HUP0202779A2 - Immunológiai eljárás szöveti transzglutamináz (tTG) elleni antitestek kimutatására, tTG alkalmazása diagnosztikai célokra és terápiás ellenőrzésre, valamint tTG-t tartalmazó orális gyógyászati hatóanyag - Google Patents
Immunológiai eljárás szöveti transzglutamináz (tTG) elleni antitestek kimutatására, tTG alkalmazása diagnosztikai célokra és terápiás ellenőrzésre, valamint tTG-t tartalmazó orális gyógyászati hatóanyag Download PDFInfo
- Publication number
- HUP0202779A2 HUP0202779A2 HU0202779A HUP0202779A HUP0202779A2 HU P0202779 A2 HUP0202779 A2 HU P0202779A2 HU 0202779 A HU0202779 A HU 0202779A HU P0202779 A HUP0202779 A HU P0202779A HU P0202779 A2 HUP0202779 A2 HU P0202779A2
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- ttg
- antibodies
- sprue
- detection
- therapy
- Prior art date
Links
- 102100038095 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 2 Human genes 0.000 title claims abstract description 114
- 108700039882 Protein Glutamine gamma Glutamyltransferase 2 Proteins 0.000 title claims abstract description 109
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 52
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 23
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 title claims description 15
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title claims description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 title abstract description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 title 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 title 1
- 208000015943 Coeliac disease Diseases 0.000 claims abstract description 62
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 31
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 18
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 16
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 claims abstract description 13
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims abstract description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 18
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 claims description 15
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 claims description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 3
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 31
- 201000010099 disease Diseases 0.000 abstract description 29
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 abstract description 4
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 abstract description 4
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 abstract description 4
- 239000013543 active substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000006058 immune tolerance Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract description 2
- 208000026278 immune system disease Diseases 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 32
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 32
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 24
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 17
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 17
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 15
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 13
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 12
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 108010061711 Gliadin Proteins 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 9
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 8
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical group N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 6
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 6
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 6
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 6
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 6
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 6
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 101000666171 Homo sapiens Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase 2 Proteins 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 5
- 108030001310 Protein-glutamine gamma-glutamyltransferases Proteins 0.000 description 5
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 5
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 4
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 4
- 108010068370 Glutens Proteins 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 4
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 4
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 235000021312 gluten Nutrition 0.000 description 4
- 235000006171 gluten free diet Nutrition 0.000 description 4
- 235000020884 gluten-free diet Nutrition 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010003827 Autoimmune hepatitis Diseases 0.000 description 3
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 3
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 3
- 206010025476 Malabsorption Diseases 0.000 description 3
- 208000004155 Malabsorption Syndromes Diseases 0.000 description 3
- 206010029719 Nonspecific reaction Diseases 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 3
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 3
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 3
- 241000209140 Triticum Species 0.000 description 3
- 235000021307 Triticum Nutrition 0.000 description 3
- 239000000370 acceptor Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 3
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000020192 tolerance induction in gut-associated lymphoid tissue Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JYCQQPHGFMYQCF-UHFFFAOYSA-N 4-tert-Octylphenol monoethoxylate Chemical compound CC(C)(C)CC(C)(C)C1=CC=C(OCCO)C=C1 JYCQQPHGFMYQCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000007319 Avena orientalis Nutrition 0.000 description 2
- 244000075850 Avena orientalis Species 0.000 description 2
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 2
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 description 2
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 description 2
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 2
- 241000209056 Secale Species 0.000 description 2
- 235000007238 Secale cereale Nutrition 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 2
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 2
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 2
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 2
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 2
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003238 esophagus Anatomy 0.000 description 2
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 238000012817 gel-diffusion technique Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 210000005024 intraepithelial lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 2
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 2
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 201000009410 rhabdomyosarcoma Diseases 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine thiocyanate Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=C(SC#N)C=C1C(O)=O JGVWCANSWKRBCS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003954 umbilical cord Anatomy 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 2
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L (5-bromo-4-chloro-1h-indol-3-yl) phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP([O-])(=O)[O-])=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N Ala-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O HJCMDXDYPOUFDY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010011968 Decreased immune responsiveness Diseases 0.000 description 1
- 206010012468 Dermatitis herpetiformis Diseases 0.000 description 1
- 206010048768 Dermatosis Diseases 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N Erythritol Natural products OCC(O)C(O)CO UNXHWFMMPAWVPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108050001049 Extracellular proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 102000000802 Galectin 3 Human genes 0.000 description 1
- 108010001517 Galectin 3 Proteins 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 206010072579 Granulomatosis with polyangiitis Diseases 0.000 description 1
- 102100031547 HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 206010062713 Haemorrhagic diathesis Diseases 0.000 description 1
- 206010019799 Hepatitis viral Diseases 0.000 description 1
- 101000866278 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000007924 IgA Deficiency Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- 208000022559 Inflammatory bowel disease Diseases 0.000 description 1
- 206010022704 Intestinal T-cell lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 108010077077 Osteonectin Proteins 0.000 description 1
- 102000009890 Osteonectin Human genes 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 108010050808 Procollagen Proteins 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010067787 Proteoglycans Proteins 0.000 description 1
- 102000016611 Proteoglycans Human genes 0.000 description 1
- 206010039915 Selective IgA immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000024799 Thyroid disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 206010067584 Type 1 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 108010046334 Urease Proteins 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 235000010716 Vigna mungo Nutrition 0.000 description 1
- 240000001417 Vigna umbellata Species 0.000 description 1
- 235000011453 Vigna umbellata Nutrition 0.000 description 1
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 1
- 201000000839 Vitamin K Deficiency Bleeding Diseases 0.000 description 1
- 206010047634 Vitamin K deficiency Diseases 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012072 active phase Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 229960002648 alanylglutamine Drugs 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 230000000981 bystander Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 description 1
- 206010009887 colitis Diseases 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000012303 cytoplasmic staining Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 108010040063 dermatan sulfate proteoglycan Proteins 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 230000002183 duodenal effect Effects 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000006694 eating habits Nutrition 0.000 description 1
- 210000004177 elastic tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 108010003914 endoproteinase Asp-N Proteins 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003722 extracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 108060002894 fibrillar collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000013373 fibrillar collagen Human genes 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 210000003953 foreskin Anatomy 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002309 glutamines Chemical class 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000010439 graphite Substances 0.000 description 1
- 229910002804 graphite Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 201000007156 immunoglobulin alpha deficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 235000004213 low-fat Nutrition 0.000 description 1
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002669 lysines Chemical class 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001466 metabolic labeling Methods 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 108700005457 microfibrillar Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 108010008217 nidogen Proteins 0.000 description 1
- JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N nitro blue tetrazolium(2+) Chemical compound COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 JPXMTWWFLBLUCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000003300 oropharynx Anatomy 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 108060006613 prolamin Proteins 0.000 description 1
- XXRYFVCIMARHRS-UHFFFAOYSA-N propan-2-yl n-dimethoxyphosphorylcarbamate Chemical compound COP(=O)(OC)NC(=O)OC(C)C XXRYFVCIMARHRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011241 protective layer Substances 0.000 description 1
- 208000005069 pulmonary fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 208000029138 selective IgA deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003997 social interaction Effects 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 208000035736 spondylodysplastic type Ehlers-Danlos syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 description 1
- 208000035408 type 1 diabetes mellitus 1 Diseases 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 201000001862 viral hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 208000016794 vitamin K deficiency hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/104—Aminoacyltransferases (2.3.2)
- C12N9/1044—Protein-glutamine gamma-glutamyltransferase (2.3.2.13), i.e. transglutaminase or factor XIII
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4713—Autoimmune diseases, e.g. Insulin-dependent diabetes mellitus, multiple sclerosis, rheumathoid arthritis, systemic lupus erythematosus; Autoantigens
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Rehabilitation Therapy (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
Abstract
A találmány tárgyát eljárások képezik ellenanyagok testfolyadékokbantörténő kimutatására, szöveti transzglutaminázzal (<tissuetransglutaminase<; tTG), annak antigén sajátságú struktúráival,immunreaktív szekvenciáival vagy analógjaival, valamint tTG-tartalmúvegyületekkel, azok antigén sajátságú struktúráival, immunreaktívszekvenciáival vagy analógjaival adott immunreakció alapján. Atalálmány tárgyát képezi tTG és a fenti vegyületek alkalmazásabetegségek diagnózisára és a terápia hatásosságának ellenőrzésére;előnyösen, krónikus gyulladásos betegségek vagy autoimmun betegségekdiagnózisára és terápiájuk hatásosságának ellenőrzésére; például<sprue< vagy <coeliakia< diagnózisára és terápiája hatásosságánakellenőrzésére. A találmány tárgyát képezik továbbá, szájon átadagolható gyógyászati hatóanyagok, amelyek aktív hatóanyagként tTG-t,tTG-tartalmú vegyületeket vagy azok részeit tartalmazzák, és amelyekalkalmasak immuntolerancia kiváltására. A találmány szerinti megoldásalkalmas tTG-vel kapcsolatos immunológiai rendellenességek dignózisáraés a terápiás hatékonyság ellenőrzésére. Ó
Description
.:. ··* ’·· ·
P02027/9
Képviselő :
Danubia
Szabadalmi és Védjegy Iroda Kft.
•Budapest
Immunológiai eljárás szöveti transzglutamináz (tTG) elleni antitestek kimutatására, tTG alkalmazása diagnosztikai célokra és terápiás ellenőrzésre, valamint tTG-t tartalmazó orális gyógyászati hatóanyag
A találmány tárgyát eljárások képezik ellenanyagok testfolyadékokban történő kimutatására, szöveti transzglutaminázzal („tissue transglutaminase; tTG), annak antigén sajátságú struktúráival, immunreaktiv szekvenciáival vagy analógjaival, valamint tTG-tartalmú vegyületekkel, azok antigén sajátságú struktúráival, immunreaktiv szekvenciáival vagy analógjaival adott immunreakció alapján.
Ugyancsak a találmány tárgyát képezi tTG és a fent említett vegyületek alkalmazása betegségek diagnózisára és a terápia hatásosságának ellenőrzésére; előnyösen, krónikus gyulladásos betegségek vagy autoimmun betegségek diagnózisára és terápiájuk hatásosságának ellenőrzésére; előnyösebben, „sprue vagy „coeliakia diagnózisára és terápiája hatásosságának ellenőrzésére. A találmány tárgyát képezik továbbá, szájon át adagolható gyógyászati hatóanyagok, amelyek aktív hatóanyagként tTG-t, tTG-tartalmú vegyületeket, azok antigén sajátságú struktúráit, immunreaktiv szekvenciáit vagy analógjait tartalmaznak, és alkalmazhatók a fenti
Aktaszámunk: 89218-597/PÁ vegyületekkel szemben irányuló immunreakcióval járó betegségek kezelésére, azáltal, hogy a fent említett vegyületek szájon át történő adagolásával immuntoleranciát váltunk ki.
