに従って操作することに
よって、特異的シグナルが血清について得られた。群毎に、ＭＳ血清は、コント
ロール被験者から採取した血清試料よりも有意に高い応答を示した（Ｐ＝０．０
０７８、両側、ノンパラメトリックｔ検定）。図９Ａを参照。更には、¹²⁵Ｉ−
ＢＳＡ−ＢＳ³−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−γ―Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒ
ｇ−Ｇｌｙ複合物とヒト免疫グロブリンとの結合は、フリーのＰｒｏ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｕ−γ―Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙペプチドを添加すること
によって特異的に阻害することが出来た。即ち、免疫グロブリンの阻害率％は、
ＭＳ血清においてはコントロール血清と比較して有意に高かった（ｐ＝０．００
８、両側、ノンパラメトリックｔ検定）。図９ｃを参照。従って、ＭＳ患者は、
異性化（γＬ）グルタミン酸を含むＭＢＰ誘導エピトープに配向させた抗体を複
数有している。

【０１２０】 これらの結果を図9に示すが、この図において三つのグラフは、下記の通り
である： グラフＡ； 多発性硬化症（ＭＳ）の患者及び健常対照者（ＣＯ）から採取
した血清 中におけるヒト免疫グロブリンと¹²⁵Ｉ−ＢＳＡ−ＢＳ³−Ｐｒｏ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｕ−γ―Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（競合化合物とし
てフリーのペプチドは一切添加しない）との結合。

【０１２１】 グラフＢ； 多発性硬化症（ＭＳ）の患者及び健常対照者（ＣＯ）から採取
した血清 中におけるヒト免疫グロブリンと¹²⁵Ｉ−ＢＳＡ−ＢＳ³−Ｐｒｏ−Ｓ
ｅｒ−Ｇｌｕ−γ―Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（競合化合物とし
てフリーのＰｒｏ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−γ―Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇ
ｌｙペプチドを添加）との結合。

【０１２２】 グラフＣ； 多発性硬化症（ＭＳ）の患者及び健常コントロール（ＣＯ）か
ら採取した血清中におけるヒト免疫グロブリンと¹²⁵Ｉ−ＢＳＡ−ＢＳ³−Ｐｒｏ
−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−γ―Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙとの結合のパ
ーセント阻害率。

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【図面の簡単な説明】

【図１】（Ａ）は、ペプシンで分解したヒトＩｇＧについて行った第一回目の
排除クロマトグラフィーにより実施例１において得られた結果を、溶出物質のＯ
Ｄ２８０ｎｍまた収集したフラクションについて測定したＩＡＭＴ活性を示すグ
ラフとして示す。図１（Ｂ）は、サイズ排除クロマトグラフィーによって単離し
たペプシン分解ＩｇＧのいくつかの分画について異性化の特異的度合いを示す；

【図２】サイズ排除クロマトグラフィーによって単離したＩｇＧの低分子量断
片をアニオン交換樹脂カラムによる分離に供することによって実施例１において
得られた結果を示す。更に精製に供したフラクションについて収集したプールを
、ａ，ｂ，ｃ及びｄとして表す。

【図3】図2において示した陰イオン精製ＩｇＧペプチドの“プールｂ”からＨ
ＰＬＣでペプチド類を分離した結果を示す。下記するトレーサーを示す：ＵＶ２
１４ｎｍ、蛍光（３８０／２９７ｎｍ）、アセトニトリルグラジエント及びＩＡ
ＭＴ反応性である。

【図４】図３において概要を示したプールｂ精製物のＲＰ−ＨＰＬＣによる第
二回目の精製結果を示す。ＵＶ２１４ｎｍ検出器シグナル及び溶出物質のＩＡＭ
Ｔ反応性を示す。

