CN110055235A - 用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原及其制备方法、试剂盒及检测方法 - Google Patents

用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原及其制备方法、试剂盒及检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原包括替换天然转谷氨酰胺酶中的特定氨基酸序列中的一个或多个特定氨基酸使所述天然转谷氨酰胺酶失去酶活性而形成的替换蛋白，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原具有免疫原性。本发明还公开了一种用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原的制备方法。本发明还公开了一种转谷氨酰胺酶抗体检测试剂盒及一种转谷氨酰胺酶抗体检测方法。

Description

用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原及其制备方法、试剂盒及 检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原及其制备方法、试剂盒及检测方法。
背景技术
乳糜泻(celiac disease，CD)是患者进食麦类食品后，对其中的醇溶谷蛋白不耐受而引起的慢性小肠吸收不良综合症，而α-醇溶蛋白含有大量可导致乳糜泻疾病的毒性肽。典型临床表现包括腹泻、腹痛、腹胀等消化道症状。若是未确诊或不及时治疗，将发展为吸收障碍，甚至可能增加肠道淋巴瘤和胃肠道肿瘤的风险。IgA抗肌内膜抗体(anti-EMA)和IgA抗转谷氨酰胺酶抗体(anti-tTG)在CD病人血清中含量很高，常作为CD疾病检测的标志物。由于anti-tTG比anti-EMA成本低，稳定性高，已成为CD的首选筛查手段。
转谷氨酰胺酶(缩写为tTG)属于蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶家族，能够催化酰基转移，普遍存在于许多不同的器官中，包括心脏、肝脏和小肠等。tTG除了自身的酶活功能外还是乳糜泻中的自身抗原。通过检测其对应的自身抗体，有助于诊断CD病。现有检测试剂盒的基本原理是通过固相化tTG作为抗原与检测病人血清中的anti-tTG结合，通过酶联免疫法检测血清中的anti-tTG含量，但酶联免疫法的检测特异性差并且灵敏度低。
发明内容
基于此，有必要提供一种检测灵敏度高且特异性强的用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原及其制备方法、试剂盒及检测方法。
一种用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原包括替换天然转谷氨酰胺酶中的特定氨基酸序列中的一个或多个特定氨基酸替换使所述天然转谷氨酰胺酶失去酶活性而形成的替换蛋白，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原具有免疫原性。
在其中一个实施例中，所述特定氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在其中一个实施例中，所述天然转谷氨酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述特定氨基酸选自所述天然转谷氨酰胺酶的第277位氨基酸半胱氨酸、第335位氨基酸组氨酸或第358位氨基酸天冬氨酸。
在其中一个实施例中，所述第277位氨基酸半胱氨酸替换后的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸中的一种。
在其中一个实施例中，所述第335位氨基酸替换后的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸中的一种。
在其中一个实施例中，所述第358位氨基酸替换后的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸中的一种。
在其中一个实施例中，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原还包括与所述替换蛋白的末端偶联的标签蛋白，所述标签蛋白选自His6标签蛋白、Flag标签蛋白、麦芽糖结合蛋白和谷胱甘肽巯基转移酶中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原通过对所述天然转谷氨酰胺酶的基因中的所述特定氨基酸序列中的一个或多个特定氨基酸的编码核苷酸进行替换，将所述替换后的转谷氨酰胺酶基因经基因工程技术发酵得到。
在其中一个实施例中，所述替换后的转谷氨酰胺酶基因如SEQ ID NO.5所示。
一种所述的用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原的制备方法，包括：
提供所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原对应的基因序列；
将所述基因序列插入到载体质粒中得到重组载体；以及
将所述重组载体导入到表达菌体中进行发酵得到所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原。
一种转谷氨酰胺酶抗体检测试剂盒，包括：用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原。
在其中一个实施例中，所述转谷氨酰胺酶抗体检测试剂盒还包括抗人IgA抗体、固相载体和化学发光分子，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原能够包被在所述固相载体上，所述化学发光分子能够标记在所述抗人IgA抗体上。