Az eljárások alkalmazhatók tTG-vel, tTG-tartalmú vegyületekkel azok antigén sajátságú struktúráival, immunreaktív szekvenciáival vagy analógjaival szemben irányuló immunreakcióval kapcsolatos betegségek diagnózisára és/vagy terápiájuk hatásosságának ellenőrzésére.
A találmány alapját az a felismerés képezi, hogy a szöveti transzglutamináz (tTG; EC 2.3.2.13) tölti be az autoantigén szerepét sprue vagy coeliakia betegségekben.
A fenti felismerés alapján fejlesztettük ki a találmány szerinti immunológiai eljárást, amely alkalmas tTG-vel és tTG-tartalmú vegyületekkel szembeni ellenanyagok kimutatására .
A coeliakia a vékonybél nyálkahártyájának betegsége, amelynek első tünetei főként a késői csecsemőkorban és a tipegő korban jelentkeznek. Amennyiben a megfelelő klinikai kép nem jelentkezik a felnőtt kort megelőzően, a betegséget „nem—trópusi spruenak nevezzük. Mindkét kifejezés tehát ugyanarra a betegségre vonatkozik. A spruet a nyálkahártya gyulladásos elváltozása kíséri, aminek következménye általános malabszorbció (felszívódási zavar). Az esetek többségében, glutenmentes diéta alkalmazásán alapuló kezelésre a morfológiai és klinikai tünetek javulnak.
Jól ismert kóroki faktorok a búza, árpa, rozs - és bizonyos mértékben a zab -gluténjei; míg alacsonyabb fokú filogenetikai rokonságban levő növényfajták, például a kuko rica, rizs és szója gluténjei nem váltanak ki betegséget. Az említett glutének közül, a kóroki szerepet az alkoholban oldódó prolaminoknak, közelebbről, az α-gliadinnak tulajdonít j ák.
A fenti okokból, a sprue elsősorban olyan országokban fordul elő, ahol a búza fő élelmiszer-alapanyagként szerepel (például Európa, U.S.A., Ausztrália), a betegség előfordulási aránya az újszülöttek között például Dániában 0,14/1 000, Spanyolországban 0,7/1 000, Olaszországban 1/1 000, Németországban 0,45/1 000, és Svédországban 2,42/1 000.
Újabb vizsgálatok azonban azt mutatták, hogy a betegség nyilvánvaló klinikai tünetekkel nem járó formája - azaz, a nyálkahártya morfológiai elváltozása, súlyosabb tünetek jelentkezése nélkül - sokkal gyakoribb, mint korábban azt hittük. Egy 1994-ben Olaszországban végzett vizsgálat szerint, iskolás gyermekek közt a betegség előfordulási aránya 3,28/1 000. A latens sprue kockázata a sprueban szenvedő betegek legközelebbi rokonaiban eléri az 50 %-ot.
Az elsősorban latens formában jelentkező spruet gyakran polimorf dermatózis azaz, Dermatitis herpetiformis kíséri, amelynek jellemző tünete a bőr papillacsúcsaiban található, granuláris IgA-lerakódást tartalmazó kis méretű bőr alatti hólyagok jelenléte. A vékonybél biopsziája szabálytalan, többé-kevésbé súlyosan károsodott nyálkahártyát mutat.
Jól megalapozott kapcsolat mutatható ki továbbá a sprue és az inzulinfüggő Diabetes mellitus^ a pajzsmirigy betegségei és a szelektív IgA-hiány közt.
A spruet kísérő számos klinikai tüneten, például anémián (vérszegénységen) felül, amely - többek között - a B12-vitamin felszívódási zavarára, valamint a fokozott vérzékenységi hajlamot eredményező K-vitamin hiányra vezethető vissza, fontos megemlíteni a betegséggel kapcsolatosan kimutatható jelentősen megnövekedett kockázatot gasztrointesztinális (gyomor-bélrendszeri) malignus tumorok kialakulására .
A sprueban szenvedő betegek akár 15 %-ánál, többnyire 50 éves kor felett, tumoros betegség alakul ki; ezek 50 %-a bél T-sejtes limfóma, további 25 % pedig a nyelőcsövet, száj-garat üreget és vékonybelet érintő tumor.
A sprue kezelése életre szóló gluténmentes diéta szigorú betartásán alapul, amelyben nem csak a búzából készült gluténtartalmú termékektől kell tartózkodni, hanem a rozsból, árpából és zabból készült termékeket is el kell kerülni. A beteg számára ez szigorú megszorításokat jelent mind az étkezési szokások, mind a társadalmi érintkezés tekintetében .
Amennyiben a spruet időben diagnosztizálják és annak kezelését időben megkezdik, a betegség jó prognózisú. Az egyszer már jelentkezett komplikációk azonban gyakran nem fordíthatók vissza teljes mértékben. A fentiekkel szemben, ha a betegséget nem ismerik fel, és az kezeletlen marad, a felszívódási zavar következtében súlyos tünetek léphetnek fel. Végül, számolnunk kell bél eredetű limfómák és más gyomor-bél rendszeri daganatos elváltozások kialakulásának fokozott kockázatával.
Jelenleg, a vékonybél biopsziás vizsgálata képezi a sprue diagnózisának és - a gluténmentes diéta betartása mellett - a betegség utánkövetésének legmagasabb szintű elismert módszerét, bár egyre nagyobb jelentőséget kapnak immunológiai markerek kimutatásán alapuló nem-invaziv diagnosztikai eljárások is. Mivel sprueban szenvedő betegek szérumában olyan, IgA- és IgG-osztályba tartozó ellenanyagok mutathatók ki, amelyek egyrészt, gliadinnal szemben irányulnak, másrészt, az endomizium („endomysium; kollagén és elasztikus elemeket is tartalmazó kötőszöveti sövényrendszer) valamely autoantigénjével reagálnak, amely utóbbi speciális kötőszövet, amely többek között, I., III. és V. kollagéneket, elasztikus rostokat, nem—kollagén természetű proteineket, például fibronektint és proteoglikánokat tartalmaz -, a beteg szérumát ELISA-eljárással gliadinnal szemben irányuló IgG- és IgA-ellenanyagok jelenlétére, indirekt immunflucreszenciás eljárással pedig endomiziummal szemben irányuló IgG- és IgA-ellenanyagok jelenlétére tesztelhetjük. Mig a gliadinnal szemben irányuló ellenanyagok nem elég specifikusak sprue betegségre, az endomiziummal szemben irányuló IgA-ellenanyagok kimutatását nagy fokú érzékenység és specifitás (97-100 %) jellemzi. Az immunfluoreszcens vizsgálathoz azonban főemlőstől nyert nyelőcsőmetszetre van szükség. Jelenleg, kísérletek folynak endomiziummal szembeni ellenanyagok köldökzsinór-szöveten történő kimutatására is.
Az korai diagnózissal és a diéta szigorú betartásával a betegség tünetmentes állapotban tartható, és a betegeknél fennálló fokozott kockázat malignus tumorok kialakulásáraugyancsak a normális szintre csökkenthető. Nagy az érdeklődés tehát sprue kimutatására alkalmas eljárások kifejlesztésére. Mivel a sprue latens formájában szenvedő betegek is a magas kockázati csoportba tartozónak tekintendők, valamennyi érintett egyént (különösen a betegek legközelebbi hozzátartozóit), és végső soron - amint azt Olaszországban mérlegelik - valamennyi iskolás korú gyermeket vizsgálnunk kellene egy érzékeny, specifikus, könnyen kivitelezhető és alacsony költséggel járó vizsgálati eljárással.
Eddig azonban, a nagy populációk vizsgálatára kiterjedő szűrési programok kudarcot vallottak, a következő problémák következtében:
Az invazív duodenális biopszia tünetmentes egyéneknél ésszerűtlen beavatkozás, és különösen költséges.
A gliadinnal szemben irányuló ellenanyagok kimutatására szolgáló ELISA-eljárások alkalmazhatósága megkérdőjelezhető, azok nem kielégítő specifitása miatt.
Az IgA-osztályú ellenanyagok kimutatására alkalmas immunfluoreszcens eljárások, amelyek főemlős nyelőcsőszövet alkalmazását teszik szükségessé, általános szűrővizsgálat céljára túlságosan költségesek. Ezen felül, értékelésük szubjektív, és nem teszik lehetővé az IgA-hiányos spruebetegek (azaz, a betegek 2 %-ának) azonosítását.
Eddig tehát sprue/coeliakia betegség kimutatására és a megfelelő terápia hatásosságának ellenőrzésére alkalmas nem-invazív, specifikus, kvantitatív, gyors, könnyen és olcsón kivitelezhető kimutatási eljárás nem állt rendelkezésre .
Ezt a problémát kívántuk megoldani. Azon meglepő eredmény alapján, hogy a szöveti transzglutamináz (tTG; EC 2.3.2.13) tölti be az autoantigén szerepét sprue betegségben, a csatolt 1-6. igénypontok szerinti immunológiai eljárásokat fejlesztettünk ki, melyek alkalmasak tTG és tTG-tartalmú vegyületekkel szemben irányuló ellenanyagok kimutatására testfolyadékokban, különösen szérumban, amely eljárás nem csupán sprue vagy coeliakia diagnózisát teszi lehetővé, hanem valamennyi, tTG-vel vagy tTG-tartalmú vegyülettel, azok antigén sajátságú struktúráival, immunreaktív szekvenciáival vagy analógjaival szemben irányuló immunreakcióval járó betegségét is.
A szöveti transzglutamináz a transzglutaminázok (TG) családjába tartozik. A TG-k (EC 2.3.2.13) Ca2+-függő, aciltranszfert katalizáló enzimek; az általuk katalizált reakciókban peptidkötésben lévő glutaminok y-karboxamidcsoportjai szolgálnak acil-donorokként. Acil-akceptorokként, elsősorban proteinkötésben lévő lizinek szerepelnek, így a transzfer ε-(y-glutamil)lizin-kötést eredményez. A TG-k szubsztrátspecifitása acildonorok vonatkozásában igen szigorú (függ az aminosav—szekvenciától), míg a lehetséges akceptorok köre kivételesen tág. A képződő kovalens peptidkötések nagy mértékben stabilak és proteáz-rezisztensek, és a keresztkötést tartalmazó proteinek vegyszerekkel, enzimatikus vagy fizikai behatásokkal szembeni megnövekedett ellenállóképességéhez vezetnek.
