JPH11295313A - 抗体または抗体断片の重合体とその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】従来の重合化抗体の持つ問題点を解決した、従
来の重合化抗体よりも分子量が大きく、均一な重合度を
有する重合化抗体と、前記重合化抗体を用いた改良され
た免疫学的測定法を提供すること。 【解決手段】実質的に粒径が0.1μm以下の分子を含まな
いことを特徴とする抗体または抗体断片の重合体、なら
びにこの重合化抗体を用いた免疫学的測定法。 【効果】本発明による抗体または抗体断片の重合体は、
ゲル濾過クロマトグラフ等により分画しなくても均一な
重合度を有する重合体として使用可能である。重合度が
均一なので反応性にばらつきがなく、免疫学的測定にお
ける再現性の向上や非特異結合の抑制に効果が大きい。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、抗体または抗体断片の
重合体と、前記重合体を用いた免疫学的測定法に関す
る。

【０００２】

【従来技術の問題点】臨床検査の分野において、抗原・
抗体反応を利用した免疫学的検査方法は、感度、特異性
が高いことから、特に体液中の微量物質の定量に多用さ
れてきた。また、これらの免疫学的測定法で、より高感
度に、より精度良く測定するために各種の改良が試みら
れてきた。

【０００３】これまでの技術は、抗原・抗体反応を促進
するために、アフィニティーの高い抗体を使用し、かつ
免疫比濁法においてはポリエチレングリコール(PEG)の
ような、免疫凝集促進剤を添加することによってその目
的を果たしていた。しかしながら、免疫比濁法において
は、抗原・抗体反応に由来する濁度のみが測定系の高感
度化要因であり、そのためには多量の抗体・高濃度の抗
体を試薬中に存在させることが必要であった。したがっ
て試薬コストの増大を招き、さらには被検検体中の非特
異反応因子が、高濃度で存在する抗体と反応し、測定誤
差を生ずる原因となっていた。また、モノクローナル抗
体は、単一のエピトープしか認識しないという特有の性
質のために、免疫比濁法での使用は不可能であるか、可
能であっても実用的な感度を得ることはできなかった。

【０００４】上記の問題点は、表面積の大きい不溶化担
体に抗体を担持させるラテックス凝集法・EIA・ELISA・
IRMA法などでは解消される。しかしながら、固相に抗体
を担持させる際、特に物理的担持法の場合、抗体の疎水
性度が問題となり、常に一定量の抗体を不溶化担体上に
担持することが困難である場合が多い。このことは、測
定系の性能を左右する大きな要因であり、さらには製造
ロット差を生み出す原因にもなっていた。

【０００５】このため、抗体を一部変性させて疎水性度
を高めた後、不溶化担体に吸着させる方法が試みられて
いる1)。しかしながら、この抗体変性によって抗体活性
を失う場合があり、すべての種類の抗体に応用できない
という難点がある。また血清・体液および組織抽出液を
サンプルとしてEIA・ELISA・IRMA法を行う場合、不溶化
担体上の抗体と抗原との免疫反応複合体に結合する標識
抗体の量が減少することが多いと言われている2)。この
理由は、サンプル中の比較的分子量の大きなタンパク質
が不溶化担体上に非特異吸着し、その立体障害により、
標識抗体が正確な免疫反応をすることができないことに
よる3)。したがってこの現象を回避するには、あらかじ
め大きな分子量を有する抗体を不溶化担体に結合させ、
その立体障害により、サンプル中に存在する非特異物質
を、不溶化担体上のすき間に入れなくする工夫が必要で
ある。

【０００６】また、抗体不溶化担体と標識抗体を使用し
て免疫学的測定法を行い、至適な感度・反応性等を有す
る測定試薬を作製する場合、標識抗体の標識率・濃度が
試薬の至適化に大きく左右される。特に高感度な測定系
を構築する場合には、アッセイにおける非特異吸着によ
ってその性能の可否が決まることが多い。その場合、単
量体抗体への標識率が高いと、不溶化担体への非特異吸
着が高くなり高感度化ができない。石川らによって考案
された、抗体フラグメントFab′と酵素を化学的に結合
させた酵素標識抗体は、前記の非特異吸着を防止するた
めの大きな手段となっている4)。ただし、測定範囲の広
い検査項目を測定する場合には、プロゾーン現象を回避
するために、標識抗体の濃度を上げてやる必要性があ
る。その場合、標識抗体濃度の上昇と共に不溶化担体上
への非特異反応が起こり、高感度でかつ測定範囲の広い
検査項目（例としてhCGが挙げられる）についてはどち
らかを犠牲にして測定系を組み立てなくてはならなかっ
た。

