CN102893151A - 标记化探针-水溶性载体复合物 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的在于高再现性地制作标记化探针-载体复合物，其用于对被测物质进行高灵敏度且稳定的检测和测定。其中，在标记物与探针-水溶性载体的结合中，利用亲和素、链霉亲和素等亲和素类与生物素的特异性结合，且在与载体结合之前进行该亲和素类与探针的结合。即，在使跟被测物质结合的物质与亲和素类结合之后，使该结合体与高分子水溶性载体结合来制作亲和素化探针-水溶性载体复合物，通过在该亲和素化探针-水溶性载体复合物中混合生物素化标记物，再现性良好地得到可藉由亲和素类与生物素的特异性结合来高灵敏度地检测和测定出被测物质的稳定的标记化探针-水溶性载体复合物。

Description

标记化探针-水溶性载体复合物
技术领域
本发明涉及在水溶性载体上结合两种以上的探针、进一步结合标记物而成的标记化探针-水溶性载体复合物的制作方法；利用该方法制作的标记化探针-水溶性载体复合物；及其使用方法。通过使用该标记化探针-水溶性载体复合物，能够高灵敏度地进行稳定的检测和测定。
背景技术
在使用跟被测物质特异性结合的探针与标记物的结合物、以被测物质与标记物藉由探针的结合量为指标来对被测物质进行检测和测定的方法中，其灵敏度通常由探针和标记物的分子数来决定。即，标记物相对于1分子探针所结合的分子数是有限的，该比例决定了灵敏度。
因此，通过对探针本身进行聚合化来制作聚合物，由此会增大分子量，通过增加与该聚合物结合的标记物的分子数来进行反应性得到提高的高灵敏度化(专利文献1)。但是，探针聚合化的调节并不容易，尚未达到实用化。
另外还提出了将酶标记物和探针单独地共价键合在聚赖氨酸、氨基葡聚糖等载体上所得到的分子量增大、标记物的结合数多的标记物探针复合物(专利文献2)。但是，利用该技术尽管可增加反应性，但空白值下的反应也会增加，尚未达到检测和测定时的高灵敏度化。
进一步提出了下述提案：使酶标记物结合在聚赖氨酸等载体上并藉由载体上的标记物从而结合有探针的标记物-探针复合物(专利文献3)；使探针结合在葡聚糖等载体上，藉由载体上的探针从而结合有标记物的水溶性载体-探针复合物(专利文献4)；使亲水性的中介物结合在载体上从而在中介物上结合有探针和检测标记的标记物的探针复合物(专利文献5)；在藉由酶标记物结合有2分子以上的载体的复合物上结合有探针的嵌段化标记物探针(专利文献6)。
但是，上述现有技术中还存在反应性增加的同时空白值下的反应也会增加这样的技术课题，在以信号/噪音比的形式来评价反应性的情况下，难以得到高灵敏度且稳定的复合物。并且，在复合物的形成中，若首先进行载体与探针或标记物的结合，则由于载体的多官能性而难以再现性良好地制作所期望的复合物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平11-295313号公报
专利文献2：日本特开2000-88850号公报
专利文献3：日本特开2001-181299号公报
专利文献4：日本特开2003-194821号公报
专利文献5：国际公开2006/011543
专利文献6：国际公开2006/070732
发明内容
发明所要解决的课题
为了使用跟被测物质特异性结合的探针与标记物的结合物，以被测物质与标记物藉由探针的结合量为指标，高灵敏度地进行被测物质的检测和测定，在1分子探针与标记物的结合物中必须含有大量的标记物。因此，需要制作大分子的探针与标记物的结合物。
但是，在使用会形成大分子结合物的载体的情况下，尽管反应性增加，但空白值下的反应也增加，结果难以得到高灵敏度且稳定的复合物。另外，若作为形成复合物的最初阶段进行载体与探针或标记物的结合，则由于载体的多官能性而难以再现性良好地制作所期望的复合物。因此，期待稳定地制作可解决上述课题的结合物和稳定地制作该结合物的方法。
解决课题的手段
本发明人想到，在标记化探针-载体复合物的制作中，在探针与标记物的结合中利用亲和素类与生物素的特异性结合，并且发现，通过在与载体结合之前进行亲和素类与探针的结合，能够再现性良好地制作灵敏度极高且稳定的复合物。此外发现，在为了化学结合而进行探针的化学修饰时，向探针导入硫羟基不会对探针的结合能力带来影响；进而通过使用水溶性载体作为载体，构建出了在以高灵敏度稳定地检测和测定中有用的标记化探针-水溶性载体复合物。
即，本发明涉及包括以下工序的标记化探针-水溶性载体复合物的制作方法。
工序1.使具有硫羟基、可与被测物质结合的探针与具有马来酰亚胺基的亲和素类结合，制成探针结合体；
工序2.接下来，使具有硫羟基的所述探针结合体与具有马来酰亚胺基的高分子水溶性载体结合，制成探针结合体-水溶性载体复合物；和
工序3.进一步将所述探针结合体-水溶性载体复合物与生物素化标记物混合，使探针结合体-水溶性载体复合物的亲和素类与生物素化标记物的生物素结合。
本发明还涉及通过该工序制作的标记化探针-水溶性载体复合物。
本发明进一步涉及使用了通过上述工序制作的标记化探针-水溶性载体复合物的测定法、免疫测定法或高灵敏度测定法。
