JP2000338108A - 免疫凝集反応測定試薬及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 試料中の抗原（または抗体）などの超微量成
分を高感度で測定でき、Ｂ／Ｆ分離を必要とせず、簡便
に測定し得る免疫凝集反応測定試薬を提供する。 【解決手段】 溶液中において、測定対象物質である抗
体（または抗原）に対応した抗原（または抗体）をキャ
リアータンパク質に複合化させた後、該キャリアータン
パク質を不溶性担体に担持させる、免疫凝集反応測定試
薬の製造方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、抗原や抗体を高感
度で測定し得る免疫凝集反応測定試薬およびその製造方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】臨床検査の分野では、生体試料（血液、
尿など）を用いて種々の疾患の診断を行っているが、こ
れらを診断する方法として、種々の測定法が開発され利
用されている。これらの測定法の代表的方法として、酵
素反応を利用する生化学測定法や抗原抗体反応を利用す
る免疫測定法が挙げられる。近年においては、生体試料
中の成分を精度よく測定することが望まれ、特異性の高
い抗原抗体反応を利用した免疫測定法が盛んに用いられ
ている。

【０００３】免疫測定法としては、免疫比濁法（ＴＩＡ
法）、ラテックス比濁法（ＬＩＡ法）、酵素免疫測定法
（ＥＩＡ法）、放射免疫測定法（ＲＩＡ法）などが挙げ
られ、目的に応じて使い分けされている。すなわち、生
体試料中に含まれている成分の量が比較的多い場合は、
ＴＩＡ法やＬＩＡ法が使用されている。ＴＩＡ法やＬＩ
Ａ法では、測定される生体試料中の成分としては、例え
ば、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）、抗ストレプトリジ
ン−Ｏ抗体（ＡＳＯ）、フィブリン分解産物（ＦＤＰ）
などが挙げられ、生体試料中の濃度として、数ｎｇ／ｍ
Ｌ以上の場合に用いられる。これに対して、生体試料中
に含まれる成分の量が微量の場合は、ＥＩＡ法やＲＩＡ
法が使用され、測定する生体試料中の成分としては、例
えば、αフェトプロティン（ＡＦＰ）に代表される癌マ
ーカーやインシュリンに代表されるホルモンなどが挙げ
られ、生体試料中の濃度として、数ｎｇ／ｍＬ以下の場
合に用いられる。

【０００４】更に、近年、生体試料中の微量成分の測定
が重要視され、ＥＩＡ法やＲＩＡ法などが益々利用され
てきている。しかしながら、ＴＩＡ法やＬＩＡ法では測
定に要する時間が短く、操作が簡便で種々の自動分析装
置（以下、汎用自動分析装置）へ適用可能であるのに比
べて、ＥＩＡ法やＲＩＡ法では反応時間が長く、操作法
が煩雑で、かつ、使用する酵素や放射性同位元素の種類
が多岐にわたる。従って、ＥＩＡ法やＲＩＡ法は、特定
の自動分析装置（以下、専用自動分析装置）においての
み用いられることが多く、ＲＩＡ法に至っては放射性同
位元素を利用するため特定の施設が必要というような種
々の問題がある。

【０００５】近年、生体試料中の微量成分の測定におい
ては、癌などの早期発見やエイズウイルスなどの感染初
期を診断するため、超微量でも測定できる方法が要望さ
れている。超微量測定が可能な手法としては、ＬＩＡ法
やＥＩＡ法の変法または改良法など測定法自体の精度を
上げる手法と、ＬＩＡ法やＥＩＡ法などでは従来からの
方法で測定に使用する装置の性能を上げる手法に大別さ
れ、一部実用化されている。

【０００６】測定法自体の精度を上げる手法としては、
ＬＩＡ法の不溶性担体を着色する方法（特開平１−２１
４７６０号公報）、ＥＩＡ法の抗原または抗体を標識す
る物質として酵素の代わりに、発光物質を利用する方法
（特開平５−３４３４６号公報）などが挙げられる。ま
た、装置の性能を上げる手法として、特開平３−１６７
４７５号公報に提案される方法がある。

