KR100593515B1 - 면역학적 측정방법, 면역학적 측정용 시약 및 그의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
검체중에 있어서의 대상으로 되는 항체 또는 항원에 대해서 면역학적으로 반응하는 항원 또는 항체에 검체를 혼합해서 면역학적 응집반응의 레벨을 측정함으로써 검체중의 대상으로 되는 항체 또는 항원의 존재를 정성적으로 또는 정량적으로 결정하는 측정방법에 있어서, 상기 반응하는 항원 또는 항체를, 담체에 대해서 결합능을 지닌 아미노산 서열을 개재해서 해당 담체에 효율적으로 고정하는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은, 검체중의 대상으로 하는 항체 또는 항원에 대응하는 항원 또는 항체를, 검체에 혼합한 후, 면역학적 응집반응을 일으켜, 응집상태를 검출 또는 측정하는, 해당 검체중의 대상으로 하는 항체 또는 항원의 면역학적 측정방법에 관한 것이다. 또, 본 발명은, 상기 측정방법에 사용되는 시약 및 해당 시약의 제조방법에 관한 것이다.
임상검사의 분야에서는, 혈액이나 소변 등의 생체시료중에 함유된 각종 성분을 측정함으로써, 각종 환자의 질병의 진단을 행하고 있고, 이들 측정방법으로서 각종 측정방법이 개발되어 이용되고 있다. 예를 들면, 효소반응을 이용하는 효소적 측정법, 항원-항체반응을 이용하는 면역학적 측정법 등이 광범위하게 이용되고 있다. 특히, 근년, 특이성이 높은 항원-항체반응을 이용한 면역측정법이, 그 측정정밀도가 높은 점으로부터 보다 빈번하게 이용되고 있다.
한편, 환경분야나 식품분석의 분야에서는, 종래, 시료로부터 측정대상물질을 추출해서 농출한 후, 고속액체크로마토그래피나 가스크로마토그래피를 이용해서 측 정하는 방법이 일반적이었다. 하지만, 근년, 다이옥신이나 내분비교란물질(소위 환경호르몬)등의 문제에서 보는 바와 같이, 극히 저농도의 측정대상물의 측정, 다종다양한 측정대상물의 측정, 다검체의 신속측정 등의 요구가 증대되어, 종래법에서의 대응이 곤란하게 되고 있다. 그래서, 근년, 항원-항체반응을 이용한 면역측정법이, 환경분석이나 식품분석의 분야에서도 이용되기 시작하고 있다.
면역측정법으로서는, 면역응집법(면역비촉법, 라텍스응집측정법), 효소면역측정법, 방사면역측정법 등을 들 수 있고, 목적에 따라서 적절하게 선택하면 된다. 특히, 물에 불용성인 담체에 항원 또는 항체를 고정하고, 해당 담체를 검체와 혼합해서 면역학적 응집반응을 시킨 후, 그 응집도를 검출하는 면역응집법은, 반드시 대형·고가의 측정장치를 필요로 하지 않고, 육안에 의해 간편하게 판정하는 것도 가능하므로, 현지(on-site)에서의 간이측정법 등으로서 널리 이용되고 있다. 그러나, 면역응집법에 있어서는, 일반적으로, 그 불용성 담체미립자로서 폴리스티렌라텍스나 젤라틴입자 등이 이용되고 있고(일본국 특개평 11-295313호 공보, 일본국 특개 2000-338108호 공보), 색조가 백색 혹은 투명하기 때문에, 육안에 의한 판정을 하고자 할 경우에는, 전문기술과 훈련을 필요로 하는 등의 과제가 있었다.
상기 과제를 해결하는 방법으로서, 안료나 염료 등의, 육안판정이 용이한 색조를 가진 물에 불용성인 담체를 이용하는 시도가 행해지고 있다. 일본국 특개평 4-274762호 공보에서는, 불용성 담체로서 프탈로시아닌색소를 이용해서, 해당 미립자에 물리적 흡착법에 의해서 항체를 고정한 고정화 항체를 사용함으로써, 면역학적 응집반응후의 응집물이 청색의 색조를 띠는 육안판정이 용이한 면역응집측정방법이 개시되어 있다.
그러나, 안료 등의 불용성 담체에 항원이나 항체를, 물리적 흡착에 의해서 고정하고자할 경우, 충분한 흡착력을 얻을 수 없는 경우가 있고, 측정용 시약의 제조효율이나 보존안정성 등에 있어서 과제가 있었다. 또, 일반적으로, 물리적 흡착에 의해서 항원이나 항체를 고정하고자 할 경우, 그들 항원이나 항체의 소수성도의 차이가 문제로 되어, 항상 일정량의 항원이나 항체를 고정하는 것이 곤란한 경우도 많이 있었다. 이것은, 측정계의 성능을 좌우하는 큰 요인이며, 나아가서는 제조로트간의 차를 일으키는 원인으로도 되고 있었다.
이 문제를 해소하기 위해, 항체를 일부 변성시켜서 소수성도를 높인 후, 불용성 담체에 흡착시키는 방법이 시도되어 있다(생화학실험법 11, 엔자임이뮤노에세이(Enzyme Immunoassay), 동경화학동인, p270, 1989년). 그러나, 이 방법에는, 변성에 의해서 항체가 활성을 잃을 경우가 있어, 전체 종류의 항체에는 응용할 수 없다고 하는 과제가 있었다.
본 발명의 목적은, 검체중의 측정대상물인 항체 또는 항원을 정량적으로 혹은 정성적으로 판정하는 개량된 면역학적 측정방법을 제공하는 데 있다. 또, 본 발명의 목적은, 상기 측정방법에 이용되는 측정용 시약 및 그 시약의 제조방법을 제공하는 데 있다.
본 발명자들은, 안료 등의 담체에 대해서, 결합능을 지닌 아미노산 서열을, 펩티드 라이브러리로부터 스크리닝해서, 이 아미노산 서열의 펩티드를, 유전공학적 수법을 이용해서 항원 또는 항체에 융합시켜서 제시한 바, 해당 항원 또는 항체를 효율적으로 상기 담체 표면에 고정하는 것이 가능하다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명의 일측면에 의하면, 검체중에 있어서의 대상으로 되는 항체 또는 항원의 존재 혹은 양을 판정하는 측정방법에 있어서,
각각 상기 검체중의 대상으로 되는 항체 또는 항원에 대응하는 항원 또는 항체가 고정된 담체를 준비하는 공정과;
상기 담체와 상기 검체를 혼합하는 공정과;
상기 혼합공정에 기인하는 면역학적 응집반응의 레벨을 측정하는 공정을 구비하고;
상기 담체에 고정된 항원 또는 항체는, 상기 담체에 대해서 결합능을 지닌 아미노산 서열을 개재해서 해당 담체에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 측정방법이 제공된다.
본 발명의 다른 양상에 의하면, 검체중에 있어서의 대상으로 되는 항체 또는 항원의 존재 혹은 양을 측정하기 위한 측정용 시약에 있어서,
상기 항체 또는 항원에 대응하는 항원 또는 항체가 담체에 고정되어 있고, 상기 담체에 고정된 상기 항원 또는 항체는, 상기 담체에 대해서 결합능을 지닌 아미노산 서열을 개재해서 해당 담체에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 측정용 시약이 제공된다.
본 발명의 또다른 양상에 의하면, 검체중에 있어서의 대상으로 되는 항체 또 는 항원의 존재 혹은 양을 측정하기 위한 측정용 시약의 제조방법에 있어서,
상기 항체 또는 항원에 대응하는 항원 또는 항체를 담체에 고정하는 공정을 구비하고,
상기 담체에 고정된 상기 항원 또는 항체는, 상기 담체에 대해서 결합능을 지닌 아미노산 서열을 개재해서 해당 담체에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 측정용 시약의 제조방법이 제공된다.
여기서, "항체 또는 항원의 존재 또는 양을 판정(측정)하는 것"이란, 응집상태의 측정에 사용되는 것으로, 즉, 응집의 유무를 정량적으로 구하는 것과, 응집의 정도를 정성적으로 구하는 것의 양쪽을 포함한다.
본 발명에 의하면, 항원 또는 항체를 효율적으로 담체의 표면에 고정할 수 있으므로, 제조공정이 극히 효율적이다.
또한, 안료 등의 색재가 담체로서 사용될 경우, 해당 색재의 표면에 항원 또는 항체가 고정되어 있는 측정용 시약은, 소정의 색조를 띠고 있으므로, 임상검사나 환경분석, 식품분석 등에 이용되는 측정용 시약으로서 사용될 때에, 육안판정이 용이하고 신뢰성이 높게 된다.
이상, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대해 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서 사용되는 담체로서는, 특히 제한은 없고, 종래 항원-항체반응에 사용되는 항원이나 항체의 담체로서 공지의 것이면 어느 것이라도 이용할 수 있다. 이러한 담체의 예로서는, 폴리스티렌, 스티렌-부타디엔 공중합체, 스티 렌-메타크릴산 공중합체, 폴리글리시딜 메타크릴레이트, 아크롤레인-에틸렌글리콜 디메타크릴레이트 공중합체 등의 유화중합에 의해 얻어진 유기 고분자 라텍스와 같은 유기 고분자 물질; 실리카, 실리카-알루미나, 알루미나 등의 무기산화물 등을 들 수 있다. 담체로서는 안료를 사용하는 것이 가능하다. 담체로서 사용되는 안료는, 특히 제한되지 않으며, 이러한 안료의 예로서는, 카본블랙, 산화구리, 이산화망간, 아닐린블랙, 활성탄, 비자성 페라이트, 마그네타이트 등의 흑색안료; 크롬옐로, 아연황, 황색산화철, 카드뮴옐로, 미네랄 패스트 옐로, 니켈티탄 옐로, 네이플스 옐로, 나프톨 옐로 S, 한자옐로 G, 한자 옐로 10G, 벤지딘 옐로 G, 벤지딘 옐로 GR, 퀴놀린 옐로 레이크, 퍼머넌트 옐로 NCG, 터트라진(tartrazine) 레이크 등의 황색안료; 적색 크롬옐로, 몰리브덴 오렌지, 퍼머넌트 오렌지 GTR, 피라졸론 오렌지, 벌칸오렌지, 벤지딘오렌지 G, 인단트렌 브릴리언트 오렌지 RK, 인단트렌 브릴리언트 오렌지 GK 등의 오렌지색안료; 산화철 레드, 카드뮴 레드 납, 황화수은, 카드뮴, 퍼머넌트 레드 4R, 리톨 레드, 피라졸론 레드, 워칭 레드, 카드뮴염, 레이크레드 C, 레이크레드 D, 브릴리언트카민 6B, 브릴리언트카민 3B, 에오신 레이크, 로다민 레이크 B, 알리자린 레이크 등의 적색안료; 아이런 블루, 코발트 블루, 알칼리 블루 레이크, 빅토리아 블루 레이크, 프탈로시아닌 블루, 비자성 프탈로시아닌 블루, 부분염소화 프탈로시아닌 블루, 패스트 스카이 블루, 인단트렌 블루 BC 등의 청색 안료; 망간 바이올렛, 패스트 바이올렛 B, 메틸 바이올렛 레이크 등의 자색안료; 산화 크롬, 크롬 그린, 피그먼트 그린 B, 말라카이트 그린 레이크, 파이날 옐로 그린 G 등의 그린 안료; 아연화, 산화 티탄, 안티몬백, 황화 아연 등의 백 색 안료; 바라이트 분말, 탄산 바륨, 클레이, 실리카, 화이트 카본, 탤크, 알루미나 화이트 등의 체질안료 등을 들 수 있으나, 사용가능한 안료는 이들로 한정되는 것은 아니다.
또한, 담체로서, 상기 유기 고분자물질 등을 안료나 염료로 착색해서 사용하는 것도 가능하다. 이 경우, 담체로부터 염료성분이 용출되어 버리지 않도록, 폴리머중에 염료를 봉입시키는 것이 바람직하다.