Továbbá, a különböző TG-k széles körű előfordulása különböző szervekben, szövetekben, plazmában és szövet közti folyadékokban, összefüggést mutat a transzglutamináz által módosított proteinek előfordulásával véralvadékokban, sejtmembránokon, a hám szarurétegében, hajban, körmökben és az extracelluláris mátrixban.
Az ismert transzglutaminázok megkülönböztethetők fizikai sajátságaik, a test különböző helyein történő kimutathatóságuk és elsődleges struktúrájuk alapján.
A szöveti TG-t (tTG-t) celluláris, eritrocita, endotheliális, citoplazmáris, máj vagy II. típusú TG-nek is nevezik, és az 75-85 kDa molekulatömegű monomer.
A protein 687 aminosavból álló teljes aminosav-szekvenciáját cDNS alapján határozták meg. A proteinszekvencia vonatkozásában, 84 %-os homológia mutatható ki a humán enzim és az egér makrofágokból nyert megfelelő enzim közt; és 81 %-os homológia mutatható ki a humán enzim és a megfelelő tengerimalac enzim közt. A fenti fajokban előforduló nukleotidszubsztitúciók gyakran nem befolyásolják az aminosavszekvenciát. Az aktív centrum nagy mértékben konzervált, és jelentős proteinszekvencia-homológiát mutat a három említett faj esetében (azaz, az 51 aminosavból 49 azonos), továbbá, nagy fokú homológiát mutat (75 %) a XIII. faktor aalegységével.
A proteinben szignálpeptid vagy glikozileződés nem mutatható ki, és annak ellenére, hogy abban több cisztein aminosav található, diszulfid-hidakak nincsenek jelen. Fluoreszcens hibridizációs eljárás szerint, a humán szöveti transzglutamináz gén a 20ql2-kromoszómarégióban található. Bár az enzimfelszabadulás mechanizmusa nem világos, egyértelmű bizonyítékok támasztják alá, hogy a tTG, általános intracelluláris elterjedtsége ellenére, fontos szerepet tölt be az extracelluláris mátrixban (ECM-ben). Ezen felül, az intracelluláris Ca2+-koncentráció fiziológiás körülmények mellett valószerűtlen, hogy elérje a tTG aktivitásához szükséges szintet, míg az extracelluláris térben elegendően magas Ca2+ -koncentráció mutatható ki.
Több vizsgálat kapcsolatot mutatott ki a tTG és a fibronektin ECM-protein közt. A fibronektinen felül, a nidogén, az N-terminális prokollagén III. peptid, az V. és XI. kollagének, az oszteonektin - amely egy mikrofibrillumasszociált glikoprotein -, magas molekulatömegű dermatánszulfát proteoglikán és a galektin-3 lektin ECM-molekulák is a tTG specifikus szubsztrátjaiként azonosíthatók.
Továbbá, a tTG sebgyógyulásban betöltött lényeges szerepére utalnak azok az immunfluoreszcens vizsgálatok, amelyeket tenyésztett WI38-sejteken (tüdő embrionális fibroblasztokon) végeztek, amely sejtek esetében, normális körülmények mellett nem mutatható ki extracelluláris tTGaktívitás, de mesterségesen előidézett sérülés esetében az enzim extracellulárisan is kimutathatóvá válik. Az enzim feltehetően passzív felszabadulását a sérült sejtekből,
- 10 kezdetben nem-kovalens kötés kialakulása követi az enzim és az ECM, közelebbről, az azt alkotó fibronektin és fibrilláris kollagének közt, miáltal az enzim néhány órára katalitikusán aktívvá válik. Patkánymodellben - hasonlóképp, sérülés mesterséges úton történő létrehozását követően -, 5 napon át fokozott tTG-aktivitás volt kimutatható. Továbbá, amennyiben humán eritrocita lizátumokat plazmával inkubáltunk, azt találtuk, hogy a felszabaduló tTG erős affinitást mutat fibronektinhez. Valamennyi adat arra utal, hogy tTG ECM-hez történő kötődése központi szerepet játszik a sebgyógyulás korai fázisában, közelebbről, az a XIII. faktorral együtt hozzájárul a fibrin stabilizálásához, úgy, hogy keresztkötéseket képez az extracelluláris proteinek közt, miáltal védőréteg és stabil adhezív szubsztrát képződik a sérült sejtek körül. Eddig, nem sikerült gerincesekben kimutatni olyan enzimet, amely képes lenne a proteinek tTG által katalizált, különlegesen stabil keresztkötéseit hasítani .
Azon felismerés alapján, hogy a tTG szerepel autoantigénként sprue betegségben, a találmány tárgyát képezi tTG, tTG-tartalmú vegyületek, azok antigén sajátságú struktúráinak, immunreaktív szekvenciáinak vagy analógjainak alkalmazása a fenti vegyületekkel szemben irányuló immunreakcióval járó betegségek diagnózisára és terápiájuk hatásosságának ellenőrzésére. Közelebbről, a találmány szerinti eljárásokkal diagnosztizálhatok például a felsorolt betegségek: akut gyulladásos betegségek, például tüdőgyulladás, glomerulonephritis, vírushepatitis; krónikus gyulladásos betegségek,
- 11 például Crohn-betegség, Colitis ulcerosa; autoimmun betegségek, például autoimmun hepatitis, Sjoegren-szindróma, Wegener-granulomatózis, reumatoid artritisz, idiopátiás szerviibrózisok, például tüdőiibrózis. A találmány szerinti kimutatási eljárás különösen előnyösen alkalmazható sprue diagnózisára és terápiája hatásosságának ellenőrzésére. Mivel az eljárás gyorsan és költségkímélő módon kivitelezhető, lehetővé teszi a populáció hatékony szűrését tTGellenanyagok jelenlétére.
A találmány szerinti eljárásban tTG-ként alkalmazhatunk állati, szintetikus vagy rekombináns eredetű tTG-t; ugyanez érvényes tTG-tartalmú vegyületekre, amelyek ezen felül, lehetnek vegyes eredetűek (például tartalmazhatnak állati tTG-t szintetikus pepiiddel összekapcsolva). A leírásban tTG-tartalmú vegyületeken tTG proteinekkel alkotott kémiai vegyületeit vagy azok analógjait értjük. A leírásban. tTG-analógoknak vagy a tTG-tartalmú vegyületek anlógjainak nevezünk valamennyi olyan antigén sajátságú struktúrát, amely tTG-vel vagy tTG-tartalmú vegyülettel szAmbAni ellenanyagokkal immunreakcióba lép, ilyenek lehetnek például szintetikus peptidek. Immunreaktív szekvenciákon tTG vagy tTG-tartalmú vegyületek proteolízis, szintézis vagy géntechnológiai beavatkozás révén létrejött fragmentumait, valamint azok aminosav-szubsztitúcióval létrehozott variánsait értjük.
A találmány szerinti immunológiai kimutatási eljárást jól ismert módszerek szerint végezzük. A betegben jelen lévő ellenanyagok kimutatására tehát bármely direkt (például
- 12 szenzor „chip alkalmazásán alapuló) vagy indirekt módszer alkalmazható.
A direkt eljárások szerint, az ellenanyagok antigénhez történő kötődését megváltozott kémiai vagy fizikai sajátságok alapján mutatjuk ki, úgy, hogy jelölt kötődő vegyület kimutatását magában foglaló további lépésekre nincs szükség .
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a tTG-ellenanyagokat immunvizsgálati eljárással, előnyösen, szilárd fázisú immunvizsgálati eljárással mutatjuk ki, úgy, hogy a reagálóanyagot, közvetlen vagy közvetett módon, könnyen kimutatható jelölő vegyülettel kapcsoljuk össze. Előnyösebben, a kimutatást ELISA, RIA vagy immunfluoreszcens módszerrel mutatjuk ki. Ilyen kimutatási eljárásokban alkalmazott módszerek szakember számára jól ismertek.
ELISA-eljárásban például, az antigént - esetünkben tTG-t - közvetlenül vagy közvetett módon hordozóhoz, például polisztirénhez kötjük. A kimutatandó ellenanyaggal történő inkubálást követően, az antigénhez kötődött ellenanyagokat - például beteg szérumában található ellenanyagokat közvetlen vagy közvetett módszerrel mutatjuk ki, enzimhez kötött anyagok alkalmazásával. Ilyen anyagokként alkalmazhatunk ellenanyagokat, ellenanyag-fragmentumokat vagy nagy affinitású ligandumokat, például biotin jelölőanyaghoz kötődő avidint. Enzimekként alkalmazhatunk például peroxidázt, alkalikus foszfatázt, β-galaktozidázt, ureázt vagy glükóz oxidázt. A kötődött enzimek, ezáltal a kötődött tTG
- 13 ellenanyagok mennyiségét például kromogén szubsztrát hozzáadásával határozhatjuk meg.
Radioimmunvizsgálati eljárásokban, az antigént - például tTG-t - az előbbiekhez hasonló módon, közvetlenül vagy közvetett módon hordozóhoz, például polisztirénhez kötjük. A kimutatandó ellenanyaggal történő inkubálást követően, az antigénhez kötődött ellenanyagokat - például beteg szérumában található ellenanyagokat radioaktív jelölést, például 125I-izotópot hordozó anyagok alkalmazásával mutatjuk ki. Ilyen anyagokként alkalmazhatunk ellenanyagokat, ellenanyag-fragmentumokat, nagy affinitású ligandumokat, például biotin jelölőanyaghoz kötődő avidint. A kötődött radioaktivitás mértékét megfelelő mérőkészülékkel határozhatjuk meg.
Immunfluoreszcens vizsgálati eljárások alkalmazásakor, az antigénhez kötődött ellenanyagok mennyiségét a fentiekkel azonos elv alapján határozzuk meg, fluoreszcens jelölölőanyagot, például fluoreszcein-izotiocianátot (FITC) hordozó anyagok alkalmazásával. Ilyen anyagokként alkalmazhatunk ellenanyagokat, ellenanyag-fragmentumokat, nagy affinitású ligandumokat, például biotin jelölőanyaghoz kötődő avidint. A kötődött fluoreszcens festék mennyiségét ezután megfelelő mérőkészülékkel határozzuk meg.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a betegben található ellenanyagokat agglutinációs eljárással vagy géldiffúziós eljárással mutatjuk ki. Ezek az módszerek szakember számára jól ismertek. Géldiffúziós eljárás szerint, az antigént vagy ellenanyagot tartalmazó oldatot például agar vagy agarózlemez egymáshoz közel eső mélyületeibe
- 14 mérjük. Esetünkben, antigén oldatként alkalmazhatunk például tTG-oldatot; ellenanyag oldatként pedig például vérszé— rumot. Amint az anyagok kidiffundálnak a mélyületekből, koncentrációgradiens jön létre, amelynek centrumát a megfelelő mélyület képezi. Amennyiben a gélben az átfedő antigén és ellenanyag koncentrációk aránya meghatározott értéket ér el, és az ellenanyag oldat az antigénnel szemben irányuló ellenanyagokat tartalmaz, precipitátum képződik a gélben.
