DE60011622T2

DE60011622T2 - Diagnose der glutensensibilitätsenteropathie und anderer autoimmunerkrangungen

Info

Publication number: DE60011622T2
Application number: DE60011622T
Authority: DE
Inventors: Mats Paulsson; Miklos Sardy; Uwe Odenthal; Sarolta Karpati; Neil Smyth; Daniel Aeschlimann
Original assignee: Immundiagnostik AG; WIESLAB AB; WIESLAB LUND AB
Current assignee: Immundiagnostik AG; WIESLAB AB; WIESLAB LUND AB
Priority date: 1999-06-28
Filing date: 2000-06-28
Publication date: 2005-09-08
Anticipated expiration: 2020-06-29
Also published as: DE60011622D1; JP2003521677A; CA2377733C; CA2377733A1; ATE269543T1; WO2001001133A2; WO2001001133A3; AU776091B2; AU5821400A; EP1200827A2; US7781169B1; EP1200827B1

Description

Technisches Gebiet
Die Erfindung betrifft die Diagnose von glutensensitiver Enteropathie und anderer Autoimmunkrankheiten über den Nachweis von Antikörpern gegen Transglutaminasen.
Hintergrund der Erfindung
Die glutensensitive Enteropathie (GSE) ist eine häufige chronische Dünndarmerkrankung autoimmunen Ursprungs, die bei Kindern und auch bei Erwachsenen vorkommt. Sie wird ausgelöst und verursacht von Weizengluten, der auch in anderen Zerealien vorkommt. Die klinische Erscheinungsform der GSE ist überlicherweise die Zöliakie-Erkrankung (CD). Bei einigen Individuen tritt sie aber auf zusammen mit Dermatitis herpetiformis (DH), einer bullösen autoimmunen Hauterkrankung, welche charakterisiert ist durch eine granuläre IgA-Färbung der Papillarhaut. Diese zwei Formen der GSE haben den gleichen genetischen Hintergrund und gehen einher mit Klasse II-HLA-Antigenen DQ2 und DR3 und HLA-A1, -B8, -DR3-Haplotyp. Bei Aufnahme von Gluten und entsprechender genetischer Veranlagung tritt eine T-Zellen-vermittelte Autoimmunantwort im Dünndarm auf, die zunächst zu einer Infiltration durch Lymphozyten führt, dann zu einer völligen Atrophie der Villi und zu einer gestörten Nahrungsaufnahme (Marsh, M. N. et al., Bailliere Clin Gastr 1995 (9): 273–294). Bei glutenfreier Diät verschwinden aber die pathologischen Veränderungen gänzlich, und es wird eine normale Morphologie und Funktion hergestellt.
Die Diagnose der GSE beruht auf charakteristischen histologischen Veränderungen (Atrophie der Villi, intraepitheliale Lymphozytose, kryptische Hyperplasie), die durch jejunale Biopsien gestellt werden können, und auf der Regeneration der Mucosa bei glutenfreier Diät und einem Rückfall bei einem Exposition gegenüber Gluten. Auch serologische Tests wurde zur Diagnose der GSE verwandt, da sie weniger invasiv sind und eine billige Alternative darstellen. Sie weisen IgA-Antikörper gegen das Endomysium-Antigen, Reticulin oder Gliadin nach. Der Anti-Endomysium-IgA-Antikörper-(EMA)-Test ist das serologische Verfahren der Wahl, da er eine höhere Sensitivität und Spezifität besitzt als die Tests auf der Basis von Anti-Reticulin-IgA-Antikörper und Anti-Gliadin-IgA-Antikörper. EMA wird in 60 bis 70% der unbehandelten Patienten mit DH gefunden und bei nahezu allen unbehandelten Zöliakie-Patienten. Der EMA-Test erfolgt aber an teueren Oesophagus-Schnitten aus bedrohten Primaten, ist mühsam und zeitaufwenig und subjektiv in Grenzfällen.
Gewebstransglutaminase (TGc, EC 2.3.2.13) wurde zudem als Haupt- bzw. einziges Endomysium-Autoantigen der Zöliakie identifiziert (Dieterich W. et al., Nature Medicine 1997, 3(7):797–801). Es gibt zudem einen Zöliakie-ELISA-Test auf Grundlage käuflicher Meerschweinchen-TGc. Wenngleich die TGc-Aminosäuresequenzen zwischen Meerschweinchen und Mensch zu 82,8% übereinstimmen, so ist dieser Test hochsensitiv und zu über 90% spezifisch (Ikura K. et al., Biochemistry 1988; 27:2898–905; Gentile V. et al., J. Biol. Chem. 1991; 266: 478–83; Dieterich W. et al., Gastroenterology 1998; 115:1317–21; Sulkanen S. et al., Gastroenterology 1998; 115: 1322–8). Darüber hinaus wurden Radioligandenassays mit geklontem Human-tTG entwickelt für eine kombinierte Einschrittbestimmung von tTG-IgA- und -IgG-Antikörpern (Seissler et al., Horm. Metab. Res. 1999, 31: 375–379).
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es die Bereitstellung eines besseren Assays auf glutensensitive Enteropathien und insbesondere einen Antikörperbindungsassay, der eine differentielle Diagnose erlaubt von Autoimmunkrankheiten des GSE-Typs, Autoimmunkrankheiten, die mit GSE einhergehen und scheinbar nicht-aktiven latenten glutensensitiven Enteropathien.
Kurze Beschreibung der Erfindung
Dieses Ziel wird erreicht durch einen Proteinbindungsassay gemäß den Ansprüchen 1 bis 5, der eine differentielle Diagnose erlaubt der glutensensitiven Enteropathie (GSE), von Autoimmunkrankheiten des GSE-Typs, Autoimmunkrankheiten, die mit GSE einhergehen, sowie von einer Gruppe von Autoimmunkrankheiten, die mit IgA und IgG gegen Transglutaminasen einhergehen. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft einen Bindungsassay mit mehreren Proteinen, umfassend Human-Gewebstransglutaminase und weitere Transglutaminasen als Bindungspartner. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft einen Proteinbindungsassay, der Transglutaminasen umfasst, die aus verschiedenen Geweben und Spezien isoliert oder geklont wurden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Autoimmunkrankheiten des GSE-Typs, umfassend einen Mehrfachproteinbindungsassay auf der Basis von Human-TGc und anderen Transglutaminasen wie Meerschweinchen-TGc oder anderen Vertretern der Transglutaminase-Proteinfamilie. Mehrfachproteinbindungs assay bedeutet hier, dass die Diagnose auf Grundlage von mindestens zwei, bevorzugt drei oder mehreren unterschiedlichen Transglutaminasemolekülen als Antigen erfolgt.
Die Erfindung stellt bereit ein Verfahren zur Diagnose von Autoimmunerkrankungen des GSE-Typs oder die einhergehen mit glutensensitiver Enteropathie, umfassend das Nehmen einer Probe und das Prüfen der Probe auf Antikörper gegen Gewebstransglutaminase und mindestens eine weitere Transglutaminase. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Autoimmunerkrankung Dematitis herpetiformis, Morbus Duhring, oder eine Autoimmunerkrankung, ausgewählt aus Addison'sche Erkrankung, auoimmune hämolytische Anämie, autoimmune thrombozytopenische Purpura, autoimmune Schilddrüsenerkrankung, IDDM, Alopezie, atrophische Gastritis – perniziöse Anämie, Chron'sche Erkrankung, Hypoadrenalismus, Hypogonadismus, Hyposplenismus, Kryoglobulinismus, Kolitis ulcerosa, Goodpasture Syndrom, gluteninduzierte Ataxie, IgA-Nephropathie oder IgA-Glomerulonephrititis, Myasthenia gravis, Partiallipodystrophie, Polymyositis, primärer biliäre Zirrhose, primäre Sklerose, Cholangitis, progressive systemische Sklerose, oraler Aphthose, chronische Perikarditis, rezidive Polychondritis, rheumatoide Arthritis, Rheumatismus, Sarcoidose, Neuropathie, Krämpfe, Sjögren Syndrom, SLE, Milzatrophie, Type-I (Insulinabhängiger) Diabetes mellitus, Diabetes mellitus anderen Typs, Transaminitis, Wegener Granulomatose, Kolitis ulcerosa, Vasculitis (sowohl systemisch als auch der Haut), Vitiligo. Eine andere Gruppe Autoimmunerkrankungen, die auf diese Weise diagnostiziert oder unterschieden werden können, gehen einher mit Unfruchtbarkeit, erhöhtem Abortrisiko und/oder vermindertem Fötenwachstum.
Die Erfindung stellt zudem bereit einen Mehrfachproteinbindungsassay für die differentiale Diagnose von Autoimmunerkrankungen, umfassend den Nachweis von Antikörpern gegen Transglutaminase, beinhaltend als Antigen rekombinante Human-Gewebstransglutaminase und mindestens eine weitere gewebsspezifische Transglutaminase, ausgewählt aus FXIIIA, TGk, TGe, TGx und sogenanntem Band 4.2. Der Proteinbindungsassay kann zudem jede andere Transglutaminase als Antigen enthalten, insbesondere Transglutaminasen aus anderen Spezien. Der Fachmann weiß, dass auch rekombinante Fusionsproteine oder Fragmente hiervon eingesetzt werden können. Der vergleichende Proteinbindungsassay ist bevorzugt ein Immunoassay, ausgewählt aus RIA, EIA/ELISA, LiA und FiA, und besonders bevorzugt ein Sandwich-Immunoassay, ausgewählt aus IRMA, IEMA/EIA, ILMA (Immunlumineszenzassay) und IFMA (Immunfluoreszenzassay).
Es wurde überraschend gefunden, dass trotz der hohen Aminosäuresequenzübereinstimmung von Human- und Meerschweinchen-TGc einige der getesteten Patientenseren, die im ELISA mit Meerschweinchen-TGc nicht erkannt wurden, Antikörper gegen andere Epitope des Human-TGc besaßen, welche nicht im Meerschweinchenenzym konserviert waren. Unsere Untersuchungen stützen, dass TGc das Autoantigen von EMA-positiven Patienten ist, auch bei DH. Ferner haben wir entdeckt, dass es eine Klasse von Autoimmunkrankheiten gibt, wo Transglutaminasen eine entscheidene Rolle bei der Ätiologie der Erkrankungen spielen, und dass die Autoimmunkrankheiten unterschieden werden können mit Hilfe der besonderen Epitopmuster der verschiedenen Transglutaminasen.