【０００７】最近、抗体等を重合化して免疫比濁法5)、
6)や酵素・発光免疫測定法7)、8)に応用しようという特
許が公開されている。重合化した抗体や抗体断片、さら
にその標識物は測定感度の上昇をはじめとするさまざま
な効果が認められる。これらの効果は重合体の重合度が
均一であるほうが、重合体の反応性や効果もばらつきが
少なくなり有利であると考えられる。しかしながら、こ
れらの特許で開示された技術により作製された抗体ある
いは抗体断片の重合体（重合化抗体）は重合度が不均一
で分子量のばらつきが大きいという欠点がある。そのた
め反応性や重合化抗体特有の効果にもばらつきが生じ、
測定系に至適な重合体を得るには重合後にゲルろ過等の
分離を行い至適性能を有する重合体画分を分取する必要
がある。さらに、不均一な重合体作製法であるがゆえ
に、例え分取したとしても均一な重合度を有する重合体
は微量でしか得られず、きわめて作製収率が悪い。以上
のようなことから、製造上の収率の悪さならびに反応性
のばらつきにより、効果的な測定試薬・測定系を保証す
ることはできない。

【０００８】また、重合化抗体を用いた免疫比濁法で
は、重合化抗体の重合度が高いほど測定感度が上昇する
ことが明らかだが、分子量が100万以上の重合体の製造
方法やそれを用いた場合の効果は未知であり、前出の文
献でも何ら開示されていない。

【０００９】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、従来
の重合化抗体よりも分子量が大きく、均一な重合度を有
する重合化抗体と、前記重合化抗体を用いた免疫学的測
定法を提供することである。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の発明者らは鋭意
努力した結果、従来の重合化抗体の製造法を改良を試
み、より分子量が大きく重合度の均一な重合化抗体を製
造することに成功し、これをもとに免疫学的測定法の改
良を行った。すなわち、本発明は以下の構成からなる。

【００１１】（１）粒径が0.1μmよりも大きな分子から
なることを特徴とする抗体または抗体断片の重合体。

【００１２】（２）水溶性であることを特徴とする
（１）に記載の抗体または抗体断片の重合体。

【００１３】（３）水不溶性であることを特徴とする
（２）に記載の抗体または抗体断片の重合体。

【００１４】（４）抗体または抗体断片が、モノクロー
ナル抗体あるいはモノクローナル抗体の断片である
（１）から（３）に記載の抗体または抗体断片の重合
体。

【００１５】（５）抗体断片がF(ab)'2であることを特
徴とする（１）から（４）までの抗体または抗体断片の
重合体。

【００１６】（６）重合体が、マレイミド基を導入した
第１の抗体または抗体断片と、チオール基を導入した第
２の抗体または抗体断片を反応させることにより得られ
たものである、（１）から（３）の抗体または抗体断片
の重合体。

【００１７】（７）（１）から（６）に記載の重合体を
不溶化担体に固定して得られる固定化重合体。

【００１８】（８）（１）、（２）および（４）から
（６）に記載の重合体をさらに標識物質により標識して
得られる標識重合体。

【００１９】（９）標識物質が酵素である（８）に記載
の標識重合体。

【００２０】（１０）（３）に記載の抗体または抗体断
片の重合体を超音波処理して得られる組成物。

【００２１】（１１）（１）から（１０）に記載の重合
体を用いる免疫学的測定法。

【００２２】（１２）免疫学的測定法が免疫比濁法であ
る、（１１）に記載の測定法。

【００２３】（１３）（７）に記載の固定化重合体を用
いる免疫学的測定法。

【００２４】（１４）免疫学的測定法が、ラテックス凝
集法、ELISA、IRMA、あるいはイムノクロマト法からな
る群から選択されたものである、（１３）に記載の方
法。

【００２５】（１５）（８）から（９）に記載の標識重
合体を用いる、免疫学的測定における非特異吸着の抑制
方法。

【００２６】

【発明の実施の形態】本発明の重合化抗体は、粒径0.1
μmよりも大きな分子から構成される高分子量の抗体ま
たは抗体断片の重合体である。分子量100万以上の領域
で良好な分離能を持つゲル濾過用のカラムや、適当な分
子量のサイズマーカーがないために、分子量を正確に測
定するのは困難であるが、IgGを用いて作製した場合の
本発明の重合化抗体の分子量は240万以上、重合度は16
以上と推定される。また、本発明の重合化抗体は均一な
分子量分布を有していて、未反応の単量体や、低分子量
の重合体をほとんど含まないので、重合反応後に特に分
子量分画の操作を行わなずに、そのまま後述するような
各種免疫学的測定用の試薬を調製することが可能であ
る。

【００２７】本発明の重合化抗体の製造方法は後述する
が、重合度が低く分子量の小さいものは、粒径が小さく
水溶性であり、重合度が増すにしたがって粒径と疎水性
が高まり、やがては重合反応後もゲル状のままの水不溶
性物となる。本発明の重合化抗体は、粒径が0.1μmより
も大きい水溶性の重合化抗体と、それよりも重合度の高
い水不溶性の重合化抗体の両方を含む。

【００２８】本発明における重合化抗体を構成する抗体
または抗体フラグメントは、その動物種やサブクラス等
によらず使用できる。例えば、本発明に用いることが可
能な抗体（イムノグロブリン:Ig）はマウスIgG、マウス
IgM、マウスIgA、ラットIgG、ラットIgM、ラビットIg
G、ラビットIgM、ヤギIgG、ヤギIgM、ヒツジIgG、ヒツ
ジIgM、ニワトリIgY等があげられ、モノクローナルであ
るかポリクローナルであるかは問わない。しかし、本発
明の均一な重合度を有し反応性にばらつきが少ないとい
う長所を生かすためには、モノクローナル抗体を使用す
るのが好ましい。