Az agglutinációs eljárások szerint, valamely antigén— (például tTG-) hordozó részecskék, például latex vagy polisztirén részecskék közt keresztkötéseket hozunk létre ellenanyagok, például szérumból származó ellenanyagok alkalmazásával. A képződő aggregátumokat például turbidimetriával mutathatjuk ki.
A találmány egy különösen előnyös megvalósítási módja szerint, a sprueban szenvedő betegek szérumában található ellenanyagokat IgA-specifikus vagy IgG-specifikus ELISA alkalmazásával mutatjuk ki. Azt találtuk, hogy a sprueban szenvedő betegek szérumában található IgA—ellenanyagok kimutatására alkalmas, tTG alapú, újonnan kifejlesztett ELISA-eljárás nagy érzékenységének és magas specifitásának köszönhetően, kitűnően alkalmazható sprue diagnózisára és a betegség kezelése hatásosságának ellenőrzésére. Ez a kezelt betegek utánkövetése alapján is nyilvánvaló ( a kezelés során a titer csökkenése figyelhető meg). A találmány szerinti eljárással kapott ELISA-eredmények és egy harmadik személy által végzett immunfluoreszcens értékelés (antiendomizium IgA-ellenanyagok kimutatása) adatainak összeha
- 15 sonlitása szerint, a két vizsgálat jó egyezést mutat. Eltérések elsősorban alacsony ellenanyagtitereknél fordultak elő, amelyek azonban az indirekt immunfluoreszcenciás módszer alkalmazásából következnek, amelyet jelenleg az első számú választandó eljárásnak tartanak. Az eltérések többek között - a szubjektív értékelésből, és a korábbi módszerrel kapcsolatosan előforduló nem-specifikus reakciókból adódnak .
Egyéb ellenanyag osztályba tartozó ellenanyagok, például IgG-ellenanyagok kimutatásán alapuló megfelelő eljárások alkalmasak IgA-deficiens sprue betegek azonosítására, valamint tTG-vel szemben irányuló immunreakcióval járó egyéb betegségek vizsgálatára.
A találmány szerinti kimutatási eljárás további előnye származik abból, ha a tesztrendszerben tisztított tengerimalac tTG-t, humán tTG-t, proteolízissel vagy géntechnológiai eljárásokkal nyert szekvenciákat vagy analógokat, vagy szintetikus úton előállított immunogén tTG-peptideket alkalmazunk. tTG-vel szemben irányuló immunreakcióval járó egyéb betegségek diagnózisára és utánkövetésére alkalmas ELISA-eljárást ismertetünk a 3.3 példában.
A találmány tárgyát képezi továbbá, a 9. igénypont szerinti, szájon át adagolható gyógyászati hatóanyag tTGvel, tTG-tartalmú vegyületekkel, azok antigén sajátságú struktúráival, immunreaktív szekvenciáival vagy analógjaival szemben irányuló immunreakcióval járó betegségek kezelésére. A szájon át történő adagolásra alkalmas hatóanyagokat előnyösen, tabletta vagy kapszula formájában állítjuk
- 16 elő, és azok alkalmazásával orális toleranciát váltunk ki, tTG, tTG-tartalmú vegyületek, azok antigén sajátságú struktúrái, immunreaktiv szekvenciái vagy analógjai adagolásán keresztül. Egyrészt, az autoantigén szájon át történő adagolásával orális toleranciát érünk el; másrészt, úgy nevezett „bystander hatást váltunk ki, azaz, amennyiben a betegséget okozó autoantigén nem ismert, egyes esetekben terápiás hatású lehet a célszervben az immunrendszerrel érintkező egyéb antigén szájon át történő adagolása. Ez az antigén képes helyben az antigén-specifikus szupresszor Tsejtek stimulálására, ezáltal, a szisztémás immunválasz elnyomására. Kizárólag magasabb antigén dózisok alkalmazása esetén, az autoreaktiv T-sejtek anergiája váltható ki.
Orális tolerancia kiváltása a megfelelő módszer különböző autoimmun betegségek kezelésére.
A találmány szerinti gyógyászati hatóanyagokat előnyösen, sprue kezelésére alkalmazzuk, de azok alkalmazhatók más krónikus gyulladásos bélbetegségek és autoimmun hepatitis kezelésére is.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint, a tTG-t, tTG-tartalmú vegyületeket, azok antigén sajátságú struktúráit, immunreaktiv szekvenciáit vagy analógjait 0,01-100 mg/testtömeg-kg dózisban adagoljuk.
A találmány szerinti gyógyászati hatóanyagok - adott esetben -, tartalmazhatnak gyógyászatilag elfogadható adjuvánsokat, például a gyógyszergyártásban szokásosan alkalmazott töltőanyagokat, síkosító anyagokat, a készítmény szétesését elősegítő anyagokat, kötőanyagokat vagy a hatóanyag
- 17 felszabadulását elősegítő anyagokat. A gyógyászatilag elfogadható adjuváns aránya a választott aktív hatóanyagtól függően széles határok közt változhat, és az általában 0,1-20 tömeg-% közt van.
Közelebbről, a találmány előnyösen, sprue diagnózisára és terápiája hatásosságának ellenőrzésére szolgáló kimutatási eljárásra vonatkozik, amely eljárás nem-invazív, nagy fokban specifikus, és közvetlenül a betegséggel kapcsolatos vegyület kimutatására irányul. Az általunk kifejlesztett eljárás előnye, hogy az gyorsan, könnyen és költségkímélő módon kivitelezhető, valamint különböző laboratóriumokban standardizálható. A vizsgálati eljárás tehát lehetővé teszi a populáció hatékony szűrését, tTG-vel szemben irányuló ellenanyagok jelenlétére.
A vizsgálati eredmények objektív voltának köszönhetően, az eredmények mennyiségi meghatározásának lehetősége az eljárást fölébe helyezi az immunfluoreszcens értékelésnek, amely szubjektív elemeket hordoz magában. Ezen felül, az immunfluoreszcens értékelést, különösen alacsony titerek esetén, gátolja a vizsgálattal kapcsolatban megfigyelhető nem-specifikus reakciók jelentkezése. Amennyiben a tesztrendszerben a specifikus autoantigént alkalmazzuk, a főemlősök nyelőcsőmetszetein vagy köldökzsinór-metszeteken immunfluoreszcens eljárással megfigyelhető nem-specifikus reakciók a lehető legnagyobb mértékben kiküszöbölhetők.
Mivel a vizsgálati eljárás IgA—osztályú ellenanyagok vagy egyéb osztályba tartozó ellenanyagok esetében egyaránt alkalmazható, azzal az IgA-deficiens sprue betegek is azo
- 18 nosíthatók. A tTG-vel szemben irányuló ellenanyagokon alapuló kimutatási eljárás ugyancsak alkalmas tTG-vel szemben irányuló immunreakcióval járó egyéb betegségek azonosítására, vizsgálatára, és terápiájuk hatásosságának ellenőrzésére .
Miután a tTG-t a sprueban szereplő autoantigénként azonosítottuk, azt alkalmazhatjuk teljes egész formájában; vagy alkalmazhatjuk annak immunreaktív epitópjait (annak proteolízissel vagy géntechnológiai eljárásokkal nyert szekvenciáit, analógjait vagy szintetikus peptidjeit) sprue szájon át történő (orális) terápiájára; vagy tTG-vel szemben irányuló immunreakcióval járó egyéb betegségek terápiájára.
A találmány szerinti megoldást az alábbiakban konkrét megvalósítási példákon keresztül kívánjuk szemléltetni, anélkül azonban, hogy igényünket az ismertetettekre korlátoznánk.
1. példa
Az autoantigén izolálása és jellemzése
1.1 . Immunfluoreszcens eljárás, APAAP-festés (APAAP: alkalikus foszfatáz anti- alkalikus foszfatáz)
A festést különböző sejtvonalakon végeztük el, amelyeket előzőleg 2 percig, -20 C-on, 100 % metanolban fixáltunk.
Az immunfluoreszcens kimutatási eljárás szerint, a készítményeket sprueban szenvedő betegből származó szérummal vagy kontroll szérummal inkubáltuk, mostuk, majd TRITC
- 19 jelölt, nyúlban termelt anti-humán-IgA ellenanyag alkalmazásával kimutatást végeztünk [Schuppan és mtsai.: J. Bioi. Chem. 265 8823 (1990)].
Az APAAP-jelölést azután végeztük, hogy a sejteket a sprue-szérumokkal inkubáltuk, ezután, azokat mostuk, végül az APAAP-komplexeket kimutattuk [Cordell J.L. és mtsai.: J. Histochem. Cytochem. 32, 219 (1984)] .
A fenti vizsgálatban, HT1080-sejtek (humán fibroszarkóma sejtek), WT38-sejtek (humán tüdő embrionális fibroblasztok), Hep-1- és HepG2-sejtek (hepatokarcinóma sejtek) esetében, betegszérum alkalmazása mellett egyértelműen pozitív citoplazmafestődés volt megfigyelhető, míg normál szérumok alkalmazása vagy humán IgA-val történő előkezelés esetén nem volt jelölődés kimutatható. Humán fityma fibroblasztok, humán rabdomioszarkóma (RD), Ito és Morris patkány hepatóma, és kutya MDCK-sejtek alkalmazásakor csupán, igen gyenge vagy negatív reakciót tapasztaltunk.
1-2. Metabolikus sejtjelölés, és az antigén immunprecipitációja
Az autoantigén jellemzését és izolálását HT1080-sejtek alkalmazásával végeztük.