在其中一个实施例中，所述固相载体的表面具有羧基，所述固相载体能够通过所述羧基与所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原的氨基结合。
在其中一个实施例中，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原标记有生物素，所述固相载体标记有亲和素。
在其中一个实施例中，所述固相载体选自磁性颗粒。
在其中一个实施例中，所述化学发光分子选自吖啶酯和吖啶磺酰胺中的一种或多种。
在其中一个实施例中，所述转谷氨酰胺酶检测试剂盒还包括校准品、清洗剂以及激发剂中的一种或多种，所述激发剂用于使所述化学发光分子发光。
一种转谷氨酰胺酶抗体的检测方法，采用所述的转谷氨酰胺酶抗体检测试剂盒，并包括以下步骤：
将检测样品、所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原包被的所述固相载体和所述化学发光分子标记的所述抗人IgA抗体混合得到混合物；
从所述混合物中分离所述固相载体；
检测所述分离得到的固相载体的发光信号；以及
将所述发光信号带入到转谷氨酰胺酶浓度与发光信号关系的标准曲线中，得到所述检测样品中的转谷氨酰胺酶浓度。
在其中一个实施例中，所述将检测样品、所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原包被的所述固相载体和所述化学发光分子标记的所述抗人IgA抗体混合得到混合物的步骤包括：
将所述检测样品与所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原包被的所述固相载体混合孵育预定时间得到第一混合物；
用清洗液清洗所述第一混合物；
从所述清洗后的所述第一混合物中分离所述固相载体；以及
将从所述第一混合物中分离的所述固相载体与所述化学发光分子标记的所述抗人IgA抗体混合孵育得到第二混合物。
本发明通过对天然转谷氨酰胺酶中与酶活性相关的特定氨基酸序列中的一个或多个特定氨基酸进行替换得到所述用于检测转谷氨酰胺酶抗体的抗原，通过所述抗原与检测样品中的转谷氨酰胺酶抗体的特异性结合表征待测样品中的转谷氨酰胺酶抗体浓度。通过替换使所述与酶活性相关的特定氨基酸序列的性质改变，失去酶活性，失去酶活性的抗原用于检测转谷氨酰胺酶抗体时能够避免检测样品中的转谷氨酰胺酶底物与所述用于检测转谷氨酰胺酶抗体的抗原结合而将转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原占用从而造成假阳性，从而提高转谷氨酰胺酶抗体的检测灵敏性和特异性。
将本发明的用于检测转谷氨酰胺酶抗体的抗原包被固相载体，抗人IgA抗体标记化学发光分子，本发明检测的转谷氨酰胺酶抗体为IgA型抗体，将用于检测转谷氨酰胺酶抗体的抗原和抗人IgA抗体分别与检测样品中的转谷氨酰胺酶抗体结合，能够增加检测样品中的转谷氨酰胺酶抗体检测的特异性和精准性。所述固相载体作为结合的场所，有利于结合后产物的转移和清洗等，目标检测样品中的转谷氨酰胺酶抗体结合固相载体上的抗原的同时和标记有化学发光分子的抗人IgA抗体结合，化学发光分子作为检测标志物，通过化学发光分子的发光量表征检测样品中的转谷氨酰胺酶抗体的浓度，化学发光分子的发光量与检测样品中的转谷氨酰胺酶抗体的浓度成正比。
附图说明
图1为本发明一实施例的转谷氨酰胺酶抗体的检测方法的流程示意图；
图2为本发明一实施例的用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原的纯化后电泳结果照片；
图3为本发明一实施例的转谷氨酰胺酶抗体浓度与发光值的关系标准曲线照片。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本发明的用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原及其制备方法、试剂盒及检测方法进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例提供一种用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原包括替换天然转谷氨酰胺酶中的特定氨基酸序列中的一个或多个特定氨基酸使所述天然转谷氨酰胺酶失去酶活性而形成的替换蛋白，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原具有免疫原性。
本发明实施例通过对天然转谷氨酰胺酶中与酶活性相关的特定氨基酸序列中的一个或多个特定氨基酸进行替换得到所述用于检测转谷氨酰胺酶抗体的抗原，通过所述抗原与检测样品中的转谷氨酰胺酶抗体的特异性结合表征待测样品中的转谷氨酰胺酶抗体浓度。通过替换使所述与酶活性相关的特定氨基酸序列的性质改变，失去酶活性，失去酶活性的抗原用于检测转谷氨酰胺酶抗体时能够避免检测样品中的转谷氨酰胺酶底物与所述用于检测转谷氨酰胺酶抗体的抗原结合而将转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原占用从而造成假阳性，从而提高转谷氨酰胺酶抗体的检测灵敏性和特异性。
所述天然转谷氨酰胺酶包括687个氨基酸。天然转谷氨酰胺酶的氨基酸序列如SEQID NO.1所示。
所述天然转谷氨酰胺酶中与酶活性相关的所述特定氨基酸序列包括天然转谷氨酰胺酶的第270位至第360位氨基酸之间的氨基酸序列，将该段氨基酸序列的一个或多个特定氨基酸进行替换以后可使得转谷氨酰胺酶失去酶活性，即失去结合和催化底物发生化学反应的能力。所述特定氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。并且，将第270位至第360位氨基酸之间的氨基酸序列替换之后不会影响转谷氨酰胺酶的免疫原性，即转谷氨酰胺酶与转谷氨酰胺酶抗体的特异性结合能力。