Die Entdeckung, dass TGc das Hauptautoantigen in GSE ist, beantwortet nicht die Frage, warum nur ein Teil der Patienten mit CD auch Symptome für DH besitzt und wenn überhaupt, warum hier ein Unterschied im Antigenrepartoir dieser Erkrankungen besteht. Es war nicht bekannt, ob die granulären IgA-Präzipitate in der Haut von DH-Patienten gegen ein Antigen in der Haut gerichtet sind oder ob zirkulierende Immunkomplexe nur in der Papillarhaut deponiert wurden. Die IgA-Präzipitate waren bislang nicht aus der Haut extrahiert und charakterisiert worden. Die Immunfärbung für TGc gaben jedoch nicht dasselbe Färbungsmuster wie die die Direktirnmunfluoreszenzuntersuchungen der IgA-Präzipitate in der Haut von DH-Patienten. Dies legt nahe, dass das Antigen, gegen das die deponierten IgA-Antikörper gerichtet sind, möglicherweise vom TGc verschieden ist. Wir nehmen nun an, dass diese Antikörper von einer Kreuzreaktivität mit anderen Transglutaminasen stammen, welche in der Papillarhaut vorhanden sind. Eine begrenzte Kreuzreaktivität ist auch eine plausible Erklärung für die moderate Penetranz der Hauteruptionen in Patienten mit CD. Es war zudem unklar, warum die pathologische Veränderungen und klinischen Symptome eine sehr begrenzte Lokalisation besaßen, also nur im Dünndarm auftraten und, wie im Fall von DH, nur die Haut davon betroffen war, obwohl TGc in nahezu allen Geweben des menschlichen Körpers vorkommt. Für die Untersuchung dieser Fragen haben wir drei weitere Transglutaminasen, welche in der Haut zu finden sind, exprimiert, nämlich das humane TGk, TGe und TGx und zwar in humanen embyonalen Nierenzellen, und um hierdurch die zirkulierenden IgA- und IgG-Titer in Patienten mit CD, DH und anderen Autoimmunkrankheiten bestimmen zu können.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Die Erfindung wird nun im Einzelnen und mit Bezug auf die anliegenden Zeichnungen und Darstellungen beschrieben. Die Beschreibung und die Versuchsbeispiele begrenzen jedoch die Erfindung in keiner Weise. Es zeigt:
1 ein SDS-PAGE (A) und eine Immunoblot (B)-Analyse von TGc. Der Immunoblot erfolgte mit monoklonalen Antikörpern gegen TGc. Die Positionen der Molekülmassenstandards (kDa) sind links angegeben. Spur I-Meerschweinchen-TGc; Spur II Lysate von Zellen, die rekombinantes Human-TGc produzieren vor Aufreinigung; Spur III – Durchfluss; Spur IV – eluiertes TGc aus der Säule;
2 ROC-Kurve (Receiver Operating Characteristic Curve) für den Human-TGc-ELISA, die den Punkt mit der höchsten Effizienz des Tests zeigt, nach dem der Cut-Off-Wert gewählt wird.
3 Anti-TGc-Serumantikörperkonzentrationen im Human-TGc-ELISA-System in der Kontrolle (I) und bei Patienten mit CD oder DH (II). Leere Quadrate bezeichnen behandelte CD- oder DH-Patienten. Der gewählte willkürliche Cut-Off-Wert für eine Positivdiagnose (gestrichelte Linie) liegt bei einem AU von 18.
4 ROC-Kurve für den Meerschweinchen-TGc-ELISA mit dem Punkt der höchsten Effizienz des Tests, nach dem der Cut-Off-Wert gewählt wird.
5 Anti-TGc-Serumantikörperkonzentrationen im Meerschweinchen-TGc-ELISA-System in der Kontrolle (I) und bei Patienten mit CD oder DH (II). Leere Quadrate bezeichnen behandelte CD- oder DH-Patienten. Der gewählte willkürliche Cut-Off-Wert für eine Positivdiagnose (gestrichelte Linie) liegt bei einem AU von 14.
6 Serumkonzentrationen von IgA-Antikörpern gegen TGc im Human-TGc-ELISA in willkürlichen Einheiten (AU). Leere Quadrate bezeichnen behandelte CD- oder DH-Patienten. Der gewählten willkürliche Cut-Off-Werte für eine Positivdiagnose (gestrichelte Linie) liegt bei 18 AU. CD: Zöliakie; DH: Dermatitis herpetiformis; CTRL: Kontrollserum; PV: Pemphigus vulgaris; BP: bullöses Pemphigoid; CR: Crohnsche Erkrankung, CO: Kolitis ulcerosa; GP: Goodpasture-Syndrom; WEG: Wegener Granulamatose; RA: rheumatoide Arthritis; SLE: systemischer Lupus erythematodes; PSS: progressive systemische Sklerose; PA: psoriatische Arthritis; HEPC: Hepatitis C.
7 Box-und-Whiskerdarstellung der Serumkonzentrationen von IgA-Antikörpern gegen Human-TGc. Die Ober- und Unterkanten der Boxen zeigen die 25% bzw. 75%-Perzentilen. Der Median ist als horizontale Linie durch die Box dargestellt. Die obere und untere Fehlergrenze zeigt die 5% bzw. 95% Perzentile. Die CD und DH-Gruppe enthält nur unbehandelte Patienten. Abkürzungen – siehe 6.
8 Korrelation der Antikörpertiter zwischen dem Human- und dem Meerschweinchen-TGc-ELISA. Auf der x-Achse sind in willkürlichen Einheiten die Titer angegeben, welche mit dem Human-TGc-ELISA gemessen wurden; auf der y-Achse die mit dem Meerschweinchen-TGc-ELISA gemessenen Titer. Die Cut-Off-Werte sind durch gestrichelte Linien dargestellt.
9 SDS-PAGE-Analyse von TGe nach Aufreinigung. Die Position des Molekülmassenstandards (kDa) sind links angegeben.
10 Immunoblot-Analyse der Human-TGc's mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpern gegen den Strep-II-Tag. Die Positionen des Molekülmassenstandards (kDa) sind links angegeben. Spur I: TGc; Spur II: TGe; Spur III: TGk; Spur IV: TGx.
11 Bindung von IgA der GSE-Patientenseren an Human-TGc oder- TGe im ELISA. Seren, die mit den TGc's reagieren, gaben Werte unter 0,4. Ähnliche Ergebnisse mit dem TGe. Aber Seren mit erhöhten IgA-Antikörper-Titern gegen TGc zeigen in den meisten Fällen niedrige Antikörpertiter gegen TGe.
12 Hemmung der IgA-Bindung in vier GSE-Patientenseren an Festphase-Human-TGc durch Präinkubation mit zunehmenden Mengen Human-TGc (gestrichelte Linie) oder TGe (durchgehende Linie). Sowohl TGc als TGe geben eine Hemmung, wenngleich TGc wirksamer ist als TGe.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Die Erfinder exprimierten Human-TGc und andere Transglutaminasen durch DNA-Rekominationsverfahren und erstellten auf Basis der aufgereinigten Proteine verschiedene ELISA's für den Nachweis von Anti-TG-IgA-Antikörpern. Die Ergebnisse mit diesen ELISAs wurden verglichen mit den Ergebnissen aus den Meerschweinchen-TGc-ELISAs und der EMA-Tests an Affen-Oesophagus.
Material und Methoden
SDS-PAGE und Immunoblotting
Die SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidelektrophorese) erfolgte nach dem Verfahren von Laemmli (Laemmli, Nature 1970; 227:680–5) mit einem 12-prozentigen Polyacrylamid-Trenngel und einem 5-prozentigen Polyacrylamid-Sammelgel. Die Proben wurden durch Zusatz von 2% (v/v) 2-Mercaptoethanol reduziert. Die Proteine wurden nachgewiesen entweder durch Färbung mit Coomassie-Brilliant-Blau R (Serva) oder durch Immunblotting nach elektrophoretischem Transfer auf eine Nitrocellulosemembran (Protran, Schleicher & Schuell) nach dem Verfahren von Towbin und Mitarbeiter (Towbin H. et al., Proc Natl Acad Sci USA, 1979, 76:4350–4). Nach dem Proteintransfer wurden die Membranen mit Ponceau S (Serva) gefärbt und 75 Minuten bei Raumtemperatur in TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7,4), 5% fettfreies Milchpulver blockiert. Die blockierte Membran wurde dann mit dem spezifischen Antikörper inkubiert.
Human-TGc wurde nachgewiesen mit monoklonalen Maus-Antikörpern gegen TGc (spezifisch für TGc, aber kreuzreagierend sowohl mit Human- als auch Meerschweinchen-TGc, Neomarkers: Ab-3, CUB7402 + TG 100), verdünnt 1:2000 in TBS, 5% fettfreies Milchpulver und 0,05% Tween^TM 20 (Sigma); Reaktion: 1,5 Stunden bei Raumtemperatur. Zum Nachweis gebundener Maus-Antikörper wurden die Membran eine Stunde bei Raumtemperatur mit Meerrettichperoxidase-markierten Kaninchen-Antikörpern gegen Mausimmunglobuline (Dako) inkubiert, verdünnt 1:2000 in TBS/Tween, 5% fettfreies Milchpulver. Gebundene Sekundärantikörper wurden nachgewiesen durch Autoradiographie unter Verwendung eines Chemilumineszenz-Verstärkersystems (ECL Kit, Amersham). Als positive Kontrolle diente in jedem Fall Meerschweinchen-TGc (Sigma).