【０００７】しかしながら、これらのいずれの手法にお
いても、汎用自動分析装置への適用は不可能であり、専
用自動分析装置が必要という問題は解決されていない。
専用自動分析装置が必要な理由は、上述のように、ＥＩ
Ａ法やＲＩＡ法に代表される微量成分の測定法では、反
応時間、操作法、使用する酵素や放射性同位元素の種類
などが測定法により種々異なることによる。さらに、こ
れら以外の大きな理由として、現在、開発または上市さ
れている微量成分の測定法では、Ｂ／Ｆ分離と呼ばれる
操作（Ｂは免疫反応等により結合した成分、Ｆは未反応
の成分）が必ず必要であるため、Ｂ／Ｆ分離操作のでき
ない汎用自動分析装置へは適用できず、Ｂ／Ｆ分離操作
のできる専用自動分析装置が必要となってくる。

【０００８】最近、特開平５−２４９１１２号公報、特
開平７−１７９４９５号公報などにみられるように、Ｂ
／Ｆ分離の不必要な測定法も提案、開発されている。し
かしながら、感度不足や、測定時間が長いなどの問題に
より、専用自動分析装置が必要となったり、一部の汎用
自動分析装置にしか適用できないなどの問題がある。

【０００９】一方、臨床検査の現場においては、超微量
分析を行うには高価な専用自動分析装置が必要で、か
つ、設置場所を確保しなければならないため、汎用自動
分析装置による超微量成分の測定を望む声が大きい。

【００１０】以上のように、現在、開発または上市され
ている超微量成分の測定は、ユーザーの強い要望がある
にもかかわらず、Ｂ／Ｆ分離操作が必要なため、専用自
動分析装置での測定に限られているという大きな問題点
がある。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、上述
した従来技術の欠点を解消し、試料中の抗原または抗体
などの超微量成分を高感度で測定することができ、Ｂ／
Ｆ分離を必要とせず、簡便に上記超微量成分を測定する
ことを可能とする免疫凝集反応測定試薬およびその製造
方法を提供することにある。

【００１２】

【課題を解決するための手段】本願の第１の発明は、溶
液中において、測定対象物質である抗体（または抗原）
に対応した抗原（または抗体）をキャリアータンパク質
に複合化させた後、該キャリアータンパク質を不溶性担
体に担持させることを特徴とする免疫凝集反応測定試薬
の製造方法である。

【００１３】本願の第２の発明は、溶液中において、測
定対象物質である抗体が認識するエピトープの配列が含
まれるペプチドをキャリアータンパク質に複合化させた
後、該キャリアータンパク質を不溶性担体に担持させる
ことを特徴とする免疫凝集反応測定試薬の製造方法であ
る。

【００１４】第２の発明に係る製造方法の特定の局面で
は、前記ペプチドとして、等電点が、前記キャリアータ
ンパク質の等電点−０．５以下、または等電点＋０．５
以上の範囲にあるペプチドが用いられ、該ペプチドが複
合化されたキャリアータンパク質が不溶性担体に担持さ
れる際に、溶液のｐＨが、前記キャリアータンパク質の
等電点−０．５以上、等電点＋０．５以下の範囲とされ
る。

【００１５】また、第２の発明に係る免疫凝集反応測定
試薬の製造方法のより特定の局面では、前記測定対象物
質が、Ｃ型肝炎ウィルス抗体であり、前記ペプチドとし
て、等電点が１〜４．５または５．５〜１３の範囲にあ
るものが用いられ、前記キャリアータンパク質としてウ
シ血清アルブミンが用いられ、前記ペプチドが複合化さ
れたキャリアータンパク質が不溶性担体に担持される際
に、溶液のｐＨが４．５〜５．５とされる。

【００１６】本願の第３の発明は、第２の発明に係る免
疫凝集反応測定試薬の製造方法により製造される免疫凝
集反応測定試薬であって、前記ウシ血清アルブミン１分
子に対し、平均で１５分子以下の割合で前記ペプチドが
複合化されていることを特徴とする。

【００１７】第３の発明に係る免疫凝集反応測定試薬の
特定の局面では、Ｃ型肝炎ウィルス抗体が認識するエピ
トープの配列を有する前記ペプチドが、下記の配列のう
ち、少なくとも１つの配列を有するものが用いられる。