A sejteket L-alanil-L-glutamint, 10 % fötális borjúszérumot („fetal calf serum, FCS, Gibco), 100 egység/ml penicillint és 100 pg/ml streptomycint (Seromed) tartalmazó Dulbecco-féle módosított Eagle-tápfolyadékban (DMEM, Gibco) tenyésztettük, 37 °C-on, 8 % CO2atmoszférában. A metabolikus jelöléshez a sejteket 5 cm átmérőjű tenyésztő edényekbe vittük át, majd azután, hogy
- 20 mintegy 90 %-ban összefüggő tenyészet alakult ki, a sejteket metionin- és FCS-mentes tápfolyadékban tartottuk, majd ezt a tápfolyadékot 3 ml, 35S-metionint (0,2 mCi; Expre35S35S, NEN-Dupont) tartalmazó FCS-mentes tápfolyadékkal helyettesítettük. Miután a sejteket 16-20 órán át a fenti tápfolyadékban inkubáltuk, a felülúszókat eltávolítottuk. A sejteket foszfát-pufferes fiziológiás sóoldattal (PBS; Seromed) mostuk, majd 3 ml lízispufferben lizáltattuk [50 mmól/1 Tris-HCl; 150 mmól/1 NaCl; 0,5 % Triton-X-100; 0,5 % IGEPAL CA-630 nem-ionos detergens (Sigma); Complete® proteázinhibitor (Boehringer) (pH=7,5)]. Ezután, CNBr-aktivált „Sepharose-4B (Pharmacia) alkalmazásával immunoprecipitációt végeztünk, mind a tápfolyadék, mind a sejtlizátum esetében.
Az aktiválást és a „Sepharose-hoz történő kötést a gyártó utasításai szerint végeztük. Miután a „Sepharose-t duzzadni hagytuk, és 1 mmól/1 HCl-ben, pH=2,5 mellett mostuk, a CNBr-aktivált „Sepharose-t egy éjszakán át, 4 °Con, nyálban termelt, humán IgA-val szemben irányuló ellenanyaggal inkubáltuk (Dianova; 2,4 mg ellenanyag / 1 ml Sepharose), a következő összetételű pufferben: 0,1 mól/1 NaHCO3, 0,5 mól/1 NaCl, (pH=8,3). A nem-kötődött ellenanyagokat az összekapcsoló pufferrel történő mosással távolítottuk el, a szabad kötőhelyeket 1 mól/1 etanolamin (pH=9,0) hozzáadásával, majd 2 órán át, szobahőmérsékleten történő inkubálással telítettük. Ezt követően, a Sepharose-t 3-szor mostuk (az egyes mosásokat 10-10-szeres térfogatú pufferrel végezve), az alábbi összetételű puffé
- 21 rek váltakozva történő alkalmazásával: 0,1 mól/1 nátriumacetát; 0,5 mól/1 NaCl (pH=4,0); és 0,1 mól/1 Tris-HCl; 0,5 mól/1 NaCl (pH=8,0), majd a „Sepahrose-t sprueban szenvedő betegek és egészséges egyének szérumaival inkubáltuk (0,5 ml szérum / 1 ml Sepharose), egy éjszakán át, 4 °C-on, összekapcsoló pufferben [50 mmól/1 Tris-HCl; 150 mmól/1 NaCl; 1 mmól/1 CaCl2; 1 mmól/1 MgCl2 (pH=8,0)]. A feleslegben lévő szérumellenanyagokat összekapcsoló pufferrel történő háromszori mosással távolitottuk el.
Minden alkalommal, 1 ml HT1080-tápfolyadékot vagy a metabolikusan jelölt sejtek sejtlizátumát (mintegy 5xl04 sejt lizátumát) 50 μΐ „C14B-Sepharose-val (Pharmacia) 30 percig, szobahőmérsékleten előinkubáltunk, hogy a nemspecifikusan kötődő proteineket eltávolitsuk. Centrifugálást (10 OOOxg, 5 perc, 4 C) követően, a felülúszókat keverés mellett, 4 °C-on, 50 μΐ olyan „Sepharose-val inkubáltuk, amelyhez előzőleg a betegekből vagy kontroll egyénekből származó IgA-t kötöttünk. Ezután, a „Sepharosepelleteket 3x1 ml mosópufferrel [10 mmól/1 Tris-HCl; 1 % IGEPAL CA-630 (Sigma); 0,5 % nátrium-dezoxikolát; 0,1% nátrium laurilszulfát; Complete® (Boehringer) (pH=8,0), majd 1 ml, 10 mmól/1 Tris-HCl-pufferrel (pH=8,0) mostuk. Ezt követően, a pelleteket SDS vizsgálati pufferben szuszpendáltuk, 5 percig, redukáló vagy nem-redukáló körülmények mellett, 95 °C-on inkubáltuk; 10-12,5 % SDS-poliakrilamidgélen szétválasztottuk [Lámmli, U.K.: Nature 227, 680 (1970)]; majd a precipitálódott proteineket autoradiográfiával kimutattuk (1. ábra).
- 22 További vizsgálatok során, a tápfolyadék esetében kötődött nagy molekülatömegú proteinről kimutattuk, hogy az fibronektin, amely - más proteinek mellett - nem-specifikus módon kötődött „Sepharose-hoz.
Egy sejt-asszociált 85 kDa protein precipitálódott azonban mind a 30 tesztelt sprue betegből származó szérumból; míg a 15 kontrollszérum - ezen belül, normál szérumok, Colitis ulcerosában vagy Sjoegren-szindrómában szenvedő betegek széruma - esetében ilyen protein nem volt megfigyelhető. A fentiek alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy ez a protein a sprue kialakulása szempontjából alapvetően fontos autoantigén.
A gélek ezüst-nitráttal történő proteinfestésével [Henkeshoven J. és mtsai.: Electrophoresis 6, 103 (1985)] egy éles proteincsík volt hozzárendelhető az autoradiográfiával kimutatott 85 kDa csíkhoz.
1.3 . A 85 kPa autoantigén izolálása és tisztítása
Hogy az autoantigénből nagyobb mennyiséget izolálhassunk, összesen 65 (175 cm2 alapterületű) tenyésztőedényben HT1080-sejteket (mintegylO9 sejtet) tenyésztettünk. Röviddel azelőtt, hogy összefüggő tenyészet alakult volna ki, a tápfolyadékot FCS-mentes tápfolyadékra cseréltük, majd a sejteket további 16-20 órán át, C02-termosztátban inkubáltuk. A sejtek lizálását és az immunprecipitációt a fent leírtak szerint végeztük. A „Sepharose-pelletet összesen 4,5 ml, 2% DL-ditiotreitolt (Sigma) tartalmazó SDS-reakciópufferben inkubáltuk, 5 percig, 95 °C-on, hogy a kötődött
- 23 proteineket felszabadítsuk, majd azokat analitikus SDSpoliakrilamidgélen analizáltuk.
Az autoantigén további tisztítására, az immunprecipitátumot elúciós elektroforézissel, „Prep Cell (Modell 491, Bio-Rad) alkalmazásával szétválasztottuk, a következők szerint eljárva: 4,5 ml proteinelegyet 6,5 cm szeparáló gélből (8 % poliakrilamid; pH=8,8) és 1,5 cm gyüjtőgélből (4 % poliakrilamid; pH=6,8) álló kerek gélre vittünk fel (külső átmérő: 3 cm), majd elektroforézissel szétválasztottunk. Az egyes proteineket az elúciós pufferben gyűjtöttük [25 mmól/1 Tris-HCl; 0,1 mól/1 glicin; 0,01 % SDS (pH=8,3)], 1,2 ml frakciókban (0,8 ml/perc elúciós sebesség mellett). Az eluált frakciókat SDS-PAGE-gélen analizáltuk, a kívánt proteint tartalmazó frakciókat (mintegy 15 ml) elegyítettük, és ultrafiltrációs eljárással („Amicon Centriprep-50 alkalmazásával; lOOOxg mellett) mintegy 1 ml térfogatúra koncentráltuk.
1.4 Az autoantigén proteáz emésztése
Több vizsgált proteáz közül az endoproteináz-Asp-N bizonyult megfelelőnek a protein fragmentálására, mivel az nagy mértékben reprodukálható hasítási mintát eredményezett, viszonylag jól elkülöníthető fragmentumokkal. 1:100 arányú enzim:szubsztrát koncentrációt alkalmaztunk, és az emésztést 30 percig, 37 °C-on végeztük.
1·5 A proteinek transzferé PDVF-membránra
Miután a tisztított autoantigént emésztettük, a peptid fragmentumokat preparatív, 10 %-os Tricingélen szétválasztottuk [Schágger H. és mtsai.: Anal Biochem. 166, 368
- 24 (1987)] (2. ábra), és 4 °C-on, PVDF-mebránra (polivinilidén-difluorid; „Immobilon™, Millipore) vittük át, félszáraz gyorsbiot eljárással, grafit-tartalmú elektródlemezek •alkalmazásával („Fastblot B32/33; Biometra). Ebből a célból, a következő rétegeket helyeztük az anódlemezre: 1.) 1. anódpufferrel [300 mmól/1 Tris-HCl; 20 % metanol (pH=10,4)] átitatott szűrőpapírt; 2.) 2. anódpufferrel [30 mmól/1 Tris-HCl; 20 % metanol (pH=10,4)] átitatott szűrőpapírt; 3.) a metanolban aktivált és anódpufferrel ekvilibrált PVDF-membránt; 4.) a Tricingélt; 5.) két réteg, katódpufferrel átitatott szűrőpapírt [25 mmól/1 Tris-HCl; 40 mmól/1 ε-amino-n-kapronsav; 20 % metanol (pH=9,4)]; 6.) katódlemez. A transzfert 35 percen át, 180 mA mellet végeztük.
Ezután, a PVDF-membránt 0,1 % „Coomassie Blue Serva R250 festéket és 50 % metanolt tartalmazó elegyben 5 percig festettük, 50 metanolt, 10 % ecetsavat tartalmazó oldatban színtelen!tettük, desztillált vízzel alaposan mostuk, majd levegőn szárítottuk. Az emésztett autoantigén 10 kDa, 14 kDa, 16 kDa és 25 kDa molekulatömegű jellemző csíkjait óvatosan kivágtuk, és annak N-terminusát egy előzetes szekvenálással meghatároztuk.
1.6 Edman-degradáció
[Az eljárást Edman és Henschen leírása szerint végeztük: lásd Neddleman S.B.: „Protein Sequence Determination, Springer Verlag, Berlin, 232-279. oldal (1975)].