담체의 형상은, 그 용도에 따라서, 적절하게 선택가능하나, 예를 들면, 측정대상물이 항원이고, 담체표면에 대응하는 항체를 고정할 경우는, 1nm 내지 10nm의 범위내의 입자직경을 지닌 입자를 사용해도 되고, 보다 바람직하게는, 50nm 내지 1㎛의 범위내의 입자직경을 지닌 입자를 사용해도 된다.
본 발명에 있어서, 측정대상물인 항체 또는 항원에 대응하는 항원 또는 항체(상대 항원 또는 항체)로서는, 특히 제한은 없고, 측정대상물인 항체/항원과 항원-항체반응을 일으킬 수 있는 한, 생물유래의 단백질 또는 펩티드, 또는 이것을 일부 개변한 단백질 또는 펩티드, 인공적으로 설계된 단백질 또는 펩티드, 또는 이들의 단편을 이용하는 것이 가능하다. 예를 들면, 측정대상물이 항원이고, 담체 표면에 대응하는 항체를 고정할 경우에는, 상기 항체로서는, 모노클로날항체 또는 폴리클로날항체의 어느 것도 이용할 수 있다. 또, 측정대상물이 항체이고, 안료표면에 대응하는 항원을 고정할 경우에는, 상기 항원으로서는, 단백질 혹은 펩티드의 어느 것을 이용해도 된다.
예를 들면, C형 간염 바이러스(HCV) 감염증의 진단을 목적으로 해서, 혈액중의 C형 간염바이러스항체(HCV항체)의 존재유무를 측정하고자 할 경우에는, HCV항체와 항원-항체반응을 일으킬 수 있는 공지의 C형 간염바이러스의 항원 단백질, 예를 들면, HCV의 코어단백질이나 엔빌로프단백질과 같은 구조단백질, NS1단백질, NS2단백질, NS3단백질, NS4 단백질, NS5단백질과 같은 비구조단백질이나 그 단편으로 이루어진 군(Proc. Nat1. Acad, Sci, USA, 89, 10011-10015, 1992)으로부터 선택된 적어도 1개를, 상기 측정대상물에 대한 항원 또는 항체로서 이용하는 것이 가능하다. 또, 상기 항원단백질의 아미노산 서열의 일부가 아미노산의 부가, 결손, 치환 및/또는 삽입 등에 의해서 수식을 받은 것이어도, 항원성이 본 발명의 방법의 실시에 충분한 정도로 구비되어 있으면 사용할 수 있다.
본 발명의 담체에 대한 결합능을 지닌 아미노산 서열(담체-결합 아미노산 서열)을 얻기 위해서는, 예를 들면, 이하에 설명하는 파지(phage) 디스플레이 펩티드 라이브러리법을 이용하는 것이 가능하다. 파지 랜덤 펩티드 라이브러리를 구축하는 방법으로서는, 예를 들면, M13계 파지의 표면단백질(예를 들면, gene III단백질)의 N말단측 유전자에 랜덤서열의 합성유전자를 연결해서 제작하면 된다(Scott JK and Smith GP., Science, 249, 386, 1990, Cwirla SE et al., Proc. Nat1, Acad. Sci, USA, 87, 6378, 1990). 삽입되는 합성 유전자의 크기는, 펩티드가 안정적으로 발현될 수 있으면 특히 제한은 없지만, 제작한 라이브러리가 모든 랜덤서열을 망라하고, 또한, 발현된 펩티드가 결합능을 지니기 위해서는, 6 내지 40개의 아미노산을 코딩하는 유전자길이(대략 600 내지 4,000의 분자량에 상당함)가 적당하고, 그중에서도, 7 내지 18개의 아미노산이 보다 바람직하다.
목적의 담체에 결합하는 파지를 선택하기 위해서는, 담체를 컬럼이나 플레이트위에 고정화하고, 상기의 라이브러리를 담체에 접촉시켜, 결합파지를 남기면서 비결합파지는 세정에 의해 닦아 버린다. 세정후 남은 파지를 산 등에 의해서 용출시킨 후, 완충액으로 중화하고 나서, 해당 중화된 파지를 대장균에 감염시켜 파지를 증폭시킨다. 이 선별을 복수회 반복하면, 목적의 담체에 결합능이 있는 복수의 클론이 농축된다. 여기서, 단일의 클론을 단리하기 위해서, 재차 대장균에 감염시킨 상태에서, 배지플레이트상에 단일의 콜로니를 형성시킨다. 각각의 단일의 콜로니를 액체 배지에서 배양한 후, 배지상청액중에 존재하는 파지를 폴리에틸렌글리콜 등으로 침전정제하고, 그 염기서열을 해석하면 펩티드의 구조를 알 수 있다. 랜덤한 아미노산 서열을 지닌 펩티드라이브러리의 제작방법으로서는, 상기와 같은 파지를 이용하는 방법외에, 화학적으로 합성된 펩티드를 이용하는 것도 가능하다. 그 방법으로서, 예를 들면, 비즈(beads)를 이용하는 방법(Lam, K.S. et al., Nature, 354, 82, 1991), 액상 포커싱법(Houghton, R.A. et al., Nature 354, 84, 1991), 마이크로플레이트법(Fodor, S.P.A. et al., Science, 251, 767, 1991) 등이 보고되어 있고, 이들 방법중 어느 방법도 본 발명에 적용가능하다.
파지 디스플레이 펩티드 라이브러리의 스크리닝에 의해서, 담체에 대해서 결합능을 지닌 아미노산 서열이 2종이상 얻어진 경우에는, 이들 서열의 전부 또는 일부를 적당히 조합시켜 직렬로 연결한 서열을 담체에 대해서 결합능을 지닌 아미노산 서열로서 이용해서 된다. 이 때, 2종류의 아미노산 서열사이에는 적당한 스페이서 서열을 위치시키는 것이 바람직하다. 스페이서 서열로서는, 3 내지 약 400개의 아미노산으로 이루어진 것이 바람직하고, 또, 이러한 스페이서 서열은 어느 아미노산을 포함해도 된다. 가장 바람직하게는, 스페이서 서열은, 항원 또는 항체와 측정대상물과의 작용을 저해하지 않고, 또, 해당 항원 또는 항체가 담체에 결합하는 것을 방해하지 않는 것이다.
본 발명의 담체에 대한 결합능을 지닌 아미노산 서열은, 랜덤 펩티드 라이브러리의 스크리닝에 의해서 결정된 아미노산 서열외에, 담체의 화학적 성질에 의거해 합리적으로 설계된 아미노산 서열로 하는 것도 가능하다.
상기 방법에 의해 얻어진, 담체에 대한 결합능을 지닌 아미노산 서열은, 통상의 유전자 공학적 수법을 이용해서, 상대 항원 또는 항체에 융합해서 이용된다. 담체에 대한 결합능을 지닌 아미노산 서열은, 상기 상대 항원 또는 항체의 N말단 혹은 C말단에 융합시켜 발현시키는 것이 가능하다. 또, 적당한 스페이서 서열을 삽입해서 발현시키는 것도 가능하다.
스페이서 서열로서는, 3 내지 약 400개의 아미노산으로 이루어진 서열이 바람직하고, 또, 이러한 스페이서는, 어느 아미노산을 함유하고 있어도 된다. 가장 바람직하게는, 스페이서 서열이, 상대 항원 또는 항체와 측정대상물과의 사이의 작용을 방해하지 않고, 또한, 해당 항원 또는 항체가 담체에 대해서 결합하는 것을 방해하지 않는 것이다.
담체에 대해서 결합능을 지닌 펩티드와 상대 항원 또는 항체와의 융합체의 단리·정제방법은, 상기 항원 또는 항체의 활성이 유지될 수 있는 방법이면, 어느 방법도 이용할 수 있다.
상대 항원 또는 항체를 담체에 고정하는 공정은, 상기 상대 항원 또는 항체와 담체에 대해서 결합능을 지닌 아미노산 서열과의 융합체를, 수성 매체중에서 담체와 접촉시킴으로써 달성할 수 있다.
본 공정의 수성 매체의 조성은, 특히 제한되지 않지만, 예를 들면, 각종 완충액을 이용하는 것이 가능하다. 완충액으로서는, 생화학적 반응에 이용되는 일반적인 완충액, 예를 들면, 아세트산 버퍼, 인산 버퍼, 인산 칼륨버퍼, 3-(N-모르폴리노)프로판설폰산(MOPS)버퍼, N-트리스(히드록시메틸)메틸-3-아미노프로판설폰산(TAPS)버퍼, 트리스염산버퍼, 글리신버퍼, 2-(시클로헥실아미노)에탄설폰산(CHES)버퍼 등을 적합하게 이용할 수 있다. 완충액의 농도는, 일반적인 농도, 즉, 5mM 내지 1.0M의 범위로 사용하는 것이 가능하나, 바람직하게는, 10 내지 200mM로 사용한다. 또, pH는 5.5 내지 9.0, 바람직하게는, 7.0 내지 8.5로 되도록 조제하나, 사용하는 조건에 따라서는, 상기 범위로 제한되지 않는다.
또, 수성 매체중에서의 담체의 분산상태를 유지하기 위해, 후속 공정을 방해하지 않는 종류 및 농도이면, 적당한 계면활성제를 첨가해도 된다. 이와 같은 계면활성제의 예로서는, 올레산나트륨, 도데실설폰산나트륨, 도데실황산나트륨, 도데실-N-사르코신산 나트륨, 콜산나트륨, 데옥시콜산 나트륨, 타우로데옥시콜산 나트륨 등의 음이온 계면활성제; 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드, 도데실 피리듐 클로라이드 등의 양이온 계면활성제; 3-[(클로아미도프로필)디메틸-암모니오]-1-프로 판설폰산(CHAPS), 3-[(3-클로아미도프로필)디메틸-암모니오]-2-히드록시-1-프로판설폰산(CHAPSO), 팔미토일 리솔렉틴, 도데실-β-알라닌 등의 양성 계면활성제; 옥틸 글리코사이드, 옥틸 티오글리코사이드, 헵틸 티오글리코사이드, 데카노일-N-메틸 글루카미드(MEGA-10), 폴리옥시에틸렌 도데실 에테르(Brij, Lubrol), 폴리옥시에틸렌-i-옥틸페닐 에테르(Triton X), 폴리옥시에틸렌 노닐페닐에테르(Nonidet P-40, Triton N), 폴리옥시에틸렌 지방산에스테르(Span), 폴리옥시에틸렌소르비톨에스테르(Tween) 등의 비이온 계면활성제 등을 들 수 있다.
또한, 수성 매체중에서의 분체상태의 담체의 분산상태를 유지하기 위해서, 후속 공정을 방해하지 않는 종류 및 농도이면, 적당한 보조용매를 첨개해도 된다. 보조 용매로서는, 예를 들면, 헥산 등 직쇄형 지방족 탄화수소, 메탄올, 에탄올 등의 1가 알콜류나 글리세롤 등의 다가 알콜류 및 지방산 에테르류, 카르복시산에테르류, 이들의 유도체, 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 사용할 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 상기 상대 항원 또는 항체의 융합물의 담체에의 고정화는, 해당 담체와 상기 융합물을 소정의 수성 매체중에서 소정의 농도로 되도록 혼합함으로써 달성된다. 이 때, 항원 또는 항체가 담체의 표면에 균등하게 흡착되도록, 반응용기를 적당한 강도로 진탕 혹은 교반하는 것이 바람직하다.
고정화 양의 측정은, 예를 들면, 담체에 농도를 이미 알고 있는 항원 또는 항체용액을 첨가하여, 고정화 처리를 행하고, 해당 고정화 반응후의 용액중의 단백질 농도를 측정하여, 감산법에 의해 고정화 양을 산출하는 등의 방법을 이용하면 된다.
상기 방법에 의해 제작된 고정화된 항원 또는 항체는, 그대로 사용해도 되나, 사용전에 동결건조 등을 실시해도 된다.