【００１８】配列番号１．Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａ
ｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌ
ｎ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｕ
Ｇｌｕ Ｃｙｓ 配列番号２．Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｈｉｓ
Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔｙｒ
Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ａ
ｌａ Ａｌａ Ａｒｇ 配列番号３．Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｇｌｙ
Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａ
ｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｙ 配列番号４．Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ
Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｐ
Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇ
ｌｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓ
ｐ

【００１９】

【発明の実施の形態】以下、本発明の詳細を説明する。
本発明に係る免疫凝集反応測定試薬より測定される測定
対象物質としては、生体試料中の抗原または抗体が挙げ
られ、例えば、肝炎（Ｂ型もしくはＣ型など）由来抗原
または抗体、ＨＩＶ抗原または抗体、梅毒由来抗原また
は抗体、α−フェトプロテインに代表される癌マーカ
ー、インシュリンに代表されるホルモン、オータコイド
などを例示することができるが、特にこれらに限定され
るものではない。

【００２０】本発明の免疫凝集反応測定試薬では、上記
測定対象物質である抗体（または抗原）に対応した抗原
（または抗体）がキャリアータンパク質に複合化され
る。ここで、キャリアータンパク質に複合化される抗原
（または抗体）としては、上記測定対象物質である抗体
（または抗原）と免疫反応により免疫複合体を形成し得
る限り、特に限定されるものではない。

【００２１】測定対象物質が抗原であり、キャリアータ
ンパク質に抗体を複合化させる場合には、抗体として
は、モノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のいず
れであってもよい。また、抗体の製造方法についても特
に限定されるものではない。例えば、ポリクローナル抗
体は、ウサギ、山羊、メン山羊などの動物に測定対象物
である抗原を免疫して産生させることができる。モノク
ローナル抗体についても、公知の方法により得ることが
できる。

【００２２】上記のようにして得られた抗体について
は、クロマトグラフィーなどにより、適宜精製してもよ
く、場合によっては特別の精製を行うことなく用いても
よい。また、キャリアータンパク質に抗体を複合化させ
る場合には、適当な緩衝液などにより抗体を希釈して用
いてもよい。緩衝液としても、特に限定されず、例え
ば、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、Ｇ
ｏｏｄ緩衝液などを用いることができ、使用する抗体や
キャリアータンパク質を考慮し、適宜選択すればよい。

【００２３】測定対象物質が抗体であり、抗原がキャリ
アータンパク質に複合化される場合には、上記抗原とし
ては、タンパク質あるいはポリペプチドのいずれであっ
てもよく、製造方法についても特に限定されるものでは
ない。抗原としてタンパク質を用いる場合には、該タン
パク質は天然物から得られるものであってもよく、遺伝
子工学的手法により得られたものであってもよい。ま
た、上記抗原としてペプチドを用いる場合においても、
化学的に合成されたペプチド、遺伝子工学的手法により
得られたペプチドなどのいずれをも用いることができ、
通常、化学的に合成されたペプチドが用いられる。

【００２４】本発明において用いられる上記キャリアー
タンパク質としては、抗体（または抗原）を複合化、す
なわち複合化し得るものであれば特に限定されない。例
えば、上記キャリアータンパク質としては、ウシ血清ア
ルブミン（Ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉ
ｎ）、キーホールリンペットヘモシアニン（Ｋｅｙｈｏ
ｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、オボア
ルブミン（Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）、ヒト血清アルブミン
（Ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ）、トロン
ボグロブリン（Ｔｈｒｏｍｂｏｇｌｏｂｕｌｉｎ）、微
小管結合タンパク質（Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ ａｓｓ
ｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）、ジフテリア毒素
（Ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ ｔｏｘｏｉｄ）等を例示する
ことができる。

【００２５】上記キャリアータンパク質は、天然物から
得られたものであってもよく、遺伝子工学手法により得
られたものであってもよく、いずれをも用いることがで
き、通常、天然物から得られたキャリアータンパク質が
用いられる。