发明人经过大量实验发现，所述天然转谷氨酰胺酶的第277位氨基酸半胱氨酸、第335位氨基酸组氨酸或第358位氨基酸天冬氨酸对于转谷氨酰胺酶的酶活性具有重要作用，将所述第277位氨基酸、第335位氨基酸或第358位氨基酸替换后将直接降低酶活性甚至完全失去酶活性。因此，替换的所述特定氨基酸为第277位氨基酸半胱氨酸、第335位氨基酸组氨酸或第358位氨基酸天冬氨酸中的一个或多个。优选的，将所述第277位氨基酸半胱氨酸、第335位氨基酸组氨酸和第358位氨基酸天冬氨酸均进行替换。
在一实施例中，所述第277位氨基酸半胱氨酸替换后的氨基酸可以为丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸中的一种。在一实施例中，所述第335位氨基酸替换后的氨基酸可以为丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸中的一种。在一实施例中，所述第358位氨基酸替换后的氨基酸可以为丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸中的一种。选择所述替换后的氨基酸能够使转谷氨酰胺酶失去酶活性并且不会破坏转谷氨酰胺酶的免疫原性，使得所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原仍能够与转谷氨酰胺酶抗体特异性结合。
在一实施例中，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原还包括与所述替换替换蛋白的末端偶联的标签蛋白，所述标签蛋白用于所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原的特异性筛选和纯化。所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原的筛选和纯化步骤可以通过与所述标签蛋白对应的层析柱进行操作。在一实施例中，所述标签蛋白可以选自His6标签蛋白、Flag标签蛋白、麦芽糖结合蛋白(MBP)和谷胱甘肽巯基转移酶(GST)中的一种或多种。优选的，所述标签蛋白选自谷胱甘肽巯基转移酶。
在一实施例中，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原可以通过直接人工合成氨基酸序列或者通过基因工程技术发酵得到。优选的，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原通过对所述天然转谷氨酰胺酶的基因中的所述特定氨基酸序列中的一个或多个特定氨基酸的编码核苷酸进行替换，将所述替换后的转谷氨酰胺酶基因经基因工程技术发酵得到。
在一实施例中，所述天然转谷氨酰胺酶抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述天然转谷氨酰胺酶抗体的基因序列如SEQ ID NO.3所示。在一具体实施例中，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原通过将天然转谷氨酰胺酶抗体的所述第277位氨基酸半胱氨酸替换为丙氨酸，将所述第335位氨基酸替换为丙氨酸，并将所述第358位氨基酸替换为丙氨酸形成。所述替换后的转谷氨酰胺酶基因序列如SEQ ID NO.5所示，利用所述替换后的转谷氨酰胺酶基因通过基因工程发酵得到的所述于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
所述替换后的转谷氨酰胺酶基因，即，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原对应的基因可以通过直接人工合成或者通过对天然转谷氨酰胺酶的基因进行基因突变的方法得到。
本发明实施例还提供一种所述的用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原的制备方法，包括：
S110，提供所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原对应的基因序列；
S120，将所述基因序列插入到载体质粒中得到重组载体；以及
S130，将所述重组载体导入到表达菌体中进行发酵得到所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原。
在步骤S110中，所述基因序列可以通过人工合成或采用PCR替换的方法得到。
在步骤S120中，所述载体质粒可以根据所述基因序列的情况进行选择。在一实施例中，所述载体质粒可以选自pGEX-4T-1载体。
所述将所述基因序列插入到载体质粒中得到重组载体的步骤可以包括：将所述基因序列与经酶切后的所述载体质粒进行酶连接得到酶连产物；将所述酶连产物转化到克隆菌体中发酵得到所述重组载体。所述克隆菌体可以选自TOP10菌体。
在步骤S130中，所述发酵得到所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原的步骤可以包括：将所述发酵后的发酵液进行分离和纯化。在一实施例中，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原包括所述标签蛋白，所述分离和纯化的方法可以为利用与所述标签蛋白相对应的层析柱对所述发酵液进行分离和纯化得到纯净的所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原。
本发明实施例还提供一种转谷氨酰胺酶抗体检测试剂盒，包括：用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原。
在一实施例中，所述转谷氨酰胺酶抗体检测试剂盒还可以包括抗人IgA抗体、固相载体和化学发光分子，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原能够包被在所述固相载体上，所述化学发光分子能够标记在所述抗人IgA抗体上。在所述试剂盒中，所述固相载体和所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原可以为单独设置的或者为用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原包被固相载体的形式。所述化学发光分子和所述抗人IgA抗体可以为单独设置的或者为化学发光分子标记抗人IgA抗体的形式。