【００２９】抗体フラグメントは、少なくとも１個の抗
原結合部位を有する、完全型抗体から導かれた分子また
は物質として表現され、具体的にはFab、F(ab)'2等があ
げられる。これらの抗体断片は抗体の酵素あるいは化学
的処理によって、あるいは遺伝子工学的手法を用いて得
られる分子または物質である。抗体断片を用いて重合化
抗体を作製する場合には、重合反応後も十分な抗原結合
活性を維持するために、F(ab)'2断片を用いるのが好ま
しい。

【００３０】本発明の重合化抗体は、マレイミド基を導
入した第１の抗体または抗体フラグメントと、チオール
基を導入した第２の抗体または抗体フラグメントを重合
させることにより製造される。マレイミド基とチオール
基の結合を利用した重合体の製造法は公知であり、抗体
または抗体断片をこれらの官能基で修飾するための化学
修飾剤が知られている。

【００３１】マレイミド基を有する化学修飾剤として
は、抗体または抗体断片のアミノ基と反応する少なくと
も一つ以上のN-ヒドロキシスクシンイミド基と、少なく
とも一つ以上のマレイミド基を有する以下の二官能性試
薬をあげることができる。 N-(8-マレイミドカプリルオキシ)スクシンイミド N-(8-マレイミドカプリルオキシ)スルホスクシンイミド
ナトリウム塩 N-(6-マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド N-(6-マレイミドカプロイルオキシ)スルホスクシンイミ
ドナトリウム塩 N-(4-マレイミドブチリルオキシ)スクシンイミド N-(4-マレイミドブチリルオキシ)スルホスクシンイミド
ナトリウム塩 N-(11-マレイミドウンデカノイルオキシ)スクシンイミ
ド N-(11-マレイミドウンデカノイルオキシ)スルホスクシ
ンイミドナトリウム塩 ｍ-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミド
エステル ｍ-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスルホスクシン
イミドエステル スクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン
-1-カルボキシレート スルホスクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘ
キサン-1-カルボキシレート スクシニミジル4-(ρ-マレイミドフェニル)ブチレート スルホスクシニミジル4-(ρ-マレイミドフェニル)ブチ
レート N-｛［4-(2-マレイミドエトキシ)スクシニル］オキ
シ)｝スクシンイミド等

【００３２】好ましくは、水溶性が高く、pH中性域で安
定性の良いN-(8-マレイミドカプリルオキシ)スルホスク
シンイミドナトリウム塩、N-(6-マレイミドカプロイル
オキシ)スクシンイミド、N-(6-マレイミドカプロイルオ
キシ)スルホスクシンイミドナトリウム塩、N-(4-マレイ
ミドブチリルオキシ)スルホスクシンイミドナトリウム
塩、N-(11-マレイミドウンデカノイルオキシ)スルホス
クシンイミドナトリウム塩である。

【００３３】チオール基を導入するための化学修飾剤と
しては、以下の二官能性試薬をあげることができる。 N-スクシニミジルS-アセチルチオアセテート S-アセチルメルカプトスクシニックアンヒドリド N-スクシニミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネー
ト メチル-3-(4′-ジチオピリジル)プロピオニミデート メチル-4-メルカプトブチリミデート メチル-3-メルカプトプロピオニミデート イミノチオラン ジチオビス(スクシニミジルプロピオネート) ジメチル3,3′-ジチオビスプロピオニミデート・二塩酸 N-スクシニミジル(4-アジドフェニル)1,3′-ジチオプロ
ピオネート スルホスクシニミジル 2-(m-アジド-o-ニトロ-ベンズア
ミド)エチル-1,3′-ジチオプロピオネート 4-スクシニミジルオキシカルボニル-メチル-α-(2-ピリ
ジルジチオ)トルエン スクシニミジル 6-［3-(2-ピリジルジチオ)-プロピオン
アミド］ヘキサノエート スルホスクシニミジル 6-［3-(2-ピリジルジチオ)-プロ
ピオンアミド］ヘキサノエート スルホスクシニミジル(4-アジドフェニルジチオ)プロピ
オネート スルホスクシニミジル-6-［α-メチル-α-(2-ピリジル
ジチオ)トルアミド］ヘキサノエート等

【００３４】好ましくは水溶性が高く、安定性の良い、
N-スクシニミジルS-アセチルチオアセテートやS-アセチ
ルメルカプトスクシニックアンヒドリドである。

【００３５】本発明の重合化抗体の重合度は、抗体また
は抗体断片に導入するマレイミド基またはチオール基の
数、すなわち化学修飾剤の量によってある程度制御可能
である。導入するマレイミド基あるいはチオール基の数
が少ない場合には、重合度も低く、生成する重合化抗体
の粒径も小さくなり、重合化抗体の持つ効果を十分に発
揮できなくなる。逆に導入するマレイミド基あるいはチ
オール基の数を多くすると、重合度が高くなり、重合反
応時に水不溶性のゲル状の物質となる。このゲル状の物
質は超音波処理することにより懸濁液となり、後述する
ような比濁測定に用いることができるようになる。