항원 또는 항체의 고정화처리를 행하는 시간은, 1분간 내지 24시간이 바람직하고, 보다 바람직하게는, 10분간 내지 1시간이다. 과도하게 긴 처리는, 항원 또는 항체의 활성의 저하를 초래하므로 바람직하지 않다.
본 발명에 있어서, 상기 구성요소와 함께, 필요에 따라, 유기용제, 안료, 염료, 지시약, 계면활성제, 방부제, 보호제, 무기염 등의 첨가제를 사용해도 된다.
본 발명에 의하면, 항원 또는 항체를 효율적으로 담체 표면에 고정하는 것이 가능하므로, 제조공정이 극히 효율적이다.
또, 담체로서 안료 등의 색재를 이용한 경우, 임상검사나 환경분석, 식품분석 등에 이용한 때에, 정량성이 높은 동시에 육안판정이 용이하므로, 신뢰성이 높은 측정용 시약으로서 사용할 수 있다.
(실시예)
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이하에 설명하는 실시예는 본 발명의 실시형태의 일례이며, 본 발명의 기술적 범위는 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.
또, 이하의 실시예는, 담체로서 안료를 이용하고 있으나, 안료로 한정되지 않을 뿐만 아니라, 종래 항원 또는 항체반응에 사용되는 항원이나 항체의 담체로서 공지의 것은 특히 제한되지 않고 어느 것이라도 사용할 수 있다.
(참고예 1)
C형 간염바이러스 항체에 대한 항원단백질의 취득
사람 혈청(B형 간염 바이러스음성, GPT치 100단위이상) 0.5㎖에, 구아니듐 티오시아네이트용액(4M 구아니듐 티오시아네이트, 10mM EDTA, 0.1M 2-메르캅토메탄올, 2% 사르코실, 50mM 트리스-HCl, pH 7.6) 2.5㎖를 가하고, 페놀/클로로포름추출에 의해 상기 혈청중의 전체 RNA를 추출하고, 담체로서 글리코겐을 이용해서 에탄올침전에 의해 정제하였다. 그 후, 오카모토 등의 방법(Japan J. Exp. Med., 60(3), 167-177, 1990)에 의해, 랜덤헥사머를 프라이머로 이용해서 상기에서 얻어진 RNA로부터 cDNA합성시스템(베링거 멘하임사)에 의해 cDNA를 제작하였다. 이 cDNA를 템플레이트로서 이용해서, PCR법에 의해 목적의 DNA단편을 증폭하였다. 증폭된 DNA의 5'-말단을 T4폴리뉴클레오타이드 키나제에 의해 인산화한 후, 제한효소 SmaI로 소화한 플라스미드 pUC18(아머샴 파마시아 바이오테크사)과 연결해서 클로닝하였다. 플라스미드에 클로닝된 HCV의 cDNA의 염기서열을, 시쿼나제 시퀀스 키트(United States Biochemical사)에 의해 결정하고, 얻어진 뉴클레오타이드서열(즉, 염기서열)로부터, 목적으로 하는 항원 단백질 NS4를 코딩하는 부분을 선택하였다. 이 부분을, 상법에 따라 플라스미드 pUC18의 SmaI-절단부에 삽입해서, 플라스미드 pUC18-NS를 구축하였다.
(실시예 1)
구리프탈로시아닌에 대한 결합능을 지닌 아미노산서열의 취득
(1) 구리프탈로시아닌(α형, 토쿄카세이코교사 제품)을, 0.1% Tween-20을 함 유하는 TBS버퍼(50mM 트리스-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl)에 5㎎/㎖의 농도로 되도록 현탁하였다. 이 현탁액 10㎕를 엡펜도르프 튜브(Eppendorf tube)에 넣고, 990㎕ TBST버퍼(TBS버퍼 + 0.1% Tween-20)를 가해서 희석하였다.
(2) Ph. D. -12 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리(뉴잉글런드 바이오랩스사 제품) 4×1010pfu상당을 상기 튜브에 첨가하고, 25℃에서 10분간 정치하였다.
(3) 상기 튜브를 원심분리(20,630×g, 5분)한 후, 상청액을 따라 버리고, 침전으로서 안료를 회수하였다. 회수한 안료를 재차 TBST버퍼에 현탁하고, 원심분리를 반복해서 10회 세정하였다.
(4) 여기에 100㎕의 용출버퍼(0.2M 글리신-HCl, pH 2.2, 1㎎/㎖ BSA)를 가하고 1분간 정치한 후, 원심분리(20,630×g, 5분)한 후, 얻어진 상청액을 별도의 엡펜도르프 튜브로 옮겨, 15㎕의 1M 트리스-HCl(pH 9.1)을 가해서, 중화하고, 용출된 파지를 얻었다.
(5) 용출된 파지를 대수증식초기의 대장균 ER2537(뉴잉글런드 바이오랩스사 제품)에 감염시켜 증폭하였다. 37℃에서 4.5시간 배양하였다. 다음에, 증폭된 파지를 원심분리에 의해 상기 균체 세포로부터 분리하고, 폴리에틸렌글리콜의 침전에 의해 정제하였다. 이와 같이 해서 정제·증폭된 파지는 TBS버퍼에 현탁시키고, 적당한 희석계열을 이용해서 대장균에 감염시킴으로써 역가(titer)를 측정하였다.
(6) 증폭된 파지를 이용해서, 상기 (1)공정에서 (5)공정을 3회 반복하였다. 단, 이용한 TBS버퍼중의 Tween-20의 농도를 0.5%로 높임으로써, 세정의 조건을 보다 엄격하게 하였다.
2회째 사이클로부터는, 안료를 함유하지 않는 엡펜도르프 튜브를 사용해서 마찬가지의 조작을 행하여, 대조로서 이용하였다. 각 사이클에 있어서 용출된 파지의 역가를 표 1에 표시한다.
| 원액 (A) | 대조에 대한 결합 (B) | 프탈로사이닌에 대한 결합 (C) | C/A | C/B | |
| 1회째 사이클 | 4.0×1011 | 1.2×106 | 3.0×10-6 | ||
| 2회째 사이클 | 1.6×1011 | 1.1×105 | 1.7×105 | 1.1×10-5 | 1 |
| 3회째 사이클 | 2.0×1011 | 1.6×105 | 3.0×108 | 1.5×10-3 | 1800 |
| 4회째 사이클 | 1.7×1011 | 2.7×106 | 5.3×109 | 3.1×10-2 | 2000 |
(A, B 및 C의 단위: pfu/㎖)
최종적으로 용출된 파지를 과잉의 대장균에 감염시킴으로써 클론화하였다. 각 클론을 대장균에 감염시켜 증폭해서, ssDNA를 조제하고, 랜덤영역의 염기서열을 해독하여, 디스플레이하고 있는 펩티드의 아미노산 서열을 결정함으로써, 각 클론에 대해서, 구리프탈로시아닌에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열을 결정하였다. 결정된 아미노산서열과 그들의 빈도를 표 2에 표시한다.
| 결정된 아미노산서열 | 개수(A) | 빈도(A/36) |
| Lys-Tyr-Asp-Ser-Arg-His-Leu-His-Thr-His-Ser-His (서열번호 1) | 6 | 0.17 |
| Pro-Asn-Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Pro-Val-Arg-Trp-Glu (서열번호 2) | 6 | 0.17 |
| Lys-Cys-Cys-Tyr-Tyr-Asp-His-Ser-His-Ala-Leu-Ser (서열번호 3) | 4 | 0.11 |
| Glu-Tyr-Leu-Ser-Ala-Ile-Val-Ala-Gly-Pro-Trp-Pro (서열번호 4) | 3 | 0.08 |
| Lys-Leu-Trp-Ile-Leu-Glu-Pro-Thr-Val-Thr-Pro-Thr (서열번호 5) | 3 | 0.08 |
| Gln-Ser-Asn-Leu-Lys-Val-Ile-Pro-Ser-Trp-Trp-Phe (서열번호 6) | 3 | 0.08 |
| Trp-Ile-Pro-Pro-Gln-Trp-Ser-Arg-Leu-Ile-Glu-Pro (서열번호 7) | 3 | 0.08 |
| Asp-His-Pro-Gln-Ala-Lys-Pro-Asn-Trp-Tyr-Gly-Val (서열번호 8) | 1 | 0.02 |
| Gly-Leu-Pro-Pro-Tyr-Ser-Pro-His-Arg-Leu-Ala-Gln (서열번호 9) | 1 | 0.02 |
| Lys-Leu-Thr-Thr-Gln-Tyr-Met-Ala-Arg-Ser-Ser-Ser (서열번호 10) | 1 | 0.02 |
| Lys-Val-Trp-Met-Leu-Pro-Pro-Leu-Pro-Gln-Ala-Thr (서열번호 11) | 1 | 0.02 |
| Asn-Val-Thr-Ser-Thr-Ala-Phe-Ile-Asp-Thr-Pro-Trp (서열번호 12) | 1 | 0.02 |
| Arg-Leu-Asn-Leu-Asp-Ile-Ile-Ala-Val-Thr-Ser-Val (서열번호 13) | 1 | 0.02 |
| Thr-Leu-Pro-Ser-Pro-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Val-His (서열번호 14) | 1 | 0.02 |
| Thr-Asn-Arg-His-Asn-Pro-His-His-Leu-His-His-Val (서열번호 15) | 1 | 0.02 |
(실시예 2)
카본블랙에 대한 결합능을 지닌 아미노산서열의 취득
(1) 카본블랙(시그마 알드리치 재팬사 제품)을, 0.1% Tween-20을 함유하는 TBS버퍼(50mM 트리스-HCl, pH 7.5, 150mM NaCl)에 5㎎/㎖의 농도로 되도록 현탁하였다. 이 현탁액 10㎕를 엡펜도르프 튜브에 넣고, 990㎕ TBST버퍼(TBS버퍼 + 0.1% Tween-20)를 가해서 희석하였다.
(2) Ph. D. -12 파지 디스플레이 펩티드 라이브러리(뉴잉글런드 바이오랩스사 제품) 4×1010pfu상당을 상기 튜브에 첨가하고, 25℃에서 10분간 정치하였다.
(3) 상기 튜브를 원심분리(20,630×g, 5분)한 후, 상청액을 따라 버리고, 침전으로서 안료를 회수하였다. 회수한 안료를 재차 TBST버퍼에 현탁하고, 원심분리를 반복해서 10회 세정하였다.
(4) 여기에 100㎕의 용출버퍼(0.2M 글리신-HCl, pH 2.2, 1㎎/㎖ BSA)를 가하고 1분간 정치한 후, 원심분리(20,630×g, 5분)한 후, 얻어진 상청액을 별도의 엡펜도르프 튜브로 옮겨, 15㎕의 1M 트리스-HCl(pH 9.1)을 가해서, 중화하고, 용출된 파지를 얻었다.
(5) 용출된 파지를 대수증식초기의 대장균 ER2537(뉴잉글런드 바이오랩스사 제품)에 감염시켜 증폭하였다. 37℃에서 4.5시간 배양하였다. 다음에, 증폭된 파지를 원심분리에 의해 상기 균체 세포로부터 분리하고, 폴리에틸렌글리콜의 침전에 의해 정제하였다. 이와 같이 해서 정제·증폭된 파지는 TBS버퍼에 현탁시키고, 적당한 희석계열 및 대장균을 이용해서 역가(titer)를 측정하였다.
(6) 증폭된 파지를 이용해서, 상기 (1)공정에서 (5)공정을 4회 반복하였다. 단, 이용한 TBS버퍼중의 Tween-20의 농도를 0.5%로 높임으로써, 세정의 조건을 보다 엄격하게 하였다.