„Applied Biosystems 4778-Sequenator készülékkel végzett szekvenálássál három aminosav-szekvenciát kaptunk, amelyeket a „Swiss Prot 31 adatbázisban szereplő szekven- 25 ciákkal vetettünk össze („PC/GENES programcsomag alkalmazásával; IntelliGenetics). A fenti összehasonlítás szerint, minimális eltérésektől eltekintve, a három fragmentum szekvenciája egyértelműen megfelelt a humán szöveti transzglutamináz (tTG; EC 2.3.2.13; protein glutamin γ-glutamil transzferáz) szekvenciájának. A szekvenciákat az „egybetus kóddal adtuk meg; X nem azonosított aminosavat jelent:
t-Transzglutamináz:
kDa fragmentum:
t-Transzglutamináz:
kDa fragmentum:
t-Transzglutamináz:
kDa fragmentum:
28' REKLWRRGQP FW;
REKLWRRGQP F (S) ;
581' DLYLENPEIKIRILG;
DLYLENPEIXIXILG;
438' DITHTYKYPE;
DITLTYQYP(V).
A 25 kDa fragmentumhoz nem volt egyértelműen tTGszekvencia hozzárendelhető, mivel ez különböző peptidek elegyéből állt.
2. példa
A szöveti transzglutamináz (tTG) sprue-autoantigénként történő azonosítása
2.1. Tengerimalac tTG immunprecipitációja
Mivel az kereskedelemben hozzáférhető, és nagy fokú (>80 %) szekvenciahomológiát mutat humán tTG-vel, tengerimalac májból izolált tTG-t (Sigma) először gélelektorforézissel szétválasztottunk, hogy annak tisztaságát ellenőriz
- 26 zük. Több más protein jelenléte mellett, a tTG - amely az összes protein mintegy 50 %-át tette ki -, képviselte a legerősebb csíkok egyikét.
Bár a 687 aminosavból álló humán tTG csak kis mértékben különbözik a 690 aminosavból álló tengerimalac tTGproteintől, a két protein SDS-poliakrilamidgélen megfigyelhető migrációs sajátsága nagy mértékben eltér. Míg az állati eredetű protein a várakozásnak megfelelően, 75-80 kDa molekulatömegnek megfelelően vándorol, a humán proteint, annak ellenére, hogy az N-glikozilezést látszólag nem tartalmaz, jelentősen kisebb migrációs sebesség jellemzi, és az - amint azt a szakirodalomban leírják [Gentile V. és mtsai.: J. Biol. Chem. 266, 478 (1991)] -, 85 kDa látszólagos molekulatömegnek megfelelően vándorol.
A sprue betegek szérumából származó humán ellenanyagok és tengerimalac tTG közti reaktivitást immunoprecipitációs eljárással teszteltük. Ebből a célból, 4 pg tTG-t (Sigma), 500 pl, 0,5 % szarvasmarha szérumalbumint tartalmazó lízispufferben, keverés mellett, „Sepharose-B-hez kötött sprueIgA-val inkubáltunk, 4 °C-on, egy éjszakán át, majd a „Sepharose-t mostuk, redukáló körülmények mellett SDSreakciópufferben forraltuk, és a proteineket 10 %-os poliakrilamidgélen szétválasztottuk (lásd 4.1.2). Itt, a várt csík (80 kDa molekulatömegű csík) specifikus precipitációját észleltük, a szennyeződések nélkül.
2.2 A tTG autoantigénként történő azonosítása Westernblot eljárással
Miután 2 pg tengerimalac tTG-t SDS-gélen szétválasztottunk és nitrocellulózra vittünk át, a biottot 2 % alacsony zsírtartalmú fölözött tej port és 3 % Tween-20detergenst tartalmazó PBS-ben (pH=7,3), 4 °C-on, egy éjszakán át blokkoltuk. Ezt követően, a membránt egy órán át, a fentivel megegyező összetételű pufferben (1/200 arányban) hígított sprue szérumban inkubáltuk, háromszor mostuk, majd egy órán át, alkalikus foszfatázzal jelölt, humán IgA-val szemben irányuló (1/500 arányban hígított) nyúl ellenanyaggal inkubáltuk. A biottokat PBS-ben mostuk, majd „Nitro Blue tetrazolium és 5-bróm-4-klór-3-indolil-foszfát szubsztrátként történő alkalmazásával előhívtuk [Blake M.S. és mtsai.: Anal. Biochem. 136, 175 (1984)].
A 75-80 kDa méretű csík egyértelmű pozitív jelet adott a sprue szérummal, ami további bizonyítéka annak, hogy a sprue betegek széruma tTG-vel szemben irányuló, IgAosztályba tartozó ellenanyagokat tartalmaz; míg a kontroll szérumok esetében nem volt jel megfigyelhető.
2.3. A tTG endomizium-autoantigénként történő azonosítása, indirekt immunfluoreszcenciás eljárással
Főemlősből származó nyelőcső szöveti metszeteket (Euroimmun, Németország) alkalmaztunk sprue szérumokban jelen lévő, endomiziummal szemben irányuló IgA-ellenanyagok indirekt eljárással történő kimutatására, valamint azok tTG-vel történő gátolhatóságának igazolására. Miután 10 μΐ, PBS-ben 1/320 arányban hígított betegszérumot 0,5 μg vagy
- 28 10 μg tengerimalac tTG-vel (Sigma), valamint 10 μg BSA-val (Sigma) 1 órán át, szobahőmérsékleten előinkubáltunk, azokat a fenti nyelőcsőmetszetekkel inkubáltuk, 1 órán át, szobahőmérsékleten, magas páratartalmú légtérben. Pozitív kontrollként sprue szérumot alkalmaztunk (1/320 arányban hígítva), negatív kontrollként egészséges egyénektől származó szérumot alkalmaztunk (1/50 arányban hígítva). Miután a metszeteket 0,2 % BSA-t tartalmazó PBS-ben háromszor mostuk és levegőn szárítottuk, az autoantigéneket úgy mutattuk ki, hogy a metszeteket 1 órán át, szobahőmérsékleten, TRITC-jelölt, humán IgA-val szemben irányuló (PBS-ben 1/50 arányban hígított) nyúl ellenanyagokkal (Dianova) inkubáltuk. A feleslegben lévő ellenanyagokat úgy távolítottuk el, hogy a metszeteket 0,2 % BSA-t tartalmazó PBS-ben, PBS-ben, majd desztillált vízben mostuk.
A betegszérum alkalmazásával az ECM egyértelműen festődött az IgA-osztályú ellenanyagokkal, amely festődés növekvő koncentrációjú tTG hozzáadásával gátolható volt, de BSA-val történő előinkubálással nem. Az egészséges egyénekből származó szérum alkalmazásán alapuló kontroll esetében a nyelőcsőmetszeten festődés nem volt megfigyelhető.
3. példa
3.1 IgA-ellenanyagok kimutatásán alapuló sprue-specifikus ELISA kifejlesztése, sprue diagnózisára és utánkövetésére
Egy (1) μg tengerimalac transzglutaminázt (Sigma T5398) 100 μΐ PBS-ben polisztirén mikrotitráló lemezek
- 29 (Greiner Labortechnik, 96 mélyületü lemezek) mélyületeibe pipettáztunk, és a lemezeket lassú körkörös mozgatás mellett, 2 órán át, 37 °C-on inkubáltuk. A nem-kötődött tTG-t PBS-sel történő mosással távolítottak el (3x200 μΐ), a mélyületek szabad kötőhelyeit 250 μΐ, 1 % szarvasmarha szérumalbumint (Sigma) tartalmazó PBS-sel blokkoltuk, egy éjszakán át, 4 °C-on. Miután a mélyületeket 0, 1 % Tween-20detergenst tartalmazó PBS-sel mostuk (3x200 μΐ), azokhoz 0,1 % Tween-20-detergenst tartalmazó PBS-ben, csökkenő koncentrációjú szérumhígítás sort adtunk, és a lemezeket 1 órán át, szobahőmérsékleten, lassú körkörös mozgatás mellett inkubáltuk, majd Tween-20-detergenst tartalmazó PBSsel mostuk (3x200 μΐ), végül 1 órán át, szobahőmérsékleten, humán IgA-val szemben irányuló, peroxidázzal konjugált nyúl ellenanyagokkal (Dianova) inkubáltuk (amelyet 100 μΐ, 0,1 % Tween-20-detergenst tartalmazó PBS-ben, 1/400 arányban hígítva alkalmaztunk). Miután a mélyületeket PBS-sel mostuk (3-szor), a lemezeket 30 percig, szobahőmérsékleten, sötétben, 200 μΐ, következő összetételű oldattal inkubáltuk: 0,1 mól/1 citrát-puffér, 17,6 mmól/1 H202; 5,5 mmól/1 ofeniléndiamin-hidroklorid (Sigma) (pH=4,2); majd a képződött színes terméket ELISA-olvasóval (MRX, Dynatech Laboratories), 450 nm hullámhosszon kimutattuk.
Húsz (20), sprueban szenvedő betegtől származó szérumot teszteltünk gluténmentes terápia megkezdését megelőzően, és azt követően, azaz, a betegség aktív és kevésbé aktív fázisaiban. A tesztrendszer nagy mértékben szenzitívnek bizonyult, az értékek a sprue aktív fázisának megfelelően
- 30 alakultak. A diéta betartásának eredményeképp, terápia sikerét a tTG-vel szemben irányuló IgA-ellenanyagok mennyiségének csökkenése jelezte. A teszt magas fokú specifitása nyilvánvaló volt az egészséges egyénektől származó kontrollszérumok, Colitis ulcerosában, máj zsugorban, különböző tumorokban, Sjoegren szindrómában, stb. szenvedő betegektől származó szérumok alacsony fényelnyelési értékei (alacsony háttér szintje) alapján (3. ábra).
3.2 Egyéb osztályba tartozó ellenanyagok, például IgGellenanyagok kimutatásán alapuló ELISA-eljárás kifejlesztése, sprue diagnózisára és utánkövetésére
Mivel a sprue betegek mintegy 2 %-a IgA-deficiens, a szérumokat a bennük található tTG-vel szemben irányuló IgGellenanyagok szenzitivitására és specifitására teszteltük. Az ELISA-eljárást a 3.1. példában ismertetettek szerint végeztük, csupán azzal az eltéréssel, hogy abban a peroxidázzal konjugált, humán IgA-val szemben irányuló nyúl ellenanyagok (Dianova) helyett anti-humán-IgG-ellenanyagokat alkalmaztunk (Dianova). Szenzitívitásuk tekintetében, a sprue betegek esetében meghatározott értékek, mind a gluténmentes diéta megkezdését megelőzően, mind azt követően, megfeleltek az IgA-ellenanyagok kimutatásával kapott eredményeknek
Néhány kontroll szérum esetében, kis mértékben megnövekedett értékeket találtunk, ami összhangban volt azokkal a korábbi megfigyelésekkel, hogy az endomiziummal szemben irányuló, IgG-osztályba tartozó ellenanyagok indirekt
- 31 immunfluoreszcens eljárással történő kimutatása alacsonyabb specifitású vizsgálat (4. ábra).