本发明中，“探针”意味着与被测物质相互作用的结合伙伴，作为非限定性示例，可以举出抗体或者抗体片段、蛋白G、蛋白A、蛋白L、凝集素或受体等。另外，作为抗体或抗体片段的非限定性示例，可以举出Fab’、F(ab’)2、Fab或IgG等。
另外，作为该抗体或抗体片段，可以使用两种以上的抗体或抗体片段。
本发明中，“亲和素类”意味着为低分子碱性糖蛋白的亲和素、与其类似的蛋白质或其片段等与生物素化合物形成稳定复合物的物质，作为该“亲和素类”的非限定性示例，可以举出亲和素或链霉亲和素等。
本发明中，“水溶性载体”优选分子量为50万以上。作为本发明中水溶性载体的非限定性示例，可以举出葡聚糖、氨基葡聚糖、糊精、集束糊精(Cluster Dextrin)、聚蔗糖或普鲁兰多糖等。
本发明中使用“生物素化标记物”。此处的“生物素”为维生素B复合物的一种，已知与亲和素有非常强力的结合。作为本发明中的“生物素化标记物”的非限定性示例，可以举出生物素化荧光素酶、生物素化碱性磷酸酶、生物素化POD(过氧化物酶，peroxidase)、生物素化GOD(葡糖氧化酶，glucose oxidase)、生物素化FITC(异硫氰酸荧光素，fluorescein isothiocyanate)、生物素化吖啶鎓、生物素化吖啶鎓衍生物或生物素化三(2,2’-联吡啶)钌(II)等。该“生物素化标记物”中的生物素与标记物的结合中，可以利用包括化学修饰等已知的任意手段，特别优选利用基因重组。这是因为，由于不进行化学结合所用的化学修饰，不会降低该标记物的活性。
本发明的工序1中，在可与被测物质结合的探针不具有足够的硫羟基的情况下，首先向该探针导入硫羟基。在硫羟基的导入中可以使用任何已知的方法，在探针为抗体或抗体片段的情况下，使用2-巯基乙醇等还原剂，通过对内在的二硫键进行还原来导入硫羟基，从而可使得对探针结合能力的影响为最小限，因而是特别有利的。
接下来，向亲和素类中导入马来酰亚胺基。马来酰亚胺基的导入可以使用任何已知的方法，例如可使用Sulfo-KMUS(同仁化学社制造)之类的已知的马来酰亚胺试剂。
在具有硫羟基且可与被测物质结合的探针与具有马来酰亚胺基的亲和素类的结合中，可以使用任何已知的方法。例如，可将探针和亲和素类分别在适当浓度下溶解于缓冲液中，通过使该溶解液发生反应来进行结合反应。另外，为在以后的工序中回避非特异反应，可以在上述结合反应完成后使用2-巯基乙醇等硫醇试剂来封闭未反应的马来酰亚胺基。封闭后的探针-亲和素类结合体可以通过凝胶过滤等已知的方法进行精制。
本发明的工序2中，首先向工序1中制作的探针-亲和素类结合体中导入硫羟基。硫羟基的导入可以采用例如使用2-亚氨基硫烷等已知的任意方法。
向水溶性载体中导入马来酰亚胺基时可以使用任何已知的方法。例如，通过使水溶性载体与酸反应来导入羧基，通过透析等去除该酸后，使用乙二胺等已知的氨基导入试剂，将羧基置换为氨基。置换后，通过透析等除去未反应的氨基导入试剂，加入已知的马来酰亚胺试剂进行反应，由此可得到具有马来酰亚胺基的水溶性载体。
具有硫羟基的探针-亲和素类结合体与具有马来酰亚胺基的水溶性载体的结合可以使用任何已知的方法。另外，为了在以后的工序中回避非特异反应，优选在结合反应完成后使用2-巯基乙醇等硫醇试剂来封闭导入至水溶性载体中的未反应的马来酰亚胺基。封闭后的探针结合体-水溶性载体复合物可以通过凝胶过滤等已知的方法进行精制。
本发明的工序3中，通过将上述探针结合体-水溶性载体复合物与生物素化标记物混合，使探针结合体-水溶性载体复合物的亲和素类与生物素化标记物的生物素进行结合。如上所述，由于亲和素类与生物素的亲和性非常强，因此可以例如分别以适当的浓度制备探针结合体-水溶性载体复合物和生物素化标记物，并将该制备液混合，由此来进行该亲和素类与生物素的结合反应。
对于通过本发明的工序而制作的标记化探针-水溶性载体复合物，由于该探针与目的被测物质高灵敏度且稳定地进行反应，因而可在任何已知的测定法中加以利用。另外，在该探针为抗体或抗体片段的情况下，本发明的标记化探针-水溶性载体复合物可以在任何已知的免疫测定法中加以利用。
进一步地，通过本发明的工序制作的标记化探针-水溶性载体复合物即使在长期保存后也极为稳定。即使在37℃进行1周的加速稳定性试验，其也保持了经时稳定性。
本发明中，作为一例，在生物素化标记物中使用生物素化荧光素酶、作为探针使用Fab’、作为亲和素类使用链霉亲和素、作为水溶性载体使用葡聚糖(T2000)进行了说明，但并不限于本例。
将IgG抗体利用胃蛋白酶消化，向所得到的F(ab’)2中加入2-巯基乙醇进行还原处理，之后通过凝胶过滤进行精制，得到具有硫羟基的Fab’。
另一方面，向链霉亲和素中加入导入马来酰亚胺基的试剂进行处理后，通过凝胶过滤进行精制，得到导入有马来酰亚胺基的链霉亲和素。
将利用上述方法得到的导入有硫羟基的Fab’和导入有马来酰亚胺基的链霉亲和素混合来进行反应，之后添加2-巯基乙醇封闭未反应的马来酰亚胺基，通过凝胶过滤进行精制，得到Fab’-链霉亲和素结合体。
向所得到的Fab’-链霉亲和素结合体中加入2-亚氨基硫烷来进行反应，之后通过凝胶过滤进行精制，得到导入有硫羟基的Fab’-链霉亲和素结合体。
制作葡聚糖(T2000)中导入有氨基的氨基葡聚糖，进一步加入马来酰亚胺试剂来进行反应，之后通过凝胶过滤进行精制，得到导入有马来酰亚胺基的葡聚糖(T2000)。