2회째 사이클로부터는, 안료를 함유하지 않는 엡펜도르프 튜브를 사용해서 마찬가지의 조작을 행하여, 대조로서 이용하였다. 각 사이클에 있어서 용출된 파지의 역가를 표 3에 표시한다.
| 원액 (A) | 대조에 대한 결합 (B) | 카본블랙에 대한 결합 (C) | C/A | C/B | |
| 1회째 사이클 | 4.0×1011 | 8.9×106 | 2.2×10-5 | ||
| 2회째 사이클 | 1.6×1011 | 1.1×105 | 3.8×106 | 2.4×10-5 | 35 |
| 3회째 사이클 | 2.0×1011 | 1.6×105 | 6.0×106 | 3.0×10-5 | 40 |
| 4회째 사이클 | 1.7×1011 | 1.1×106 | 1.5×108 | 8.8×10-4 | 140 |
| 5회째 사이클 | 1.9×1011 | 2.0×106 | 2.7×109 | 1.4×10-2 | 1400 |
(A, B 및 C의 단위: pfu/㎖)
최종적으로 용출된 파지를 과잉의 대장균에 감염시킴으로써 클론화하였다. 각 클론을 대장균에 감염시켜 증폭해서, ssDNA를 조제하고, 랜덤영역의 염기서열을 해독하여, 디스플레이하고 있는 펩티드의 아미노산 서열을 결정함으로써, 각 클론에 대해서, 카본블랙에 대해서 결합능을 지닌 아미노산서열을 결정하였다. 이와 같이 해서 얻어진 아미노산서열과 그들의 빈도를 표 4에 표시한다.
| 결정된 아미노산서열 | 개수(A) | 빈도(A/38) |
| Trp-Pro-His-Ala-Trp-Lys-Val-Trp-Trp-Pro-Ala-Ser (서열번호 16) | 4 | 0.10 |
| Asn-Trp-Trp-Trp-Pro-Pro-Tyr-Ile-Arg-His-Gln-Pro (서열번호 17) | 3 | 0.08 |
| Trp-His-Trp-Ser-Trp-Thr-Pro-Trp-Pro-Ser-His-His (서열번호 18) | 2 | 0.05 |
| Trp-Pro-Trp-Ala-Trp-His-Pro-Ser-Arg-Asp-Val-Tyr (서열번호 19) | 2 | 0.05 |
| Trp-His-Gly-Tyr-Trp-Tyr-Ser-Asn-Leu-Asn-Thr-Thr (서열번호 20) | 2 | 0.05 |
| Trp-Trp-Thr-Pro-Trp-Met-Ser-His-Ala-Tyr-Pro-Val (서열번호 21) | 2 | 0.05 |
| Trp-Pro-Asn-Pro-Tyr-Trp-Gly-Trp-Phe-Ala-Ala-Val (서열번호 22) | 2 | 0.05 |
| Thr-Ser-Trp-His-Thr-Trp-Trp-Trp-Arg-Gln-Pro-Pro (서열번호 23) | 2 | 0.05 |
| Asn-Ala-Trp-His-Lys-Tyr-Trp-Trp-Pro-Ile-Thr-Lys (서열번호 24) | 2 | 0.05 |
| His-Pro-Asn-Asn-Asp-Trp-Ser-Lys-Ala-Pro-Gln-Phe (서열번호 25) | 2 | 0.05 |
| Trp-Trp-Thr-Pro-Gln-Pro-Trp-Trp-Ser-Phe-Pro-Ile (서열번호 26) | 1 | 0.03 |
| Trp-Pro-His-Thr-Ser-Trp-Trp-Gln-Thr-Pro-Leu-Thr (서열번호 27) | 1 | 0.03 |
| Trp-His-Val-Asn-Trp-Asp-Pro-Met-Ala-Trp-Tyr-Arg (서열번호 28) | 1 | 0.03 |
| Ser-Trp-Pro-Trp-Trp-Thr-Ala-Tyr-Arg-Val-His-Ser (서열번호 29) | 1 | 0.03 |
| Trp-His-Ser-Asn-Trp-Tyr-Gln-Ser-Ile-Pro-Gln-Val (서열번호 30) | 1 | 0.03 |
| Gly-Tyr-Trp-Pro-Trp-Lys-Phe-Glu-His-Ala-Thr-Val (서열번호 31) | 1 | 0.03 |
| Ala-Trp-Trp-Pro-Thr-Thr-Phe-Pro-Pro-Tyr-Tyr-Tyr (서열번호 32) | 1 | 0.03 |
| Asn-Pro-Trp-Trp-Ser-His-Tyr-Tyr-Pro-Arg-Ser-Val (서열번호 33) | 1 | 0.03 |
| Trp-Pro-His-Asn-Tyr-Pro-Leu-Asn-His-Ser-Asn-Pro (서열번호 34) | 1 | 0.03 |
| Thr-Trp-Ala-His-Pro-Leu-Glu-Ser-Asp-Tyr-Leu-Arg (서열번호 35) | 1 | 0.03 |
| His-Thr-Tyr-Tyr-His-Asp-Gly-Trp-Arg-Leu-Ala-Pro (서열번호 36) | 1 | 0.03 |
| Thr-Phe-Val-Gln-Thr-Pro-Leu-Ser-His-Leu-Ile-Ala (서열번호 37) | 1 | 0.03 |
| Arg-Val-Pro-Pro-Ser-Lys-Leu-Thr-Arg-Pro-Pro-Phe (서열번호 38) | 1 | 0.03 |
| His-Ser-Ile-Tyr-Ser-Val-Thr-Pro-Ser-Thr-Ala-Ser (서열번호 39) | 1 | 0.03 |
| Leu-Asn-Thr-Gln-Asn-His-Ala-Pro-Leu-Pro-Ser-Ile (서열번호 40) | 1 | 0.03 |
(실시예 3)
구리프탈로시아닌에 대한 결합능을 지닌 항원 단백질의 제조
항원 단백질 NS4를 코딩하는 염기서열에 대해서 상류측 프라이머(5'-TTCACAGGATCCACTGAGCTCGATGCC CAC-3') 및 하류측 프라이머(5'-GATCTGGGCTCGAGCCGACTAGTA GTCGCT-3')를 이용해서, 참고예에서 제조한 플라스미드 pUC18-NS를 템플레이트로 해서 PCR을 행하였다. 얻어진 DNA단편은, 상류 영역에 BamHI/SacI제한부위를, 하류 영역에 SpeI/XhoI제한부위를, 그리고 이들 사이에 항원 단백질 NS4유전자를 지녔다.
정제된 PCR증폭산물을 BamHI와 XhoI에 의해 소화하고, 플라스미드 pGEX-6P-1(아머샴 파마시아 바이오테크사 제품)의 대응하는 부위에 삽입해서, 벡터 pGEX-NS를 얻었다.
다음에, 실시예 1의 각 결합 아미노산서열(서열번호 1 내지 15)에 대해서 스페이서 서열 GS를 개재해서 항원 단백질 NS4의 N말단에 융합해서 발현할 수 있는 대장균 발현벡터를 다음과 같이 해서 제작하였다. 이들 아미노산 서열을 코딩하는 DNA로서 하기 표 5에 표시한 2본쇄(本鎖)의 합성 올리고뉴클레오타이드의 세트를 준비하였다.
| 아미노산 서열번호 | 합성 DNA의 염기서열 |
| 1 | 5'-GATCCAAATATGATAGCCGTCATCTGCATACCCATAGCCATGAGCT-3' 5'-CATGGCTATGGGTATGCAGATGACGGCTATCATATTTG-3' |
| 2 | 5'-GATCCCCGAACCGTCTGGGCCGTCGTCCGGTGCGTTGGGAAGAGCT-3' 5'-CTTCCCAACGCACCGGACGACGGCCCAGACGGTTCGGG-3' |
| 3 | 5'-GATCCAAATGCTGCTATTATGATCATAGCCATGCGCTGAGCGAGCT-3' 5'-CGCTCAGCGCATGGCTATGATCATAATAGCAGCATTTG-3' |
| 4 | 5'-GATCCGAATATCTGAGCGCGATTGTGGCGGGCCCGTGGCCGGAGCT-3' 5'-CCGGCCACGGGCCCGCCACAATCGCGCTCAGATATTCG-3' |
| 5 | 5'-GATCCAAACTGTGGATTCTGGAACCGACCGTGACCCCGACCGAGCT-3' 5'-CGGTCGGGGTCACGGTCGGTTCCAGAATCCACAGTTTG-3' |
| 6 | 5'-GATCCCAGAGCAACCTGAAAGTGATTCCGAGCTGGTGGTTTGAGCT-3' 5'-CAAACCACCAGCTCGGAATCACTTTCAGGTTGCTCTGG-3' |
| 7 | 5'-GATCCTGGATTCCGCCGCAGTGGAGCCGTCTGATTGAACCGGAGCT-3' 5'-CCGGTTCAATCAGACGGCTCCACTGCGGCGGAATCCAG-3' |
| 8 | 5'-GATCCGATCATCCGCAGGCGAAACCGAACTGGTATGGCGTGGAGCT-3' 5'-CCACGCCATACCAGTTCGGTTTCGCCTGCGGATGATCG-3' |
| 9 | 5'-GATCCGGCCTGCCGCCGTATAGCCCGCATCGTCTGGCGCAGGAGCT-3' 5'-CCTGCGCCAGACGATGCGGGCTATACGGCGGCAGGCCG-3' |
| 10 | 5'-GATCCAAACTGACCACCCAGTATATGGCGCGTAGCAGCAGCGAGCT-3' 5'-CGCTGCTGCTACGCGCCATATACTGGGTGGTCAGTTTG-3' |
| 11 | 5'-GATCCAAAGTGTGGATGCTGCCGCCGCTGCCGCAGGCGACCGAGCT-3' 5'-CGGTCGCCTGCGGCAGCGGCGGCAGCATCCACACTTTG-3' |
| 12 | 5'-GATCCAACGTGACCAGCACCGCGTTTATTGATACCCCGTGGGAGCT-3' 5'-CCCACGGGGTATCAATAAACGCGGTGCTGGTCACGTTG-3' |
| 13 | 5'-GATCCCGTCTGAACCTGGATATTATTGCGGTGACCAGCGTGGAGCT-3' 5'-CCACGCTGGTCACCGCAATAATATCCAGGTTCAGACGG-3' |
| 14 | 5'-GATCCACCCTGCCGAGCCCGCTGGCGCTGCTGACCGTGCATGAGCT-3' 5'-CATGCACGGTCAGCAGCGCCAGCGGGCTCGGCAGGGTG-3' |
| 15 | 5'-GATCCACCAACCGTCATAACCCGCATCATCTGCATCATGTGGAGCT-3' 5'-CCACATGATGCAGATGATGCGGGTTATGACGGTTGGTG-3' |
(서열번호 43 - 72)
표 5에 표시한 바와 같은 각각의 아미노산 서열에 대해서 2종의 DNA단편을 합성하고, 제조업자의 지시서에 따라 T4폴리뉴클레오타이드 키나제(Gibco사 제품)를 이용해서 인산화하였다. 이어서, 2종의 합성 DNA단편을 등몰비로 혼합하고, 80℃에서 5분간 가열하고, 그 후 실온까지 천천히 냉각시킴으로써 2본쇄 DNA단편을 얻었다. 얻어진 2본쇄 DNA단편은, 그 후의 클로닝에 직접 이용하였다.
플라스미드 pGEX-NS를 BamHI 또는 SacI에 의해 소화하고, 상기 2본쇄 DNA단편중 어느 하나를 삽입하였다. 이 벡터를 이용해서 숙주 미생물인 대장균(JM109) 을 형질전환하여, 결합 아미노산서열-NS4-글루타티온-S-트랜스페라제(GST) 융합단백질을 발현하는 형질전환체를 얻었다. 형질전환된 균주의 확인은 Miniprep(Wizard Minipreps DNA Purification Systems, PROMEGA사 제품)를 이용해서 조제한 플라스미드 DNA를 템플레이트로 해서 pGEX 5' 시퀀싱 프라이머(Sequencing Primer)(아머샴 파마시아 바이오테크사 제품)를 이용한 시퀀싱에 의해서 인서트의 염기서열을 결정함으로써 행하였다.