【図５】実施例２で得られた結果を、3つの患者群の血清試料について行った
Ｅ
ＬＩＳＡ測定法で得られたシグナルグラフの形式として示したものである。

【図６】実施例３で得られた結果を、競合ペプチドの存在下に試験した6つの
血清試料のＥＬＩＳＡ信号の棒グラフの形式として示したものである。

【図７】実施例４で得られた結果を、ＲＡ患者と健常コントロールの試料を用
いて均質ＲＩＡ測定法で得たシグナル（ＣＰＭにおける）グラフの形式として示
したものである。

【図８】実施例４で得られた結果を、競合ペプチドの存在下で得られたＲＩＡ
信号を阻害率として表した棒グラフの形式として示したものである。

【図９】実施例６で得られた結果を、散布グラフＡ，Ｂ及びＣの形式として示
したものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 クリストガウ、ステファン デンマーク国、デーカー−2820 ヘントホ フテ、レーべスコフスベイ、10アー Ｆターム(参考） 4H045 AA10 AA30 BA01 BA13 BA14 BA15 BA16 BA18 CA40 DA75 DA86 EA22 FA71

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）異性化したペプチド結合及び/又は光学的に反転したアミ
   ノ酸を含むエピトープを特異的に認識する自己反応性免疫系成分及び/又は（ｂ
   ）前記エピトープを含む自己抗原若しくはその断片及び/又は（ｃ）前記エピト
   ープを含む且つ自己免疫応答を誘発する能力を有する非自己抗原若しくはその断
   片の試料中での存在を定量的又は定性的に測定する操作に試料を供することから
   成る測定方法。
2. 【請求項２】前記免疫系成分が、細胞性免疫系成分である、請求項１において
   記載された方法。
3. 【請求項３】前記免疫系成分が、Tリンパ球である、請求項２において記載さ
   れた方法。
4. 【請求項４】前記免疫系成分が、体液性免疫系成分である、請求項１において
   記載された方法。
5. 【請求項５】前記エピトープが、異性化したペプチド結合及び/又は光学的に
   反転したアミノ酸を含むIｇGから誘導されたアミノ酸配列を含んで成る、請求項
   ４において記載された方法。
6. 【請求項６】前記免疫系成分が、下記する配列の何れか一つに含まれるアミノ
   酸^*Ａｓｘを含んで成るエピトープに配向させた自己抗体である、請求項４にお
   いて記載された方法： Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｔｙｒ； Ｔｒｐ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ； Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−^*Ａｓｘ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒ
   ｏ； Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ； Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−^*Ａｓｘ−Ｓｅｒ−Ｖａ
   ｌ−Ｉｌｅ； Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅ
   ｒ−Ｇｌｙ−^*Ａｓｘ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ； Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒ
   ｇ；及び Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−^*Ａｓｘ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ｔｙ
   ｒ： なお上式において、^*Ａｓｘは、αD Ａｓｐ若しくはＡｓｎ、又はβＬ Ａｓ
   ｐ若しくは原初の配列における残基Ａｓｐ若しくはＡｓｎの異性化／光学的反転
   により生成するβＤ Ａｓｐである。
7. 【請求項７】前記免疫系成分が、下記する配列の何れか一つの配列に含まれる ^* Ａｓｘなるアミノ酸を含んで成るエピトープに対して配向させた自己抗体であ
   る、請求項４において記載された方法： Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ
   −Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ａｒｇ
   −^*Ａｓｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−又はＶａｌ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−