将本发明实施例的用于检测转谷氨酰胺酶抗体的抗原包被固相载体，抗人IgA抗体标记化学发光分子，本发明实施例检测的转谷氨酰胺酶抗体为IgA型抗体，将用于检测转谷氨酰胺酶抗体的抗原和抗人IgA抗体分别与检测样品中的转谷氨酰胺酶抗体结合，增加了检测样品中的转谷氨酰胺酶抗体检测的特异性和精准性。所述固相载体作为结合的场所，有利于结合后产物的转移和清洗等，目标检测样品中的转谷氨酰胺酶抗体结合固相载体上的抗原的同时和标记有化学发光分子的抗人IgA抗体结合，化学发光分子作为检测标志物，通过化学发光分子的发光量表征检测样品中的转谷氨酰胺酶抗体的浓度，化学发光分子的发光量与检测样品中的转谷氨酰胺酶抗体的浓度成正比。
在一实施例中，所述化学发光分子可以选自但不限于吖啶酯和吖啶酰胺中的一种或多种。
在一实施例中，所述检测试剂盒还包括校准品、清洗剂以及激发剂中的一种或多种。
所述校准品为特定浓度梯度的天然IgA转谷氨酰胺酶抗体溶液，所述天然IgA转谷氨酰胺酶抗体溶液中的溶剂可以包括Tris-HCl缓冲液和牛血清白蛋白溶液中的一种或多种。所述天然IgA转谷氨酰胺酶抗体溶液的pH可以为7.5～8.5。
所述清洗液用于清洗未结合到所述固定载体上的试剂。所述清洗剂可以包括吐温和的Tris-HCl缓冲液中的一种或多种。
所述激发剂用于与所述化学发光分子反应从而使所述化学发光分子发光。在一实施例中，所述化学发光分子可以选自吖啶酯或吖啶磺酰胺，所述激发剂可以包括双氧水、硝酸和氢氧化钠。在碱性双氧水溶液中，所述化学发光分子受到过氧化氢离子进攻时，生成不稳定的二氧乙烷，二氧乙烷分解为CO2和电子激发态的N-甲基吖啶酮，当N-甲基吖啶酮回到基态时发出最大发射波长为430nm的光子。优选的，所述试剂盒还可以包括发光增强剂，所述发光增强剂可以为表面活性剂，所述表面活性剂可以选自曲拉通(Triton X-100)、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)和吐温20中的一种或多种。
所述固相载体和所述用于检测转谷氨酰胺酶抗体的抗原的包被方式可以为通过所述固相载体表面的活性基团与所述用于检测转谷氨酰胺酶抗体的抗原抗原结合或者通过对所述固相载体和所述用于检测转谷氨酰胺酶抗体的抗原分别进行分子标记，通过标记分子进行结合。所述活性基团可以包括氨基、羧基和羟基中的一种或多种。在一实施例中，所述固相载体的表面具有羧基，所述固相载体能够通过所述羧基与所述用于检测转谷氨酰胺酶抗体的抗原的氨基结合。所述分子标记可以为生物素和亲和素标记，所述生物素和所述亲和素可以特异性结合。在另一实施例中，所述用于检测转谷氨酰胺酶抗体的抗原标记有生物素，所述固相载体标记有亲和素。所述亲和素可以选自链霉亲和素。每个链霉亲和素可以结合4个生物素，从而扩大固相载体结合所述用于检测转谷氨酰胺酶抗体的抗原的容量。
在一实施例中，所述固相载体为所述转谷氨酰胺酶抗体检测的结合反应的载体，检测样品中转谷氨酰胺酶抗体与所述用于检测转谷氨酰胺酶抗体的抗原、抗人IgA抗体的结合集成在所述固相载体上，有利于转移、清洗和分离结合后的产物，使得操作更便利。所述固相载体可以为粒子状，粒子状的固相载体的表面积大，提供更多的结合位点从而提高反应容量，并且粒子状的固相载体更适用于液相反应，为检测的实施提供便利。所述固相载体颗粒可以选自聚苯乙烯粒子和磁性粒子中的一种或多种。优选的，所述固相载体选自磁性颗粒。磁性颗粒作为固相载体具有易于分离的特点，能够适用于自动化生产的需求。并且磁性颗粒的良好的环境抗性使得它可以适应从酸到碱的苛刻反应环境，从而使得反应体系具有更大的包容性。
所述抗人IgA抗体可以为鼠抗人IgA抗体和兔抗人IgA抗体中的一种或多种。
请参阅图1，本发明实施例还提供一种转谷氨酰胺酶抗体的检测方法，采用所述的转谷氨酰胺酶抗体检测试剂盒，并包括以下步骤：
S210，将检测样品、所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原包被的固相载体和所述化学发光分子标记的抗人IgA抗体混合得到混合物；
S220，从所述混合物中分离所述固相载体；
S230，检测所述分离得到的固相载体的发光信号；以及
S240，将所述发光信号带入到转谷氨酰胺酶浓度与发光信号关系的标准曲线中，得到所述检测样品中的转谷氨酰胺酶浓度。
优选的，所述将检测样品、所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原包被的固相载体和所述化学发光分子标记的抗人IgA抗体混合得到混合物的步骤可以包括：
S211，将所述检测样品与所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原包被的固相载体混合孵育预定时间得到第一混合物；
S212，用清洗液清洗所述第一混合物；
S213，从所述清洗后的所述第一混合物中分离所述固相载体；以及
S214，将从所述第一混合物中分离的所述固相载体与所述化学发光分子标记的抗人IgA抗体混合孵育得到第二混合物。
通过先将所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原包被的固相载体和待测样品混合，清洗后再与化学发光分子标记的抗人IgA抗体结合，步骤S211使得待测样品中的转谷氨酰胺酶抗体与所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原结合而固定在所述固相载体上，然后经过步骤S212和步骤S213将未结合到固相载体上的试剂清洗，避免未结合的化学发光分子的干扰。
所述待测样品、所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原包被的固相载体和所述化学发光分子标记的抗人IgA抗体的质量比可以根据待测样品中的转谷氨酰胺酶抗体浓度的大致情况进行确定。
实施例