얻어진 균주를 LB-Amp배지 10㎖에서 하룻밤 예비배양한 후, 해당 예비배양액 0.1㎖를, 신선한 LB-Amp배지 10㎖에 옮겨, 37℃, 170rpm에서 3시간 진탕배양하였다. 그 후 IPTG를 첨가(최종농도: 1mM)하고, 37℃에서 4 내지 12시간 배양을 지속하였다.
IPTG유도한 대장균을 집균(8,000×g, 2분, 4℃)하고, 1/10량의 4℃ PBS에 재현탁하였다. 상기 균체를 동결해동 및 고주파음에 의한 분해에 의해 파쇄하고, 원심분리(8,000×g, 10분, 4℃)해서 고형물을 제거하였다. 목적의 발현단백질이 상청액에 존재하는 것을 SDS-PAGE로 확인한 후, 발현된 GST융합 단백질을 글루타티온 세파로스 4B(Glutathione Sepharose 4B beads; 아머샴 파마시아 바이오테크사 제품)를 이용해서 정제하였다.
상기 글루타티온 세파로스는, 미리 다음과 같이 비특이적 흡착을 제어하는 처리를 행하였다. 즉, 글루타티온 세파로스를 동량의 PBS로 원심분리(8,000×g, 1분, 4℃)에 의해 3회 세정한 후, 4% BSA함유 PBS를 동량 첨가해서 4℃에서 1시간 정치하였다. 처리후, 얻어진 산물을 동량의 PBS로 2회 세정하고, 1/2량의 PBS에 재현탁하였다.
전처리한 글루타티온 세파로스 40㎕를, 무세포추출액 1㎖에 첨가하고, 4℃에서 서서히 교반하였다. 이것에 의해, GST융합단백질을 글루타티온 세파로스에 흡착시켰다.
흡착후, 원심분리(8,000×g, 1분, 4℃)해서 글루타티온 세파로스를 회수하고, 400㎕의 PBS로 3회 세정하였다. 그 후, 10mM 글루타티온 40㎕를 첨가하고, 4℃에서 1시간 교반해서, 흡착한 GST융합 단백질을 용출시켰다. 원심분리(8,000×g, 2분, 4℃)해서 상청액을 회수한 후, PBS에 대해서 투석해서, GST융합 단백질을 정제하였다. 이 정제된 단백질은, SDS-PAGE에 의해, 싱글밴드를 나타내는 것을 확인하였다.
각 GST융합 단백질 500㎍을 프레시션(PreScission) 프로테아제(아머샴 파마시아 바이오테크사 제품)로 소화한 후, 글루타티온 세파로스를 통과시켜 프레시션 프로테아제와 GST를 제거하였다. 플로-쓰로(flow-through)분획을 또, PSB로 평형화한 세파덱스 G200컬럼에 걸어, 발현단백질의 최종 정제물을 얻었다. 이 최종 정제된 단백질은, SDS-PAGE에 의해 싱글밴드를 나타내는 것을 확인하였다.
(실시예 4)
카본블랙에 대한 결합능을 지닌 항원 단백질의 제조
항원 단백질 NS4를 코딩하는 염기서열에 대해서 상류측 프라이머(5'-TTCACAGGATCCACTGAGCTCGATGCC CAC-3') 및 하류측 프라이머(5'-GATCTGGGCTCGAGCCGACTAGTA GTCGCT-3')를 이용해서, 참고예에서 제조한 플라스미드 pUC18-NS를 템플레이트로 해서 PCR을 행하였다. 얻어진 DNA단편은, 상류 영역에 BamHI/SacI제한부위를, 하류 영역에 SpeI/XhoI제한부위를, 그리고 이들 사이에 항원 단백질 NS4유전자를 지녔다.
정제된 PCR증폭산물을 BamHI와 XhoI에 의해 소화하고, 플라스미드 pGEX-6P-1(아머샴 파마시아 바이오테크사 제품)의 대응하는 부위에 삽입해서, 벡터 pGEX-NS를 얻었다.
다음에, 실시예 2의 각 결합 아미노산서열(서열번호 16 내지 40)에 대해서 스페이서 서열 GS를 개재해서 항원 단백질 NS4의 N말단에 융합해서 발현할 수 있는 대장균 발현벡터를 다음과 같이 해서 제작하였다. 이들 아미노산 서열을 코딩하는 DNA로서 하기 표 6에 표시한 2본쇄의 합성 올리고뉴클레오타이드의 세트를 준비하였다.
| 아미노산 서열번호 | 합성 DNA의 염기서열 |
| 16 | 5'-GATCCTGGCCGCATGCGTGGAAAGTGTGGTGGCCGGCGAGCGAGCT-3' 5'-CGCTCGCCGGCCACCACACTTTCCACGCATGCGGCCAG-3' |
| 17 | 5'-GATCCAACTGGTGGTGGCCGCCGTATATTCGTCATCAGCCGGAGCT-3' 5'-CCGGCTGATGACGAATATACGGCGGCCACCACCAGTTG-3' |
| 18 | 5'-GATCCTGGCATTGGAGCTGGACCCCGTGGCCGAGCCATCATGAGCT-3' 5'-CATGATGGCTCGGCCACGGGGTCCAGCTCCAATGCCAG-3' |
| 19 | 5'-GATCCTGGCCGTGGGCGTGGCATCCGAGCCGTGATGTGTATGAGCT-3' 5'-CATACACATCACGGCTCGGATGCCACGCCCACGGCCAG-3' |
| 20 | 5'-GATCCTGGCATGGCTATTGGTATAGCAACCTGAACACCACCGAGCT-3' 5'-CGGTGGTGTTCAGGTTGCTATACCAATAGCCATGCCAG-3' |
| 21 | 5'-GATCCTGGTGGACCCCGTGGATGAGCCATGCGTATCCGGTGGAGCT-3' 5'-CCACCGGATACGCATGGCTCATCCACGGGGTCCACCAG-3' |
| 22 | 5'-GATCCTGGCCGAACCCGTATTGGGGCTGGTTTGCGGCGGTGGAGCT-3' 5'-CCACCGCCGCAAACCAGCCCCAATACGGGTTCGGCCAG-3' |
| 23 | 5'-GATCCACCAGCTGGCATACCTGGTGGTGGCGTCAGCCGCCGGAGCT-3' 5'-CCGGCGGCTGACGCCACCACCAGGTATGCCAGCTGGTG-3' |
| 24 | 5'-GATCCAACGCGTGGCATAAATATTGGTGGCCGATTACCAAAGAGCT-3' 5'-CTTTGGTAATCGGCCACCAATATTTATGCCACGCGTTG-3' |
| 25 | 5'-GATCCCATCCGAACAACGATTGGAGCAAAGCGCCGCAGTTTGAGCT-3' 5'-CAAACTGCGGCGCTTTGCTCCAATCGTTGTTCGGATGG-3' |
| 26 | 5'-GATCCTGGTGGACCCCGCAGCCGTGGTGGAGCTTTCCGATTGAGCT-3' 5'-CAATCGGAAAGCTCCACCACGGCTGCGGGGTCCACCAG-3' |
| 27 | 5'-GATCCTGGCCGCATACCAGCTGGTGGCAGACCCCGCTGACCGAGCT-3' 5'-CGGTCAGCGGGGTCTGCCACCAGCTGGTATGCGGCCAG-3' |
| 28 | 5'-GATCCTGGCATGTGAACTGGGATCCGATGGCGTGGTATCGTGAGCT-3' 5'-CACGATACCACGCCATCGGATCCCAGTTCACATGCCAG-3' |
| 29 | 5'-GATCCAGCTGGCCGTGGTGGACCGCGTATCGTGTGCATAGCGAGCT-3' 5'-CGCTATGCACACGATACGCGGTCCACCACGGCCAGCTG-3' |
| 30 | 5'-GATCCTGGCATAGCAACTGGTATCAGAGCATTCCGCAGGTGGAGCT-3' 5'-CCACCTGCGGAATGCTCTGATACCAGTTGCTATGCCAG-3' |
| 31 | 5'-GATCCGGCTATTGGCCGTGGAAATTTGAACATGCGACCGTGGAGCT-3' 5'-CCACGGTCGCATGTTCAAATTTCCACGGCCAATAGCCG-3' |
| 32 | 5'-GATCCGCGTGGTGGCCGACCACCTTTCCGCCGTATTATTATGAGCT-3' 5'-CATAATAATACGGCGGAAAGGTGGTCGGCCACCACGCG-3' |
| 33 | 5'-GATCCAACCCGTGGTGGAGCCATTATTATCCGCGTAGCGTGGAGCT-3' 5'-CCACGCTACGCGGATAATAATGGCTCCACCACGGGTTG-3' |
| 34 | 5'-GATCCTGGCCGCATAACTATCCGCTGAACCATAGCAACCCGGAGCT-3' 5'-CCGGGTTGCTATGGTTCAGCGGATAGTTATGCGGCCAG-3' |
| 35 | 5'-GATCCACCTGGGCGCATCCGCTGGAAAGCGATTATCTGCGTGAGCT-3' 5'-CACGCAGATAATCGCTTTCCAGCGGATGCGCCCAGGTG-3' |
| 36 | 5'-GATCCCATACCTATTATCATGATGGCTGGCGTCTGGCGCCGGAGCT-3' 5'-CCGGCGCCAGACGCCAGCCATCATGATAATAGGTATGG-3' |
| 37 | 5'-GATCCACCTTTGTGCAGACCCCGCTGAGCCATCTGATTGCGGAGCT-3' 5'-CCGCAATCAGATGGCTCAGCGGGGTCTGCACAAAGGTG-3' |
| 38 | 5'-GATCCCGTGTGCCGCCGAGCAAACTGACCCGTCCGCCGTTTGAGCT-3' 5'-CAAACGGCGGACGGGTCAGTTTGCTCGGCGGCACACGG-3' |
| 39 | 5'-GATCCCATAGCATTTATAGCGTGACCCCGAGCACCGCGAGCGAGCT-3' 5'-CGCTCGCGGTGCTCGGGGTCACGCTATAAATGCTATGG-3' |
| 40 | 5'-GATCCCTGAACACCCAGAACCATGCGCCGCTGCCGAGCATTGAGCT-3' 5'-CAATGCTCGGCAGCGGCGCATGGTTCTGGGTGTTCAGG-3' |
(서열번호 73 - 122)
표 6에 표시한 바와 같은 각각의 아미노산 서열에 대해서 2종의 DNA단편을 합성하고, 제조업자의 지시서에 따라 T4폴리뉴클레오타이드 키나제(Gibco사 제품)를 이용해서 인산화하였다. 이어서, 2종의 합성 DNA단편을 등몰비로 혼합하고, 80℃에서 5분간 가열하고, 그 후 실온까지 천천히 냉각시킴으로써 2본쇄 DNA단편을 얻었다. 얻어진 2본쇄 DNA단편은, 그 후의 클로닝에 직접 이용하였다.
플라스미드 pGEX-NS를 BamHI 또는 SacI에 의해 소화하고, 상기 2본쇄 DNA단편중 어느 하나를 삽입하였다. 이 벡터를 이용해서 숙주 미생물인 대장균 JM109를 형질전환하여, 결합 아미노산서열-NS4-글루타티온-S-트랜스페라제(GST) 융합단백질을 발현하는 형질전환체를 얻었다. 이 형질전환체의 확인은 Miniprep(Wizard Minipreps DNA Purification Systems, PROMEGA사 제품)를 이용해서 조제한 플라스미드 DNA를 템플레이트로 해서 pGEX 5' 시퀀싱 프라이머(Sequencing Primer)(아머샴 파마시아 바이오테크사 제품)를 이용한 시퀀싱에 의해서 인서트의 염기서열을 결정함으로써 행하였다.