Rekombinante exprimierte TGs wurden nachgewiesen mit polyklonalen Kaninchenantikörpern gegen den Strep-II-Tag (Institut für Bioanalytik), verdünnt 1:5000 in TBS, 1% fettfreies Milchpulver und 0,05% Tween 20 (Sigma); Reaktionszeit: eine Stunde bei Raumtemperatur. Für den Nachweis der gebundenen Kaninchenantikörper wurden die Membranen bei Raumtemperatur eine Stunde inkubiert mit Meerrettichperoxidase-markierten Schweineantikörpern gegen Kaninchenimmunoglobulin (Dako), verdünnt 1:3000 in TBS/Tween, 1% fettfreies Milchpulver. Gebundene Sekundärantikörper wurden nachgewiesen durch Lumineszenz nach 5 Minuten Inkubation in 100 mM Tris/HCl, pH 8,3, 0,2 mM p-Coumarinsäure (Sigma), 2,65 mM H₂O₂ (Sigma) und 1,25 mM 3-Aminophthalhydrazid (Fluka). Als positive Kontrolle diente Human-TGc, exprimiert als Fusionsprotein mit einem C-terminalen Strep-II-Tag.
Reverse Transkription und polymerase Kettenreaktion
Die reverse Transkription erfolgte mit AMV reverser Transkriptase (Oncor Appligene) und die PCR mit Pfx Tag Polymerase (Life Technologies) gemäß den von den Herstellern angegebenen Verfahren.
Rekombinate Expression von Human-TGc
Der episomale eukaryotische Expressionsvektor pCEP-Pu/BM40SP, hergestellt aus pCEP4 (Invitrogen; Kohfeldt E. et al., FEBS Lett 1997;414:557–61) wurde durch Einführen einer Sequenz mit dem Strep-II-Tag (IBA, Germany) und eines Stoppcodons in die multiple Klonierungsstelle modifiziert. Die Primer 5'-GGCCGCATGGAGCCATCCACAATTCGAAAAGTA und 5'- GGCCTACTTTTCGAATTGTGGATGGCTCCATGC wurden verschmolzen und in die Not I-Stelle eingeführt. Man erhielt so den Vektor pCEP-Pu/BM40SP/C-Strep, der ein carboxyterminales Strep-II-Fusionsprotein produzierte, welche sich eignet für eine Streptavidinaffinitätsaufreinigung mit einer Strep-Tactin^TM- Affinitätssäule (IBA, Germany), wie beschrieben von Schmidt TGM et al. (J Mol Biol 1996; 255:753–66). Die Human-TGc-cDNA gesamter Länge (GeneBank accession number M55153, kloniert in pSP73) wurde durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) mit 5'-ATTAAGCTTGCCGCCACCATGGCCGAGGAGCTGGTC als 5'-Primer und 5'-TAAGCGGCCGCGGGGCCAATGATGACATTC als 3'-Primer amplifiziert. Mit dem 5'-Primer wurde eine neue Hind III-Restriktionsstelle sowie eine Kozak-Translations- und Initiationssequenz eingeführt. Mit dem 3'-Primer wurde eine neue Not I-Restriktionsstelle eingeführt und das Stoppcodon entfernt. Das PCR-Produkt wurde mit Hind III und Not I geschnitten, aufgereinigt und in dieselbe Restriktionsstelle von pCEP-Pu/BM40SP/C-Strep eingefügt. Dadurch wurde der Expressionsvektor pCEP-Pu/TGc/C-Strep erhalten. Die korrekte Einführung und die Sequenz des ganzen Produkts wurde verifiziert durch Cyclesequenzierung mit dem ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit. Die Produkte wurden auf einem ABI Prism 377 Sequenzautomaten (Perkin-Elmer/Applied Biosystems) aufgetrennt.
Humane embryonale Nierenzellen (293-EBNA, Invitrogen) wurden mit pCEP-Pu/TGc/C-Strep transfektiert und nach Zellkultur in Dulbecco's MEM-Medium NUT MIX F-12 (Life Technologies), enthaltend 10% fötales Kälberserum (Life Technologie), 1% L-Glutamin (Life Technologies), 200 IU/ml Penicillin (Life Technologies) sowie 200 μg/ml Streptomycin (Life Technologies), geerntet. Die Zellen wurden mit 0,5 μg/ml Puromycin selektiert. Nach Wegnahme des Mediums und Waschen mit kalter (4°C) 0,25 mM Sucrose wurden die Zellen mechanisch in kalter 0,25 M Sucrose Iysiert. Das Lysat wurde von teilchenförmigen Material durch 30minütiges Zentrifugieren bei 4°C und 27.200 g geklärt. Es folgte eine 60-minütige Ultrazentrifugation des Überstands bei 4°C und 210.000 g. Nach Filtern durch ein Käsetuch und Zugabe von 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF, Fluka) als Proteaseinhibitor wurde 12 ml Überstand bei 4°C mit einer Fließrate von 0,4 ml/cm²/min über eine StrepTactin-Affinitätssäule mit 3 cm³ Volumen geschickt; Äquilibrieren mit steril gefiltertem 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, 1 mM Ethylendiamintetraacetat (ETDA). Es wurde extensiv mit Äquilibrierungspuffer, der 1 mM PMSF enthielt, mit einer Fließrate von 0,9 ml/cm²/min gewaschen. Das Protein wurde mit Äquilibrierungspuffer, enthaltend 1 mM PMSF und 2,5 mM Desthiobiotin (Sigma), bei einer Fließrate von 0,4 ml/cm²/min eluiert. Es wurden 2 ml-Fraktionen gesammelt. Die Aufreinigung wurde überwacht durch Coomassie-gefärbte SDS-PAGE und Westernblots mit monoklonalen Antikörpern gegen TGc, wie oben beschrieben. Die Proteinkonzentration wurde auf SDS-PAGE bestimmt und mit dem Bicinchoninsäure(BCA)-Proteinassayreagenz (Pierce) nach dem Protokoll des Herstellers gemessen. Als Standard diente Rinderserumalbumin.
Gewinnung der cDNAs verschiedener Transglutaminasen
Die Gesamt-RNA aus humanen Keratinozyten wurde mit spezifischen Primern für das TGe- bzw. das TGk-Proenzyme revers transkripiert. Die cDNAs wurden durch PCR gewonnen. Die Human-TGx-cDNA gesamter Länge (GeneBank accession number AF035960) wurde in pSP73 kloniert.
Herstellung eines Expressionskonstrukts für die Expression von TGe
Es wurde ein episomales Expressionskonstrukt hergestellt für die Produktion eines C-terminalen Strep II-Fusionsproteins, das sich eignete für eine Streptavidin-Affinitätsreinigung mit der StrepTactin^TM--Affinitätssäule (Institut für Bioanalytik, Deutschland; Schmidt TGM et al., J Mol Biol 1996; 225:753–66). Die cDNA für TGe-Proenzym wurde durch PCR amplifiziert unter Verwendung des 5'-Primers 5'-ATTAAGCTTGCCGCCACCATGGCTGCTCTAGGAGTC und des 3'-Primers 5'-ATTGCGGCCGCTTCGGCTACATCGATGGACAAC. Mit dem 5'-Primer wurde eine neue Hind III Restriktionsstelle sowie eine Kozak-Translations- und Initiationssequenz eingeführt. Der 3'-Primer hingegen führte eine neue Not I-Restriktionsstelle ein und entfernte das Stoppcodon. Das PCR-Produkt wurde mit Hind III und Not I Restriktionsenzym verdaut, aufgereinigt und in dieselbige Restriktionsstelle des episomalen eukaryotischen Expressionsvektors pCEP-Pu/BM40SP/C-Strep, herstellt aus pCEP4 (Invitrogen), eingeführt. Es wurde schließlich der Expressionsvektor pCEP-Pu/TGe/C-Strep erhalten.
Konstruktion des Expressionsvektors pCEP41N-Strep
Es wurde der eukaryotische episomale Expressionsvektor pCEP4 (Invitrogen) modifiziert und eine Sequenz mit einer Kozak Translations- und Initiationssequenz sowie das Strep II-Tag in die multiple Klonierungsstelle eingeführt. Die Primer 5'-CTAGTTGCCGCCACCATGGCTTGGAGCCATCCACAATTCGAAAAGG und 5'-CTAGCGCCTTTTCGAATTGTGGATGGCTCCAAGCCATGGTGGCGGCAA wurde miteinander verschmolzen und in die Nhe I-Stelle eingeführt. Es wurde so der Vektor pCEP4/N-Strep hergestellt, der ein N-terminales Strep II-Fusionsprotein produziert.
Konstruktion der Expressionskonstrukte für die Expression von TGx
Es wurden zwei episomale Expressionskonstrukte hergestellt, welche die Gewinnung von einem C-terminalen als auch einem N-terminalen Strep II-Fusionsprotein erlauben. Für die Konstruktion mit dem C-terminalen Strep II-tag wurde die TGx-cDNA durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) mit Hilfe des 5'-Primers 5'-ATTGCGGCCGCCATGGCCCAAGGGCTAGAAG und des 3'Primers 5'-TAAGCGGCCGCTAATGCAAAGTCTACATAAAC amplifiziert. Mit dem 5'-Primer wurde eine neue Not I-Restriktionsstelle eingeführt sowie eine Kozak Translations- und Initiationssequenz. Mit dem 3'-Primer wurde eine neue Not I-Restriktionsstelle eingeführt und das Stoppcodon entfernt. Das PCR-Produkt wurde mit Not I Restriktionsenzym verdaut, aufgereinigt und in dieselbe Restiktionsstelle von pCEP4 eingeführt. Der Expressionsvektor am Ende war pCEP4/TGx/C-Strep. Für das Konstrukt mit dem N-terminalen Strep II-Tag wurde die TGx-cDNA durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) mit dem 5'-Primer 5'-ATTGCTAGCCCAAGGGCTAGAAGTGG und dem 3'-Primer 5'-TAAGCGGCCGCTTATAATGCAAAGTCTACATAAAC amplifiziert. Mit dem 5'Primer wurde eine neue Nhe I-Restriktionsstelle eingeführt und das erste Methionin entfernt. Mit dem 3'-Primer wurde eine neue Not I-Restriktionsstelle direkt nach dem Stoppcodon eingeführt. Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen Nhe I und Not I verdaut, aufgereinigt und in dieselben Restriktionsstellen von pCEP4 eingeführt. Es wurde schließlich der Expressionsvektor pCEP4/N-Strep/TGx erhalten.