将通过上述方法得到的导入有硫羟基的Fab’-链霉亲和素结合体和导入有马来酰亚胺基的葡聚糖(T2000)混合来进行反应，之后添加2-巯基乙醇来封闭未反应的马来酰亚胺基，通过凝胶过滤进行精制，得到Fab’-链霉亲和素结合体-葡聚糖复合物。
将所得到的Fab’-链霉亲和素结合体-葡聚糖(T2000)复合物与生物素化荧光素酶混合来进行反应，得到荧光素酶标记Fab’-葡聚糖(T2000)复合物。
使用所得到的荧光素酶标记Fab’-葡聚糖(T2000)复合物作为标记抗体，与另外准备的固定有抗体的固相进行组合，进行夹心免疫分析，由此完成高灵敏度的检测和测定法。
虽然并非是要拘泥于理论，但可认为，通过本发明，与现有情况相比再现性良好地得到了灵敏度极高且稳定的标记化探针-水溶性载体复合物这一点的主要原因在于，藉由亲和素类与生物素的高亲和性来进行探针与标记物的结合、且在与载体结合之前进行该探针与亲和素类的结合。探针与亲和素类的结合、以及亲和素类与生物素的结合中，容易对与该结合相关的分子数比等进行调节，因而可再现性良好且稳定地制作具有同等结构的标记化探针-水溶性载体复合物。并且认为，如此稳定地制作出的标记化探针-水溶性载体复合物所具有的结构极其适合于在相对抑制构成噪音的非特异性反应的同时仅增加构成信号的特异性反应。
发明的效果
通过实施本发明，能够再现性良好地得到与被测物质特异性地结合的高灵敏度且稳定的标记化探针-水溶性载体复合物，通过使用该标记化探针-水溶性载体复合物，能够高灵敏度且稳定地进行检测和测定。
附图说明
图1为IgG-链霉亲和素结合体-葡聚糖(T2000)复合物的洗脱分布图。
图2为Fab’(c11-9+c11-14)-链霉亲和素结合体-葡聚糖(T2000)复合物的洗脱分布图。
图3为Fab’(c11-9)-链霉亲和素结合体-葡聚糖(T2000)复合物的洗脱分布图。
图4为Fab’(c11-14)-链霉亲和素结合体-葡聚糖(T2000)复合物的洗脱分布图。
图5为Fab’(c11-9+c11-14)-链霉亲和素结合体-葡聚糖(T500)复合物的洗脱分布图。
图6为FITC标记Fab’与FITC标记Fab’-葡聚糖复合物的反应性的比较。
具体实施方式
使固定化有用于与被测物质特异性地结合的探针的不溶性载体与检体发生反应，之后去除检体进行清洗，其后加入标记化探针-水溶性载体复合物进行反应，再次去除清洗后对不溶性载体上的标记物的活性进行测定，由此来进行检体中的被测物质的检测和测定。
实施例1
通过还原处理来制备具有硫羟基的IgG
将抗HCV核心抗原小鼠单克隆IgG抗体c11-9和c11-14溶解在0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)中，分别制备5mg/mL的溶液。向这些IgG溶液300μL中添加0.2M的2-巯基乙醇(和光纯药社制造)30μL，在37℃进行1.5小时反应。反应后，利用PD-10(GEHealthcare社制造)进行凝胶过滤精制，得到具有硫羟基的IgG，该硫羟基是对抗体内存在的二硫键进行还原而得到的。对各硫羟基的数目进行定量，结果确认到每1分子IgG中存在有8.0个硫羟基。
实施例2
通过还原处理来制备具有硫羟基的Fab’
将抗HCV核心抗原小鼠单克隆IgG抗体c11-9和c11-14溶解在0.1M乙酸钠缓冲液(pH4.5)中，制备成10mg/mL。接下来，向1mL这些IgG溶液中添加胃蛋白酶0.2mg，在37℃搅拌6小时，使IgG被胃蛋白酶消化。胃蛋白酶消化后，利用2NNaOH中和，进一步利用Superdex200柱(GE Healthcare社制造)进行精制，从而得到F(ab’)2。
向各3.0mg/mL的F(ab’)21300μL中添加0.2M的2-巯基乙醇(和光纯药社制造)130μL，在37℃进行1.5小时反应。反应后，利用PD-10(GE Healthcare社制造)进行凝胶过滤精制，得到具有硫羟基的Fab’，该硫羟基是对抗体内存在的二硫键进行还原而得到的。对各硫羟基的数目进行定量，其结果，在c11-9中确认到每1分子Fab’中存在3.3个硫羟基、在c11-14中确认到每1分子Fab’中存在3.4个硫羟基。
实施例3
向链霉亲和素中导入马来酰亚胺基
将20mg的链霉亲和素(MP Bio社制造)溶解在0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)2mL中，向二甲基甲酰胺中加入以6mg/mL进行溶解的马来酰亚胺试剂Sulfo-KMUS(同仁化学社制造)133μL。在30℃反应1小时后，利用PD-10(GE Healthcare社制造)进行凝胶过滤精制，得到导入有马来酰亚胺基的链霉亲和素。对马来酰亚胺基的数目进行定量，结果确认到每1分子链霉亲和素中存在3.7个马来酰亚胺基。
实施例4
IgG-链霉亲和素结合体的制作
将实施例1中制作的c11-9和c11-14的导入有硫羟基的IgG溶解在0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)中，分别制备出2.5mg/mL的导入有硫羟基的IgG溶液。另一方面，将实施例3中制作的导入有马来酰亚胺基的链霉亲和素溶解在0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)中，制备出13.0mg/mL的导入有马来酰亚胺基的链霉亲和素溶液。