3.3 . ELISA-eljárás - például IgA-ellenanyagok kimutatásán alapuló ilyen eljárás - kifejlesztése tTG-vel szemben irányuló immunreakcióval járó egyéb betegségek diagnózisára és utánkövetésére
Az ELISA-eljárást a 3.2 példában ismertetettek szerint végeztük.
Krónikus gyulladással járó betegségben vagy autoimmun betegségben [például Colitis ulcerosában (C.U:), Crohn-betegségben, akut autoimmun hepatitisben] szenvedő betegek szérumai esetében kis mértékben vagy mérsékelten emelkedett értékeket tapasztaltunk.
A tTG-vel szemben irányuló autoantigének kimutatására alkalmas IgG-specifikus ELISA-eljárás alkalmazható tehát tTG-vel szemben irányuló immunreakcióval járó betegségekben szenvedő betegek esetében diagnózisra, és a terápia hatásosságának ellenőrzésére.
4. példa
A szöveti transzglutamináz (tTG) eddig nem ismert funkciójának kimutatása, gliadin-keresztkötések létrehozásában
Mig a tTG által katalizált reakciókban acil-akceptorok széles spektruma vehet részt, az acil-donor szerepének betöltésére csak néhány molekula képes. Egy in vitro kísérletben radioaktívan jelölt putreszcin gliadinba történő, tTG által katalizált beépülését, és ezen keresztül azt
- 32 vizsgáltuk, hogy a gliadin képes-e a tTG donorszubsztrátjaként funkcionálni. Százhatvan (160) μΐ pufferben [0,1 mól/1 Tris-HCl; 150 mmól/1 NaCl; 5 mmól/1 CaCl2 (pH=7,5)] 1 pg szubsztrátot (gliadint vagy kontroll proteineket, például albumint), 2 pCi [3H]-putreszcint és 1 μg tTG-t (tengerimalac eredetű proteint; Sigma) inkubáltunk 2 órán át, 37 °C-on. A reakciót 100 μΐ, 50 %-os triklórecetsav („trichloracetic acid, TCA) hozzáadásával állítottuk le, és a proteineket 4 °C-on, egy éjszakán át precipitáltuk. Centrifugálást követően, a pelleteket 10 % TCA-val mostuk, SDS tartalmú reakciópufferben szuszpendáltuk, majd egyrészt - SDS-PAGE-gélen szétválasztottuk; másrészt, szcintillációs számlálóban a beütésszámot meghatároztuk. Míg a kontrollok esetében nem volt észlelhető putreszcinbeépülés, gliadin alkalmazása esetén egyértelműen kimutatható volt a [3H]-putreszcin beépülése, mind a szintillációs számlálóval meghatározott eredmények alapján, mint az SDSPAGE alapján, bizonyítékát szolgáltatva annak, hogy a gliadin kitűnő szubsztrátja a tTG-nek.
- 33 A leírásban a következő rövidítéseket alkalmaztuk:
Ab: („Antibody) ellenanyag;
APAAP: alkalikus foszfatáz - anti- alkalikus foszfatáz;
BSA: („bovine serum albumin) szarvasmarha szérumalbumin;
cm: centiméter;
DMEM: Dulbecco-féle módosított Eagle-tápfolyadék;
EC: enzim osztályozási hivatkozási szám;
ELISA: („Enzyme-linked immunosorbent assay) enzimmel jelölt reagens kötődésén alapuló immunoszorbens vizsgálati élj árás;
ECM: extracelluláris mátrix;
FCS: („fetal calf serum) fötális borjúszérum;
h: [hour(s)] óra, órák;
H2O2: hidrogén-peroxid;
HLA: humán limfocita antigén;
IEL: intraepitheliális limfociták;
lg: immunglobulin;
kDa: Kilodalton;
mól/1.: mól/liter;
mA: milliAmper;
MHC: („major histocompatibility complex) fő hisztokompatibilitási komplex;
min.: [„minute(s)] perc;
mmól/1: millimól/liter;
Mr: relatív molekulatömeg;
- 34 : mikrogramm;
μΐ: mikroliter;
PAGE: poliakrilamid gélelektroforézis;
PBS: („phosphate buffer) foszfát-puffer;
PLA2: foszfolipáz-A2;
PVDF: polivinilidén-difluorid;
SDS: („sodium dodoecyl sulfate) nátrium- dodecilszulfát;
TCA: („tricloracetc acid) triklórecetsav;
TGF: („transforming growth factor) transzformáló növekedési faktor ;
Tris : Tris- (hidroximetil)-aminometán;
tTG: („tissue transglutaminase) szöveti transzgluta mináz.
Claims (10)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás coeliakiás betegség immunológiai azonosítására, azzal jellemezve, hogy anti-tTG-ellenanyagokat mutatunk ki valamely testfolyadékban, szöveti transzglutaminázzal (tTG-vel·), tTG-tartalmú vegyületekkel, azok antigén sajátságú struktúráival, immunreaktiv szekvenciáival vagy analógjaival adott immunreakció alapján.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán IgA- és/vagy IgG-ellenanyagokat mutatunk ki.
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy humán, állati, szintetikus vagy rekombináns tTG-vel vagy tTG-tartalmú vegyülettel szemben irányuló ellenanyagokat mutatunk ki.
- 4. Az 1-3. igénypontok valamelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy önmagában ismert immunvizsgálati módszert alkalmazunk, előnyösen, a reagálóanyagok egyikét direkt vagy indirekt módszerrel, jól kimutatható jelölőanyaggal kapcsoljuk össze.
- 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kimutatást szilárd fázison végezzük.
- 6. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kimutatást ELISA-, RIA- vagy immunfluoreszcens eljárással végezzük.
- 7. tTG, tTG-tartalmú vegyület, ezek antigén sajátságú struktúrái, immunreaktiv szekvenciái vagy analógjai alkalmazása autoimmun betegségek diagnózisára vagy terápiájuk hatásosságának ellenőrzésére.
- 8. A 7. igénypont szerinti alkalmazások bármelyike, coeliakiás betegség diagnózisára vagy terápiája hatásosságának ellenőrzésére.
- 9. Szájon át adagolható gyógyászati hatóanyag, amely tTG-t, tTG-tartalmú vegyületet, ezek antigén sajátságú struktúráit, immunreaktiv szekvenciáit vagy analógjait, valamit - adott esetben - gyógyászatilag tolerálható adjuvánst tartalmaz, coeliakiás betegség kezelésére.
- 10. tTG, tTG-tartalmú vegyület, ezek antigén sajátságú struktúrái, immunreaktiv szekvenciái vagy analógjai alkalmazása coeliakiás betegség kezelésére alkalmas, szájon át adagolható gyógyászati hatóanyag előállítására.A bejelentő helyett a meghatalmazott:DANUBIASzabadalmi és Védjegy Iroda Kft.dr. Pethő Árpád
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE19630557A DE19630557C2 (de) | 1996-07-18 | 1996-07-18 | Verfahren zum Nachweis von Antikörpern aus Körperflüssigkeiten durch eine Immunreaktion mit Gewebe-Transglutaminase (tTG) sowie die Verwendung von tTG in Diagnose und Therapie |
| PCT/EP1997/003740 WO1998003872A2 (de) | 1996-07-18 | 1997-07-14 | IMMUNOLOGISCHES NACHWEISVERFAHREN VON ANTIKÖRPERN, DIE GEGEN GEWEBE-TRANSGLUTAMINASE (tTG) GERICHTET SIND, VERWENDUNG VON tTG ZUR DIAGNOSE UND THERAPIEKONTROLLE SOWIE ORALES PHARMAZEUTISCHES MITTEL ENTHALTEND tTG |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUP0202779A2 true HUP0202779A2 (hu) | 2002-12-28 |
| HUP0202779A3 HUP0202779A3 (en) | 2009-07-28 |
| HU228479B1 HU228479B1 (en) | 2013-03-28 |
Family
ID=7801172
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU0202779A HU228479B1 (en) | 1996-07-18 | 1997-07-14 | Immunological process for detecting antibodies directed towards tissue transglutaminase (ttg), use of ttg for diagnostic purposes and therapy control, and oral pharmaceutical agent containing ttg |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6319726B1 (hu) |
| EP (1) | EP0912898B1 (hu) |
| CN (1) | CN1138146C (hu) |
| AT (1) | ATE210296T1 (hu) |
| AU (1) | AU718797B2 (hu) |
| BR (1) | BR9710500B1 (hu) |
| CA (1) | CA2260769C (hu) |
| CZ (1) | CZ291662B6 (hu) |
| DE (2) | DE19630557C2 (hu) |
| DK (1) | DK0912898T3 (hu) |
| ES (1) | ES2131038T3 (hu) |
| GR (1) | GR990300020T1 (hu) |
| HU (1) | HU228479B1 (hu) |
| IL (1) | IL128042A (hu) |
| NO (1) | NO321466B1 (hu) |
| NZ (1) | NZ333744A (hu) |
| PL (1) | PL189091B1 (hu) |
| PT (1) | PT912898E (hu) |
| SI (1) | SI9720044B (hu) |
| SK (1) | SK284410B6 (hu) |
| WO (1) | WO1998003872A2 (hu) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU3596199A (en) * | 1998-05-06 | 1999-11-23 | Kobenhavns Universitet | Treatment of celiac disease |
| US7781169B1 (en) | 1999-06-28 | 2010-08-24 | Mats Paulsson | Diagnosis of gluten sensitive enteropathy and other autoimmunopathies |
| US6703208B1 (en) | 1999-10-20 | 2004-03-09 | Immco Diagnostics | Immunological assay for detection of antibodies in celiac disease |
| WO2001029090A1 (en) * | 1999-10-20 | 2001-04-26 | Immco Diagnostics | Immunological assay for detection of antibodies in celiac disease |
| CU22968A1 (es) * | 2000-06-07 | 2004-07-14 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Procedimiento para la detección de anticuerpos anti transglutaminasa con utilidad en el diagnóstico de la enfermedad celíaca |
| GB0103024D0 (en) * | 2001-02-07 | 2001-03-21 | Rsr Ltd | Assay for Autoantibodies to tissue transglutaminase |
| FI20010868A0 (fi) * | 2001-04-25 | 2001-04-25 | Markku Maeki | Menetelmä ja välineet gluteenin indusoimien tautien havaitsemiseksi |
| KR100488131B1 (ko) * | 2001-07-07 | 2005-05-06 | (주)푸드바이오테크 | 알레르기 진단용 단백질 칩과 알레르기 유발원의 검출방법 및 알레르기 유발 항체의 검출 방법 |
| GB0117870D0 (en) * | 2001-07-21 | 2001-09-12 | Univ Nottingham Trent | Method of diagnosis and kit of parts therefor |
| US7320788B2 (en) * | 2002-02-14 | 2008-01-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Enzyme treatment of foodstuffs for Celiac Sprue |
| DE60336754D1 (de) * | 2002-02-14 | 2011-05-26 | Univ R | Enzymbehandlung von nahrungsmitteln für zöliakie-sprue |