(1)用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原的制备
采用基因工程技术手段，通过大量的分子生物学分析软件分析筛选出tTG酶活中心的关键位点，进行基因定点突变形成用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原的基因，使其失去催化酶活性，但依然保留免疫原性。使用软件优化密码子序列，然后化学合成核苷酸序列，用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原的基因序列如SEQ ID NO.5所示。将SEQ ID NO.5序列通过酶连接插入到pGEX-4T-1载体中得到酶连产物。将酶连产物将转化TOP10克隆菌体，得到重组载体pGEX-4T-1-tTG。经测序正确后，经发酵提取重组载体pGEX-4T-1-tTG质粒，转入表达菌体BL21(DE3)中，得到重组表达菌体。
含有重组载体pGEX-4T-1-tTG的BL21(DE3)菌，用含100ug/ml氨苄青霉素的500ml培养基37℃振荡培养至菌液浓度为OD600＝1.0左右，用终浓度为1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)20℃诱导16小时得到发酵液，然后4℃，7000rpm将发酵液离心3分钟收集菌体，每升发酵液的菌体用20ml的50mM Tris-HCl和200mM NaCl混合液，pH8.0重悬，超声破碎，将超声破碎裂解液在4℃，12000rpm离心20分钟，收集上清过Glutathione Sepharose 4FastFlow柱(GE)(简称GST柱)(缓冲液A:50mM Tris-HCl+200mM NaCl；缓冲液B:50mM Tris-HCl+200mM NaCl+20mM还原型谷胱甘肽)。用5倍柱床体积的缓冲液A平衡GST柱，加入裂解液上清，用5倍介质体积的缓冲液A洗去未结合的蛋白，之后用100％缓冲液B洗脱目的蛋白(用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原)。
对洗脱目的蛋白(用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原)进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳，电泳结果如图2所示。由图2可看出用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原的纯度达到90％左右，-20℃保存备用。
(2)转谷氨酰胺酶抗体检测试剂盒的制备
用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原包被的磁性颗粒制备：
取50mg羧基化的磁性颗粒(粒径为0.05-1um)悬浮液，磁分离，留沉淀，然后使用20mM，pH5.5的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液重悬，加入1mL新鲜制备的10mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)水溶液，活化磁性颗粒表面羧基，加入4mg步骤(1)得到的用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原，室温下混悬6h，磁分离，去上清，用含2％BSA的100mM pH8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原包被的磁性颗粒，按5mL/瓶分装，4℃保存备用。
吖啶酯标记的鼠抗人IgA抗体的制备：
取50ul 25mg/mL的鼠抗人IgA抗体，加入150ul 0.1M pH9.0-9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入1.5ul 5mg/mL的吖啶酯混匀，室温下避光反应，1.5h后取出，用5mL GEDesalting预装柱脱盐处理，先使用TBS平衡层析柱，然后加入反应后的吖啶酯溶液，收集蛋白峰样品保存，按5mL/瓶分装，4℃保存备用。
组织型谷氨酰胺转移酶抗体校准品的制备：
用缓冲液(40mM Tris-Cl，0.5％BSA，1％NaCl，pH8.0)将组织型转谷氨酰胺转移酶抗体IgA配制成浓度为0U/mL、2U/mL、5U/mL、10U/mL、20U/mL、50U/mL和100U/mL，每瓶0.5mL分装冻干，4℃保存备用。
(3)转谷氨酰胺转移酶抗体化学发光免疫检测方法：
本发明以化学发光测定仪为检测工具，步骤(2)的试剂盒为检测试剂，方法学模式为夹心法，即仪器依次加入检测样品、用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原包被的磁性颗粒、吖啶酯标记的鼠抗人IgA抗体，反应10min后，进行磁分离，仪器将反应混合物送入暗室，依次加入化学发光预激发液、化学发光激发液进行发光反应，最后记录发光强度，从标准曲线计算出检测样品的转谷氨酰胺转移酶抗体浓度。
(4)转谷氨酰胺转移酶抗体检测试剂盒的灵敏度和特异性测试
采用步骤(3)的方法，对0U/mL、2U/mL、5U/mL、10U/mL、20U/mL、50U/mL和100U/mL浓度的转谷氨酰胺转移酶抗体校准品进行检测，绘制标准曲线如图3所示。
接着对接着测试实际检测样品，根据检测样品发光值计算检测样品的转谷氨酰胺转移酶抗体浓度。
灵敏度的检测：
参照美国临床实验室标准化委员会标准(CLSI EP17-A)文件推荐实验方案，计算转谷氨酰胺转移酶抗体检测试剂盒的灵敏度，求得的灵敏度为2U/mL。
线性的检测：
采用转谷氨酰胺转移酶抗体检测试剂盒，对浓度为0U/mL、2U/mL、5U/mL、10U/mL、20U/mL、50U/mL和100U/mL的转谷氨酰胺转移酶抗体做线性分析，计算线性相关系数，r＝0.9996，另外，该试剂盒对转谷氨酰胺转移酶抗体样品检测的线性范围为2U/mL～100U/mL。