接下来，向各导入有硫羟基的IgG溶液500μL中添加导入有马来酰亚胺基的链霉亲和素溶液38μL，在30℃进行1小时反应。反应后，添加0.2M的2-巯基乙醇(和光纯药社制造)54μL，在4℃进行一晩反应，封闭未反应的马来酰亚胺基。反应后，利用Superdex200柱(GE Healthcare社制造)进行凝胶过滤精制，得到IgG-链霉亲和素结合体。
实施例5
荧光素酶标记IgG的制作
向实施例4中制作的10μM的c11-9和c11-14的IgG-链霉亲和素结合体50μL中加入61μM的生物素化荧光素酶(Kikkoman社制造)8.2μL，在25℃进行1小时反应，由此来制作荧光素酶标记IgG。
实施例6
Fab’-链霉亲和素结合体的制作
将实施例2中制作的c11-9和c11-14的导入有硫羟基的Fab’溶解在0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)中，分别制备出2.6mg/mL的导入有硫羟基的Fab’溶液。另一方面，将实施例3中制作的导入有马来酰亚胺基的链霉亲和素溶解在0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)中，制备出13.0mg/mL的导入有马来酰亚胺基的链霉亲和素溶液。
接下来，向各导入有硫羟基的Fab’溶液1400μL中添加导入有马来酰亚胺基的链霉亲和素溶液365μL，在30℃进行1小时反应。反应后，添加0.2M的2-巯基乙醇(和光纯药社制造)177μL，在4℃反应一晩，封闭未反应的马来酰亚胺基。反应后，利用Superdex200柱(GE Healthcare社制造)进行凝胶过滤精制，得到Fab’-链霉亲和素结合体。
实施例7
荧光素酶标记Fab’的制作
向实施例6中制作的26.4μM的c11-9和c11-14的Fab’-链霉亲和素结合体10μL中加入61μM的生物素化荧光素酶(Kikkoman社制造)4.3μL，在25℃进行1小时反应，由此来制作荧光素酶标记Fab’。
实施例8
向导入有氨基的葡聚糖中导入马来酰亚胺基
分别将2g的葡聚糖(T2000)和葡聚糖(T500)与4.7g一氯乙酸溶解在50mL的3NNaOH溶液中，在室温下进行70分钟搅拌，由此向葡聚糖(T2000)和葡聚糖(T500)导入羧基。接着添加磷酸二氢钠0.2g，利用6N HCl中和混合液来使反应停止，通过透析除去未反应的一氯乙酸。
透析后，添加16.4g的乙二胺与1.2g的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺，在室温下搅拌4小时，由此将导入至葡聚糖(T2000)和葡聚糖(T500)中的羧基转换为氨基。接下来，通过透析除去未反应的乙二胺与碳二亚胺，通过冷冻干燥回收氨基葡聚糖(T2000)和氨基葡聚糖(T500)。
分别将1.5mg的氨基葡聚糖(T2000)和氨基葡聚糖(T500)溶解在0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)3mL中，加入以12mg/mL溶解在二甲基甲酰胺中的马来酰亚胺试剂Sulfo-KMUS(同仁化学社制造)30μL，在37℃进行30分钟反应。反应后，利用PD-10(GEHealthcare社制造)进行凝胶过滤精制，得到导入有马来酰亚胺基的氨基葡聚糖(T2000)和氨基葡聚糖(T500)。对马来酰亚胺基的数目进行定量，结果确认到，在每1分子葡聚糖(T2000)中存在294个马来酰亚胺基、在每1分子葡聚糖(T500)中存在65个马来酰亚胺基。
实施例9
IgG-链霉亲和素结合体-葡聚糖复合物的制作
分别将实施例4中制作的c11-9和c11-14的IgG-链霉亲和素结合体利用0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)进行溶解，制成2.5mg/mL的溶液，进行等量混合，制备出IgG-链霉亲和素结合体溶液。
向该IgG-链霉亲和素结合体溶液264μL中添加以1mg/mL溶解在二甲基甲酰胺中的2-亚氨基硫烷(PIERCE社制造)2μL，在30℃进行30分钟反应。反应后，利用PD-10(GE Healthcare社制造)进行凝胶过滤精制，得到导入有硫羟基的IgG-链霉亲和素结合体。对硫羟基的数目进行定量，结果确认到在每1分子的IgG-链霉亲和素结合体中存在4.8个硫羟基。
接下来，在实施例8中制作的0.625μM的导入有马来酰亚胺基的氨基葡聚糖(T2000)溶液40μL中混合8.6μM的导入有硫羟基的IgG-链霉亲和素结合体290μL，在30℃静置1小时。其后，添加0.2M的2-巯基乙醇(和光纯药社制造)33μL，在4℃反应一晩，封闭未反应的马来酰亚胺基。反应后，利用Superdex200柱(GE Healthcare社制造)进行凝胶过滤精制，由图1所示的空穴峰(ボイドピーク)级分得到IgG-链霉亲和素结合体-葡聚糖(T2000)复合物。