Konstruktion der Expressionskonstrukte für die Expression von TGk
Es wurden zwei episomale Expressionskonstrukte konstruiert, welche die Gewinnung von einem C-terminalen und einem N-terminalen Strep II-Fusionsprotein erlauben. Für das Konstrukt mit dem C-terminalen Strep II-Tag wurde die cDNA für das TGk-Proenzym durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) mit 5'-ATTAAGCTTGCCGCCACCATGATGGATGGGCCACGTTCC als 5'-Primer und 5'-ATTGCGGCCGCAGCTCCACCTCGAGATGCCATAGG als 3'-Primer amplifiziert. Mit dem 5'-Primer wurde eine neue Hind III-Restriktionsstelle eingeführt sowie eine Kozak Translations- und Initiationssequenz. Mit dem 3'-Primer hingegen wurde eine neue Not I-Restriktionsstelle eingeführt und das Stoppcodon entfernt. Das PCR-Produkt wurde mit Hind III und Not I Restriktionsenzym geschnitten, aufgereinigt und in dieselben Restriktionsstellen von pCEP-Pu/-BM40SP/C-Strep eingeführt. Der erhaltene Expressionsvektor war pCEP-PuTGk/C-Strep.
Für die Konstruktion mit dem N-terminalen Strep II-Tag wurde die cDNA von TGA durch eine Polymerasekettenreaktion (PCR) mit 5'-ATTGCTAGCAGATGGGCCACGTTCCGATG als 5'-Primer und 5'-ATTGGATCCTAAGCTCCACCTCGAGATGC als 3'-Primer amplifiziert. Mit dem 5'-Primer wurde eine neue Nhe I-Restriktionsstelle eingeführt und die ersten zwei Methionine entfernt. Mit dem 3'-Primer wurde hingegen eine neue Not I-Restriktionsstelle direkt nach dem Stoppcodon eingeführt. Das PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen Nhe I und Not I verdaut, aufgereinigt und in dieselben Restriktionsstellen von pCEP4 eingeführt. Der schließlich erhaltene Expressionsvektor war pCEP4/N-Strep/TGK. Die korrekte Einführung und die Sequenz des ganzen Konstrukts wurde durch Cyclesequenzierung wie oben beschrieben verifiziert
Rekombinante Expression von Human-TGe, TGx und TGk
Es wurden humane embryonale Nierenzellen (293-EBNA, Invitrogen) transfektiert und geerntet nach Zellkultur in Dulbecco's MEM-Medium NUT MIX F-12 (Life Technologies), enthaltend 10% fötales Kälberserum (Life Technologies), 1% L-Glutamin (Life Technologies), 200 IU/ml Penicillin (Life Technologies), 200 μg/ml Streptomycin (Life Technologies). Die mit pCEP-Pu-Konstrukten transfektierten Zellen wurden mit 0,5 μg/ml Puromycin (Sigma) selektiert, und die mit pCEP4 mit 333 μg/ml (335 U/ml) Hygromycin B (Calbiochem). Nach Entfernen des Mediums und Waschen mit kalter (4°C) 0,25 M Sucrose wurden die Zellen mechanisch in kalter 0,25 M Succrose lysiert. Das Lysat wurde von teilchenförmigem Material durch 30-minütiges Zentrifugieren bei 4°C und 27200 g geklärt, gefolgt von einer 60 minütigen Ultrazentrifugation des Überstands bei 4°C und 210000 g. Nach Filtern durch ein Käsetuch und Zusatz von 1 mM PMSF (Fluka) als Proteaseinhibitor wurde 12 bis 72 ml Überstand bei 4°C und mit einer Fließrate von 0,4 ml/cm³/min über eine StrepTactin^TM-Affinitätssäule mit 3 cm³ Volumen geschickt, äquilibriert mit steril gefiltertem 100 mM Tris/HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA. Das Protein wurde mit einer Fließrate von 0,4 ml/cm²/min mit Äquilibrierungspuffer eluiert, enthaltend 1 mM PMSF und 2.5 mM Desthiobiotin (Sigma). Es wurden 2 ml-Fraktionen gesammelt. Die Aufreinigung wurde durch SDS-PAGE kontrolliert und durch Immunblots mit monoklonalen Antikörpern gegen das oben beschriebene Strep-Tag. Die Proteinkonzentration wurde durch SDS-PAGE ermittelt und gemessen mit Bicinchoninsäure(BCA)-Proteinassayreagenz (Pierce) nach dem Verfahren des Herstellers, wobei als Standard Rinderserumalbumin diente.
Assay der Transglutaminaseaktivität
Die Aktivität von TGc und TGe wurde gemessen über einen 30minütigen Einbau bei 37°C von [1,4-³H]Putrescin (Amersham), wie bereits früher beschrieben von Aeschlimann D et al., J Biol Chem 1991; 266:15308–17, mit nur dem Unterschied, dass der Puffer 7,5 mM Dithiothreitol enthielt, um alle oxidierten Sulfhydrylgruppen, welche für eine katalytische Aktivität nötig sind, zu reduzieren. Das TGe war durch partiellen proteolytischen Verdau aktiviert und zwar durch eine 20minütige Präinkubation bei 37°C mit entweder 45,4 μg/ml (0,5 U/ml) Proteinase K (Sigma) oder 45,4 μg/ml (55,4 U/ml) Trypsin 1:250 (Sigma) oder 1,18 mg/ml (1 U/ml) Dispase (Life Technologies).
Massenspektometrie
Die Massenspektometrie von TGc und TGe erfolgte durch ein matrixgestütztes Laserdesorptionsverfahren mit einem Bruker-Reflex-III-Gerät, ausgestattet mit einen große-Massen-Detektor für eine lineare Detektion. Als Matrix diente Sinapinsäure und die externe Kalibrierung erfolgte mit einfach-, zweifach- und dreifach geladenen Molekülionen von Protein A.
Sera und Patienten
In einer ersten Studie wurden Patienten von den gastroenterologischen Abteilungen der Inneren Medizin oder der Pädiatrie oder der dermatologischenvenerologischen Abteilung der Semmelweis-Universität untersucht. Die Diagnose von CD wurde bestätigt durch jejunale Biopsie, wohingegen DH nachgewiesen wurde durch Hautbiopsie. Von 71 Patienten mit GSE (33 mit DH und 38 mit CD) wurden Serumproben genommen, 26 mit nicht-CD Magendarmerkrankungen (wie zum Beispiel M. Crohn, Nahrungsmittelhypersensitivität, Nahrungsmittelintoleranz, Darminfektion, Refluxoesophagitis, nicht-CD Diarrhöe, Nahrungsmitteldystrophie) und 27 mit anderen Diagnosen wie Autoimmunerkrankungen (systemischer Lupus erythematodes, Diabetes mellitus Typ I), verschiedenen Hauterkrankungen (Pemphigus foliaceus, Ichtyose Urticaria), Cholelithiase, Hepatosplenomegalia, Nanosomia und gesunden Kontrollen. Das mittlere Alter und das Geschlecht der Patienten sind Tabelle I zu entnehmen.
TABELLE 1 Alter (bei Entnahme der Blutprobe in Jahren) und Geschlecht der Patienten
Für die Gewinnung der Daten hinsichtlich der Empfindlichkeit des TGc-ELISAs wurden in der laufenden Studie auch Seren von 16 behandelten Patienten (Patienten auf glutenfreier Diät) mit aufgenommen.
In der Zusatzstudie über GSE-assozierte Autoimmunerkrankungen wurden verwandet Seren von der gastroenterologischen Abteilung der Inneren Medizin oder Pädiatrie, von der dermatolosichen-venerologischen Abteilung der Semmelweis-Universität, von den Abteilungen für Innere Medizin I-IV der Medizinischen Fakultät der Universität Köln und vom Labor für Autoimmunkrankheiten der Wieslab Co., Schweden. Die Serumproben stammten von Patienten mit folgenden Autoimmundiagnosen (Zahl der Patienten in Klammer): GSE (141; hiervon 73 DH, einschließlich 18 auf glutenfreier Diät, und 68 CD, einschließlich 27 auf glutenfreier Diät), Crohn'sche Erkrankung (31), bullöses Pemphigoid (44), Pemphigus vulgaris (57), Kolitis ulcerosa (21), Goodpasture Syndrom (20), Wegener Granulomatose (20), rheumatoide Arthritis (44), SLE (25), progressive systemische Sklerose (7). Seren von Patienten mit Arthritis psoriatica (5) und Hepatitis C (39) wurden gleichfalls untersucht, da diese Krankheiten auch eine Autoimmunkomponente haben können.
Alle Serumproben wurden bei –78°C bis zur Untersuchung gelagert. Unter den Kontrollseren (48) waren einige von gesunden Individuen (21) und einige von Patienten mit Krankheiten, die klar keine Autoimmunkomponente besaßen (27). Alle Serumproben wurden bis zur Untersuchung bei –78°C gelagert.
EMA-Test
Die Serum-IgA-Antikörper wurden durch indirekte Immunofluoreszenz bestimmt (Collin P et al, Scand J Gastroenterol 1992; 27:367–71). Alle Serumproben wurden 1:5 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH: 7,4) verdünnt. Als Antigen dienten 10 μm starke Kryostat-Gewebeschnitte des analwärtigen Teils von Affenoesophagus (aus der Familie der Cercopithecinae). Gebundenes IgA wurde bestimmt durch α-Ketten-spezifisches Fluoresceinisothiocyanat-konjugierte Kaninchen-Anti-Human-IgA-Antikörper (1:40 in PBS, Dako). Alle eingesetzten Seren in dieser ersten Studie waren zweifelsfrei negativ oder positiv für IgA-EMA. In der Zusatzstudie wurden keine EMA-Untersuchungen vorgenommen.