精密度测定：
取浓度为20U/mL及100U/mL两个转谷氨酰胺转移酶抗体样品，每个样本每个浓度各做3个平行，用三批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明该试剂盒批内及批间差均小于5％。
干扰性实验：
取混合血清分别添加干扰物，干扰物包括：结合胆红素、游离胆红素、血红蛋白、抗坏血酸和甘油酯中的一种或多种，血清和干扰物添加质量比按照1：20进行，分别测定混合血清及添加了各种干扰物后混合血清的测值，计算二者之间的偏差，以±10％为可接受范围。结果表明，干扰性均达到NCCLS文件标准，可用于临床实验室转谷氨酰胺转移酶抗体状况的准确评估。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司
<120> 用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原及其制备方法、试剂盒及检测方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Glu Glu Leu Val Leu Glu Arg Cys Asp Leu Glu Leu Glu Thr
1 5 10 15
Asn Gly Arg Asp His His Thr Ala Asp Leu Cys Arg Glu Lys Leu Val
20 25 30
Val Arg Arg Gly Gln Pro Phe Trp Leu Thr Leu His Phe Glu Gly Arg
35 40 45
Asn Tyr Glu Ala Ser Val Asp Ser Leu Thr Phe Ser Val Val Thr Gly
50 55 60
Pro Ala Pro Ser Gln Glu Ala Gly Thr Lys Ala Arg Phe Pro Leu Arg
65 70 75 80
Asp Ala Val Glu Glu Gly Asp Trp Thr Ala Thr Val Val Asp Gln Gln
85 90 95
Asp Cys Thr Leu Ser Leu Gln Leu Thr Thr Pro Ala Asn Ala Pro Ile
100 105 110
Gly Leu Tyr Arg Leu Ser Leu Glu Ala Ser Thr Gly Tyr Gln Gly Ser
115 120 125
Ser Phe Val Leu Gly His Phe Ile Leu Leu Phe Asn Ala Trp Cys Pro
130 135 140
Ala Asp Ala Val Tyr Leu Asp Ser Glu Glu Glu Arg Gln Glu Tyr Val
145 150 155 160
Leu Thr Gln Gln Gly Phe Ile Tyr Gln Gly Ser Ala Lys Phe Ile Lys
165 170 175
Asn Ile Pro Trp Asn Phe Gly Gln Phe Glu Asp Gly Ile Leu Asp Ile
180 185 190
Cys Leu Ile Leu Leu Asp Val Asn Pro Lys Phe Leu Lys Asn Ala Gly
195 200 205
Arg Asp Cys Ser Arg Arg Ser Ser Pro Val Tyr Val Gly Arg Val Val
210 215 220
Ser Gly Met Val Asn Cys Asn Asp Asp Gln Gly Val Leu Leu Gly Arg
225 230 235 240
Trp Asp Asn Asn Tyr Gly Asp Gly Val Ser Pro Met Ser Trp Ile Gly
245 250 255
Ser Val Asp Ile Leu Arg Arg Trp Lys Asn His Gly Cys Gln Arg Val
260 265 270
Lys Tyr Gly Gln Cys Trp Val Phe Ala Ala Val Ala Cys Thr Val Leu
275 280 285
Arg Cys Leu Gly Ile Pro Thr Arg Val Val Thr Asn Tyr Asn Ser Ala
290 295 300
His Asp Gln Asn Ser Asn Leu Leu Ile Glu Tyr Phe Arg Asn Glu Phe
305 310 315 320
Gly Glu Ile Gln Gly Asp Lys Ser Glu Met Ile Trp Asn Phe His Cys
325 330 335
Trp Val Glu Ser Trp Met Thr Arg Pro Asp Leu Gln Pro Gly Tyr Glu
340 345 350
Gly Trp Gln Ala Leu Asp Pro Thr Pro Gln Glu Lys Ser Glu Gly Thr
355 360 365
Tyr Cys Cys Gly Pro Val Pro Val Arg Ala Ile Lys Glu Gly Asp Leu
370 375 380
Ser Thr Lys Tyr Asp Ala Pro Phe Val Phe Ala Glu Val Asn Ala Asp
385 390 395 400
Val Val Asp Trp Ile Gln Gln Asp Asp Gly Ser Val His Lys Ser Ile
405 410 415
Asn Arg Ser Leu Ile Val Gly Leu Lys Ile Ser Thr Lys Ser Val Gly
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Arg Asp Glu Arg Glu Asp Ile Thr His Thr Tyr Lys Tyr Pro Glu Gly