【００２６】本発明で用いられる不溶性担体としては、
例えば、有機高分子粉末、微生物、血球及び細胞膜片な
どを挙げることができ、特に限定されるものではない。
有機高分子粉末としては、例えば、不溶性アガロース、
セルロース、不溶性デキストランなどの天然高分子粉
末；ポリスチレン、スチレン−スルホン酸塩共重合体、
スチレン−メタクリル酸共重合体、アクリロニトリル−
ブタジエン−スチレン共重合体、塩化ビニル−アクリル
酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリル酸エステル
共重合体などの合成高分子粉末を挙げることができる。
特に、合成高分子粉末を均一に懸濁させたラテックスが
好適に用いられる。

【００２７】上記不溶性担体は、その使用目的・用途に
よって異なるが、通常、化学合成により得ることがで
き、あるいは市販されているものを用いることができ
る。また、表面にスルホン酸基やカルボキシル基を導入
した不溶性担体も適宜用いることができる。

【００２８】不溶性担体として上記ラテックスを用いる
場合、ラテックス粒子の粒径は０．００５〜１．５μｍ
が好ましく、０．０５〜０．６μｍがより好ましい。本
発明において、抗体（または抗原）が複合化されたキャ
リアータンパク質の不溶性担体への担持方法については
特に限定されず、吸着、化学結合あるいは包接などの適
宜の方法で行われる。

【００２９】すなわち、不溶性担体にキャリアータンパ
ク質を担持させる方法については、使用するキャリアー
タンパク質の種類によって異なるが、通常、以下の方法
で行われる。

【００３０】キャリアータンパク質を含む溶液を不溶性
担体の懸濁液に添加し、攪拌する。その結果、物理的吸
着により、キャリアータンパク質が不溶性担体に結合さ
れる。

【００３１】また、表面にスルホン酸基やカルボキシル
基が導入されている不溶性担体の場合には、適当な架橋
剤を添加することにより、キャリアータンパク質を不溶
性担体に化学的に結合させることができる。この場合、
架橋剤で架橋できるように、キャリアータンパク質を修
飾してもよい。

【００３２】上記のように物理的に吸着させる方法ある
いは架橋剤により結合する方法のいずれを採用するか
は、使用するキャリアータンパク質の物性や構造を考慮
して、適宜選択すればよく、両者を併用してもよい。

【００３３】上記キャリアータンパク質を不溶性担体に
担持させる際の溶液のｐＨは３〜１０、温度は２〜５０
℃が好ましい。ｐＨがこの範囲を外れると、キャリアー
タンパク質または抗原（または抗体）がタンパク質であ
るため、変性する恐れがある。また、温度については、
２℃未満であると反応速度が遅く、所望の感度を有する
免疫凝集反応測定試薬を得ることが困難となることがあ
り、５０℃を超えると、キャリアータンパク質または抗
原（または抗体）は変性する恐れがある。

【００３４】従来の免疫凝集反応測定試薬と測定対象物
質が含まれている生体試料とを混合すると、生体試料中
の抗原（または抗体）と、不溶性担体に担持された抗体
（または抗原）との抗原抗体反応が起こり、不溶性担体
の凝集が生じる。もっとも、測定対象物質が微量の場合
には、凝集の程度が小さく、検出できないことがある。

【００３５】これに対して、本発明では、測定対象物質
である抗原（または抗体）に対する抗体（または抗原）
が、キャリアータンパク質に複合化された後に、該キャ
リアータンパク質が不溶性担体に担持されている。従っ
て、測定対象物質である抗原（または抗体）に対する抗
体（または抗原）の配向性が高められ、生体試料中の抗
原（または抗体）の濃度が低い場合であっても、凝集し
易くなる。特に、測定対象物質が抗体の場合、その抗体
に対する抗原として合成ペプチドを用いることにより、
抗原の等電点を自由に調整することができる。上記ペプ
チドの等電点をキャリアータンパク質の等電点より０．
５以上高くしたり、あるいは低くすることにより、キャ
リアータンパク質の等電点付近のｐＨの緩衝液中で不溶
性担体に担持させる際に、ペプチドが荷電を帯びること
になり、それによってさらに配向性が高まり、より一層
凝集が起こり易くなる。