【００３６】本発明において第１の抗体または抗体断片
と第２の抗体または抗体断片は、どのような組み合わせ
であってもよい。たとえば単一の抗体にそれぞれマレイ
ミド基とチオール基を導入したものを重合させてもよい
し、マレイミド基を導入したF(ab)'2とチオール基を導
入した別の抗体を重合させることもできる。

【００３７】本発明における重合化抗体は、不溶化担体
に固相化することも可能である。不溶化担体としては、
ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエ
ン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、
ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチ
ン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、
金属、セラミックス、又は磁性体等の材質よりなるビー
ズ、マイクロプレート、試験管、スティック、又は試験
片等の形状の不溶化担体を用いることができる。

【００３８】固相化方法は物理的吸着法、化学的結合法
又はこれらの併用等の公知の方法をとることが可能であ
る。たとえば、表面にアミノ基を導入したポリスチレン
ビーズに、先に挙げたような化学修飾剤を用いてマレイ
ミド基、あるいはチオール基を導入し、重合化抗体に残
存しているチオール基やマレイミド基と結合させること
により固相化重合化抗体を得ることができる。

【００３９】また、本発明における重合化抗体は、各種
物質により標識し、標識重合化抗体として用いることが
できる。標識物質としては、放射性同位元素、酵素、蛍
光物質、色素等をあげることができる。これらの標識物
質による抗体の標識法は公知であるが、不溶化担体への
固相化と同様に重合化抗体に残存するチオール基やマレ
イミド基を利用して、マレイミド基、あるいはチオール
基を導入した酵素（パーオキシダーゼやルシフェラーゼ
等）で標識するのが好ましい。

【００４０】本発明おいて得られる重合化抗体、固相化
重合化抗体、標識重合化抗体ならびに水不溶性重合化抗
体の懸濁液は、各種免疫学的測定に応用可能である。

【００４１】本発明の重合化抗体は免疫比濁法に応用可
能であり、免疫比濁法の手順自体はすでに公知である。
一般的には測定すべき分析物を含有するサンプルを、重
合化抗体とともに適当な条件下で十分な時間インキュベ
ートし、吸光度の変化を測定する。必要に応じて非特異
結合を抑制するために界面活性剤等を、また、反応を促
進するためにポリエチレングリコール(PEG)等の物質を
あらかじめ反応系に添加しておいてもよい。また、水不
溶性の重合化抗体を超音波処理して得られる懸濁液で
も、前述の免疫比濁法と同じ手順で免疫比濁測定が可能
である。

【００４２】本発明において得られる固相化重合化抗体
は、ラテックス凝集法や、ELISA、IRMA、ならびにイム
ノクロマト法にも使用可能である。

【００４３】ラテックス凝集法の手順は公知であり、一
般的には測定すべき分析物を含有するサンプルを、ラテ
ックス粒子に固相化した本発明の固相化重合化抗体とと
もに適当な条件下で十分な時間インキュベートし、吸光
度、あるいは散乱光の変化を測定する。免疫比濁法と同
様に、均一系において抗原抗体反応により生成する凝集
物を光学的に測定する方法なので、ラテックス凝集法に
おいても、必要に応じて非特異結合を抑制するために界
面活性剤等を、また、反応を促進するためにポリエチレ
ングリコール(PEG)等の物質をあらかじめ反応系に添加
しておいてもよい。

【００４４】ELISAならびにIRMAにおいては、ポリスチ
レンビーズや96穴マイクロタイタープレートのウェルに
本発明の重合化抗体を固相化して用いる。その他の試薬
類の製造方法や、測定操作は、公知のサンドイッチアッ
セイに則って行われる。一般的には、測定すべき対象物
を含有するサンプルを、任意の順序で固相化重合化抗
体、標識した抗体または抗体断片とともに適当な条件下
で十分な時間インキュベートし、サンドイッチ複合体を
形成する。その後、サンドイッチ複合体と遊離の標識し
た抗体または抗体断片を分離して、サンドイッチ複合体
上の標識を適当な方法で検出する。サンドイッチアッセ
イでは標識した抗体または抗体断片の代わりに標識重合
化抗体を用いることも可能である。

【００４５】本発明の標識重合化抗体は、従来のELIS
A、IRMA等の測定法における標識した抗体または抗体断
片の代わりに使用可能である。これらの測定法は前述の
サンドイッチアッセイの原理に基づき行われる。標識重
合化抗体を用いた場合には、従来の標識抗体（単量体）
に比べて、単位抗体あたりの標識物の量が相対的に増加
するので、高感度となることは公知であるが、さらに本
発明では非特異結合の抑制方法も提供する。

【００４６】

【発明の効果】本発明で得られる重合化抗体は、従来製
造できなかった大きな分子量を持ち、なおかつ重合反応
後に分子量分画しなくてもそのまま使用できるほど均一
な分子量分布を有する。したがって、重合化抗体による
効果の期待できる各種免疫学的測定法において、非常に
有用である。