ELISA
Das ELISA-Verfahren war ähnlich dem früher beschriebenen Calcium-aktivierten Test (Dieterich W et al, Gastroenterology 1998; 115:1317–21.; Sulkanen S et al., Gastroenterology 1998; 115:1322–8). In Kürze: eine Mikrotiterplatte (Nunc MaxiSorp) mit 96 Vertiefungen wurde über Nacht bei 4°C (mindestens 9 Stunden) beschichtet mit 1 μg Meerschweinchen-TGc (Sigma) oder human-TGe oder -TGc pro Vertiefung in 100 μl 50 mM Tris/HCl, pH 7,5, enthaltend 5mM CaCl₂. Es erfolgte keine Blockierung. Nach jedem Schritt wurden die Vertiefungen gewaschen mit 50 mM Tris/HCl, das 10 mM EDTA und 0,1 % Tween 20 (TET) enthielt. Die Seren wurden verdünnt auf verschiedene Konzentrationen mit TET, oder auf den Platten 1,5 Stunden bei Raumtemperatur präinkubiert in 50 mM Tris/HCl, 0,1 % Tween 20 und verschiedene Konzentrationen TGc oder TGe oder Meerschweinchen-TG. Gebundenes IgA wurde nachgewiesen durch eine Stunde Inkubation bei Raumtemperatur mit Peroxidase-konjugierten Anti-Human-Antikörpern (Dako), verdünnt 1:4000 in TET. Die Farbentwicklung erfolgte 5 Minuten bei Raumtemperatur mit 100 μl 60 μg/ml 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin-Substrat in 100 mM Natriumacetat, pH 6,0, 0,015% H₂O₂. Die Reaktion wurde durch Zusatz von 100 μl 20%iger N₂SO₄ gestoppt. Die Absorption wurde mit einen ELISA-Ausleser bei 450 nm gemessen.
Die in dem Versuch eingesetzten Proteinmengen und Serumkonzentrationen wurden optimiert. Alle Serumproben wurden dreifach untersucht. Auf allen Platten waren Triplikate der negativen und positiven Referenzseren und ein blanker Puffer. Die Antikörperkonzentrationen sind in willkürlichen Einheiten (AU) angegeben, d.h. als Prozentsatz der positiven Referenzseren.
Um den Einfluss der Calciumaktivierung auf die Daten zu bestimmen, wurde in einem Versuch Human-TGc ohne Calciumchlorid im Beschichtungspuffer eingesetzt.
Inhibierungs-ELISA
Es wurden die Serum-IgA-Spiegel gegen TGe mit denen gegen TGc verglichen. Es wurden vier Seren von Patienten mit CD oder DH untersucht, von denen man bereits wusste, dass sie leicht erhöhte (1 Serum), moderat erhöhte (1 Serum) oder stark erhöhte (2 Seren) IgA-Antikörperspiegel gegen TGc besaßen. Die Blockierungsversuche erfolgten durch 60-minütiges Präinkubieren der Seren bei Raumtemperatur mit einer Reihenverdünnung von 1:250 bis 1:32000 in 50 mM Tris/HCl, 0,1 % Tween 20 mit 1 μg TGe oder TGc. Es wurde eine Serumverdünnung gewählt, bei der der größte Unterschied erfasst wurde zwischen den Antikörper-Titern der Seren mit und ohne Präinkubation. Im nachfolgenden Inhibierungsversuch wurden die vier Seren bei dieser Verdünnung in 50 mM Tris/HCl, 0,1% Tween-20 60 Minuten bei Raumtemperatur mit einer Verdünnungsreihe präinkubiert, die von 0 bis 4 μg TGc oder Tge reichte.
Statistik
Die optische Dichten (und somit Titer in AU-Werten) zeigten keine Gauss'sche Verteilung, so dass wir für die statistische Beschreibung von den Titern der verschiedenen Patientengruppen Mediane mit 95%igen Vertrauensintervallen (95% CI) verwenden (Gardner MJ & Altman DG, Statistics with confidence-confidence intervals and statistical guidelines. London: British Medical Journal, 1989:28 pp.) und zum Vergleich den nicht-parametrischen zweiseitigen Test unverbundener Stichproben nach Mann-Whitney (Werner J. Biomathematik und Medizinische Statistik, 2. Auflage München-Wien-Baltimore, Urban & Schwarzenberg, 1992:53, pp.) Für die Beschreibung der Korrelation zwischen den Titern wurde der Spearman'sche Korrelationskoeffizient mit 95% CI verwendet und eine Korrelationsanalyse für unverbundene Werte einer Nicht-Normalverteilung (Gardner & Altman, 1989; Werner, 1992).
Der Vergleich der Titer mit dem calciumaktivierten und mit dem inaktivierten Human-TGc-ELISA erfolgte mit dem Wilcoxon'schen zweiseitigen Vorzeichenrang (Werner, 1992). Für die Beschreibung und den Vergleich der zwei ELISA-Systeme wurden die ROC-Kurven (Receiver Operating Characteristic Curves) und die Flächen unter den ROC-Kurven (AUC) mit 95% CI dargestellt. Für die Berechnung der Vertrauensintervalle aus den AUC wurde neben den zumeist verwendeten Verfahren auch das Bootstrap-Verfahren verwandt, das fehlerkorrigierende und beschleunigte (BCA) Confidence-Intervallverfahren, da es geeigneter ist bei der Beschreibung von Vertrauensintervalle des AUC, die sehr nahe am Maximum (1,0) liegen (DeLong ER et al., Biometrics 1988; 44:873–45; Mossman D., Med Decis Making 1995; 15_358–66; Hellmich M. Receiver operating characteristic (ROC) Kurven und Flächen darunter. [PhD thesis] 1996. http://www.medizin.-uni-koeln.de/kai/imsie/homepages/Martin.Hellmich/dr.html (aufgenommen Juni 1999).
BEISPIELE
Rekombinantes human-TGc
Das humane TGc wurde in der humanen embryonalen Nierenzelllinie EBNA-293 als Fusionsprotein mit einem Strep II-Tag exprimiert. Das Protein wurde in einem Schritt durch Affinitätsbindung an eine StrepTactin-Säule aufgereinigt. Durch Waschen mit Desthiobiotin wurde das Protein als einzelne Bande mit einem scheinbaren Molekülgewicht von 89 kDa (1A) eluiert, wenn auf einem Coomassie-gefärbten SDS-PAGE bestimmt. Die Westernblotanalyse zeigte, dass die Bande mit monoklonalen Anti-TGc-Antikörpern reagierte (1 b). Die Säule band nahezu alles markierte Protein und es war keine Immunoreaktivität im Durchfluss festzustellen (1 B). Die Ausbeute eines Lysats konfluenter Monolayer-Zellen in einer Zellkulturschale mit 13 cm Durchmesser betrug etwa 200 μg. Die berechnete Molekülmasse der Sequenz für humanes TGc ist 77,3 kDa. Die berechnete Molekülmasse des Fusionsproteins (TGc mit einem carboxyterminalen Tag von 10 Aminosäuren) ist 78,4 kDa. Die Massenspektrometrie des Fusionsproteins ergab eine Molekülmasse von 78,3 kDa. In den Zelllysaten war die Aktivität des exprimierten Human-TGc 4,7mal höher als die Hintergrundaktivität der in nicht-transfektierten 293-EBNA-Zellen vorhandenen Transglutaminasen. Das frisch aufgereinigte Human-TGc zeigte ähnliche oder höhere Aktivität als das Meerschweinchen-TGc von Sigma.
Eigenschaften des human-TGc-ELISA
Die optimale Beschichtungskonzentration mit Human-TGc betrug 1 μg pro Vertiefung. Wurden hochpositive Seren von vier Patienten für die Kalibrierung eingesetzt, so wurde eine logarithmisch lineare Kurve zwischen den Verdünnungen 1:250 und 1:32000 gefunden. Die vier negativen Seren gaben ein geringes Signal bei niedrigen Verdünnungen (> 1:500). Einige positive Seren besaßen ein Signalplateau bei einer Verdünnung von 1:250 oder geringer. Das Verhältnis zwischen den mittleren OD-Werten von positiven und negativen Ergebnissen bei der Verdünnung 1:250 war 1:6, bei höheren Verdünnungen hingegen mehr als 1:10. Es wurde somit eine Serumverdünnung von 1:250 im Assay verwandt. Eine positive und eine negative Bezugsserumprobe wurde im Assay mit aufgenommen, um so die Assayeigenschaften zu kontrollieren. Das positive Serum wurde als "Standard" eingesetzt, und die Werte für die optische Dichte wurden als prozentuale willkürliche Einheiten (AU) des Standardserums berechnet. Die mittleren Intra- und Interassaykoeffizienten für die Variation des Standardserums waren 1,3 bzw. 13,7%. Die mittleren Intra- und Interassaykoeffizienten für die Variation des Human-TGc-ELISAs waren 3,2% (n=124) bzw. 9,2 % (n=15).
Die Median-Antikörperkonzentrationen bei Patienten mit unbehandelter GSE (CD oder DH) war 61,4 AU (n=55,95%) CI: 45,1 bis 78,5), für die Kontrollen 12 AU (n=53,95% CI: 10.8 bis 13). Der Unterschied war signifikant (p<0,0001). Bei den behandelten Patienten war der Median der Antikörperkonzentrationen 48,1 AU (n=16,95%, CI: 20,8 bis 85,6), für die Kontrollen mit Magen-Darmerkrankungen 12,1 AU (n=26,95%, CI: 9,8 bis 14,7), für die gesunden Individuen und die Kontrollen mit anderen Diagnosen 12 AU (n=27.95%, CI: 10.7 bis 13,0). Die Fläche unter der ROC-Kurve war 0,999 (95%, CI: 0,996 bis 1,001; 95% CI mit BC_a-Verfahren: 0.990 bis 1,0) (2)
Ein Cut-Off-Wert von 18 AU wurde gewählt und die Seren mit Antikörperkonzentrationen gleich oder höher 18 AU wurden als Human-TGc-ELISA-positiv markiert. Dieser Cut-Off-Wert ergibt eine Spezifität und eine Sensitivität von 98,1% (95% CI: 95,7 bis 100%) und 98,2% (95% CI: 95,9 bis 100%) bzw. (behandelte Patienten wurden ausgeschlossen). Das Zusammenfallen von Human-TGc-Assay mit den klinischen Diagnosen, ausgenommen behandelte Patienten, war 106/108 (98,1%), weil ein falschpositives und ein falschnegatives Ergebnis (3) vorhanden waren.