   Ｌｙｓ−^*Ａｓｘ−Ｉｌｅ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ： なお上式において、^*Ａｓｘは、αD Ａｓｐ若しくはＡｓｎ、又はβＤ Ａｓ
   ｐ若しくは原初の配列における残基Ａｓｐ若しくはＡｓｎの異性化／光学的反転
   により生成するβL Ａｓｐである。
8. 【請求項８】前記免疫系成分が、下記する配列の何れか一つに含まれるアミノ
   酸^*Ｇｌｘを含んで成るエピトープに対して配向させた自己抗体である、請求項
   ４において記載された方法： Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−^*Ｇｌｘ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ； Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−^*Ｇｌｘ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ；又は Ａｓｐ−Ａｌａ−^*Ｇｌｘ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ： なお上式において、^*Ｇｌｘは、αD Ｇｌｕ若しくはＧｌｎ、又はγＬ Ｇｌ
   ｕ若しくは原初の配列における残基Ｇｌｕ若しくはＧｌｎの異性化／光学的反転
   により生成するγＤ Ｇｌｕである。
9. 【請求項９】前記免疫系成分又は自己抗原の検出によって自己免疫病が示され
   るものである、請求項１乃至８の何れか一項において記載された方法。
10. 【請求項１０】前記疾病が、リューマチ性関節炎、多発性硬化症、インスリン
    依存性糖尿病、重症筋無力症、ツェリアカ（腹部内臓病）、チャガス病、乾癬又
    はクローン病である、請求項９において記載された方法。
11. 【請求項１１】自己抗原又はその断片と前記自己抗原内における異性化したペ
    プチド結合又は光学的反転したアミノ酸の存在に対して特異的である免疫学的結
    合パートナーとの反応性を検出することから成る、自己抗原又はその断片を検出
    する方法。
12. 【請求項１２】前記免疫学的結合パートナーが、請求項６乃至８の何れか一項
    において定義されエピトープに対して特異的である、請求項１１において記載さ
    れた方法。
13. 【請求項１３】前記した免疫系成分、自己抗原、非自己抗原又は抗原断片の検
    出量に関する情報を提供するものである、前記請求項のうちの何れか一項におい
    て記載された方法。
14. 【請求項１４】自己抗原中の単一又は複数のエピトープの位置を決定する方法
    において、L―イソアスパルチル（Ｄ―アスパルチル）メチルートランスフェラ
    ーゼ（ＩＡＭＴ）及び標識化メチル基供給源とを用いて前記自己抗原内の異性化
    したペプチド結合及び/又は光学的に反転したアミノ酸の一つ以上に前記標識化
    メチル基を導入すること、及び前記標識化メチル基が導入された前記自己抗原内
    の位置を決定すること、前記位置を包含する領域内における前記自己抗原のアミ
    ノ酸配列を決定すること、及び前記位置において前記異性化した又は光学的に反
    転したアミノ酸を組み込んだ前記アミノ酸配列のペプチドを試験・検査して自己
    反応性免疫系成分との反応性を測定すること、とから成る前記単一又は複数のエ
    ピトープの位置決定方法。
15. 【請求項１５】該自己抗体が自己免疫病に関連するものである、請求項１４に
    記載された方法。
16. 【請求項１６】該自己免疫病が、リューマチ性関節炎、多発性硬化症、インス
    リン依存性糖尿病、重症筋無力症、ツェリアカ（腹部内臓病）、チャガス病、乾
    癬又はクローン病である、請求項９において記載された方法。
17. 【請求項１７】自己反応性免疫系成分によって認識されるエピトープを含むぺ
    プチドであって、該エピトープが異性化したペプチド結合又は光学的反転したア
    ミノ酸を含むものである、前記ペプチド。
18. 【請求項１８】請求項６乃至８の内の何れか一項において定義されたエピトー
    プを含む、請求項１７において記載されたペプチド。
19. 【請求項１９】変化したアミノ酸残基である^*Ａｓｘ又は^*Ｇｌｘ―なお本式に
    おいて、^*ＧｌｘはαD Ｇｌｕ若しくはＧｌｎ、又はγＬ Ｇｌｕ若しくは原初
    の配列における残基Ｇｌｕ若しくはＧｌｎの異性化／光学的反転により生成する
    γＤ Ｇｌｕであり、又^*ＡｓｘはαD Ａｓｐ若しくはＡｓｎ、又はβＬ Ａｓ
    ｐ若しくは原初の配列における残基Ａｓｎ若しくはＡｓｐの異性化／光学的反転
    により生成するβＤ Ａｓｐである―及び少なくとも三種の側鎖アミノ酸残基と
    をＮ―末端及び/又はＣ―末端方向に含んで成る、請求項１８において記載され
    たペプチド。