얻어진 균주를 LB-Amp배지 10㎖에서 하룻밤 예비배양한 후, 해당 예비배양액 0.1㎖를, 신선한 LB-Amp배지 10㎖에 옮겨, 37℃, 170rpm에서 3시간 진탕배양하였다. 그 후 IPTG를 첨가(최종농도: 1mM)하고, 37℃에서 4 내지 12시간 배양을 지속하였다.
IPTG유도한 대장균을 집균(8,000×g, 2분, 4℃)하고, 1/10량의 4℃ PBS에 재현탁하였다. 상기 균체를 동결해동 및 고주파음에 의한 분해에 의해 파쇄하고, 원심분리(8,000×g, 10분, 4℃)해서 고형물을 제거하였다. 목적의 발현단백질이 상청액에 존재하는 것을 SDS-PAGE로 확인한 후, 발현된 GST융합 단백질을 글루타티온 세파로스 4B(Glutathione Sepharose 4B beads; 아머샴 파마시아 바이오테크사 제품)를 이용해서 정제하였다.
상기 글루타티온 세파로스는, 미리 다음과 같이 비특이적 흡착을 제어하는 처리를 행하였다. 즉, 글루타티온 세파로스를 동량의 PBS로 원심분리(8,000×g, 1분, 4℃)에 의해 3회 세정한 후, 4% BSA함유 PBS를 동량 첨가해서 4℃에서 1시간 정치하였다. 처리후, 얻어진 산물을 동량의 PBS로 2회 세정하고, 1/2량의 PBS에 재현탁하였다.
전처리한 글루타티온 세파로스 40㎕를, 무세포추출액 1㎖에 첨가하고, 4℃에서 서서히 교반하였다. 이것에 의해, GST융합단백질을 글루타티온 세파로스에 흡착시켰다.
흡착후, 원심분리(8,000×g, 1분, 4℃)해서 글루타티온 세파로스를 회수하고, 400㎕의 PBS로 3회 세정하였다. 그 후, 10mM 글루타티온 40㎕를 첨가하고, 4℃에서 1시간 교반해서, 흡착한 GST융합 단백질을 용출시켰다. 원심분리(8,000×g, 2분, 4℃)해서 상청액을 회수한 후, PBS에 대해서 투석해서, GST융합 단백질을 정제하였다. 이 정제된 단백질은, SDS-PAGE에 의해, 싱글밴드를 나타내는 것을 확인하였다.
각 GST융합 단백질 500㎍을 프레시션 프로테아제(아머샴 파마시아 바이오테크사 제품)로 소화한 후, 글루타티온 세파로스를 통과시켜 프레시션 프로테아제와 GST를 제거하였다. 플로-쓰로(flow-through)분획을 또, PSB로 평형화한 세파덱스 G200컬럼에 걸어, 발현단백질의 최종 정제물을 얻었다. 이 최종 정제된 단백질은, SDS-PAGE에 의해 싱글밴드를 나타내는 것을 확인하였다.
(실시예 5)
구리프탈로시아닌에 대한 결합능을 지닌 항원 단백질의 제조
구리프탈로시아닌에 대한 결합능을 지닌 2종류의 아미노산 서열, Lys-Tyr-Asp-Ser-Arg-His-Leu-His-Thr-His-Ser-His(서열번호 1) 및 Pro-Asn-Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Pro-Val-Arg-Trp-Glu(서열번호 2)이, 스페이서 서열(Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser)을 개재해서 이 순서로 직렬로 접속된 서열 Lys-Tyr-Asp-Ser-Arg-His-Leu-His-Thr-His-Ser-His-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Pro-Asn-Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Pro-Val-Arg-Trp-Glu(서열번호 41)을 얻었다. 다음에, 얻어진 아미노산 서열이 항원단백질 NS4의 N말단에 융합되도록 해당 아미노산 서열을 스페이서서열 GS를 개재해서 발현시키는 대장균 발현벡터를 이하와 같이 구축하였다. 이 아미노산서열을 코딩하는 DNA는, 2종의 합성 올리고뉴클레오타이드 5'-GATCCAAATATGATAGCCGTCATCTGCATACCCATAGCCATGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCCCGAA CCGTCTGGGCCGTCGTCCGGTGCGTTGGGAAGAGCT-3'(서열번호 123) 및 5'-CTTCCCAACGCACCGGACGACGGCCCAGACGGTTCGGGCTGCCGCCGCCGCTGCCGCCGCCATGGCTATGGGTATGCAGATGACGGCTATCATATTTG-3'(서열번호 124)를, 각각 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(Gibco사 제품)에 의해 인산화하고 등몰로 혼합해서, 80℃에서 5분간 가열하고, 그 후 실온까지 서서히 냉각시킴으로써 2본쇄 DNA단편을 얻었다. 얻어진 2본쇄 DNA단편은, 실시예 3과 마찬가지로 해서, 플라스미드 pGEX-NS의 BamHI/SacI사이트에 삽입하고, 이 벡터를 이용해서 대장균 JM109를 형질전환하여 발현용 균주를 얻었다. 실시예 3과 마찬가지로 해서, 서열번호 41의 아미노산 서열을 NS4의 N말단에 융합한 발현단백질을 정제하였다.
(실시예 6)
카본블랙에 대한 결합능을 지닌 항원 단백질의 제조
카본블랙에 대한 결합능을 지닌 2종류의 아미노산 서열, Trp-Pro-His-Ala-Trp-Lys-Val-Trp-Trp-Pro-Ala-Ser(서열번호 16) 및 Asn-Trp-Trp-Trp-Pro-Pro-Tyr-Ile-Arg-His-Gln-Pro(서열번호 17)이, 스페이서 서열(Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser)을 개재해서 이 순서로 직렬로 접속된 서열 Trp-Pro-His-Ala-Trp-Lys-Val-Trp-Trp-Pro-Ala-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Gly-Gly-Ser-Asn-Trp-Trp-Trp-Pro-Pro-Tyr-Ile-Arg-His-Gln-Pro(서열번호 42)을 얻었다. 다음에, 얻어진 아미노산 서열이 항원단백질 NS4의 N말단에 융합되도록 해당 아미노산 서열을 스페이서서열 GS를 개재해서 발현시키는 대장균 발현벡터를 이하와 같이 구축하였다. 이 아미노산서열을 코딩하는 DNA는, 2종의 합성 올리고뉴클레오타이드 5'-GATCCTGGCCGCATGCGTGGAAAGTGTGGTGGCCGGCGAGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCGGCAGCAACTGGTGGTGGCCGCCGTATATTCGTCATCAGCCGGAGCT-3'(서열번호 125) 및 5'-CCGGCTGATGACGAATATACGGCGGCCACCACCAGTTGCTGCCGCCGCCGCTGCCGCCGCCGCTCGCCGGCCACCACACTTTCCACGCATGCGGCCAG-3'(서열번호 126)를, 각각 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제(Gibco사 제품)에 의해 인산화하고 등몰로 혼합해서, 80℃에서 5분간 가열하고, 그 후 실온까지 서서히 냉각시킴으로써 2본쇄 DNA단편을 얻었다. 얻어진 2본쇄 DNA단편은, 실시예 4와 마찬가지로 해서, 플라스미드 pGEX-NS의 BamHI/SacI사이트에 삽입하고, 이 벡터를 이용해서 대장균 JM109를 형질전환하여 발현용 균주를 얻었다. 실시예 4와 마찬가지로 해서, 서열번호 42의 아미노산 서열을 NS4의 N말단에 융합한 발현단백질을 정제하였다.
(비교예 1)
항원단백질의 제조
항원 단백질 NS4를 코딩하는 염기서열에 대해서 상류측 프라이머(5'-TTCACAGGATCCACTGAGCTCGATGCC CAC-3') 및 하류측 프라이머(5'-GATCTGGGCTCGAGCCGACTAGTA GTCGCT-3')를 이용해서, 참고예에서 제조한 플라스미드 pUC18-NS를 템플레이트로 해서 PCR을 행하였다. 얻어진 DNA단편은, 상류 영역에 BamHI/SacI제한부위를, 하류 영역에 SpeI/XhoI제한부위를, 그리고 이들 사이에 항원 단백질 NS4유전자를 지녔다.
정제된 PCR증폭산물을 BamHI와 XhoI에 의해 소화하고, 플라스미드 pGEX-6P-1(아머샴 파마시아 바이오테크사 제품)의 대응하는 부위에 삽입해서, 벡터 pGEX-NS를 얻었다. 이 벡터를 이용해서, 대장균 JM109를 형질전환하여, NS4-GST 융합단백질을 발현하는 형질전환균주를 얻었다. 이 형질전환 균주의 확인은 Miniprep(Wizard Minipreps DNA Purification Systems, PROMEGA사 제품)를 이용해 서 조제한 플라스미드 DNA를 템플레이트로 해서 pGEX 5' 시퀀싱 프라이머(Sequencing Primer)(아머샴 파마시아 바이오테크사 제품)를 이용한 시퀀싱에 의해서 인서트의 염기서열을 결정함으로써 행하였다.
얻어진 균주를 LB-Amp배지 10㎖에서 하룻밤 예비배양한 후, 해당 예비배양액 0.1㎖를, 신선한 LB-Amp배지 10㎖에 옮겨, 37℃, 170rpm에서 3시간 진탕배양하였다. 그 후 IPTG를 첨가(최종농도: 1mM)하고, 37℃에서 4 내지 12시간 배양을 지속하였다.
IPTG유도한 대장균을 집균(8,000×g, 2분, 4℃)하고, 1/10량의 4℃ PBS에 재현탁하였다. 상기 균체를 동결해동 및 고주파음에 의한 분해에 의해 파쇄하고, 원심분리(8,000×g, 10분, 4℃)해서 고형물을 제거하였다. 목적의 발현단백질이 상청액에 존재하는 것을 SDS-PAGE로 확인한 후, 발현된 GST융합 단백질을 글루타티온 세파로스 4B(Glutathione Sepharose 4B beads; 아머샴 파마시아 바이오테크사 제품)를 이용해서 정제하였다.
상기 글루타티온 세파로스는, 미리 다음과 같이 비특이적 흡착을 제어하는 처리를 행하였다. 즉, 글루타티온 세파로스를 동량의 PBS로 원심분리(8,000×g, 1분, 4℃)에 의해 3회 세정한 후, 4% BSA함유 PBS를 동량 첨가해서 4℃에서 1시간 정치하였다. 처리후, 얻어진 산물을 동량의 PBS로 2회 세정하고, 1/2량의 PBS에 재현탁하였다.
전처리한 글루타티온 세파로스 40㎕를, 무세포추출액 1㎖에 첨가하고, 4℃에서 서서히 교반하였다. 이것에 의해, GST융합단백질을 글루타티온 세파로스에 흡 착시켰다.
흡착후, 원심분리(8,000×g, 1분, 4℃)해서 글루타티온 세파로스를 회수하고, 400㎕의 PBS로 3회 세정하였다. 그 후, 10mM 글루타티온 40㎕를 첨가하고, 4℃에서 1시간 교반해서, 흡착한 GST융합 단백질을 용출시켰다. 원심분리(8,000×g, 2분, 4℃)해서 상청액을 회수한 후, PBS에 대해서 투석해서, GST융합 단백질을 정제하였다. 이 정제된 단백질은, SDS-PAGE에 의해, 싱글밴드를 나타내는 것을 확인하였다.
각 GST융합 단백질 500㎍을 프레시션 프로테아제(아머샴 파마시아 바이오테크사 제품)로 소화한 후, 글루타티온 세파로스를 통과시켜 프레시션 프로테아제와 GST를 제거하였다. 플로-쓰로(flow-through)분획을 또, PSB로 평형화한 세파덱스 G200컬럼에 걸어, 발현단백질의 최종 정제물을 얻었다. 이 최종 정제된 단백질은, SDS-PAGE에 의해 싱글밴드를 나타내는 것을 확인하였다.