【００３６】従って、好ましくは、上記ペプチドとし
て、等電点が、キャリアータンパク質の等電点−０．５
よりも低く、あるいはキャリアータンパク質の等電点＋
０．５よりも高いペプチドが用いられる。なお、ペプチ
ドの等電点の上限は１３であるため、好ましいペプチド
の等電点の上限値は１３である。

【００３７】なお、本発明に係る免疫凝集反応測定試薬
において、測定対象物質がＣ型肝炎ウィルス抗体の場
合、すなわちＣ型肝炎ウィルス抗体測定用の免疫凝集反
応測定試薬に、キャリアータンパク質としてウシ血清ア
ルブミンを用いた場合には、ウシ血清アルブミンの等電
点が５．０であるため、ペプチドとしては、等電点が
４．５以下、または５．５以上のものが好適に用いら
れ、より好ましくは等電点が１〜４．５または５．５〜
１３の範囲にあるペプチドが用いられる。この場合、ウ
シ血清アルブミンの等電点付近のｐＨの緩衝液中で、ウ
シ血清アルブミンを不溶性担体に担持させることによ
り、ペプチドを荷電を帯びることになり、それによって
凝集が起こり易くなる。従って、ウシ血清アルブミンを
不溶性担体に担持させる際の緩衝液のｐＨは、４．５〜
５．５の範囲とすることが好ましい。

【００３８】また、上記ペプチドを例えばウシ血清アル
ブミンに複合化する場合には、ウシ血清アルブミン１分
子に対してペプチドを１６分子以上複合化すると、ウシ
血清アルブミンが不溶化する。ウシ血清アルブミンが不
溶化すると、不溶性担体に担持させることができなくな
るため、ウシ血清アルブミン１分子に対し複合化される
ペプチドは１５分子以下であることが望ましい。

【００３９】さらに、Ｃ型肝炎ウィルス抗体が認識する
エピトープは、各抗原タンパク質にそれぞれ複数箇所存
在するが、特に抗原性が高いので、配列番号１〜４のア
ミノ酸配列のうち少なくとも１つの配列が含まれている
ことが望ましく、それによってＣ型肝炎ウィルス抗体を
より効果的に検出することができる。なお、配列番号１
〜３の配列が特に抗原性が高いことは、従来より公知で
ある（Ｊｏｕｎａｌｏｆ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ，１
６（２），１６７−１８１（１９９５））。

【００４０】なお、配列番号１〜４のペプチドの等電点
は、以下の通りである。配列番号１のペプチドの等電点
＝３．４、配列番号２のペプチドの等電点＝７．３、配
列番号３のペプチドの等電点＝１０．８、配列番号４の
ペプチドの等電点＝４．０。

【００４１】

【実施例】以下、本発明の実施例を説明することによ
り、本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の
実施例に限定されるものではない。

【００４２】（実施例１） 試薬及び材料 ａ）ラテックス溶液：１０％（Ｗ／Ｖ）ポリスチレンラ
テックス溶液（ラテックスの粒径０．４μｍ、積水化学
工業社製） ｂ）ラテックス希釈用緩衝液：５０ｍＭの第１リン酸ナ
トリウムと５０ｍＭの第２リン酸ナトリウムとをｐＨ５
となるように混合したもの ｃ）Ｃ型肝炎ウィルス抗体：配列番号２のアミノ酸配列
を有する合成ペプチドをマレイミド反応によりウシ血清
アルブミンに複合化したもの ｄ）抗原希釈用緩衝液：上記ラテックス希釈用緩衝液と
同じものを使用 ｅ）ブロッキング用緩衝液：５０ｍＭの第１リン酸ナト
リウムと５０ｍＭの第２リン酸ナトリウムとをｐＨ＝
６．５となるように混合したものに、ウシ血清アルブミ
ン（Ｆｒａｃｔｉｏｎ Ｖ，Ｍｉｌｅｓ Ｃｏｒｐ社
製）を１％（Ｗ／Ｖ）となるように、かつＮａＮ₃ を
０．１％（Ｗ／Ｖ）となるように添加したもの ｆ）検体希釈用希釈液（Ｒ１液）：ブロッキング用緩衝
液に、ポリエチレングリコール（平均分子量７５００、
和光純薬社製）を１％（Ｗ／Ｖ）となるように添加した
もの ｇ）Ｃ型肝炎ウィルス検体：Ｃ型肝炎ウィルス陽性患者
血清（ＩＮＴＥＲＧＥＮ社製） ラテックス試薬の調製 上記ポリスチレンラテックス液１容に、ラテックス希釈
用緩衝液２容を添加し、３．３％（Ｗ／Ｖ）ラテックス
液を得た。合成ペプチド抗原をタンパク質濃度が８００
μｇ／ｍｌとなるように抗原希釈用緩衝液で希釈し、抗
原液を得た。