Rekombinantes human-TGe
Das human-TGe wurde in humanen embryonalen Nierenzellen EBNA-293 als Fusionsproenzym mit dem Strep-II-Tag exprimiert. Das Protein konnte in einem Schritt durch Affinitätsbindung an eine StrepTactin-Säule aufgereinigt werden. Nach der Elution mit Desthiobiotin war eine einzelne 60 kDa Bande im SDS-PAGE (9) zu sehen. Diese reagierte mit monoklonalen Antikörpern gegen den Strep II-Tag (10, Spur II). Die Säule band nahezu alles markierte TGe und es war keine Immunreaktivität im Durchfluss festzustellen. Die Ausbeute aus dem Lysat einer konfluenten Zellmonolayer in einer Zellkulturschale mit 13 Durchmesser war etwa 200 μg. Die aus der Sequenz für humanes TGe-Proenzym berechnete Molekülmasse ist 76826 Da. Die berechnete Molekülmasse des Fusionsproteins (TGe-Proenzym mit einem carboxyterminalen Tag von 10 Aminosäuren) ist 78011 Da. Die Massenspektrometrie des Fusionsproteins ergab eine Molekülmasse von 77765 Da. In den Zelllysaten war die Aktivität des exprimierten Human-TGe 2,5 mal höher als die Hintergrundaktivität der in nicht-transfektierten 293-EBNA-Zellen vorhandenen Transglutaminasen. Frisch aufgereignetes menschliches TGe-Proenzym besaß das 1,40 bis 1,80fache der Aktivität von TGc. Wenn diese mit verschiedenen Proteasen (Proteinase K, Trypsin oder Dispase) aktiviert wurde, war sie ähnlich oder sogar höher als die Aktivität von TGc.
Eigenschaften des Human-TGe-ELISA
GSE-Seren, die erhöhte IgA-Antikörperspiegel gegen human-TGc zeigten, besaßen auch erhöhte IgA-Titer gegen Human-TGe, wohingegen Seren, die nicht mit Human-TGc reagierten, auch nicht mit Human-TGe reagierten (11). Die Antikörpertiter für TGe waren in den meisten Fällen geringer als für TGc (11).
Inhibierungs-ELISA
Die Präinkubation der GSE-Seren mit Human-TGc oder Human-TGe inhibierten die IgA-Reaktivität auf einer ELISA-Platte, die mit Human-TGc (12) beschichtet war. Die Ergebnisse stützen, dass Serum-IgA-Antikörper aus Patienten mit CD oder DH sowohl Human-TGc als auch dem TGe reagieren, wenngleich die Titer für TGe geringer sind. Sowohl TGc als auch TGe inhibieren die Reaktion der Serum-IgA-Antikörper mit TGc. Zumindest ein Teil der Serum-Antikörper aus Patienten mit CD und DH sind gegen Epitope gerichtet, welche auf beiden Transglutaminasen zu finden sind.
Eigenschaften des Meerschweinchen-TGc-ELISAs
Die optimale Beschichtungskonzentration mit Meerschweinchen-TGc war 1 μg pro Vertiefung und die optimale Serumverdünnung 1:250, wie beim Human-TGc-ELISA. Alle Assays wurden gleichzeitig parallel zum Human-TGc-Assay durchgeführt und es wurden die gleichen Serumproben und Serumverdünnungen eingesetzt. Die mittleren Intra- und Interassaykoeffizienten für die Variation des Standardserums waren 2,2 % bzw. 9 %. Die Intra- bzw. Interassaykoeffizienten für die Variation des Meerschweinchen Elisa waren 2,8% (n=124 und 12,8)/15).
Der Median der Antikörperkonzentrationen bei Patienten mit unbehandelter GSE (CD oder DH) war 51,8AU (n=55,95% CI: 34.2 bis 63); für die Kontrollen 8 AU (n=53,95% CI: 7,3 bis 8,9). Der Unterschied war signifikant (p<0,0001). Bei den behandelten Patienten war der Median der Antikörperkonzentrationen 18 AU (n=16,95% CI: 9,2 bis 69,9); für die Kontrollen mit Magen-Darm-Erkrankungen 7,5 AU (n=26,95% CI: 9.6 bis 69,9); für gesunde Individuen und Kontrollen mit anderen Diagnosen 8,5 AU (n=27,95% CI: 7,2 bis 10,3). Die Fläche unter der ROC-Kurve war 0,980 (95% CI: 0,958 bis 1,002; 95% CI mit dem BC_a-Verfahren: 0,943 bis 0,993) (4).
Es wurde ein Cut-Off-Wert von 14 AU gewählt und Seren mit Antikörperkonzentrationen gleich oder höher 14AU wurden markiert als Meerschweinchen-TGc-ELISA positiv. Dieser Cut-Off-Wert ergab (mit Ausnahme behandelter Patienten) eine Spezifität und Sensitivität von 96,2% (95% CI: 92,8 bis 99,6%) bzw. 92,7% (95% CI: 88,1 bis 97,3%). Die Koinzidenz von Meerschweinchen-TGc-Assay mit den klinischen Dia gnosen (ausgenommen behandelte Patienten) war 102:108 (94,4%), bei 2 falschpositiven und 4 falschnegativen Ergebnissen. (5)
Wirkung der Calciumaktivierung
Es wurden 32 Serumproben mit und ohne Calciumaktivierung im ELISA auf IgA-Anti-HumanTGc-Antikörper getestet. Die Gesamtantikörpertiter unterschieden sich nicht signifikant (p=0,27). Jedoch waren Seren mit Anti-TGc-Titer unterhalb 30 AU im calciumaktivierten Assay signifikant weniger als im Assay ohne Calciumaktivierung (n=18, p=0,009), wohingegen die höheren Titer sich nicht signifikant unterschieden (n=14, p=0,35).
Vergleich von EMA mit TGc-ELISA
Alle Patienten mit EMA-positiven Seren hatten GSE (55/56, 98,2%). Ausgenommen hiervon waren behandelte Patienten und zusätzlich ein falschpositives Ergebnis. 12 von 16 (75%) der behandelten Patienten mit GSE waren EMA-positiv. Vergleicht man nur die unbehandelten EMA-positiven Fälle, so fallen die Ergebnisse mit Human- und Meerschweinchen-TGc-ELISA beim EMA-Test in 54 von 56 Fällen (96,4%) bzw. 51 von 56 Fällen (91,1%) zusammen. Das falschpositive Serum im EMA war negativ sowohl imHuman- als auch im Meerschweinchen-TGc-ELISA. Das eine falschnegative Serum im human-TGc-ELISA war auch negativ im Meerschweinchen-TGc-ELISA. Die 12 Patienten auf komplett glutenfreier Diät mit EMA-Positivität waren zudem in beiden ELISA-Systemen mit vorhandenen anti-TGc-IgA-Spiegeln positiv.
Alle EMA-negativen Patienten waren entweder behandelte Patienten mit GSE oder Patienten ohne GSE. Vergleicht man nur die unbehandelten EMA-negativen Fälle, so fallen die Ergebnisse im Human- und Meerschweinchen-TGc-ELISA zusammen mit dem EMA-Test in 52 von 53 (98.1 %) bzw. 51 von 53 (96,2%) Fällen. Das eine falschpositive Serum im Human-TGc-ELISA war auch falschpositiv im Meerschweinchen-TGc-ELISA; daneben wurde noch ein weiteres falschpositives Serum im Meerschweinchen-Assay erfasst. Beide falschpositiven Seren waren Patienten mit M. Crohn. Die vier EMA-negativen Patienten mit behandelter GSE waren auch negativ im Meerschweinchen-TGc-ELISA, aber keiner von diesen war positiv im Human-TGc-ELISA. Die Gesamtkoinzidenz zwischen EMA-Test und Human- bwz. Meerschweinchen-ELISA war 120/124 96,8%) bzw. 117/124 (94,4%).
Vergleich von Human-TGc-ELISA und Meerschweinchen-TGc-ELISA
Die Ergebnisse der beiden ELISAs stimmten überein in 119 von 124 getesteten ELISAs (96%). In den auseinanderlaufenden Fällen war der Human-Assay empfindlicher als der Meerschweinchen-Assay. Der Human-Assay lieferte also positive Ergebnisse. Eines war ein EMA-negativer CD-Patienten auf glutenfreier Diät. Im fünften uneinigen Fall gab der Meerschweinchen-ELISA ein falschpositives Ergebnis bei einem Patienten mit M. Crohn. Der Antikörpertiter war jedoch auch (17,5 AU) im Human-TGc-ELISA hoch und erreichte fast den Cut-Off-Wert (18AU).
Die falschen Ergebnisse im Human-TGc-ELISA stimmten mit denen des Meerschweichen-TGc-ELISAs überein. Beide Assays erfassten nicht das Serum eines EMA-positiven CD-Patienten und beide erkannten einen Patienten mit M. Crohn als positiv. Beide Assays lieferten negative Ergebnisse bei einem falsch-EMA-positiven Patienten.
Die Werte der beiden Assays korrelierten gut (r_b=0,9377, 95% CI: 0,9121–0,9559, p<0,0001), die Korrelation war theoretisch exponentiell, aber in der Praxis linear, mit einem Exponenten von 1,05 (8). Der Unterschied zwischen den Flächen unter den ROC-Kurven war 0,019 (95% CI: –0,002–0,40; 95% CI mit BC_a-Verfahren: 0,005–0,056).