(실시예 7)
항원 단백질의 구리프탈로시아닌입자에의 고정화
구리프탈로시아닌입자를, 0.1% Tween-20을 함유하는 TBS버퍼에 0.5%(w/v)의 농도로 되도록 현탁하였다. 이 현탁액 10㎖를 테플론(상품명)제 원심관에 놓고, 여기서 실시예 3 및 5에서 제조한 융합단백질 50㎍ 또는 비교예 1에서 제조한 단백질 50㎍을 가하고, 실온에서 30분간 진탕하였다. 원심분리조작(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해서 구리프탈로시아닌입자를 침전으로서 회수하고, 해당 구리프탈로시아닌입자에 결합하고 있지 않던 항원를 함유하는 상청액과 분리하였다. 해당 구 리프탈로시아닌입자를, 0.1% Tween-20을 함유하는 TBS버퍼에 재현탁하고, 원심조작을 반복함으로써, 구리프탈로시아닌입자를 세정하였다. 세정한 구리프탈로시아닌입자의 현탁액의 단백질농도를 마이크로 BCA단백질 정량시약키트(피어스케미칼사 제품)에 의해서 측정하였다. 측정결과를 하기 표 7에 표시한다.
| 아미노산서열번호 | 단백질량(㎍) | |
| 실시예 3 | 1 | 6 |
| 실시예 3 | 2 | 6 |
| 실시예 3 | 3 | 5 |
| 실시예 3 | 4 | 5 |
| 실시예 3 | 5 | 5 |
| 실시예 3 | 6 | 5 |
| 실시예 3 | 7 | 5 |
| 실시예 3 | 8 | 5 |
| 실시예 3 | 9 | 5 |
| 실시예 3 | 10 | 5 |
| 실시예 3 | 11 | 5 |
| 실시예 3 | 12 | 5 |
| 실시예 3 | 13 | 5 |
| 실시예 3 | 14 | 4 |
| 실시예 3 | 15 | 4 |
| 실시예 5 | 41 | 11 |
| 비교예 1 | - | 1 |
비교예 1의 단백질을 이용한 경우에 비해서, 구리프탈로시아닌결합서열을 융합한 실시예 3 및 5의 융합 단백질을 이용한 경우의 쪽이, 단백질농도가 높아, 항원단백질을 융합단백질에 의해 유효하게 안료표면에 고정할 수 있는 것으로 확인되었다.
(실시예 8)
항원 단백질의 카본블랙입자에의 고정화
카본블랙입자를, 0.1% Tween-20을 함유하는 TBS버퍼에 0.5%(w/v)의 농도로 되도록 현탁하였다. 이 현탁액 10㎖를 테플론(상품명)제 원심관에 놓고, 여기서 실시예 4 및 6에서 제조한 융합단백질 50㎍ 또는 비교예 1에서 제조한 단백질 50㎍을 가하고, 실온에서 30분간 진탕하였다. 원심분리조작(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해서 카본블랙입자를 침전으로서 회수하고, 해당 카본블랙입자에 결합하고 있지 않던 항원를 함유하는 상청액과 분리하였다. 해당 카본블랙입자를, 0.1% Tween-20을 함유하는 TBS버퍼에 재현탁하고, 원심조작을 반복함으로써, 카본블랙입자를 세정하였다. 세정한 카본블랙입자의 현탁액의 단백질농도를 마이크로 BCA단백질 정량시약키트(피어스케미칼사 제품)에 의해서 측정하였다. 측정결과를 하기 표 8에 표시한다.
| 아미노산서열번호 | 단백질량(㎍) | |
| 실시예 4 | 16 | 6 |
| 실시예 4 | 17 | 6 |
| 실시예 4 | 18 | 5 |
| 실시예 4 | 19 | 5 |
| 실시예 4 | 20 | 5 |
| 실시예 4 | 21 | 5 |
| 실시예 4 | 22 | 5 |
| 실시예 4 | 23 | 5 |
| 실시예 4 | 24 | 5 |
| 실시예 4 | 25 | 5 |
| 실시예 4 | 26 | 5 |
| 실시예 4 | 27 | 5 |
| 실시예 4 | 28 | 5 |
| 실시예 4 | 29 | 4 |
| 실시예 4 | 30 | 4 |
| 실시예 4 | 31 | 4 |
| 실시예 4 | 32 | 4 |
| 실시예 4 | 33 | 4 |
| 실시예 4 | 34 | 4 |
| 실시예 4 | 35 | 4 |
| 실시예 4 | 36 | 4 |
| 실시예 4 | 37 | 4 |
| 실시예 4 | 38 | 4 |
| 실시예 4 | 39 | 4 |
| 실시예 4 | 30 | 4 |
| 실시예 6 | 42 | 15 |
| 비교예 1 | - | 1 |
비교예 1의 단백질을 이용한 경우에 비해서, 카본블랙결합서열을 함유하는 실시예 4 및 6의 융합 단백질을 이용한 경우의 쪽이, 단백질농도가 높아, 항원단백질을 융합단백질에 의해 유효하게 안료표면에 고정할 수 있는 것으로 확인되었다.
(실시예 9)
면역응집법에 의한 HCV항체의 측정
0.1M 인산칼륨버퍼(pH 6.5), 1.0% 소혈청 알부민(시그마-알드리치 재팬사 제품) 및 0.05% NaN3로 이루어진 블로킹용 버퍼에, 실시예 7 및 8에서 제조한 융합단백질을 각각 고정한 안료입자를 현탁하고, 원심분리(10,000×g, 4℃, 10분)에 의해 해당 안료입자를 회수하는 조작을 3회 반복해서 세정하고, 얻어진 산물을 4㎖의 블로킹용 버퍼에 현탁하였다.
상기와 같이 제조한 측정용 시약과, 시판의 면역응집측정용의 진단시약(오르토 HCV Ab PAII, 오르토 다이아그노스틱 시스템즈사 제품, 이하 "시판품"이라 칭함)과의 비교를, HCV항체양성환자의 혈청을 이용해서 행하였다. 시험방법은 상기 시판품에 부착된 메뉴얼에 따랐다. 그 결과를 하기 표 9 및 10에 표시한다.
| 아미노산서열번호 | 혈청의 희석배율(배) | ||||
| 10,000 | 25,000 | 50,000 | 100,000 | ||
| 실시예 7 | 1 | + | + | + | - |
| 2 | + | + | + | - | |
| 3 | + | + | + | - | |
| 4 | + | + | + | - | |
| 5 | + | + | + | - | |
| 6 | + | + | + | - | |
| 7 | + | + | + | - | |
| 8 | + | + | + | - | |
| 9 | + | + | + | - | |
| 10 | + | + | + | - | |
| 11 | + | + | + | - | |
| 12 | + | + | + | - | |
| 13 | + | + | + | - | |
| 14 | + | + | + | - | |
| 15 | + | + | + | - | |
| 41 | + | + | + | - | |
| 시판품 | - | + | + | - | - |
(표중, +는 응집이 관찰됨을 의미하고, -는 응집이 관찰되지 않음을 의미함)
| 아미노산서열번호 | 혈청의 희석배율(배) | ||||
| 10,000 | 25,000 | 50,000 | 100,000 | ||
| 실시예 8 | 16 | + | + | + | - |
| 17 | + | + | + | - | |
| 18 | + | + | + | - | |
| 19 | + | + | + | - | |
| 20 | + | + | + | - | |
| 21 | + | + | + | - | |
| 22 | + | + | + | - | |
| 23 | + | + | + | - | |
| 24 | + | + | + | - | |
| 25 | + | + | + | - | |
| 26 | + | + | + | - | |
| 27 | + | + | + | - | |
| 28 | + | + | + | - | |
| 29 | + | + | + | - | |
| 30 | + | + | + | - | |
| 31 | + | + | + | - | |
| 32 | + | + | + | - | |
| 33 | + | + | + | - | |
| 34 | + | + | + | - | |
| 35 | + | + | + | - | |
| 36 | + | + | + | - | |
| 37 | + | + | + | - | |
| 38 | + | + | + | - | |
| 39 | + | + | + | - | |
| 40 | + | + | + | - | |
| 42 | + | + | + | - | |
| 시판품 | - | + | + | - | - |
(표중, +는 응집이 관찰됨을 의미하고, -는 응집이 관찰되지 않음을 의미함)
표 9 및 표 10의 결과로부터, 본 발명의 측정용 시약은, 시판품과 동등이상의 감도를 지니고 있는 것을 알 수 있었다. 또, 본 발명의 측정용 시약은, 불용성 담체로서 안료를 함유하므로, 해당 시약이 색조를 띠고 있어 육안판정이 극히 용이하다.
또, 상기의 실시예에서는 육안에 의해 측정을 행하고 있으나, CCD 등과 같은 시각적 화상인식수단을 이용해서 응집상태를 측정해도 된다. 이 경우, 담체로서 색재를 이용하지 않고도 응집상태의 측정을 행할 수 있다.
이상, 본 발명에 의하면, 항원 또는 항체를 효율적으로 담체의 표면에 고정할 수 있으므로, 제조공정이 극히 효율적이다.
또한, 본 발명에 의하면, 안료 등의 색재가 담체로서 사용될 경우, 해당 색재의 표면에 항원 또는 항체가 고정되어 있는 측정용 시약은, 소정의 색조를 띠고 있으므로, 임상검사나 환경분석, 식품분석 등에 이용되는 측정용 시약으로서 사용될 때에, 육안판정이 용이하고 신뢰성이 높게 된다.
<110> CANON KABUSHIKI KAISHA
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the same
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<151> 2002-06-13
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<151> 2003-05-02
<160> 129
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gatcctggca tagcaactgg tatcagagca ttccgcaggt ggagct 46
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> complementary to 101
<400> 102
ccacctgcgg aatgctctga taccagttgc tatgccag 38
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<400> 103
gatccggcta ttggccgtgg aaatttgaac atgcgaccgt ggagct 46
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> complementary to 103
<400> 104
ccacggtcgc atgttcaaat ttccacggcc aatagccg 38
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gatccgcgtg gtggccgacc acctttccgc cgtattatta tgagct 46
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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cataataata cggcggaaag gtggtcggcc accacgcg 38
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gatccaaccc gtggtggagc cattattatc cgcgtagcgt ggagct 46
<210> 108
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> complementary to 107
<400> 108
ccacgctacg cggataataa tggctccacc acgggttg 38
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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gatcctggcc gcataactat ccgctgaacc atagcaaccc ggagct 46
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<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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ccgggttgct atggttcagc ggatagttat gcggccag 38
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<211> 46
<212> DNA
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gatccacctg ggcgcatccg ctggaaagcg attatctgcg tgagct 46
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cacgcagata atcgctttcc agcggatgcg cccaggtg 38
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gatcccatac ctattatcat gatggctggc gtctggcgcc ggagct 46
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<212> DNA
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ccggcgccag acgccagcca tcatgataat aggtatgg 38
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser
1 5
Claims (12)
- 검체중에 있어서의 대상으로 되는 항체 또는 항원의 존재 혹은 양을 판정하는 측정방법에 있어서,각각 상기 검체중의 대상으로 되는 항체 또는 항원에 대응하는 항원 또는 항체가 고정된 안료를 준비하는 공정과;상기 안료와 상기 검체를 혼합하는 공정과;상기 혼합공정에 기인하는 면역학적 응집반응의 레벨을 측정하는 공정을 구비하고;상기 안료에 고정된 항원 또는 항체는, 상기 안료에 대해서 결합능을 지닌 아미노산 서열을 개재해서 해당 안료에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 측정방법.
- 삭제
- 제 1항에 있어서, 상기 안료가 구리프탈로시아닌인 것을 특징으로 하는 측정방법.