【００４３】上記３．３％（Ｗ／Ｖ）ラテックス液４０
０μｌを２５℃のインキベーター中でマグネチックスタ
ーラーを用いて攪拌しつつ、上記抗原液１００μｌを素
早く添加し、２５℃で１時間攪拌した。

【００４４】次に、ブロッキング用緩衝液を０．５ｍｌ
添加し、２５℃で、続けて１時間攪拌した。さらに、こ
の混合液を１５℃、１８０００ｒｐｍで２０分間遠心分
離した。

【００４５】遠心分離により得られた沈殿に、ブロッキ
ング用緩衝液を２ｍｌ添加し、上記と同様にして、再度
遠心分離し、沈殿を洗浄した。この洗浄操作は合計３回
行った。

【００４６】洗浄後に、沈殿にブロッキング用緩衝液２
ｍｌを添加し、よく攪拌した後、超音波粉砕機を用いて
分散処理し、固形分０．２５％（Ｗ／Ｖ）のラテックス
試薬を得、４℃で保存した。

【００４７】Ｃ型肝炎ウィルス検体の測定 上記ラテックス試薬（合成ペプチド抗原をウシ血清アル
ブミンに複合化し、かつラテックスに担持させた試薬）
からなる免疫凝集反応測定試薬を用い、生化学用自動分
析装置（日立製作所社製、品番：７１７０型）を用い、
以下のようにしてＣ型肝炎ウィルス検体の測定を行っ
た。すなわち、上記ラテックス試薬の調製で得られた
固形分０．２５％（Ｗ／Ｖ）のラテックス試薬をそのま
まＲ２液とし、以下の測定条件で測定を行った。

【００４８】 検体容量 ２０μｌ 検体希釈用希釈液（Ｒ１液） １８０μｌ ラテックス試薬（Ｒ２液） ２０μｌ 測定波長 ７００ｎｍ 測定温度 ３７℃ 測定に際しては、上記自動分析装置るセルに入れられた
検体にＲ１液を投入し、５分後にＲ２液を投入した。ラ
テックス試薬すなわちＲ２液を添加してから約６０秒後
の吸光度と、約３１０秒後の吸光度との差を測定し、こ
の吸光度の差を１００００倍したものを吸光度変化量と
した。

【００４９】測定結果 Ｃ型肝炎ウィルス陽性患者血清５検体（それぞれ、検体
名称を、検体イ、ロ、ハ、ニ、ホとする）を検体として
用い、２段階希釈により２¹⁰倍まで希釈したサンプルを
用意した。上記の測定方法に従って、各サンプルの吸
光度変化を測定し、吸光度変化量＝４０をカットオフ値
とし、吸光度変化量がカットオフ値以上のものについて
は＋、カットオフ値未満のものについては−とした。結
果を下記の表１に示す。

【００５０】（比較例１）実施例においては、ポリスチ
レンラテックスに、Ｃ型肝炎ウィルス抗原として、合成
ペプチドをウシ血清アルブミンに複合化したものを担持
させたが、比較例１では、合成ペプチドのみを用いた。
その他の点については、実施例１と同様とした。すなわ
ち、比較例１では、合成ペプチドのみがラテックスに担
持されたラテックス試薬を調製した。上記のようにして
得られたラテックス試薬を用い、実施例と同様にしてＣ
型肝炎ウィルス検体の測定を行った。結果を下記の表１
に示す。

【００５１】（比較例２）Ｃ型肝炎ウィルス抗体測定用
ＥＩＡキットとして、市販のＥＩＡキット（ダイナボッ
ト社製、品番：ＨＣＶ・ＥＩＡII）を用い、キット添付
の操作法に従って測定を行った。なお検体としては、実
施例と同様に、Ｃ型肝炎ウィルス陽性患者血清を検体と
し、２段階希釈により２¹⁰倍まで希釈したサンプルを用
いた。