Rekombinantes human-TGe
Das Human-TGe wurde in der humanen embryonalen Nierenzelllinie EBNA-293 exprimiert und zwar als Fusionsprotein mit dem Strep-II-Tag. Das Protein konnte in einem Schritt durch Affinitätsbindung an eine StrepTactin^TM-Säule aufgereinigt werden. Die Elution mit Desthiobiotin lieferte ein Protein mit einer einzelnen 80 kDa Bande im SDS-PAGE (9), die von monoklonalen Antikörpern gegen den Strep-II-Tag (10) erkannte wurd. Die Säule band nahezu alles markierte TGe. Im Durchfluss blieb keine sichtbare Immunreaktivität. Die Ausbeute des Lysats von konfluenten Monolayerzellen in einer Zellkulturschale mit 13 cm Durchmesser war etwa 200 μg. Die berechnete Molekülmasse der Sequenz des Human-TGe-Proenzyms ist 76826 Da. Die berechnete Molekülmasse des Fusionsprotein (TGe-Proenzym mit einem carboxyterminalen Marker von 10 Aminosäuren) ist 78011 Da. Die Massenspektrometrie des Fusionsproteins ergab eine Molekülmasse von 77765 Da. In den Zelllysaten war die Aktivität des exprimierten Human-TGe 2,5 mal höher als die Hintergrundaktivität der in nicht-transfektierten 293-EBNA-Zellen vorhandenen Transglutaminasen. Das frisch aufgereinigte Human-TGe-Proenzym besaß 1,40 bis 1,80 mal die Aktivität von TGc und zeigte eine ähnliche oder höhere Aktivität als TGc bei einer Aktivierung mit verschiedenen Proteasen (Proteinase K, Trypsin oder Dispase).
Diskussion der Beispiele und Ergebnisse
Unseres Wissens wurde human-TGc noch nie zuvor in Säugetierzellen über DNA-Rekombinationsverfahren exprimiert. Wir verwendeten menschliche Zellen anstelle von Bakterien aus zwei Gründen. Erstens kann nicht die Möglichkeit von posttranslationalen Modifikationen des TGc ausgeschlossen werden, selbst wenn es hierfür keine Beweise gibt. Derartige Modifikationen erfolgen mit höchster Wahrscheinlichkeit nicht in Bakterien. Zweitens, wenn Chaperone für eine korrekte Faltung der Proteine notwendig sein sollten, so sind diese mit höherer Wahrscheinlichkeit in menschlichen Zellen vorhanden.
Die Molekülmasse von Meerschweinchen-TGc unterscheidet sich nur geringfügig (0,1 kDa) von der des Human-TGc, wenn durch Massenspektrometrie gemessen, aber das Meerschweinchen-TGc läuft erheblich schneller auf einem SDS-PAGE als Human-TGc. Das TGc aus humanen Fibroblasten läuft mit gleicher Geschwindigkeit wie unser Fusionsprotein, wenngleich ein Unterschied von 1,2 kDa besteht. Diese Beobachtungen lassen vermusten, dass der Unterschied zwischen den Strukturen des Human- und des Meerschweinchen-TGc größer sind als dies die Übereinstimmung in den Aminosäuresequenzen nahelegt. Das Human-TGc kann als Fusionsprotein mit einem Strep-II-Tag sehr wirksam in einem Schritt aufgereinigt werden. Man erhält hierbei auf einem Coomassie-gefärbten Gel nur eine Bande. Diese Proteinbande konnte klar im Immunoblot als Gewebstransglutaminase identifiziert werden. Die Massenspektrometrie gab die erwartete Molekülgröße. Das aufgereinigte rekombinante Human-Protein besaß Transglutaminaseaktivität. Es ist nicht bekannt, ob das Human-TGc die gleiche katalytische Aktivität besitzt wie das Meerschweinchenenzym. Unser aufgereinigtes Protein besaß gleiche oder höhere Aktivität als die gleiche Menge Meerschweinchen-TGc aus Leber. Wir schließen daher, dass das von uns im Assay verwendete Protein das gereinigte aktive Human-TGc mit einem C-terminalen Strep-II-Tag war.
Die in dem Versuch eingesetzte Meerschweinchen-TGc-Präparation aus Leber enthielt weitere Proteinverunreinigungen, mit monoklonalen Anti-TGc-Antikörpern nicht immunoreaktiv waren. Dennoch konnte sie von den Autoren in der Ursprungsform erfolgreich eingesetzt werden. Man brauchte sie nicht weiter aufreinigen. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass in einigen der Mikrotitervertiefungen die Immunopositivität von einer Reaktivität gegen diese Verunreinigungen herkamen.
Sulkanen und Mitarbeiter (Sulkanen S et al., Gastroenterology 1998; 115:1322–8) zeigen, dass Calcium im Beschichtungspuffer bei Konzentrationen, die für eine Aktivierung von Meerschweinchen-TGc geeignet sind, bessere Testergebnisse geben als bei einer spezifischen Erfassung von TGc durch Antikörper. Die Autoren erklären ihre Beobachtung durch eine Konformationsänderung während der Calciumaktivierung, aber nach dem Beschichten entfernen sie das Calcium durch Waschen und dann verwenden sie eine hohe Konzentration EDTA, so dass die Antikörper-Antigen-Reaktionen in Abwesenheit von Calcium erfolgt. Es wird daher angenommen, dass die Konformationsänderung von den immobilisierten TGc-Moleküle nach dem Entfernen des Calciums beibehalten wird. Neben den Konformationsänderungen, die durch das Beschichten unwahrscheinlich irreversibel werden, gibt es aber auch noch weitere mögliche Erklärungen für diesen Effekt. Das TGc kann als sein eigenes Substrat wirken und es kann sich selbst quervernetzen zu Proteinkomplexen mit höherem Molekulargewicht (Birkbichler PJ et al, Biochem Biophys Res Commun 1977; 87:1–7). Dies tritt wahrscheinlich in den Vertiefungen auf, wo die Konzentration an TGc ungefähr gleich ist der Aktivität des Assays. Somit werden nicht nur TGc-Monomere sondern auch TGc-Komplexe in den ELISA-Vertiefungen immobilisiert, und dies kann die Bindung von Antikörpern begünstigen, was ein höheres Signal gibt. Zusätzlich können quervernetzte TGc-Komplexe neue Antigenepitope bilden, die von denen des TGc-Monomers verschieden sind. Diese Hypothese stützt sich auf der Beobachtung, dass die Präinkubation von CD-Seren mit calciumaktivierten Meerschweinchen-TGc wirksam die Reaktivität in den ELISAs blockiert. Aber wenn man denselben Blockierungseffekt mit inaktivierten Meerschweinchen-TGc erzielen will, ist eine Präinkubation mit einer zehnfachen Menge erforderlich.
Sulkanen und Mitarbeiter (Sulkanen S et al., Gastroenterology 1998; 115:1322–8) veränderten das ursprüngliche Verfahren von Dieterich W et al, Nature Medicine 1997;3(7):797:801) nicht nur, in dem sie eine Calciumaktivierung verwenden, sondern auch durch eine Veränderung des Puffers und durch das Weglassen des Blockierens. Sie zeigen keine Daten, welche der Komponenten für die besseren Assayeigenschaften verantwortlich ist. Wir testeten einige positive und negative Seren mit und ohne Calciumaktivierung des Human-TGc und wir konnten signifikanten Veränderungen in den Gesamteigenschaften des Assays finden. Dies legt nahe, dass neben Calcium weitere Faktoren für die Aktivierung des Meerschweinchen-TGc-Assays wichtig sind. Da jedoch die optischen Dichten der EMA-positiven Seren mit Anti-TGc-Spiegeln von weniger als 30 AU im calciumaktivierten Assay signifikant niedriger waren oder sogar negativ im Assay ohne Calciumaktiverung, verwendeten wir auch im Assay mit Human-TGc Calcium.
Die Cut-Off-Werte für die ELISAs wurden auf Grundlage des ROC-Analysen der Versuche gesetzt. Es konnte kein Cut-Off-Wert gefunden werden, welcher eine perfekte Trennung von Individuen mit und ohne GSE erlaubt, wenngleich die Koinzidenz mit der Diagnose durch Biopsie in beiden Versuchen hoch ist. Der Meerschweinchen-TGc-ELISA erfasste nicht zwei unbehandelte Patienten mit DH und einen unbehandelten Patienten mit CD, der aber vom Human-TGc-ELISA erfasst wurde. Die 95% Vertrauensintervalle von den Sensitivitäten der beiden ELISAs überlappen. Der Sensitivitätsunterschied muss daher durch weitere Untersuchungen bestätigt werden. Die Ergebnisse bestätigen die Annahme, dass einige Antikörper gerichtet sind gegen Epitope von Human-TGc, die in Meerschweinchen-TGc nicht konserviert sind. Ein Serum aus einem CD-Patienten mit klarer EMA-Positivität war nicht in beiden ELISAs immunreaktiv und die Spiegel lagen so weit unterhalb des Cut-Offs, dass das Ergebnis nicht zufällig war. Es ist denkbar, dass das TGc nicht das einzige Autoantigen der GSE ist, sondern dass in einigen seltenen Fällen, selbst wenn der EMA positiv ist, keine Antikörper gegen TGc vorhanden sind. Dies wird gestützt auch durch die Beobachtung, dass eine Immunabsorption der IgA-Anti-TGc-Autoantikörpern durch Meerschweinchen-TGc nicht vollständig die Anti-Endomysium-Aktivität verdrängen kann (Lock RJ et al, Clin Exp Immunol 1999; 116:258–62), wenngleich diese Versuche mit calciumaktivierten human-TGc wiederholt werden müssen, da nicht alle Patientenantikörper mit dem Meerschweinchenantigen kreuzreagieren.
Der EMA-Test gab falschpositive Werte bei einem achtjährigen Mädchen mit transienter Diarrhöe (Februar 1998). Mehrfache EMA-Tests zeigten eine Bindung von IgA in den intrazellulären Räumen der glatten Muskelzellen. Die jejunale Histologie war negativ auf GSE, und die Diarrhöe trat nicht wieder auf. Die Tatsache, dass das Serum falschpositiv im EMA-Test war, aber richtig diagnositiziert werden konnte von den beiden ELISAs, unterstreicht die Möglichkeit einer EMA-Posititvität aufgrund von Antigenen, die nicht TGc sind.