【００４７】まず、免疫比濁法の分野において、従来知
られていた測定感度の高感度化に加えて、均一な分子量
分布による再現性の改善が挙げられる。また、水不溶性
の重合化抗体を超音波処理した懸濁液では、比濁測定の
さらなる高感度化、迅速化がもたらされる。また、ELIS
A、ならびにIRMAにおいては、非特異結合の抑制効果が
認められる。

【００４８】

【実施例】実施例１ 抗体へのマレイミド基導入 モノクローナル抗体抗アルブミン−M13 IgG 5mg（自家
製）を0.1Mりん酸緩衝液pH7.2 360μlに溶解し、ジメチ
ルホルムアミド中に2mg／mlに溶解したN-(8-マレイミド
カプリルオキシ)スルホスクシンイミドナトリウム塩（S
ulfo-HMCS、同仁化学社製）を70μl加え、30℃で30〜60
分反応させた。反応後、PD-10（ファルマシア製）にか
け、タンパク質部分を回収した。その後、マレイミド基
導入IgGの回収液を遠心濃縮にて、3.5mg/ml程度まで濃
縮した。

【００４９】実施例２ 抗体へのチオール基導入 モノクローナル抗体抗アルブミン−M13 IgG 10mg（自家
製）を0.1Mりん酸緩衝液pH7.2 1.0mlに溶解し、ジメチ
ルホルムアミド1mlに10mgのN-スクシニミジル S-アセチ
ルチオアセテート（ピアース社製）を溶解した溶液を39
μlを加えた。30℃で30〜90分反応させた後、１Ｍ トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸緩衝液pH8.0
200μl、1Ｍ塩酸ヒドロキシルアミン溶液を100μl、0.1
Ｍエチレンジアミン四酢酸−0.1Mトリス（ヒドロキシメ
チル）アミノメタン溶液を50μlを順次添加し、30℃で1
0〜30分反応させた。反応後、0.01M エチレンジアミン
四酢酸含有0.1Mりん酸緩衝液を溶離液として、PD-10
（ファルマシア製）にてゲルろ過し、タンパク質部分を
回収した。さらに、SH基導入抗体の回収液を遠心濃縮に
て3.5mg/ml程度まで濃縮した。

【００５０】実施例３ マレイミド基導入抗体とチオー
ル基導入抗体の重合化反応 実施例１で調整した3.6mgマレイミド基導入モノクロー
ナル抗体抗アルブミン−M13 IgGと実施例２で調整した
3.6mgチオール基導入モノクローナル抗体抗アルブミン
−M13 IgGを混合し（反応比1:1）、30℃、30分〜60分イ
ンキュベートした。反応後の溶液の一部を取り、0.1Mリ
ン酸緩衝液（pH6.5）を用いて、TSK-GEL G4000SWXL（東
ソー社製）でゲルろ過して。図１に示すように単一のピ
ークがあることを確認した。残りの重合化抗体の溶液は
5mg/ml程度まで濃縮した。粒度分布計ELS-800(OTSUKA E
LECTRONICS)を用いて重合化抗体の粒径を測定したとこ
ろ、平均粒径0.1194μmであった。

【００５１】比較例１ 抗体へのマレイミド基導入 モノクローナル抗体抗アルブミン−M13 IgG 5mg（自家
製）を0.1Mりん酸緩衝液pH7.2 360μlに溶解し、ジメチ
ルホルムアミド中に2mg／mlに溶解したN-(8-マレイミド
カプリルオキシ)スルホスクシンイミドナトリウム塩（S
ulfo-ＨＭＣＳ、同仁化学社製）を25μl加え、30℃で30
〜60分反応させた。反応後、PD-10（ファルマシア製）
にかけ、タンパク質部分を回収した。その後、マレイミ
ド基導入IgGの回収液を遠心濃縮にて、3.5mg/ml程度ま
で濃縮した。

【００５２】比較例２ マレイミド基導入抗体とチオー
ル基導入抗体の重合化反応 比較例１で作製したマレイミド基導入モノクローナル抗
体抗アルブミン−M133.6mgと実施例２で作製したチオー
ル基導入モノクローナル抗体抗アルブミン−M13 3.6mg
を、実施例３と同様に反応させ、ゲルろ過した。その結
果、図２に示すように、さまざまな分子量を有する重合
化抗体と未反応のIgGが回収された。未反応IgGを除いた
部分の重合化抗体フラクションをプールし、5mg/mlまで
濃縮した。