【００５２】また、キット添付の操作法に従って、各サ
ンプルの吸光度を測定し、キットに付属の陽性コントロ
ール及び陰性コントロールの吸光度から算出したカット
オフ値以上のものを＋、カットオフ値未満のものを−と
した。結果を下記の表１に示す。

【００５３】

【表１】 表１から明らかなように、従来のラテックス試薬による
測定結果（比較例１）と、実施例による測定結果は、低
濃度液及び高濃度液において一致しなかった。しかしな
がら、市販のＥＩＡ法による測定結果（比較例２）と、
実施例の測定結果が同等であるため、実施例の免疫凝集
反応測定試薬を用いれば、従来のラテックス試薬を用い
た場合に比べて、試料中に含まれている抗体などの超微
量成分を高精度に測定し得ることがわかる。

【００５４】

【発明の効果】第１の発明に係る免疫凝集反応測定試薬
の製造方法では、溶液中において、測定対象物質である
抗体（または抗原）に対応した抗原（または抗体）がキ
ャリアータンパク質に複合化された後に、該キャリアー
タンパク質が不溶性担体に担持される。従って、測定対
象物質である抗体（または抗原）に対する抗体（または
抗原）の配向性が高められ、それによって測定対象物質
中の抗体（または抗原）の濃度が低い場合であっても、
凝集がより確実に生じる。よって、生体試料中に含まれ
ている抗体（または抗原）が微量であっても、微量の抗
体（または抗原）を高精度に検出し得る免疫凝集反応測
定試薬を提供することができる。

【００５５】第２の発明においても、測定対象物質であ
る抗体が認識するエピトープの配列が含まれているペプ
チドがキャリアータンパク質に複合化された後に、該キ
ャリアータンパク質が不溶性担体に担持されるので、測
定対象物質である抗体に対するペプチドの配向性が高め
られ、凝集反応性が高められる。従って、第１の発明と
同様に、生体中に含まれている抗体が微量の場合であっ
ても、高精度に該抗体を検出することを可能とする免疫
凝集反応測定試薬を提供することができる。

【００５６】また、上記ペプチドとして、キャリアータ
ンパク質の等電点−０．５以下、あるいはキャリアータ
ンパク質の等電点＋０．５以上のペプチドを用いた場合
には、キャリアータンパク質の等電点付近のｐＨの緩衝
液中において、不溶性担体にキャリアータンパク質を担
持させれば、ペプチドが荷電を帯びることになるため、
測定対象物質である抗体に対するペプチドの配向性を高
めることができ、それによって測定感度を高めることが
できる。

【００５７】また、Ｃ型肝炎ウィルス抗体測定用の免疫
凝集反応測定試薬を構成する場合に、キャリアータンパ
ク質としてウシ血清アルブミンを用い、ペプチドが複合
化されたウシ血清アルブミン１分子に対し、上記ペプチ
ドが平均で１５分子以下の割合で複合化されている場合
には、ウシ血清アルブミンに対して上記ペプチドを容易
に担持させることができる。

【００５８】また、Ｃ型肝炎ウィルス抗体が認識するエ
ピトープの配列が含まれるペプチドとして、上述した配
列番号１〜４のアミノ酸配列のうち少なくとも１つの配
列が含まれているペプチドを用いた場合には、これらの
配列が特に抗原性が高いため、Ｃ型肝炎ウィルス抗体を
より効果的に検出することができる。

【００５９】また、本発明に係る免疫凝集反応測定試薬
では、上記のように試料中の抗原または抗体などの超微
量成分を感度よく測定することができ、しかもＢ／Ｆ分
離を必要としないので、測定の簡便化を図り得る。

【００６０】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：１８ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ １ ５ Ｇｌｎ Ｇｌｕ Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃｙｓ １０ １５ 配列番号：２ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ １ ５ Ｈｉｓ Ｔｙｒ Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ａｌａ １０ １５ Ａｌａ Ａｒｇ ２０ 配列番号：３ 配列の長さ：２０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｉｌｅ １ ５ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａｒｇ １０ １５ Ａｒｇ Ｇｌｙ ２０ 配列番号：４ 配列の長さ：２４ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列 Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ １ ５ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇｌｕ １０ １５ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓｐ ２０