实施例10
向IgG-链霉亲和素结合体-葡聚糖复合物中导入生物素化荧光素酶
对于实施例9中制作的IgG-链霉亲和素结合体-葡聚糖(T2000)复合物，使用0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)将IgG-链霉亲和素结合体浓度调整为570nM。向该IgG-链霉亲和素结合体-葡聚糖(T2000)复合物溶液300μL中加入61μM的生物素化荧光素酶(Kikkoman社制造)溶液3.0μL，在25℃进行1小时反应，由此得到荧光素酶标记IgG-葡聚糖(T2000)复合物。
实施例11
Fab’-链霉亲和素结合体-葡聚糖复合物的制作
向实施例6中制作的4.0mg/mL的c11-9Fab’-链霉亲和素结合体420μL和2.6mg/mL的c11-14Fab’-链霉亲和素结合体646μL中添加以1mg/mL溶解在二甲基甲酰胺中的2-亚氨基硫烷(PIERCE社制造)2μL，在30℃进行30分钟反应。
反应后，利用PD-10(GE Healthcare社制造)进行凝胶过滤精制，得到导入有硫羟基的各Fab’-链霉亲和素结合体。对硫羟基的数目进行定量，结果确认到在每1分子c11-9Fab’-链霉亲和素结合体中存在有4.6个硫羟基、在每1分子c11-14Fab’-链霉亲和素结合体中存在有3.0个硫羟基。
接下来，将实施例8中制作的导入有马来酰亚胺基的氨基葡聚糖(T2000)和(T500)与导入有硫羟基的Fab’-链霉亲和素结合体混合，在30℃静置1小时。另外，导入有马来酰亚胺基的各氨基葡聚糖与导入有硫羟基的各Fab’-链霉亲和素结合体按以下所示的浓度、液量进行组合，制作合计4种的聚合物。
1)混合有c11-9和c11-14的Fab’-链霉亲和素结合体-葡聚糖(T2000)复合物
将21μM的导入有硫羟基的c11-9Fab’-链霉亲和素结合体200μL、18μM的导入有硫羟基的c11-14Fab’-链霉亲和素结合体240μL、以及0.625μM的导入有马来酰亚胺基的氨基葡聚糖(T2000)142μL混合。
2)c11-9Fab’-链霉亲和素结合体-葡聚糖(T2000)复合物
将21μM的导入有硫羟基的c11-9Fab’-链霉亲和素结合体200μL与0.625μM的导入有马来酰亚胺基的氨基葡聚糖(T2000)71μL混合。
3)c11-14Fab’-链霉亲和素结合体-葡聚糖(T2000)复合物
将18μM的导入有硫羟基的c11-14Fab’-链霉亲和素结合体240μL与0.625μM的导入有马来酰亚胺基的氨基葡聚糖(T2000)71μL混合。
4)混合有c11-9和c11-14的Fab’-链霉亲和素结合体-葡聚糖(T500)复合物
将21μM的导入有硫羟基的c11-9Fab’-链霉亲和素结合体200μL、18μM的导入有硫羟基的c11-14Fab’-链霉亲和素结合体240μL、以及2.5μM的导入有马来酰亚胺基的氨基葡聚糖(T500)116μL混合。
反应后，添加各复合物溶液的1/10量的0.2M的2-巯基乙醇(和光纯药社制造)，在4℃反应一晩，封闭未反应的马来酰亚胺基。次日，利用Superdex200柱(GEHealthcare社制造)进行凝胶过滤精制，由图2～5所示的各样品的空穴峰级分得到Fab’-链霉亲和素结合体-葡聚糖复合物。
实施例12
向Fab’-链霉亲和素结合体-葡聚糖复合物中导入生物素化荧光素酶
对于实施例11中制作的4种Fab’-链霉亲和素结合体-葡聚糖复合物，使用0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)将Fab’-链霉亲和素结合体浓度调整为1.8μM。向这些Fab’-链霉亲和素结合体-葡聚糖复合物溶液100μL中加入61μM的生物素化荧光素酶(Kikkoman社制造)3.0μL，通过在25℃进行1小时反应，得到以下所示的4种荧光素酶标记Fab’-葡聚糖复合物。
1)荧光素酶标记c11-9·c11-14Fab’-葡聚糖(T2000)复合物
2)荧光素酶标记c11-9Fab’-葡聚糖(T2000)复合物
3)荧光素酶标记c11-14Fab’-葡聚糖(T2000)复合物
4)荧光素酶标记c11-9·c11-14Fab’-葡聚糖(T500)复合物
实施例13
使用荧光素酶标记抗体的酶免疫测定
利用使用了WSC的碳二亚胺法，将抗HCV核心抗原小鼠单克隆抗体c11-3、c11-7、和AOT3固定于磁性颗粒，制作0.2%抗体固相化磁性颗粒。另一方面，将正常人血清和经PCR确认的两种HCV阳性血清100μL与检体处理液(6M盐酸胍、0.5NHCl、12.5%TritonX100、0.75%Tween20)100μL混合，在37℃放置15分钟，由此进行检体的前处理，之后将反应液(0.1M磷酸钠、0.15MNaCl、1%BSA、0.5%酪蛋白、0.05%Tween20、pH7.3)140μL与1M Tris缓冲液20μL混合，向该混合液160μL中加入前处理检体80μL，由此中和前处理检体。