【００５３】実施例４ 均一分子量を有する重合化抗体
での免疫比濁法および不均一な分子量を有する重合化抗
体における免疫比濁法 実施例３で作製したモノクローナル抗体抗アルブミン−
M13 IgGの均一重合化抗体を使用して、免疫比濁法によ
り抗原ヒトアルブミンとの免疫凝集能およびヒトアルブ
ミン各濃度における同時再現性を調べた。また、比較と
して比較例２で作製したモノクローナル抗体抗アルブミ
ン−M13 IgGの不均一な分子量を有する重合化抗体を使
用した免疫比濁法を行った。免疫比濁法の測定について
は以下のように行った。0.1M NaCl、4% PEG（平均分子
量6000）を含む0.1M 2-［4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピ
ペラジニル］エタンスルホン酸（HEPESと略）-NaOH緩衝
液pH7.5を第1試薬とし、上記の重合化抗体は、0.1M HEP
ES-NaOH緩衝液pH7.5で5倍希釈して第2試薬とした。測定
には7070型日立自動分析装置を使用し、標準アルブミン
溶液（0、1.56、6.25、25、100μg/ml：シグマ社製ヒト
アルブミンを0.1MHEPES-NaOH緩衝液pH7.5で希釈した)20
μlに、第1試薬300μlを加え、37℃、5分間インキュベ
ートした。ついで、前記した重合化抗体よりなる、第2
試薬を50μl添加し、37℃、5分間インキュベートした。
その後、主波長340nm、副波長700nmにおける吸光度変化
量を測定した。均一分子量を有する重合化抗体を使用し
た免疫比濁法における、標準アルブミン1.56μg/ml、6.
25μg/ml、25μg/ml、100μg/ml各濃度での同時再現性
を表１に示す。また、不均一な分子量を有する重合化抗
体を使用した免疫比濁法の同時再現性について、表２に
示した。表１に示すように、均一重合化抗体を使用した
免疫比濁法では良好な同時再現性が得られた。一方、不
均一な重合化抗体を用いた場合の免疫比濁法では同時再
現性が悪く、不均一な免疫反応の結果を反映する結果と
なった。

【００５４】

【表１】

【００５５】

【表２】

【００５６】実施例５ 標識均一重合化抗体の製造 実施例１から３と全く同様にして、モノクローナル抗体
抗アルブミン−M13 IgGの均一重合化抗体を作製した。
さらに均一重合化抗体の残存チオール基を利用して、酵
素と化学結合させ、酵素標識重合化抗体を作製した。

【００５７】ペルオキシダーゼ(HRP)へのマレイミド基
の導入 HRP(Type I-C、東洋紡製)8mgを0.1Mリン酸緩衝液pH7.2
0.6mlに溶かした。この溶液に、DMF200μlに溶解した10
mg N-(6-マレイミドカプロイルオキシ)スクシンイミド
（EMCS、同仁化学社製））を60μl加えて、30℃、60〜9
0分間インキュベーションした。反応後、0.1Ｍリン酸緩
衝液pH7.2を溶出液とし、PD-10（ファルマシア社製）で
ゲルろ過し、マレイミド基導入HRP部分を回収した。

【００５８】均一重合化抗体とマレイミド基導入HRPと
の反応 モノクローナル抗体抗アルブミン−M13 IgGの均一重合
化抗体3.5mg/ml溶液0.4mlと1.2mg/mlマレイミド基導入H
RP0.4mlを混合し、30℃で60〜90分間インキュベーショ
ンした。反応後、0.1Mリン酸緩衝液（pH6.5）を用い
て、TSK-GEL G4000SWXL（東ソー社製）でゲルろ過し、
未反応のHRPを除去し、HRP標識重合抗体部分をプールし
た。

【００５９】実施例６ 均一重合化抗体を用いたヒトア
ルブミンの酵素免疫測定法 0.15M Nacl添加20mMリン酸緩衝液pH7.0(PBS)に、実施例
１から５と同様にして作製された、モノクローナル抗体
抗アルブミン−M14の均一重合化抗体を1.0μg/mlとなる
よう溶解し、市販のELISA用96穴マイクロタイタープレ
ート(Maxisorp F96、NUNC社製、商標)の各ウェルに、10
0μlずつ分注した。また、参照として、モノクローナル
抗体抗アルブミン−M14 IgGを前記と同様に、各ウェル
に分注した。その後、37℃で2時間インキュベートし、
さらに4℃で12時間、水分が蒸発しないようプレートを
完全にシールし、放置した。次に、各ウェルを20mM PBS
pH7.0で3回洗浄した。その後、各ウェルに0.15％Tween
20、2％ブロックエース（大日本製薬製、商標）添加20m
M PBS pH7.0を200μl加え、室温で3時間インキュベート
し、プレートのブロッキングを行った。調整したプレー
トは、使用する時まで4℃に保存した。以上の方法によ
り、モノクローナル抗体抗アルブミン−M14の均一重合
化抗体固定化プレートおよびモノクローナル抗体抗アル
ブミン−M14 IgG固定化プレートを作製した。

【００６０】前記した均一重合化抗体固定化プレートお
よびIgG固定化プレートを各々3枚ずつ用意し、各々のプ
レートの各ウェルを、20mM PBS pH7.0で3回洗浄した。
次に、ヒトアルブミンを0.1％カゼインナトリウム、0.0
1％Tween20、0.1％アジ化ナトリウムを添加した20mM PB
S pH7.0で希釈溶解し、0,0.03,0.06,0.25,1.95,15.6,50
μg／mlの7種の試料溶液を作製し、各々10μlずつ、各
々のプレートの各ウェルに添加し、さらに、0.1％カゼ
インナトリウム、0.01％Tween20、0.1％アジ化ナトリウ
ムを添加した20mM PBS pH7.0を90μl加えて、37℃で30
分間インキュベーションした。反応終了後、20mM PBS p
H7.0で3回洗浄した。