- 제 3항에 있어서, 상기 안료가 구리프탈로시아닌이고, 상기 안료에 대해서 결합능을 지닌 아미노산 서열이,Lys-Tyr-Asp-Ser-Arg-His-Leu-His-Thr-His-Ser-His(서열번호 1)Pro-Asn-Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Pro-Val-Arg-Trp-Glu(서열번호 2)Lys-Cys-Cys-Tyr-Tyr-Asp-His-Ser-His-Ala-Leu-Ser(서열번호 3)Glu-Tyr-Leu-Ser-Ala-Ile-Val-Ala-Gly-Pro-Trp-Pro(서열번호 4)Lys-Leu-Trp-Ile-Leu-Glu-Pro-Thr-Val-Thr-Pro-Thr(서열번호 5)Gln-Ser-Asn-Leu-Lys-Val-Ile-Pro-Ser-Trp-Trp-Phe(서열번호 6)Trp-Ile-Pro-Pro-Gln-Trp-Ser-Arg-Leu-Ile-Glu-Pro(서열번호 7)Asp-His-Pro-Gln-Ala-Lys-Pro-Asn-Trp-Tyr-Gly-Val(서열번호 8)Gly-Leu-Pro-Pro-Tyr-Ser-Pro-His-Arg-Leu-Ala-Gln(서열번호 9)Lys-Leu-Thr-Thr-Gln-Tyr-Met-Ala-Arg-Ser-Ser-Ser(서열번호 10)Lys-Val-Trp-Met-Leu-Pro-Pro-Leu-Pro-Gln-Ala-Thr(서열번호 11)Asn-Val-Thr-Ser-Thr-Ala-Phe-Ile-Asp-Thr-Pro-Trp(서열번호 12)Arg-Leu-Asn-Leu-Asp-Ile-Ile-Ala-Val-Thr-Ser-Val(서열번호 13)Thr-Leu-Pro-Ser-Pro-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Val-His(서열번호 14)Thr-Asn-Arg-His-Asn-Pro-His-His-Leu-His-His-Val(서열번호 15)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 측정방법.
- 제 1항에 있어서, 상기 안료가 카본블랙인 것을 특징으로 하는 측정방법.
- 제 5항에 있어서, 상기 안료가 카본블랙이고, 상기 안료에 대해서 결합능을 지닌 아미노산 서열이,Trp-Pro-His-Ala-Trp-Lys-Val-Trp-Trp-Pro-Ala-Ser(서열번호 16)Asn-Trp-Trp-Trp-Pro-Pro-Tyr-Ile-Arg-His-Gln-Pro(서열번호 17)Trp-His-Trp-Ser-Trp-Thr-Pro-Trp-Pro-Ser-His-His(서열번호 18)Trp-Pro-Trp-Ala-Trp-His-Pro-Ser-Arg-Asp-Val-Tyr(서열번호 19)Trp-His-Gly-Tyr-Trp-Tyr-Ser-Asn-Leu-Asn-Thr-Thr(서열번호 20)Trp-Trp-Thr-Pro-Trp-Met-Ser-His-Ala-Tyr-Pro-Val(서열번호 21)Trp-Pro-Asn-Pro-Tyr-Trp-Gly-Trp-Phe-Ala-Ala-Val(서열번호 22)Thr-Ser-Trp-His-Thr-Trp-Trp-Trp-Arg-Gln-Pro-Pro(서열번호 23)Asn-Ala-Trp-His-Lys-Tyr-Trp-Trp-Pro-Ile-Thr-Lys(서열번호 24)His-Pro-Asn-Asn-Asp-Trp-Ser-Lys-Ala-Pro-Gln-Phe(서열번호 25)Trp-Trp-Thr-Pro-Gln-Pro-Trp-Trp-Ser-Phe-Pro-Ile(서열번호 26)Trp-Pro-His-Thr-Ser-Trp-Trp-Gln-Thr-Pro-Leu-Thr(서열번호 27)Trp-His-Val-Asn-Trp-Asp-Pro-Met-Ala-Trp-Tyr-Arg(서열번호 28)Ser-Trp-Pro-Trp-Trp-Thr-Ala-Tyr-Arg-Val-His-Ser(서열번호 29)Trp-His-Ser-Asn-Trp-Tyr-Gln-Ser-Ile-Pro-Gln-Val(서열번호 30)Gly-Tyr-Trp-Pro-Trp-Lys-Phe-Glu-His-Ala-Thr-Val(서열번호 31)Ala-Trp-Trp-Pro-Thr-Thr-Phe-Pro-Pro-Tyr-Tyr-Tyr(서열번호 32)Asn-Pro-Trp-Trp-Ser-His-Tyr-Tyr-Pro-Arg-Ser-Val(서열번호 33)Trp-Pro-His-Asn-Tyr-Pro-Leu-Asn-His-Ser-Asn-Pro(서열번호 34)Thr-Trp-Ala-His-Pro-Leu-Glu-Ser-Asp-Tyr-Leu-Arg(서열번호 35)His-Thr-Tyr-Tyr-His-Asp-Gly-Trp-Arg-Leu-Ala-Pro(서열번호 36)Thr-Phe-Val-Gln-Thr-Pro-Leu-Ser-His-Leu-Ile-Ala(서열번호 37)Arg-Val-Pro-Pro-Ser-Lys-Leu-Thr-Arg-Pro-Pro-Phe(서열번호 38)His-Ser-Ile-Tyr-Ser-Val-Thr-Pro-Ser-Thr-Ala-Ser(서열번호 39)Leu-Asn-Thr-Gln-Asn-His-Ala-Pro-Leu-Pro-Ser-Ile(서열번호 40)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 측정방법.
- 검체중에 있어서의 대상으로 되는 항체 또는 항원의 존재 혹은 양을 측정하기 위한 측정용 시약에 있어서,상기 항체 또는 항원에 대응하는 항원 또는 항체가 안료에 고정되어 있고,상기 안료에 고정된 상기 항원 또는 항체는, 상기 안료에 대해서 결합능을 지닌 아미노산 서열을 개재해서 해당 안료에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 측정용 시약.
- 검체중에 있어서의 대상으로 되는 항체 또는 항원의 존재 혹은 양을 측정하기 위한 측정용 시약의 제조방법에 있어서,상기 항체 또는 항원에 대응하는 항원 또는 항체를 안료에 고정하는 공정을 구비하고,상기 안료에 고정된 상기 항원 또는 항체는, 상기 안료에 대해서 결합능을 지닌 아미노산 서열을 개재해서 해당 안료에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 측정용 시약의 제조방법.
- 제 8항에 있어서, 상기 항원 또는 항체를, 상기 대응하는 항원 또는 항체의 생산능을 지닌 생물, 또는 상기 생산능에 관여하는 유전자를 도입한 형질전환체에 생산시키는 공정을 또 구비한 것을 특징으로 하는 측정용 시약의 제조방법.
- 제 9항에 있어서, 상기 형질전환체의 숙주미생물이 대장균(Escherichia coli)인 것을 특징으로 하는 측정용 시약의 제조방법.
- Lys-Tyr-Asp-Ser-Arg-His-Leu-His-Thr-His-Ser-His(서열번호 1)Pro-Asn-Arg-Leu-Gly-Arg-Arg-Pro-Val-Arg-Trp-Glu(서열번호 2)Lys-Cys-Cys-Tyr-Tyr-Asp-His-Ser-His-Ala-Leu-Ser(서열번호 3)Glu-Tyr-Leu-Ser-Ala-Ile-Val-Ala-Gly-Pro-Trp-Pro(서열번호 4)Lys-Leu-Trp-Ile-Leu-Glu-Pro-Thr-Val-Thr-Pro-Thr(서열번호 5)Gln-Ser-Asn-Leu-Lys-Val-Ile-Pro-Ser-Trp-Trp-Phe(서열번호 6)Trp-Ile-Pro-Pro-Gln-Trp-Ser-Arg-Leu-Ile-Glu-Pro(서열번호 7)Asp-His-Pro-Gln-Ala-Lys-Pro-Asn-Trp-Tyr-Gly-Val(서열번호 8)Gly-Leu-Pro-Pro-Tyr-Ser-Pro-His-Arg-Leu-Ala-Gln(서열번호 9)Lys-Leu-Thr-Thr-Gln-Tyr-Met-Ala-Arg-Ser-Ser-Ser(서열번호 10)Lys-Val-Trp-Met-Leu-Pro-Pro-Leu-Pro-Gln-Ala-Thr(서열번호 11)Asn-Val-Thr-Ser-Thr-Ala-Phe-Ile-Asp-Thr-Pro-Trp(서열번호 12)Arg-Leu-Asn-Leu-Asp-Ile-Ile-Ala-Val-Thr-Ser-Val(서열번호 13)Thr-Leu-Pro-Ser-Pro-Leu-Ala-Leu-Leu-Thr-Val-His(서열번호 14)Thr-Asn-Arg-His-Asn-Pro-His-His-Leu-His-His-Val(서열번호 15)Trp-Pro-His-Ala-Trp-Lys-Val-Trp-Trp-Pro-Ala-Ser(서열번호 16)Asn-Trp-Trp-Trp-Pro-Pro-Tyr-Ile-Arg-His-Gln-Pro(서열번호 17)Trp-His-Trp-Ser-Trp-Thr-Pro-Trp-Pro-Ser-His-His(서열번호 18)Trp-Pro-Trp-Ala-Trp-His-Pro-Ser-Arg-Asp-Val-Tyr(서열번호 19)Trp-His-Gly-Tyr-Trp-Tyr-Ser-Asn-Leu-Asn-Thr-Thr(서열번호 20)Trp-Trp-Thr-Pro-Trp-Met-Ser-His-Ala-Tyr-Pro-Val(서열번호 21)Trp-Pro-Asn-Pro-Tyr-Trp-Gly-Trp-Phe-Ala-Ala-Val(서열번호 22)Thr-Ser-Trp-His-Thr-Trp-Trp-Trp-Arg-Gln-Pro-Pro(서열번호 23)Asn-Ala-Trp-His-Lys-Tyr-Trp-Trp-Pro-Ile-Thr-Lys(서열번호 24)His-Pro-Asn-Asn-Asp-Trp-Ser-Lys-Ala-Pro-Gln-Phe(서열번호 25)Trp-Trp-Thr-Pro-Gln-Pro-Trp-Trp-Ser-Phe-Pro-Ile(서열번호 26)Trp-Pro-His-Thr-Ser-Trp-Trp-Gln-Thr-Pro-Leu-Thr(서열번호 27)Trp-His-Val-Asn-Trp-Asp-Pro-Met-Ala-Trp-Tyr-Arg(서열번호 28)Ser-Trp-Pro-Trp-Trp-Thr-Ala-Tyr-Arg-Val-His-Ser(서열번호 29)Trp-His-Ser-Asn-Trp-Tyr-Gln-Ser-Ile-Pro-Gln-Val(서열번호 30)Gly-Tyr-Trp-Pro-Trp-Lys-Phe-Glu-His-Ala-Thr-Val(서열번호 31)Ala-Trp-Trp-Pro-Thr-Thr-Phe-Pro-Pro-Tyr-Tyr-Tyr(서열번호 32)Asn-Pro-Trp-Trp-Ser-His-Tyr-Tyr-Pro-Arg-Ser-Val(서열번호 33)Trp-Pro-His-Asn-Tyr-Pro-Leu-Asn-His-Ser-Asn-Pro(서열번호 34)Thr-Trp-Ala-His-Pro-Leu-Glu-Ser-Asp-Tyr-Leu-Arg(서열번호 35)His-Thr-Tyr-Tyr-His-Asp-Gly-Trp-Arg-Leu-Ala-Pro(서열번호 36)Thr-Phe-Val-Gln-Thr-Pro-Leu-Ser-His-Leu-Ile-Ala(서열번호 37)Arg-Val-Pro-Pro-Ser-Lys-Leu-Thr-Arg-Pro-Pro-Phe(서열번호 38)His-Ser-Ile-Tyr-Ser-Val-Thr-Pro-Ser-Thr-Ala-Ser(서열번호 39)Leu-Asn-Thr-Gln-Asn-His-Ala-Pro-Leu-Pro-Ser-Ile(서열번호 40)로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 1개의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 펩티드.
- 제 11항 기재의 아미노산 서열의 적어도 어느 1개를 포함하는 것을 특징으로 하는 항원단백질 또는 항체단백질.
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