435 440 445
Ser Ser Glu Glu Arg Glu Ala Phe Thr Arg Ala Asn His Leu Asn Lys
450 455 460
Leu Ala Glu Lys Glu Glu Thr Gly Met Ala Met Arg Ile Arg Val Gly
465 470 475 480
Gln Ser Met Asn Met Gly Ser Asp Phe Asp Val Phe Ala His Ile Thr
485 490 495
Asn Asn Thr Ala Glu Glu Tyr Val Cys Arg Leu Leu Leu Cys Ala Arg
500 505 510
Thr Val Ser Tyr Asn Gly Ile Leu Gly Pro Glu Cys Gly Thr Lys Tyr
515 520 525
Leu Leu Asn Leu Asn Leu Glu Pro Phe Ser Glu Lys Ser Val Pro Leu
530 535 540
Cys Ile Leu Tyr Glu Lys Tyr Arg Asp Cys Leu Thr Glu Ser Asn Leu
545 550 555 560
Ile Lys Val Arg Ala Leu Leu Val Glu Pro Val Ile Asn Ser Tyr Leu
565 570 575
Leu Ala Glu Arg Asp Leu Tyr Leu Glu Asn Pro Glu Ile Lys Ile Arg
580 585 590
Ile Leu Gly Glu Pro Lys Gln Lys Arg Lys Leu Val Ala Glu Val Ser
595 600 605
Leu Gln Asn Pro Leu Pro Val Ala Leu Glu Gly Cys Thr Phe Thr Val
610 615 620
Glu Gly Ala Gly Leu Thr Glu Glu Gln Lys Thr Val Glu Ile Pro Asp
625 630 635 640
Pro Val Glu Ala Gly Glu Glu Val Lys Val Arg Met Asp Leu Leu Pro
645 650 655
Leu His Met Gly Leu His Lys Leu Val Val Asn Phe Glu Ser Asp Lys
660 665 670
Leu Lys Ala Val Lys Gly Phe Arg Asn Val Ile Ile Gly Pro Ala
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<210> 2
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Arg Val Lys Tyr Gly Gln Cys Trp Val Phe Ala Ala Val Ala Cys
1 5 10 15
Thr Val Leu Arg Cys Leu Gly Ile Pro Thr Arg Val Val Thr Asn Tyr
20 25 30
Asn Ser Ala His Asp Gln Asn Ser Asn Leu Leu Ile Glu Tyr Phe Arg
35 40 45
Asn Glu Phe Gly Glu Ile Gln Gly Asp Lys Ser Glu Met Ile Trp Asn
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Phe His Cys Trp Val Glu Ser Trp Met Thr Arg Pro Asp Leu Gln Pro
65 70 75 80
Gly Tyr Glu Gly Trp Gln Ala Leu Asp Pro Thr
85 90
<210> 3
<211> 2078
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcgatcgcca tggccgagga gctggtctta gagaggtgtg atctggagct ggagaccaat 60
ggccgagacc accacacggc cgacctgtgc cgggagaagc tggtggtgcg acggggccag 120
cccttctggc tgaccctgca ctttgagggc cgcaactacg aggccagtgt agacagtctc 180
accttcagtg tcgtgaccgg cccagcccct agccaggagg ccgggaccaa ggcccgtttt 240
ccactaagag atgctgtgga ggagggtgac tggacagcca ccgtggtgga ccagcaagac 300
tgcaccctct cgctgcagct caccaccccg gccaacgccc ccatcggcct gtatcgcctc 360
agcctggagg cctccactgg ctaccaggga tccagctttg tgctgggcca cttcattttg 420
ctcttcaacg cctggtgccc agcggatgct gtgtacctgg actcggaaga ggagcggcag 480
gagtatgtcc tcacccagca gggctttatc taccagggct cggccaagtt catcaagaac 540
ataccttgga attttgggca gtttgaagat gggatcctag acatctgcct gatccttcta 600
gatgtcaacc ccaagttcct gaagaacgcc ggccgtgact gctcccgccg cagcagcccc 660
gtctacgtgg gccgggtggt gagtggcatg gtcaactgca acgatgacca gggtgtgctg 720