接下来，向经中和的前处理检体240μL中加入0.2%抗体固相化磁性颗粒20μL，在37℃放置15分钟，由此进行1次反应。反应后，将磁性颗粒利用清洗液清洗3次，添加实施例5中制作的荧光素酶标记IgG和实施例10中制作的荧光素酶标记IgG-葡聚糖(T2000)复合物。对于标记抗体的量，加入120μL以荧光素酶浓度计稀释至18nM的标记抗体，搅拌后进一步在37℃进行15分钟反应。反应后，将磁性颗粒用清洗液清洗3次，再悬浮于50mM Tris缓冲液(pH8.5)100μL中。
向再悬浮有磁性颗粒的管中加入底物溶液(荧光素)100μL，使用Lumat LB9507(Berthold社制造)来测定荧光素酶的发光。在发光测定中，在自添加荧光素0.5秒之后起累计5秒钟的发光。其结果，如表1所示，荧光素酶标记IgG-葡聚糖(T2000)复合物显示出了高于荧光素酶标记IgG的发光值。若由样本检体(パネル検体)M的S/N比进行估算，则反应性提高大致50～100倍左右。
【表1】
(发光值)        (发光比)
实施例14
使用荧光素酶标记抗体片段的酶免疫测定
作为标记抗体使用实施例7和实施例12中制作的抗体，除此以外，利用与实施例13相同的方法来实施。其结果，如表2所示，荧光素酶标记Fab’-葡聚糖(T2000)复合物或荧光素酶标记Fab’-葡聚糖(T500)复合物显示出了高于荧光素酶Fab’标记的发光值，通过与IgG的情况同样地进行聚合化，确认到反应性提高了50～100倍左右。另外，在单独进行c11-9或c11-14抗体片段的聚合化的情况下，也观察到了反应性的提高，但确认到通过将二者组合可进一步提高反应性。
【表2】
(发光值)        (发光比)
实施例15
与应用现有探针复合物制作方法制作的聚合化标记抗体的性能比较
应用现有探针复合物制作方法制作聚合化标记抗体
应用国际公开2006/011543所述的方法来制作探针复合物。首先称量葡聚糖(T2000)44mg，溶解在0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)0.8mL中，添加高碘酸钠溶液0.4mL进行混合。在室温下反应2小时后，通过凝胶过滤(PD-10；GE Healthcare社制造)除去剩余的高碘酸钠，添加链霉亲和素(SA)溶液与CAPS溶液(10%)，在室温下反应5小时，从而将链霉亲和素导入到葡聚糖中。进一步地，为进行反应产物的稳定化，添加混合二甲胺硼烷(DMBA；生化学工业社制造)1mg与1M Tris溶液0.4mL，在室温反应一晩。其后，通过凝胶过滤(Sephacryl S-300HR 1.6x30；GE Healthcare社制造)对反应产物进行精制，得到葡聚糖-SA结合物。接下来，使用0.1M磷酸缓冲液(pH7.0)以2mg/mL制备葡聚糖-SA结合物，向该葡聚糖-SA结合物溶液0.5mL中加入利用二甲基甲酰胺溶解为10mg/mL的马来酰亚胺试剂EMCS(同仁化学社制造)5μL，在室温下进行1.5小时反应。利用PD-10(GE Healthcare社制造)对该反应产物进行凝胶过滤精制，去除未反应的EMCS，得到导入有马来酰亚胺基的葡聚糖-SA结合物。另外按实施例2中记载的方法制作c11-9与c11-14的Fab’，将各Fab’等量混合，由此来制备0.5mg/mL的Fab’溶液。接下来，向2mg/mL的导入了马来酰亚胺基的葡聚糖-SA结合物0.5mL中添加0.5mg/mL Fab’溶液1mL，在4℃反应一晩。其后添加2-巯基乙胺使其最终浓度为15mM，在室温下反应1小时来封闭未反应的马来酰亚胺基。反应后，利用Sephacryl S-300HR柱(GE Healthcare社制造)进行凝胶过滤精制，得到葡聚糖-SA-Fab’复合物。对于精制后的葡聚糖-SA-Fab’复合物所含有的SA，以浓度已知的SA溶液为标准、以利用HABA试剂进行的显色为指标来进行定量。对所制作的葡聚糖T2000-SA-Fab’聚合物，用0.1M磷酸缓冲液将SA浓度调整为570nM。向该葡聚糖T2000-SA-Fab’聚合物溶液300μL中添加61μM的生物素化荧光素酶(Kikkoman社制造)3.0μL，在25℃进行1小时反应，由此制成应用现有方法的聚合化标记抗体。
使用荧光素酶标记抗体的酶免疫测定
利用使用了WSC的碳二亚胺法，将抗HCV核心抗原小鼠单克隆抗体c11-3、c11-7、和AOT3固定于磁性颗粒，制作0.2%抗体固相化磁性颗粒。另一方面，将正常人血清和两种HCV核心抗原阳性血清100μL与检体处理液(6M盐酸胍、0.5N HCl、12.5%TritonX100、0.75%Tween20)100μL混合，在37℃放置15分钟，由此进行检体的前处理，之后将反应液(0.1M磷酸钠、0.15MNaCl、1%BSA、0.5%酪蛋白、0.05%Tween20、pH7.3)140μL与1M Tris缓冲液20μL混合，向该混合液160μL中加入前处理检体80μL，由此对前处理检体进行中和。
接下来，向经中和的前处理检体240μL中加入0.2%抗体固相化磁性颗粒20μL，在37℃放置15分钟，由此进行1次反应。反应后，将磁性颗粒利用清洗液清洗3次，添加实施例5中制作的荧光素酶标记IgG、实施例10中制作的荧光素酶标记IgG-葡聚糖(T2000)复合物、应用现有方法制作的聚合化标记抗体。对于标记抗体的量，加入120μL以荧光素酶浓度计稀释至18nM的标记抗体，搅拌后进一步在37℃进行15分钟反应。反应后，将磁性颗粒用清洗液清洗3次，再悬浮于50mM Tris缓冲液(pH8.5)100μL中。