【００６１】次に、実施例５で作製したペルオキシダー
ゼ標識モノクローナル抗体抗アルブミン−M13均一重合
化抗体を、0.25％カゼインナトリウム、0.3%Tween20を
添加した20mM PBS pH7.0で希釈し、その中に含まれる標
識ペルオキシダーゼが0.085μg/mlとなるように調整し
た溶液を、各プレートの各ウェルに100μlずつ加えた。
その後、37℃で30分、60分、90分と、プレートごとに時
間をかえてインキュベーションした。各々の反応終了
後、各プレートの各ウェルを、0.01％Tween20添加20mM
PBS pH7.0で3回洗浄した。

【００６２】次に、発色剤として、0.02％H₂O₂、0.45mM
3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（同仁化学社製）
を添加した0.1Mクエン酸緩衝液pH5.5を、各々のプレー
トの各ウェルに100μlずつ加え、37℃で30分間インキュ
ベーションした。この呈色反応は、各ウェルに4N-H₂SO₄
を50μlずつ加えることによって停止させ、波長450nmに
おける吸光度をマイクロプレートリーダーで測定した。
各ヒトアルブミン濃度におけるモノクローナル抗体抗ア
ルブミン−M14の均一重合化抗体固定化固相とペルオキ
シダーゼ標識モノクローナル抗体抗アルブミン−M13均
一重合化抗体との組み合わせによる吸光度を表３に示
す。また、モノクローナル抗体抗アルブミン−M14 IgG
固定化固相とペルオキシダーゼ標識モノクローナル抗体
抗アルブミン−M13均一重合化抗体との組み合わせによ
る吸光度を表４に示す。

【００６３】

【表３】

【００６４】

【表４】

【００６５】参照例１ マレイミド法によるHRP標識抗
体を使用したヒトアルブミンの酵素免疫測定法 モノクローナル抗アルブミン−M13抗体を文献4)に記載
の方法により、HRPと結合させ、HRP標識抗体を作製し
た。これをセファデックスG-200（ファルマシア社製）
を用いて分画精製し、0.25％カゼインナトリウム、0.3%
Tween20を添加した20mM PBS pH7.0で希釈し、その中に
含まれる標識ペルオキシダーゼが、実施例８と同様に0.
085μg/mlとなるように調整した。このようにして調整
されたHRP標識抗体を使用して、実施例８と全く同様の
方法で、ヒトアルブミンの酵素免疫測定法を行った。表
５にモノクローナル抗体抗アルブミン−M14 の均一重合
化抗体固定化固相と、マレイミド法で作製したHRP標識
抗体の組み合わせによる吸光度を示す。また、モノクロ
ーナル抗体抗アルブミン−M14 IgG固定化固相とマレイ
ミド法で作製したHRP標識抗体の組み合わせによる吸光
度を表６に示す。

【００６６】

【表５】

【００６７】

【表６】

【００６８】参照例２ 過ヨウ素酸法によるHRP標識抗
体を使用したヒトアルブミンの酵素免疫測定法 モノクローナル抗体抗アルブミン−M13抗体を、文献9)
に記載の方法により、過ヨウ素酸法によりHRPと結合さ
せた。これを、Superose 6prepカラム（ファルマシア社
製）を用いてゲルろ過し、精製した。HRP標識抗体は0.2
5％カゼインナトリウム、0.3%Tween20を添加した20mM P
BS pH7.0で希釈し、その中に含まれる標識ペルオキシダ
ーゼが、実施例８と同様に0.085μg/mlとなるように調
整した。このようにして調整されたHRP標識抗体を使用
して、実施例８と同様の方法で、ヒトアルブミンの酵素
免疫測定法を行った。表７にモノクローナル抗体抗アル
ブミン−M14 IgG固定化固相と、過ヨウ素酸法で作製し
たHRP標識抗体の組み合わせによる吸光度を示す。

【００６９】

【表７】

【００７０】実施例６と参照例１・２の結果比較 標識化された均一重合化抗体を使用した場合、反応時間
を延長しても顕著なバックグラウンド上昇は認められ
ず、固相への非特異吸着現象が抑えられているのに対
し、参照例１・２で作製した標識抗体は、反応時間を延
長すると、明らかに固相上への非特異吸着が増大してい
た。

【００７１】実施例７ 抗体へのマレイミド基導入 モノクローナル抗体抗アルブミン−M13 IgG 5mg（自家
製）を0.1Mりん酸緩衝液pH7.2 360μlに溶解し、ジメチ
ルホルムアミド中に10mg／mlに溶解したN-(8-マレイミ
ドカプリルオキシ)スルホスクシンイミドナトリウム塩
（Sulfo-HMCS、同仁化学社製）を70μl加え、30℃で30
〜60分反応させた。反応後、PD-10（ファルマシア製）
にかけ、タンパク質部分を回収した。その後、マレイミ
ド基導入IgGの回収液を遠心濃縮にて、3.5mg/ml程度ま
で濃縮した。