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 溶液中において、測定対象物質である抗
   体（または抗原）に対応した抗原（または抗体）をキャ
   リアータンパク質に複合化させた後、該キャリアータン
   パク質を不溶性担体に担持させることを特徴とする免疫
   凝集反応測定試薬の製造方法。
2. 【請求項２】 溶液中において、測定対象物質である抗
   体が認識するエピトープの配列が含まれるペプチドをキ
   ャリアータンパク質に複合化させた後、該キャリアータ
   ンパク質を不溶性担体に担持させることを特徴とする免
   疫凝集反応測定試薬の製造方法。
3. 【請求項３】 前記ペプチドとして、等電点が、前記キ
   ャリアータンパク質の等電点−０．５以下、または等電
   点＋０．５以上の範囲にあるペプチドが用いられ、該ペ
   プチドが複合化されたキャリアータンパク質が不溶性担
   体に担持される際に、溶液のｐＨが、前記キャリアータ
   ンパク質の等電点−０．５以上、等電点＋０．５以下の
   範囲とされることを特徴とする請求項２に記載の免疫凝
   集反応測定試薬の製造方法。
4. 【請求項４】 前記測定対象物質が、Ｃ型肝炎ウィルス
   抗体であり、前記ペプチドとして、等電点が１〜４．５
   または５．５〜１３の範囲にあるものが用いられ、 前記キャリアータンパク質としてウシ血清アルブミンが
   用いられ、 前記ペプチドが複合化されたキャリアータンパク質が不
   溶性担体に担持される際に、溶液のｐＨが４．５〜５．
   ５とされることを特徴とする請求項３に記載の免疫凝集
   反応測定試薬の製造方法。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の免疫凝集反応測定試薬
   の製造方法により製造される免疫凝集反応測定試薬であ
   って、 前記ウシ血清アルブミン１分子に対し、平均で１５分子
   以下の割合で前記ペプチドが複合化されていることを特
   徴とする免疫凝集反応測定試薬。
6. 【請求項６】 Ｃ型肝炎ウィルス抗体が認識するエピト
   ープの配列を有する前記ペプチドが、下記の１〜４の配
   列のうち、少なくとも１つの配列を有することを特徴と
   する請求項４に記載の方法により製造された免疫凝集反
   応測定試薬、または、請求項５に記載の免疫凝集反応測
   定試薬。 配列番号１．Ｖａｌ Ｉｌｅ Ｐｒｏ Ａｓｐ Ａｒｇ
   Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｔｙｒ Ｇｌｎ Ｇｌｕ
   Ｐｈｅ Ａｓｐ Ｇｌｕ Ｍｅｔ Ｇｌｕ Ｇｌｕ Ｃ
   ｙｓ 配列番号２．Ｓｅｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ａｓｎ Ｈｉｓ
   Ｖａｌ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｔｈｒ Ｈｉｓ Ｔｙｒ
   Ｖａｌ Ｐｒｏ Ｇｌｕ Ｓｅｒ Ａｓｐ Ａｌａ Ａ
   ｌａ Ａｌａ Ａｒｇ 配列番号３．Ｖａｌ Ｌｙｓ Ｐｈｅ Ｐｒｏ Ｇｌｙ
   Ｇｌｙ Ｇｌｙ Ｇｌｎ Ｉｌｅ Ｖａｌ Ｇｌｙ
   Ｇｌｙ Ｖａｌ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｐｒｏ Ａ
   ｒｇ Ａｒｇ Ｇｌｙ 配列番号４．Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｌｅｕ Ｐｒｏ
   Ｉｌｅ Ｔｒｐ Ａｌａ Ａｒｇ Ｐｒｏ Ａｓｐ
   Ｔｙｒ Ａｓｎ Ｐｒｏ Ｐｒｏ Ｌｅｕ Ｌｅｕ Ｇ
   ｌｕ Ｓｅｒ Ｔｒｐ Ｌｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ａｓ
   ｐ