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gtgaccaact acaactcggc ccatgaccag aacagcaacc ttctcatcga gtacttccgc 960
aatgagtttg gggagatcca gggtgacaag agcgagatga tctggaactt ccactgctgg 1020
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agggcgaacc acctgaacaa actggccgag aaggaggaga cagggatggc catgcggatc 1440
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<210> 4
<211> 687
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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Claims (10)

1.一种用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原，其特征在于，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原包括替换天然转谷氨酰胺酶中的特定氨基酸序列中的一个或多个特定氨基酸使所述天然转谷氨酰胺酶失去酶活性而形成的替换蛋白，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原具有免疫原性。
2.根据权利要求1所述的用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原，其特征在于，所述特定氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.根据权利要求1所述的用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原，其特征在于，所述天然转谷氨酰胺酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述特定氨基酸选自所述天然转谷氨酰胺酶的第277位氨基酸半胱氨酸、第335位氨基酸组氨酸或第358位氨基酸天冬氨酸。
4.根据权利要求3所述的用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原，其特征在于，
所述第277位氨基酸半胱氨酸替换后的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸中的一种；和/或，
所述第335位氨基酸组氨酸替换后的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸中的一种；和/或，
所述第358位氨基酸天冬氨酸替换后的氨基酸为丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸中的一种。
5.根据权利要求1所述的用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原，其特征在于，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原还包括与所述替换蛋白的末端偶联的标签蛋白，所述标签蛋白选自His6标签蛋白、Flag标签蛋白、麦芽糖结合蛋白和谷胱甘肽巯基转移酶中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原，其特征在于，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原通过对所述天然转谷氨酰胺酶的基因中的所述特定氨基酸序列中的一个或多个特定氨基酸的编码核苷酸进行替换，将所述替换后的转谷氨酰胺酶基因经基因工程技术发酵得到。
7.根据权利要求6所述的用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原，其特征在于，所述替换后的转谷氨酰胺酶基因如SEQ ID NO.5所示。
8.一种根据权利要求1-7任一项所述的用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原的制备方法，包括：
提供所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原对应的基因序列；
将所述基因序列插入到载体质粒中得到重组载体；以及
将所述重组载体导入到表达菌体中进行发酵得到所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原。
9.一种转谷氨酰胺酶抗体检测试剂盒，其特征在于，包括：根据权利要求1-8任一项所述的用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原；
还包括抗人IgA抗体、固相载体和化学发光分子，所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原能够包被在所述固相载体上，所述化学发光分子能够标记在所述抗人IgA抗体上。
10.一种转谷氨酰胺酶抗体的检测方法，采用如权利要求9所述的转谷氨酰胺酶检测试剂盒，并包括以下步骤：
将检测样品、所述用于转谷氨酰胺酶抗体检测的抗原包被的所述固相载体和所述化学发光分子标记的所述抗人IgA抗体混合得到混合物；
从所述混合物中分离所述固相载体；
检测所述分离得到的固相载体的发光信号；以及
将所述发光信号带入到转谷氨酰胺酶浓度与发光信号关系的标准曲线中，得到所述检测样品中的转谷氨酰胺酶浓度。
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