【００７２】実施例８ マレイミド基導入抗体とチオー
ル基導入抗体の重合化反応 実施例７で作製したマレイミド基導入モノクローナル抗
体抗アルブミン−M133.6mgと実施例２で作製したチオー
ル基導入モノクローナル抗体抗アルブミン−M13 3.6mg
を、実施例３と同様に反応させ、ゲル状の反応生成物を
得た。この反応生成物を凍結乾燥して秤量した後、0.1M
HEPES-NaOH緩衝液pH7.5を加えて再びゲルを水和し、氷
冷しながら10分間超音波処理してゲルを破砕し、水不溶
性重合化抗体の懸濁液を調製した。粒度分布計ELS-800
(OTSUKA ELECTRONICS)を用いて水不溶性重合化抗体の粒
径を測定したところ、平均粒径0.2463μmであった。

【００７３】実施例９ 水不溶性重合化抗体懸濁液での
免疫比濁法 実施例８で作製したモノクローナル抗体抗アルブミン−
M13 IgGの水不溶性重合化抗体懸濁液を使用して、免疫
比濁法により抗原ヒトアルブミンとの免疫凝集能を調べ
た。免疫比濁法の測定については以下のように行った。
第1試薬には実施例４で用いた第1試薬からPEGを除いた
組成のものを調製して用いた。また、上記の水不溶性重
合化抗体懸濁液は、0.1M HEPES-NaOH緩衝液pH7.5で希釈
して蛋白量を1mg/mlに調整したものを第2試薬とした。
測定には7070型日立自動分析装置を使用し、標準アルブ
ミン溶液（0、1.56、6.25、25、100μg/ml：シグマ社製
ヒトアルブミンを0.1M HEPES-NaOH緩衝液pH7.5で希釈し
た)20μlに、第1試薬300μlを加え、37℃、5分間インキ
ュベートした。ついで、前記した重合化抗体よりなる、
第2試薬を50μl添加し、37℃、5分間インキュベートし
た。その後、主波長340nm、副波長700nmにおける吸光度
変化量を測定した。また比較対照として、実施例４で用
いたものと同じ第1試薬で同一の操作で測定を行った。
測定結果を表８に示した。表８に示すように反応促進剤
であるPEGを添加しなくても、対照と同等の感度が得ら
れた。

【００７４】

【表８】

【００７５】参考文献 1)生化学実験法11 エンザイムイムノアッセイ：東京化
学同人,270ページ,1989年 2)酵素免疫測定法：医学書院,171ページ,1987年 3)酵素免疫測定法：医学書院,172ページ,1987年 4)特公平 4- 8748 5)特開平 9- 54092 6)特許第2704760号公報 7)特開平 9-124740 8)特開平10- 48211 9)生化学実験法11 エンザイムイムノアッセイ：東京化
学同人,211ページ,1989年

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の重合化抗体のゲル濾過クロマトグラフ
のパターン。

【図２】比較例の重合化抗体のゲル濾過クロマトグラフ
のパターン。

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】粒径が0.1μmよりも大きな分子からなるこ
   とを特徴とする抗体または抗体断片の重合体。
2. 【請求項２】水溶性であることを特徴とする請求項１に
   記載の抗体または抗体断片の重合体。
3. 【請求項３】水不溶性であることを特徴とする請求項１
   に記載の抗体または抗体断片の重合体。
4. 【請求項４】抗体または抗体断片が、モノクローナル抗
   体あるいはモノクローナル抗体の断片である請求項１か
   ら３に記載の抗体または抗体断片の重合体。
5. 【請求項５】抗体断片がF(ab)'2であることを特徴とす
   る請求項１から４までの抗体または抗体断片の重合体。
6. 【請求項６】重合体が、マレイミド基を導入した第１の
   抗体または抗体断片と、チオール基を導入した第２の抗
   体または抗体断片を反応させることにより得られたもの
   である、請求項１から５の抗体または抗体断片の重合
   体。
7. 【請求項７】請求項１から６に記載の重合体を不溶化担
   体に固定して得られる固定化重合体。
8. 【請求項８】請求項１、２および４から６に記載の重合
   体をさらに標識物質により標識して得られる標識重合
   体。
9. 【請求項９】標識物質が酵素である請求項８に記載の標
   識重合体。
10. 【請求項１０】請求項３に記載の抗体または抗体断片の
    重合体を超音波処理して得られる組成物。
11. 【請求項１１】請求項１から１０に記載の重合体を用い
    る免疫学的測定法。
12. 【請求項１２】免疫学的測定法が免疫比濁法である、請
    求項１１に記載の測定法。
13. 【請求項１３】請求項７に記載の固定化重合体を用いる
    免疫学的測定法。
14. 【請求項１４】免疫学的測定法が、ラテックス凝集法、
    ELISA、IRMA、あるいはイムノクロマト法からなる群か
    ら選択されたものである、請求項１３に記載の方法。
15. 【請求項１５】請求項８から９に記載の標識重合体を用
    いる、免疫学的測定における非特異吸着の抑制方法。