| US8143210B2 (en) | 2002-02-14 | 2012-03-27 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Enzyme treatment of foodstuffs for celiac sprue |
| RU2234086C2 (ru) * | 2002-05-08 | 2004-08-10 | Нижегородский научно-исследовательский институт детской гастроэнтерологии | Способ дифференциальной диагностики целиакии и хронического энтерита у детей с патологией тонкой кишки |
| US7265093B2 (en) * | 2002-05-14 | 2007-09-04 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Drug therapy for Celiac Sprue |
| US7202216B2 (en) * | 2002-05-14 | 2007-04-10 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Drug therapy for celiac sprue |
| US7462688B2 (en) * | 2002-05-14 | 2008-12-09 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Peptides for diagnostic and therapeutic methods for celiac sprue |
| AU2003234634A1 (en) * | 2002-05-14 | 2003-12-02 | Felix Hausch | Drug therapy for celiac sprue |
| CA2502700C (en) | 2002-11-20 | 2017-01-17 | Chaitan Khosla | Diagnostic method for celiac sprue |
| US7579313B2 (en) | 2003-11-18 | 2009-08-25 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Transglutaminase inhibitors and methods of use thereof |
| US7534426B2 (en) * | 2004-04-26 | 2009-05-19 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Glutenase enzyme assays |
| US7563864B2 (en) * | 2004-04-26 | 2009-07-21 | Celiac Sprue Research Foundation | Prolyl endopeptidase mediated destruction of T cell epitopes in whole gluten |
| US7628985B2 (en) * | 2004-04-26 | 2009-12-08 | The Board Of Regents Of The Leland Stanford Junior University | Therapeutic enzyme formulations and uses thereof in celiac sprue and/or dermatitis herpetoformis |
| US20080038760A1 (en) * | 2004-06-08 | 2008-02-14 | Method For Decting Anti-Transglutaminase Antibodies | Method for Detecting Anti-Transglutaminase Antibodies |
| EP2463656A1 (en) | 2006-07-25 | 2012-06-13 | Augurix S.A. | An immunochromatography device for the diagnosis of diseases in a sample |
| ES2369544T3 (es) * | 2007-01-26 | 2011-12-01 | Ga Generic Assays Gmbh | Procedimiento para la detección de anticuerpos en fluidos corporales mediante una reacción inmunitaria con glicoproteína 2 (gp2) de gránulos de zimogeno del páncreas para el diagnóstico diferencial de enfermedades inflamatorias del intestino y pancreatitis crónica. |
| JP2010521469A (ja) * | 2007-03-16 | 2010-06-24 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ リーランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティ | 食事性グルテンを消化するための酵素併用療法 |
| EP1978364B1 (en) | 2007-04-06 | 2011-06-01 | Zedira GmbH | Transglutaminase 6 as a diagnostic indicator of autoimmune diseases |
| HU0900199D0 (en) * | 2009-04-01 | 2009-06-29 | Debreceni Egyetem | Diagnosis of gluten-induced autoimmune diseases |
| FR2949782B1 (fr) * | 2009-09-04 | 2015-10-16 | Isp Investments Inc | Peptide activateur de la transglutaminase et composition cosmetique ou pharmaceutique le contenant. |
| JP6012767B2 (ja) | 2012-02-07 | 2016-10-25 | ヴィブラント ホールディングス リミテッド ライアビリティ カンパニー | 基板、ペプチドアレイ、および方法 |
| DE102012007510A1 (de) | 2012-04-17 | 2013-10-17 | Aesku.Diagnostics GmbH & Co. KG | Verfahren zur Präsymptomatischen Diagnostik von Zöliakie und Glutensensitivität |
| ES2729715T3 (es) | 2012-04-17 | 2019-11-05 | Aeneas Gmbh & Co Kg | Procedimiento para el diagnóstico presintomático de enfermedad celíaca y sensibilidad al gluten |
| US10006909B2 (en) | 2012-09-28 | 2018-06-26 | Vibrant Holdings, Llc | Methods, systems, and arrays for biomolecular analysis |
| US10286376B2 (en) | 2012-11-14 | 2019-05-14 | Vibrant Holdings, Llc | Substrates, systems, and methods for array synthesis and biomolecular analysis |
| EP3702782B1 (en) | 2013-02-15 | 2022-04-06 | Vibrant Holdings, LLC | Methods and compositions for amplified electrochemiluminescence detection |
| CN104090102B (zh) * | 2014-06-13 | 2016-08-17 | 江南大学 | 冷冻鱼糜中微生物谷氨酰胺转胺酶elisa检测方法 |
| EP3191629A4 (en) * | 2014-09-10 | 2018-07-11 | Vibrant Holdings, LLC | Peptide microarrays and novel biomarkers for celiac disease |
| WO2018218250A2 (en) | 2017-05-26 | 2018-11-29 | Vibrant Holdings, Llc | Photoactive compounds and methods for biomolecule detection and sequencing |
| US12319712B2 (en) | 2018-05-09 | 2025-06-03 | Vibrant Holdings, Llc | Methods of synthesizing a polynucleotide array using photoactivated agents |
| CN110055235A (zh) * | 2019-05-14 | 2019-07-26 | 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司 | 用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原及其制备方法、试剂盒及检测方法 |
| WO2025233646A2 (en) | 2024-05-09 | 2025-11-13 | Debreceni Egyetem | Detection of celiac disease-specific autoantibodies |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL155894B1 (en) * | 1987-12-23 | 1992-01-31 | Przed Zagraniczne W Polsce Pla | Test for assessing gluten-dependent enteropathies |
| DE3829524A1 (de) * | 1988-08-31 | 1990-03-01 | Behringwerke Ag | Verwendung von transglutaminasen als immunsuppressiva |
| DE19520480C2 (de) | 1995-06-03 | 1997-04-30 | Univ Leipzig | Immunochemisches Testmaterial und Enzymimmunoassay zur Diagnostik von Zöliakie und verwandten Eiweißintoleranzen |
| US5716794A (en) * | 1996-03-29 | 1998-02-10 | Xybernaut Corporation | Celiac antigen |
-
1996
- 1996-07-18 DE DE19630557A patent/DE19630557C2/de not_active Revoked
-
1997
- 1997-07-14 PT PT97939994T patent/PT912898E/pt unknown
- 1997-07-14 CA CA002260769A patent/CA2260769C/en not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-14 SK SK67-99A patent/SK284410B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1997-07-14 BR BRPI9710500-7A patent/BR9710500B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1997-07-14 DK DK97939994T patent/DK0912898T3/da active
- 1997-07-14 AU AU42011/97A patent/AU718797B2/en not_active Expired
- 1997-07-14 HU HU0202779A patent/HU228479B1/hu unknown
- 1997-07-14 IL IL128042A patent/IL128042A/en not_active IP Right Cessation
- 1997-07-14 PL PL97331203A patent/PL189091B1/pl unknown
- 1997-07-14 AT AT97939994T patent/ATE210296T1/de active
- 1997-07-14 NZ NZ333744A patent/NZ333744A/xx not_active IP Right Cessation
- 1997-07-14 WO PCT/EP1997/003740 patent/WO1998003872A2/de not_active Ceased
- 1997-07-14 DE DE59705683T patent/DE59705683D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-14 CZ CZ1999117A patent/CZ291662B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1997-07-14 CN CNB971965269A patent/CN1138146C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-14 ES ES97939994T patent/ES2131038T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1997-07-14 SI SI9720044A patent/SI9720044B/sl unknown
- 1997-07-14 EP EP97939994A patent/EP0912898B1/de not_active Expired - Lifetime
-
1999
- 1999-01-01 GR GR990300020T patent/GR990300020T1/el unknown
- 1999-01-13 US US09/229,716 patent/US6319726B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-01-15 NO NO19990190A patent/NO321466B1/no not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-08-08 US US09/925,076 patent/US20020076834A1/en not_active Abandoned
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUP0202779A2 (hu) | Immunológiai eljárás szöveti transzglutamináz (tTG) elleni antitestek kimutatására, tTG alkalmazása diagnosztikai célokra és terápiás ellenőrzésre, valamint tTG-t tartalmazó orális gyógyászati hatóanyag | |
| CA2502700C (en) | Diagnostic method for celiac sprue | |
| TWI333958B (hu) | ||
| JPH04501423A (ja) | マトリックスメタロプロテイナーゼペプチド：診断および治療における役割 | |
| EP0701569A1 (en) | Improved reagents and methods for the diagnosis and treatment of diabetes and stiff man syndrome | |
| CN101282989A (zh) | 用于诊断风湿性疾病的方法 | |
| Leung et al. | Osteopontin fragments with intact thrombin-sensitive site circulate in cervical cancer patients | |
| US7371834B2 (en) | Apoptosis-inducing factor | |
| Pelli et al. | Argininosuccinate lyase: a new autoantigen in liver disease | |
| EP2462439B1 (en) | Stabilized open form transglutaminase as a diagnostic indicator for autoimmune diseases | |
| BR112014002747A2 (pt) | método para medir um anticorpo anti-wt1 | |
| JP2006051019A (ja) | Ｍｅ−５、ｍｅ−２、及びｅｐｐ２：子宮内膜症に罹患している女性の血清中に存在する自己抗体と反応するヒト蛋白質抗原 | |
| CA2398710A1 (en) | Egg specific surface proteins | |
| EP1360280B1 (en) | Tissue transglutaminase | |
| HK1021025B (en) | Process for in vitro detecting the presence or absence of antibodies to anti-tissue transglutinase from body fluids | |
| Loppinet | Discovery and Engineering the TG2/LRP-1 Pathway for Lysosomal Delivery of Molecular Cargo: Implications for Celiac Disease | |
| JP2006180813A (ja) | アミノペプチダーゼｏおよびその利用 | |
| EP1663307A2 (en) | Method for treating, preventing and/or diagnosing cancer, related to the use of mal2 polypeptide | |
| Al-Bukhari | Investigation of the epitope specificities of antibodies to islet β-cell autoantigens |