向再悬浮有磁性颗粒的管中加入底物溶液(荧光素)100μL，使用Lumat LB9507(Berthold社制造)来测定荧光素酶的发光。在发光测定中，在自荧光素添加0.5秒之后起累计5秒钟的发光。其结果，如表3所示，荧光素酶标记IgG-葡聚糖(T2000)复合物显示出了比应用现有方法制作的聚合化标记抗体更高的反应性。若由样本检体L和M的S/N比进行估算，则荧光素酶标记IgG-葡聚糖(T2000)复合物相比于应用现有方法制作的聚合化标记抗体反应性提高大致3～5倍左右。另外，在应用现有方法制作的聚合化标记抗体的情况下，即使增加所使用的抗体量，在其S/N比方面也未见大的改善。
【表3】
Figure BDA00002246747800151
(发光值)        (发光值比)
实施例16
在生物素化POD中的应用
POD标记Fab’的制作
向实施例6中制作的15.4μM的c11-9和c11-14的Fab’-链霉亲和素结合体30μL中加入56.8μM的生物素化POD(Invitrogen社制造)8.1μL，在4℃放置一晩，制成POD标记Fab’。
向Fab’-链霉亲和素结合体-葡聚糖(T2000)复合物中导入生物素化POD
对于实施例11中制作的混合有c11-9和c11-14的Fab’-链霉亲和素结合体-葡聚糖(T2000)复合物，利用0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)将Fab’-链霉亲和素结合体浓度调整为1.4μM。向该复合物溶液50μL中加入56.8μM的生物素化POD(Invitrogen社制造)1.2μL，在4℃放置一晩，由此制成POD标记Fab’-葡聚糖(T2000)复合物。
使用POD标记抗体的酶免疫测定
利用使用了WSC的碳二亚胺法，将抗HCV核心抗原小鼠单克隆抗体c11-3、c11-7、和AOT3固定于磁性颗粒，制作0.2%抗体固相化磁性颗粒。另一方面，利用正常人血清将重组体HCV核心抗原(c11)稀释成0nM、0.12nM、1.2nM，将这些样品100μL与检体处理液(6M盐酸胍、0.5N HCl、12.5%TritonX100、0.75%Tween20)100μL混合，在37℃放置15分钟，由此进行样品的前处理。进一步将反应液(0.1M磷酸钠、0.15M NaCl、1%BSA、0.5%酪蛋白、0.05%Tween20、pH7.3)140μL与1M Tris缓冲液20μL混合，向该混合液160μL中加入前处理检体80μL，由此中和前处理检体。
接下来，向经中和的前处理检体240μL中加入0.2%抗体固相化磁性颗粒20μL，在37℃放置15分钟，由此进行1次反应。反应后，将磁性颗粒利用清洗液清洗3次，添加通过上述方法制作的POD标记Fab’和POD标记Fab’-葡聚糖(T2000)复合物。对于标记抗体的量，加入120μL以POD浓度计稀释至18nM的标记抗体，搅拌后进一步在37℃进行15分钟反应。反应后，将磁性颗粒利用清洗液清洗3次。
随后，向磁性颗粒的管中加入底物溶液(鲁米诺)200μL，使用LumatLB9507(Berthold社制造)来测定POD的发光。在发光测定中，在自添加鲁米诺12秒之后起累计3秒钟的发光。其结果，如表4所示，与POD标记Fab’相比，POD标记Fab’-葡聚糖(T2000)复合物显示出了更高的发光值，与荧光素酶的情况同样地确认到了本发明所带来的信号的扩增。由上述结果示出，本发明使用荧光素酶以外的酶也可实施。
【表4】
Figure BDA00002246747800161
(发光值)        (发光值比)
实施例17
在生物素化FITC中的应用
FITC标记Fab’的制作
向实施例6中制作的15.4μM的c11-9和c11-14的Fab’-链霉亲和素结合体30μL中加入160μM的生物素化FITC(Invitrogen社制造)2.9μL，在4℃放置一晩来制作FITC标记Fab’。
向Fab’-链霉亲和素结合体-葡聚糖(T2000)复合物中导入生物素化FITC
对于实施例11中制作的混合有c11-9和c11-14的Fab’-链霉亲和素结合体-葡聚糖(T2000)复合物，利用0.1M磷酸缓冲液(pH7.2)将Fab’-链霉亲和素结合体浓度调整为6.3μM。向该复合物溶液20μL中加入160μM的生物素化FITC(Invitrogen社制造)1.0μL，在4℃放置一晩，由此制作出FITC标记Fab’-葡聚糖(T2000)复合物。
使用FITC标记抗体的荧光免疫测定
利用使用了WSC的碳二亚胺法，将抗HCV核心抗原小鼠单克隆抗体c11-3、c11-7、和AOT3固定于磁性颗粒，制作0.2%抗体固相化磁性颗粒。另一方面，利用正常人血清将重组体HCV核心抗原(c11)稀释成0nM、0.12nM、1.2nM，将这些样品100μL与检体处理液(6M盐酸胍、0.5N HCl、12.5%TritonX100、0.75%Tween20)100μL混合，在37℃放置15分钟，由此进行样品的前处理。进一步将反应液(0.1M磷酸钠、0.15MNaCl、1%BSA、0.5%酪蛋白、0.05%Tween20、pH7.3)140μL与1M Tris缓冲液20μL混合，向该混合液160μL中加入前处理检体80μL，由此中和前处理检体。