Es ist interessant, dass bei zwei EMA-negativen Patienten mit Crohn'scher Erkrankung die TGc-Antikörpertiter oberhalb des Cut-Off-Wertes im Meerschweinchen-TGc-ELISA lagen. Einer hiervon auch im human-TGc-ELISA. Zöliakie und Crohn'sche Erkrankung sind für den gleichen Patienten vorbeschrieben (Gillberg R et al, Scand J Gastroenterol 1982; 17:491–6). Dieses Zusammentreffen ist aber sehr selten. In unseren beiden Fällen konnte zwar eine Zöliakie nicht ausgeschlossen werden, aber beide Titer lagen an der Grenze (21,6 und 17,5 AU im Human-TGc-ELISA, 15,9 und 17,8 AU im Meerschweinchen-ELISA). Die höheren Titer können auch von einer niedrigen IgA-Anti-TGc-Autoantikörperproduktion bei der Crohn'schen Erkrankung herrühren denn von einer aktiven Zöliakie. Diese Spekulation beruht auf der Tatsache, dass in beiden ELISA-Systemen die Mediane der Patiententiter mit Crohn'scher Erkrankung höher lag als bei den gesunden Individuen und den Patienten mit anderen Magen-Darm- oder Nicht-Magen-Darmerkrankungen. Die Unterschiede jedoch und die Zahl der geprüften Patientenseren waren jedoch in der vorliegenden Studie zu klein, als dass wir die Signifikanz dieses Befunds bewerten könnten.
Patienten auf komplett oder unvollständig glutenfreier Diät besaßen ein weites Spektrum an Antikörpertitern, und das Ergebnis der ELISAs war in guter Übereinstimmung mit denen der EMA-Tests. Der ELISA mit dem humanen Antigen war jedoch etwas sensitiver als der EMA-Test oder der Meerschweinchen-ELISA und erkannte einen EMA- und einen Meerschweinchen-ELISA negativen Patienten als positiv.
Verglichen zu anderen etablierten Systemen erwies sich der Human-TGc-ELISA als spezifischer und sensitiver als der EMA-Test und somit überlegen zum Meerschweinchen-TGc-ELISA. Die Ergebnisse zeigen einen hohen diagnostischen Wert für alle geprüften Systeme in dieser Untersuchung, aber auch insbesondere für den Human-TGc-ELISA. Dieser besaß perfekte Sensitivität und Spezifität und besitzt nicht die Nachteile des EMA-Tests. Wir vermuten, dass ein ELISA auf der Basis von Human-TGc die Methode der Wahl sein wird für einfache, nichtinvasive Reihenuntersuchungen und Diagnosen von GSE.
Die in 6 und 7 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass IgA gegen Human-Gewebetransglutaminase auch bei Autoimmunerkrankungen nachgewiesen werden kann, die keine glutensensitive Enteropathien sind. Die positiven Ergebnisse mit dem Human-TGc-ELISA bei Patienten mit anderen Autoimmunerkrankungen als CD und DH beruht höchstwahrscheinlich nicht darauf, dass diese Patienten eine aktive GSE besitzen. Es ist in der Tat sehr unwahrscheinlich, dass mehr als ein Viertel aller Autoimmunerkrankten mit GSE zusammenhängen, selbst wenn dies in einigen Fällen denkbar ist, wo die Titer sehr hoch sind und die Versuche eine reale Assoziierung zeigen. Von Zöliakie wird beschrieben, dass sie mit verschiedenen Autoimmunerkrankungen gemäß Tabelle 2 einhergeht.
TABELLE 2 Autoimmun-(AI)-Erkrankungen, die mit GSE einhergehen
Ein Teil dieser Zusammentreffen sind nachgewiesen, andere anekdotisch.
Es ist bekannt, dass GSE eine T-Zellen vermittelte Entzündung der duodenojejunalen Bauchregion mit verschiedenenen Resorptionsstörungen hervorrufen kann (Übersichtsartikel siehe Trejdosiewicz LK et al, Clin Gastr 1995; 9:251–72). Letzteres führt zu schmerzhaften Diarrhöen, sideropensichen Anemien, Hypoproteinemie, Osteoporose, Amenorrhöe, Hypovitaminosen und bei Kindern zu einem Zurückbleiben im Wachstum und in der Entwicklung (für eine Übersicht, siehe Corazza GR, Gasbarrini G Coeliac disease in adults. Bailliere Clin Gastr 1995; 9:329–50, Littlewood JM. Coelica disease in childhood. Bailliere Clin Gastr 1995; 9:295–328). Neben diesen direkten Konsequenzen führt eine bleibende Erkrankung zu einer Prädisponierung für verschiedene Autoimmunerkrankungen wie Diabetes Typ I und Erkrankungen wie die duodenojejunalen Lymphone. Die klinischen Zeichen und Symptome von DH betreffen hauptsächlich die Haut (polymorphische juckende Pusteln mit darunter liegenden Erythemen, die in der Regel über den außenliegenden Flächen von großen Gelenken liegen), wohingegen die gastroentrologischen Symptome oft mild sind und klinisch völlig abwesend. Jedoch kann eine entzündliche Dünndarmveränderung oft bei histologischen Untersuchungen gefunden werden, wo keine klinischen Zeichen oder Symptome für eine jejunale Pathologie vorhanden waren. Die Enteropathie bei DH ist morphologisch, klinisch und funktionell identisch mit der von CD, was eine identische oder ähnliche Ätiologie nahelegt und Krankheitsmechanismen für beide dieser zwei Formen von GSE nahelegt.
Unsere Ergebnisse zeigen jedoch eine allgemeine Rolle von TGc und anderen Transglutaminasen in Autoimmunvorgängen. Es sollten positive Ergebnisse für TGc-IgA in Patienten, die an anderen Autoimmunerkrankungen leiden, nicht allein im Ergebnis als eine Basis für die Diagnose von GSE genommen werden. Andererseits können Antikörper gegen TGc und andere Transglutaminasen wie TGe als Marker dienen für Patienten, die an anderen Autoimmunerkrankungen des GSE-Typs leiden und auch zu einer Definierung von Untergruppen mit Patienten innerhalb dieser Krankheitsgruppen.
Wir stellen somit ein neues Verfahren bereit zur Diagnose von Autoimmunerkrankungen des GSE-Typs oder die mit einer glutensensitiven Enteropathie verbunden sind, im Wesentlichen umfassend das Prüfen einer Probe auf Autoantikörper gegen Human-Gewebstransglutaminase oder andere Glutaminasen. Hierdurch können Autoimmunerkrankungen, die keine Zöliakie sind, diagnostiziert und unterschieden werden, insbesondere Dermatitis herpetiformis Duhring, Addisonsche Erkrankung, AI haemolytische Anämie, AI thrombozytopenische Purpura, AI Schilddrüsenerkrankung, atrophische Gastritis – perniziöse Anämie, IgA-Nephropathie oder IgA-Glomerulonephritis, Myasthenia gravis, partielle Lipodystrophie, Polymyositis, primäre biliäre Zirrhose, primäre sklerotische Cholangitis, chronische Perikarditis, rezidive Polychondritis, rheumatoide Arthritis, Rheuma, Sarcoidose, Sjögren Syndrom, SLE, Milzatrophie, Type-I (Insulinabhängige) Diabetes mellitus, andere Arten von Diabetes mellitus, Vasculitis (sowohl systemisch als auch kutan), Vitiligo sowie Autoimmunerkrankungen, die einhergehen mit weiblicher Unfruchtbarkeit (Collin et al, Gut, 1996: 39, 382–384), erhöhten Risiko eines Aborts (Smecul et al., Eur. J. Gastr. & Hep. 1996; 8(1), 63–67) oder reduziertem Fötenwachstum aufgrund der Autoimmunerkrankung vom GSE-Typ oder latenter nicht-aktiver GSE.

Claims

Proteinbindungsassay zur differentiellen Diagnose von Autoimmunerkrankungen, die den Nachweis von Antikörpern gegen Transglutaminase beinhalten, dadurch gekennzeichnet, dass der Proteinbindungsassay mindestens zwei verschiedene Transglutaminase-Antigene umfasst, ausgewählt aus Gewebstransglutaminase (TGc), TGk, Tge, TGx, FXIIIA und Bande 4.2.
Proteinbindungsassay nach Anspruch 1, umfassend Transglutaminase-Antigen von zwei verschiedenen Spezien.
Proteinbindungsassay nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Transglutaminase-Antigen ein rekombiniertes Fusionsprotein oder ein Fragment davon ist.
Proteinbindungsassay nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Bindungsassay ein Immunassay ist, ausgewählt aus RIA, EIA/ELISA, LiA und FIA.
Proteinbindungsassay nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Bindungsassay ein Sandwich-Immunassay ist, ausgewählt aus IRMA, IEMA/EIA, ILMA (Immunlumineszenzassay) und IFMA (Immunfluoreszenzassay).
Verfahren zur differentiellen Diagnose von Autoimmunkrankheiten des Typs GSE oder die mit einer Gluten-sensitiven Enteropathie assoziiert sind, umfassend den Einsatz eines Proteinbindungsassays nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und das Prüfen einer Probe auf Antikörper gegen Human-Gewebstransglutaminase (TGc) und mindestens ein weiteres der vorgenannten Transglutaminase-Moleküle.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Autoimmunerkrankung Dermatitis herpetiformis (Morbus Duhring) ist.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Autoimmunerkrankung gewählt ist aus Addison'sche Erkrankung, AI hämolytische Anämie, AI thrombocytopenische Purpura, AI Schilddrüsenerkrankungen, atropische Gastritis, perniziöse Anämie, Chron'sche Erkrankung, Kolitis ulcerosa, Goodpasture Syndrom, IgA Nephropathie oder IgA Glomerulonephritis, Myasthenia gravis, partielle Lipodystrophie, Polymyositis, primäre biliäre Zirrhose, primäre sklerotische Cholangitis, progressive systemische Sklerose, chronische Perikarditis, rezidive Polychondritis, rheumatoide Arthritis, Rheuma, Sarcoidose, Sjögren Syndrom, SLE, Milzatrophie, Typ-I (insulinanhängiger) Diabetes mellitus, andere Arten von Diabetes mellitus, Wegener's Granulomatosis, Kolitis ulcerosa, Vaskulitis (sowohl systemisch als auch die Haut betreffend), Vitiligo.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Autoimmunerkrankung einhergeht mit Unfruchtbarkeit, höherem Abortrisiko, reduziertem Fötuswachstum.