接下来，向经中和的前处理检体240μL中加入0.2%抗体固相化磁性颗粒20μL，在37℃放置15分钟，由此进行1次反应。反应后，将磁性颗粒利用清洗液清洗3次，添加通过上述方法制作的FITC标记Fab’和FITC标记Fab’-葡聚糖(T2000)复合物。对于标记抗体的量，加入200μL以FITC浓度计稀释至65nM的标记抗体，搅拌后进一步在4℃反应一晩。反应后，将磁性颗粒利用清洗液清洗3次。
随后，向磁性颗粒的管中加入10mM PBS(pH7.4)200μL来进行磁性颗粒的悬浮，将悬浮液分注到96孔白色微孔板(ThermoFisher社制造)中。其后，使用荧光微孔板检测器infinite200(Tecan社制造)来测定FITC的荧光。对于荧光测定的条件，在485nm的波长下激发，测定535nm的荧光。其结果，如表5和图6所示，与FITC标记Fab’相比，FITC标记Fab’-葡聚糖(T2000)复合物显示出了更高的荧光活性，与荧光素酶及POD的情况同样地确认到了本发明所带来的信号的扩增。由以上结果示出，本发明使用酶以外的低分子标记物也可实施。
【表5】
(荧光强度)
实施例18
标记化探针-水溶性载体复合物的加速稳定性
对本发明的标记化探针-水溶性载体复合物进行加速稳定性的试验。详细地说，对于实施例12中制作的荧光素酶标记c11-9·c11-14Fab’-葡聚糖(T2000)复合物，测定了在4℃保存条件下的活性与在37℃、1周的加速条件下的残留活性，进行比较研究。活性的测定利用与实施例13相同的方法进行。结果如表6所示。
【表6】
Figure BDA00002246747800181
由上述结果证实，本发明的标记化探针-水溶性载体复合物显示出优异的加速稳定性。即，本发明的标记化探针-水溶性载体复合物即使在37℃保存1周也观察到其保持了约90%左右甚至90%以上的残留活性。并且，未观察到与该加速条件相伴的背景值(background)的上升。
这些结果证实，根据本发明，得到了与被测物质特异性地结合的高灵敏度且稳定的标记化探针-水溶性载体复合物，通过使用该标记化探针-水溶性载体复合物，与现有情况比较，能够进行更高灵敏度且稳定的检测和测定。并且证实了本申请发明对于酶以外的低分子标记物也是有效的。
工业实用性
在利用被测物质与探针的特异性结合来对检体中的被测物质进行检测和测定的方法中，通过使用本发明的标记化探针-水溶性载体复合物，与现有情况相比，能够进行更高灵敏度且稳定的检测和测定。

Claims (14)

1.一种标记化探针-水溶性载体复合物的制作方法，其包括下述工序：
工序1.使具有硫羟基、可与被测物质结合的探针与具有马来酰亚胺基的亲和素类结合，制成探针结合体；
工序2.接下来，使具有硫羟基的所述探针结合体与具有马来酰亚胺基的高分子水溶性载体结合，制成探针结合体-水溶性载体复合物；和
工序3.进一步将所述探针结合体-水溶性载体复合物与生物素化标记物混合，使探针结合体-水溶性载体复合物的亲和素类与生物素化标记物的生物素结合。
2.如权利要求1所述的方法，其中，亲和素类为亲和素或链霉亲和素。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中，水溶性载体的分子量为50万以上。
4.如权利要求1～3任一项所述的方法，其中，水溶性载体选自葡聚糖、氨基葡聚糖、糊精、集束糊精、聚蔗糖或普鲁兰多糖。
5.如权利要求1～4任一项所述的方法，其中，可与被测物质结合的探针为抗体或抗体片段。
6.如权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，该方法使用两种以上的抗体或抗体片段。
7.如权利要求5或6所述的方法，其中，抗体或抗体片段选自Fab’、F(ab’)2、Fab或IgG。
8.如权利要求1～4任一项所述的方法，其中，可与被测物质结合的探针选自蛋白G、蛋白A、蛋白L、凝集素或受体。
9.如权利要求1～8任一项所述的方法，其中，生物素化标记物选自生物素化荧光素酶、生物素化碱性磷酸酶、生物素化POD、生物素化GOD、生物素化FITC、生物素化吖啶鎓、生物素化吖啶鎓衍生物或生物素化三(2,2’-联吡啶)钌(II)。
10.如权利要求9所述的方法，其中，生物素化荧光素酶是通过基因重组制作的。
11.一种标记化探针-水溶性载体复合物，其是通过权利要求1～10任一项所述的方法来制作的。
12.一种测定法，其使用通过权利要求1～10任一项所述的方法制作的标记化探针-水溶性载体复合物。
13.一种免疫测定法，其使用通过权利要求1～7或9～10任一项所述的方法制作的标记化探针-水溶性载体复合物。
14.一种高灵敏度测定法，其使用通过权利要求1～10任一项所述的方法制作的标记化探针-水溶性载体复合物。
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